CN1763079A - 一种酪蛋白组分的分离方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用分级分离的方法将乳及乳制品中的主要成份－α－酪蛋白组分和β－酪蛋白组分分离制取，使α－酪蛋白组分和β－酪蛋白组分可以更好的发挥其自身的特性，避免其它几种组分带来的缺点，使酪蛋白的使用领域增大，实用性增强，使用量较未分离前的少，并有利于各种乳及乳制品的深加工和资源利用，提高产品的附加值。本发明制取的α－和β－酪蛋白组分其纯度高、得率高、颜色好、变性程度小、灰分低，专一性好、靶向型强；同时本发明工艺简单，适用于工业化生产。

Description

一种酪蛋白组分的分离方法及应用

技术领域

本发明涉及一种酪蛋白组分的分离方法，尤其涉及一种将乳及乳制品中主要成份-α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分分离制取的方法，同时还涉及α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分在食品中的应用。

背景技术

乳中主要成分是水、乳脂肪、蛋白质、乳糖和矿物质，其中水占87％、干物质占12％(乳中除去水和气体之外的物质称为干物质)。在水中溶解着各种可溶性盐类、乳糖类，同时在水中还分散着两种胶体系统：一种是脂肪球，另一种是酪蛋白胶束(是由蛋白质分子和不溶性盐构成的，这种不溶性盐主要指磷酸钙络合物)。

乳中含有几百种蛋白质，多数含量较少，蛋白质在牛乳中的含量为3.3％～3.5％。根据蛋白质的化学或物理性质可将其分为：酪蛋白、乳清蛋白。酪蛋白是在20℃的条件下将脱脂乳用酸调节其pH值为4.6沉淀的蛋白质。大多数酪蛋白的主要成分是α_S1-酪蛋白、α_S2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白(其含量分别为36％、10％、34％、12％)，这4种酪蛋白的主要区别在于它们含磷量的多寡....。不同类型酪蛋白的结构具有相似性，能够自行结合成聚集体，并进一步形成胶束。酪蛋白富含磷，与钙结合使微粒结构稳定，在乳中呈现为含钙、磷酸盐的络合物粒子状态。正常乳在分泌时(38℃)，所有的酪蛋白成分以分散的胶粒状态存在，胶粒的直径20～600nm(平均120nm)，以海绵状结构存在，这有利于蛋白质水解酶进入分子的内部。酪蛋白胶束是由亚基和亚胶束组成的，它们通常呈椭圆形。这些亚基(直径为8～12nm)通过磷酸钙相互连接在一起，它们之间的空隙由水(在乳中称之为乳浆)填满；亚胶束(直径为10～15nm)具有开放式的结构并且每克蛋白质至少结合有1.5g水。不同的胶束所含有的α_S-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白也是不均匀一致的。α_S-酪蛋白、β-酪蛋白形成的钙盐几乎不溶于水，而κ-酪蛋白易溶，由于κ-酪蛋白主要附着在胶束的表面，其溶解性胜过胶束中另外两种酪蛋白的溶解性，使得整个酪蛋白胶束能溶解呈胶体。α_S1-酪蛋白和β-酪蛋白都不含有半胱氨酸或半胱氨酸残基，而α_S2-酪蛋白和κ-酪蛋白各含有两个半胱氨酸。酪蛋白含有大量脯氨酸残基(在α_S1-酪蛋白、α_S2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白上分别为17，10，35，20个脯氨酸残基)，它们在多肽键上分布不均，限制了α-螺旋、β-结构的形成，使酪蛋白有比较开放、松散的结构。

1.α-酪蛋白

α-酪蛋白占牛乳总酪蛋白大约一半，是酪蛋白胶粒胶粒中的基本组成部分，主要是α_S1-酪蛋白和α_S2-酪蛋白两种形体。

α_S1-酪蛋白已经被证明有五种变异体：A、B、C、D、E。α_S1-酪蛋白B-8P有199个氨基酸残基，相对分子质量为23641。微量成分α_S1-酪蛋白9P上41号位置是附加的磷酸化丝氨酸残基。在多肽键上有两个很强的疏水区(残基1～14、残基98～99)和一个高密度电荷极性区(残基45～98)，几乎所有磷酸根集团分布在45～98序列中。脯氨酸分布在疏水区中，使α_S1-酪蛋白被看作开放、松散的多肽链结构。在pH值为7时，α_S1-酪蛋白每摩尔磷酸酯基团可以结合8molCa²⁺。α_S1-酪蛋白在含7mmol/LCa²⁺或2mmol/LNaCl溶液中凝聚沉淀。乳中有一种酪蛋白，其浓度很低，被误定为λ-酪蛋白，其实它是由胞浆酶水解α_S1-酪蛋白而来。

