CN101824085B - 一种αs-酪蛋白的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种属于酪蛋白分离技术领域的α_s-酪蛋白的分离方法。该方法以牛乳酪蛋白为原料，采用化学分级分离法进行分离，依据κ-酪蛋白为非Ca²⁺敏感性酪蛋白，可溶于含钙离子的溶液中而将κ-酪蛋白与α_s-、β-酪蛋白分离，然后根据β-酪蛋白和α-酪蛋白在不同浓度的尿素溶液中溶解性不同的特点，通过调节溶液中尿素的浓度将二者分离。本方法操作简单易行，只需常规设备即可，用时仅约2～3h，获得α_s-酪蛋白组分回收率高，纯度可达到97.8％，使用本方法进行乳酪蛋白的深加工，获得的αs-酪蛋白可用水解获得相应的乳源生物活性肽，从而使产品中的目标活性肽比例大大提高。

Description

一种αs-酪蛋白的分离方法

技术领域

本发明属于酪蛋白分离技术，具体涉及一种α_s-酪蛋白的分离方法。该方法以牛乳干酪素为原料，采用化学分级分离法将其中主要成分α_s-酪蛋白分离，同时可有效分离β-酪蛋白组分。

背景技术

干酪素(casein，Cn)，又称为酪蛋白，包括α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白、β-酪蛋白(β-Cn)和κ-酪蛋白(κ-Cn)，其中α_s1-酪蛋白和α_s2-酪蛋白又统称为α_s-酪蛋白(α_s-Cn)，α_s-Cn约占到干酪素总量的47％。是乳源生物活性肽的重要来源。α_s-酪蛋白中丰富的磷酸基含量，使其成为制备促进人体钙吸收的酪蛋白磷酸肽(CPP)的最优原料。α_s-酪蛋白产品有良好的起泡性，可用作食品添加剂应用于食品生产，改善食品的性状。高纯度的食品级α_s-酪蛋白产品，经水解后，可用于改善奶酪的风味，生产保健品及一些乳源生物活性肽的原料，现今在α_s-酪蛋白的水解物中已发现了抗菌肽、抗高血压肽、免疫肽、阿片肽及促进矿物组织吸收的生物活性肽。此外，α_s-Cn水解物中也能提供促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等各种功能肽，其中一些功能肽已经进行了商业化生产。现今，上述乳源活性肽的生产原料多是干酪素，制备的肽浓度低，杂质含量高，需要进一步浓缩纯化，费时费力。若直接以α_s-酪蛋白为底物水解制备生物活性肽，将可以有效减少后续富集浓缩流程，提高目标肽的浓度。因此，快速有效的分离制备高纯度食品级α_s-Cn对于乳源活性肽的生产意义重大，有利于干酪素的工业化深加工和资源利用。

酪蛋白各组分分离的方法通常可分为三类，第一，化学沉淀法，根据酪蛋白各组分在不同条件下溶解度不同而分离；第二，色谱法，该技术适于酪蛋白组分的定性和定量分析检测，如离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)或者反相高效液相色谱(Re-HPLC)等技术，但这些技术主要用于科学研究领域，不适于大规模的工业制备，并且分离所用的缓冲液中会加入某些有毒的还原剂，因此色谱法一般不用作食品级原料的分离；第三，低温过滤法，根据酪蛋白中β-酪蛋白(β-Cn)组分的温度依赖性及酪蛋白各组分分子量不同，主要通过微滤法和超滤法进行分离。该方法主要用于β-酪蛋白的分离制备，对低温条件要求严格，由于低温会导致溶液粘度增大而降低流速，从而降低了效率，且所得酪蛋白组分纯度不理想，应用受到限制，已渐被取代。综上所述，化学沉淀法条件温和，操作简单易行，可以大批量制备，该法在酪蛋白组分分离中存在明显优势。发明名称为Methods of ectracting casein fractions from milk andcaseinates and production of novel products，申请号为PCT/GB2002/003098[P]的专利中关于酪蛋白组分α_s-酪蛋白的化学分离方法采用了Ca²⁺-低温沉淀法。即：在碱性pH条件下通过调整钙盐的浓度及低温沉淀等环节，从牛奶或干酪素中分离α_s-酪蛋白和β-酪蛋白，并可同时获得富含κ-酪蛋白的组分，可用以加工CMP。该方法的路线图见图1。另外，PostAE(PostAE，Ebert M，et al，β-casein as a bioactive precursor-processing for purification[J]，The AustralianJournal of Aairy Technology，2009，64：84-88)等人验证并优化该方法，发现β-酪蛋白低温溶解时间越长(大于2h)，αs-和β-酪蛋白分离效果越好。综上所述，该方法分离获得的αs-酪蛋白纯度较低，仅为61％～85％。此法更适于制备高纯度的β-酪蛋白，用时4h以上，要想获得更好的结果，需反复溶解和延长低温保温时间。发明名称为一种酪蛋白组分的分离方法及应用，申请号为200510096244.5的专利申请以乳或干酪素为原料，依据酪蛋白中α-酪蛋白(包括α_s-、κ-酪蛋白)和β-酪蛋白(β-Cn)在不同浓度尿素溶液中溶解性不同而进行分离。具体路线图见图2。该方法步骤较繁琐，经过两次溶解沉淀和水洗，耗时较长，总用时约4h，所得α-酪蛋白得率为69.5％，纯度仅为74.2％，β-酪蛋白得率为26.5％，纯度仅为75.0％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α_s-酪蛋白的分离方法。该方法是以牛乳干酪素为原料，采用化学分级分离法将其中主要成分α_s-酪蛋白组分分离制取，并同时分离制备β-酪蛋白组分。