α_S2-酪蛋白

在碱性尿素凝胶电泳中，α_S2-酪蛋白位于α_S1-和β-酪蛋白之间。α_S2-酪蛋白有四种成分：α_S2-酪蛋白-13P、α_S2-酪蛋白-12P、α_S2-酪蛋白-11P和α_S2-酪蛋白-10P，它们是按照磷酸根基团数目命名的(Eigel，et al.1384)。α_S2-有四种变异体：A、B、C、D，由207个氨基酸残基组成，相对分子质量为25230。因为α_S2-酪蛋白有两个磷酸丝氨酸残基簇(Serp-Serp-Serp-Glu-Glu)，而使它对Ca²⁺结合能力增强。这种磷酸丝氨酸结构在α_S2-和β-酪蛋白分子中只有一个。由于两个-SH基团的存在，加热时可形成蛋白质复合体，诱发α_S2-酪蛋白参与分子间的交联。

2.β-酪蛋白

β-酪蛋白由一种主要成分(有七种变异体：A¹、A²、A³、B、C、D、E)和八种微量成分(主要由蛋白酶水解β-酪蛋白质产生)组成。β-酪蛋白-5P(A²)由209个氨基酸残基组成，相对分子质量为23983。

β-酪蛋白由胞浆酶作用生成的多肽是根据其主要结构分类的，即β-酪蛋白-1P(f29～209)(y₁-酪蛋白)，β-酪蛋白(f106～209)(y₂-酪蛋白)和β-酪蛋白(f108～209)(y₃-酪蛋白)。

由胞浆酶作用生成的N-末端片断已经过鉴定并重新命名：β-酪蛋白-1P(f29～105，107)(即蛋白-胨成分“8慢”)，β-酪蛋白-5P(f1～105，107)(即蛋白-胨成分“5快”)和β-酪蛋白-4P(f1～128)(即蛋白-胨成分“8快”)。大量的脯氨酸残基限制了α-螺旋及β-折叠结构的形成。大量成群的疏水基和亲水基非均匀排列，使β-酪蛋白具有典型去垢剂结构：头部带负电荷，尾部是不带电荷的疏水基。

在有Ca²⁺存在和无Ca²⁺存在时，β-酪蛋白都具有一定突出的物化性质：与温度相关的相互结合特性。在无Ca²⁺的情况下，β-酪蛋白在4℃时只有单体存在，而在室温下可以形成大的多聚体(20～24个单体)，这种缔合与去垢剂胶粒的情况相似，内部都有疏水基存在，由包裹着的C-末端区组成，而外部是亲水的N-末端，这样分子间或分子内部的疏水基的相互作用在整个缔合过程中都起着重要的作用，而疏水基间的相互作用是随温度升高而加强的。按照Walstra和Jenness(1984)的观点，去掉20个C-末端残基会破坏β-酪蛋白的缔合能力，这表明在β-酪蛋白的生产中可以利用这一特性。每摩尔β-酪蛋白可以结合5molCa²⁺，这与其磷酸基合量相一致。

以牛乳为基础生产的婴儿配方乳制品是母乳的重要替代物或补充物。然而牛乳和母乳蛋白质在许多方面都存在着较大的差异：相对于乳清蛋白，牛乳酪蛋白含量高得多，而牛乳中的酪蛋白主要是α-酪蛋白，而在母乳中却以β-酪蛋白为主；在牛乳中酪蛋白与乳清蛋白的含量比为80∶20，而母乳的为40∶60，在牛乳清蛋白中含有β-乳球蛋白，而母乳中却没有。

研究表明，牛乳中α-酪蛋白的大量存在造成酪蛋白胶粒颗粒大，在婴儿胃中呈坚硬的凝块，而胃蛋白酶是为胃中的主要消化酶，其作用除水解蛋白质之外，还可以凝固乳中的酪蛋白。胎儿在出生前虽然已经有胃蛋白酶发育，但活性极低。研究者认为由于婴幼儿胃内酶的活性较低，蛋白质的凝块可能会影响其消化性。目前市售的婴儿配方奶粉在蛋白质组成上与母乳有较大的差异，不利于婴幼儿的消化吸收。

发明内容

本发明的目的是提供一种将乳及乳制品中主要成份-α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分分离的方法；

本发明的另一目的是提供由上述方法分离的α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分在生产食品中，尤其是在生产乳制品中的应用。

本发明的目的可以通过以下措施实现：

一种酪蛋白组分分离的方法，依次包括以下工艺步骤：

①将酪蛋白分散于碱性溶液中，离心脱脂、除杂；

②在溶液中加入尿素使其浓度为1.0～4.0mol/L，用酸调节使溶液pH值至3.0～6.0或先用碱调节使溶液pH值至3.0～6.0，离心或过滤使沉淀与清液分离，再向沉淀中加入尿素使其浓度为1.0～4.0mol/L，反应15～90分钟，再调节溶液pH值至3.0～6.0；

③将溶液离心或过滤得到沉淀和上清液；

④将沉淀水洗、干燥得α-酪蛋白组分；

⑤将上清液调pH值至5.5～7.0，再经膜过滤，加水洗涤，浓缩干燥得β-酪蛋白组分。

所述酪蛋白为乳及乳制品的酪蛋白。

所述乳为牛乳、羊乳、马乳；所述乳制品为干酪、干酪素、粗奶酪、奶粉、酸奶。

所述步骤①中先将乳酪蛋白配制成5％浓度的溶液，再用碱调节PH值至7.0～12.0，离心脱脂、除杂。

所述步骤①中的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水

所述步骤②中的酸为盐酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、丙酸、磷酸。

酪蛋白组分的应用，是将α-酪蛋白组分应用在生产成人食品中。

酪蛋白组分的应用，是将α-酪蛋白组分应用在生产成人乳制品、肉制品、饮料及糖果、保健食品中。

α-酪蛋白组分也可用作为乳化剂、稳定剂应用于工业生产。

α-酪蛋白组分也可以应用在皮革、胶粘剂、造纸、印刷行业中。

酪蛋白组分的应用，是将β-酪蛋白组分应用在生产婴幼儿食品中。

酪蛋白组分的应用，是将β-酪蛋白组分应用在生产婴幼儿乳制品中。

β-酪蛋白组分可以在生产营养品、功能食品、日常食品、生活用品中作原料和添加剂。

β-酪蛋白组分也可以在生产中老年、孕妇、运动员、肠胃患者、临床营养支持等特殊人群食品中应用。

β-酪蛋白组分也可以并用于牙膏、化妆品、洗涤剂等生活用品中。

下面通过实验对酪蛋白组分分离效果及各酪蛋白组分进行评价

1、酪蛋白组分分离效果的评价

为了比较原料酪蛋白的蛋白质组成及本发明的分离效果，我们对牛乳酸沉酪蛋白、酪蛋白及酪蛋白分离组分α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分进行了SDS-PAGE电泳、光密度扫描，并用Scion Image软件对扫描后的图像进行处理和分析，结果见图1：

从图中可以看出：酪蛋白中蛋白质组成与牛乳酸沉酪蛋白基本一致；而从酪蛋白中分离得到α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分与前两者有较大的差异。对α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分进行光密度扫描分析，计算出酪蛋白产品中α-酪蛋白和β-酪蛋白的相对百分含量如表1所示：

         表1.由干酪素分离获得的α-酪蛋白和β-酪蛋白的相对百分含量

	α-酪蛋白组分	β-酪蛋白组分	牛乳酸沉酪蛋白
				α-酪蛋白   β-酪蛋白
			相对百分含量(％)蛋白质含量(％)得率(％)		74.284.169.5	75.086.426.5	58.8        41.284.0

*得率＝(产品蛋白质含量/酪蛋白中蛋白质含量)×100％

从表1可以看到，采用本方法分离制取的α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分的纯度较高，而且蛋白质损失较小，可以将大部分的酪蛋白组分分离出来。

2、酪蛋白分离后各组分的体外消化效果评价

为了进一步说明原料酪蛋白的蛋白质组成及本发明分离的α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分在婴儿胃内的凝块情况，我们分别对牛乳酸沉酪蛋白、酪蛋白分离组分α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分进行了酸凝性试验，即婴儿体外消化模拟试验：在乳被摄入两小时后，婴儿胃内的pH值保持在4～5，而成人胃内的PH值则小于2。牛乳酪蛋白在此条件下会产生凝块，而母乳一般不产生此现象。进行酸凝性试验结果显示：在pH4.0的条件下，经肉眼观察，β-酪蛋白组分形成了细小、松软的絮凝物；而α-酪蛋白组分则形成了颗粒较大、紧密且坚硬的沉淀(见图2)。这一结果表明：在婴儿配方奶粉中使用β-酪蛋白组分更适合婴儿胃的发育情况，会带来胃的舒适感；而α-酪蛋白组分不适用于婴儿配方奶粉的生产。

为了更好的比较α-酪蛋白组分、β-酪蛋白组分及牛乳酸沉酪蛋白在婴儿体内的消化情况，本试验在体外模拟了婴儿胃内的环境(37℃，pH4.0)，并测定

各酪蛋白组分的体外消化率。各酪蛋白体外消化率曲线如图3所示：

由图3可一看出：随着酶解时间的延长，蛋白质的体外消化率在不断增加。β-酪蛋白组分水解的初始速度和水解120分钟以后的消化率要好于α-酪蛋白组分和牛乳酸沉酪蛋白，并且牛乳酸沉酪蛋白的消化性要略好于α-酪蛋白组分。即随着样品中α-酪蛋白含量的降低，β-酪蛋白含量的增加，样品的体外消化性得到了提高。这是由于在37℃，pH4.0的条件下，α-酪蛋白组分形成的凝块比β-酪蛋白组分的更紧密坚硬，因此减少了与胃蛋白酶的结合。

3、酪蛋白组分分离后乳化性的评价

为了比较酪蛋白组分分离后其乳化性的改变，我们做了如下实验比较其界面特性：因为酪蛋白为中性两性物质，有着明显的疏水区和亲水区，有较好的乳化性和发泡性，为了比较α-酪蛋白、β-酪蛋白及酪蛋白的乳化情况，分别取10g的α-酪蛋白、β-酪蛋白及酪蛋白，加入碱液，使其完全溶解，升温反应30min，使得转化为相应的钠盐。各量取7ml浓度为0.2mol/Lα-酪蛋白钠盐、β-酪蛋白钠盐和酪蛋白钠盐溶液，向其中均一次性加入7ml油脂，以12000r/min搅拌15min，然后将乳液移至10ml的离心管中，以3500r/min的速度离心20min后，取出离心管，离心管中的乳液从上往下依次将呈现油层、乳液层、水层三个清晰的界面，测出油层体积V_o(ml)，根据乳化能力＝(7-V_o)×100/7计算可得其乳化液稳定性顺序为：α-酪蛋白钠盐＞酪蛋白钠盐＞β-酪蛋白钠盐，由此可见，α-酪蛋白钠盐的乳化性较酪蛋白钠盐的乳化性好，将酪蛋白进行组分分离可使酪蛋白的乳化性提高。

纵上所述，本发明具有以下优点：

1、本发明采用分级分离的方法，将乳及乳制品中酪蛋白主要成份-α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分分离制取，可以更好的发挥其自身的特性，避免其它几种组分带来的缺点，使酪蛋白的使用领域增大，实用性增强，使用量较未分离前的少，并且分离后各组分的物化特性及营养价值较未分离前高，有利于各种乳及乳制品的深加工和资源利用，提高产品的附加值。

2、本发明制取的α-酪蛋白组分和β-酪蛋白组分的纯度高、得率高、颜色好、变性程度小、灰分低；专一性好、靶向型强。

3、本发明的分离工艺操作简单，适用于工业化生产。

附图说明

图1为酪蛋白及酪蛋白各组分的SDS-PAGE电泳图

1-牛乳酸沉酪蛋白    2-酪蛋白    3-α-酪蛋白组分    4-β-酪蛋白组分

图2为酪蛋白组分在pH4.0时的酸凝块图

图3为各酪蛋白体外消化率曲线

具体实施方式

实施例一：将酪蛋白样品，配制成5％浓度的溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值至12.0，搅拌使酪蛋白完全溶解；在溶液中加入尿素使其浓度为1.0mol/L，再用盐酸调节pH值至6.0，离心得到沉淀和上清液；将所得沉淀水洗、喷雾干燥即得α-酪蛋白组分；将上清液调pH至6.0，用膜过滤，水洗，喷雾干燥即得β-酪蛋白组分。

实施例二：将乳酪蛋白配成5％浓度的溶液，分散于pH值为9.0，用乙酸调节pH值至4.0，过滤得到沉淀，加入尿素使其浓度为4.0mol/L，调pH值至4.0，静置，过滤将所得沉淀水洗，脱水干燥即得α-酪蛋白组分；将上清液调pH7.0，用膜过滤，水洗，喷雾干燥得β-酪蛋白组分。

实施例三：将乳酪蛋白样品，配制成5％浓度的溶液，用氢氧化钾调节pH值为7.0，搅拌使酪蛋白至完全溶解；离心、除杂，得到蛋白液；向蛋白液中加入尿素使其浓度为4.0mol/L，用乳酸调节pH值至3.0，静置、离心得到沉淀和上清液。将所得沉淀进行水洗干燥，得到α-酪蛋白组分；将上清液调pH5.5，用膜过滤，水洗，得到沉淀干燥即为β-酪蛋白组分。

实施例四：在加工肉制品时，加入本发明分离的α-酪蛋白(一般以0.5-1.0％的比例加入)，制成含α-酪蛋白的肉制品。该肉制品的硬度降低，持油性提高，富有弹性，改善了其质地和口感。

实施例五：在生产成人奶粉时，加入本发明分离的α-酪蛋白(一般以0.5-1.0％的比例加入)，采用制备奶粉的常规工艺制作成α-酪蛋白配方的奶粉。该配方奶粉较普通的奶粉分散性好、更具有营养价值。

实施例六：在生产成人饮品时，加入本发明分离的α-酪蛋白(一般以0.5-1.0％的比例加入)，采用制备饮品的常规工艺制作成保健饮品。该保健饮品较普通饮品分散性好、营养价值高。

实施例七：在加工婴幼儿奶粉奶粉时，加入本发明制得的β-酪蛋白(一般以0.5-1.0％的比例加入)，采用制备奶粉的常规工艺制作成β-酪蛋白配方的婴幼儿奶粉。β-酪蛋白配方的婴幼儿奶粉较普通的婴幼儿奶粉更具有营养价值，分散性好，消化吸收率高于市售奶粉，有利于婴幼儿食用，其营养更接近母乳。

Claims (10)

1、一种酪蛋白组分分离的方法，依次包括以下工艺步骤：

①将酪蛋白分散于碱性溶液中，离心脱脂、除杂；

②在溶液中加入尿素使其浓度为1.0～4.0mol/L，用酸调节使溶液pH值至3.0～6.0或先用碱调节使溶液pH值至3.0～6.0，离心或过滤使沉淀与清液分离，再向沉淀中加入尿素使其浓度为1.0～4.0mol/L，反应15～90分钟，再调节溶液pH值至3.0～6.0；

③将溶液离心或过滤得到沉淀和上清液；

④将沉淀水洗、干燥得α-酪蛋白组分；

⑤将上清液调pH值至5.5～7.0，再经膜过滤，加水洗涤，浓缩干燥得β-酪蛋白组分。

2、如权利要求1所述的酪蛋白组分分离的方法，其特征在于：所述酪蛋白为乳及乳制品的酪蛋白。

3、如权利要求2所述的酪蛋白组分分离的方法，其特征在于：所述乳为牛乳、羊乳、马乳；所述乳制品为干酪、干酪素、粗奶酪、奶粉、酸奶。

4、如权利要求1所述的酪蛋白组分分离的方法，其特征在于：所述步骤①中先将乳酪蛋白配制成5％浓度的溶液，再用碱调节PH值至7.0～12.0，离心脱脂、除杂。

5、如权利要求1-4所述的酪蛋白组分分离的方法，其特征在于：所述步骤①中的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水。

6、如权利要求1-4所述的酪蛋白组分分离的方法，其特征在于：所述步骤②中的酸为盐酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、丙酸、磷酸。

7、一种酪蛋白组分的应用，是将α-酪蛋白组分应用在生产成人食品中。

8、如权利要求7所述的酪蛋白组分的应用，是将α-酪蛋白组分应用在生产成人乳制品、肉制品、饮料等中。

9、一种酪蛋白组分的应用，是将β-酪蛋白组分应用在生产婴幼儿食品中。

10、如权利要求9所述的酪蛋白组分的应用，是将β-酪蛋白组分应用在生产婴幼儿乳制品中。

Images