本方法的原理为：首先依据κ-酪蛋白(κ-Cn)为非Ca²⁺敏感性酪蛋白，可溶于含钙离子的溶液中而将κ-Cn与α_s-、β-Cn分离，然后根据β-酪蛋白(β-Cn)和α-酪蛋白在不同浓度的尿素溶液中溶解性不同的特点，通过调节溶液中尿素的浓度将二者分离。

一种α_s-酪蛋白的分离方法，以牛乳酪蛋白为原料，采用化学分级分离法进行分离，具体操作步骤如下：

(1)配制质量-体积百分比浓度为2.7％的酪蛋白水溶液，并调节pH值至11.0，静置1-5min；

(2)然后向酪蛋白水溶液中加入CaCl₂至Ca²⁺浓度达0.04-0.06mol/L，调节pH值至7.0，离心收集沉淀，沉淀为α_s-Cn和β-Cn的混合物；

(3)将沉淀溶于6.6mol/L尿素水溶液中，然后加水稀释使溶液中尿素的浓度为3.3mol/L，调节pH值至4.6，离心并收集沉淀，沉淀经水洗2-3次，冷冻干后得α_s-酪蛋白；

(4)将步骤(3)离心后的上清液加水稀释，使其尿素浓度至1.6-1.8mol/L，调节pH至4.6，离心收集沉淀，沉淀经水洗2-3次、干燥后得β-酪蛋白。

步骤(3)中所述6.6mol/L尿素水溶液中含有浓度为1.8mol/L的NaCl。

上述方法中调节pH值采用1～5mol/L NaOH溶液和1～5mol/L HCl溶液；

上述步骤(3)中稀释尿素溶液用水为蒸馏水或去离子水；

所述步骤(3)和(4)中沉淀水洗的次数优选为2-3次。

本发明的有益效果：本方法操作简单易行，无需低温，流程中涉及的试剂和药品种类少，只需常规设备即可，用时仅约2～3h，获得α_s-酪蛋白组分回收率高，约占酪蛋白中α-酪蛋白总量的80％以上，纯度可达到97.8％，使用本方法进行乳酪蛋白(干酪素)的深加工，获得的αs-酪蛋白可用水解获得相应的乳源生物活性肽，从而使产品中的目标活性肽比例大大提高。该方法适合工业化生产，有利于牛乳酪蛋白的开发利用，具有很好的应用前景。

将采用本发明方法获得的α_s1-酪蛋白配制成水溶液，通过胰蛋白酶水解，水解液分别经10KD、3KD的超滤膜超滤后，收集滤过液(＜3KD)并冷冻干燥，得α_s-酪蛋白肽粉末(＜3KD)，将该粉末配制成15mg/mL水溶液，该溶液经反向高效液相色谱分析，经样品出峰时间与标准物比对，证明水解物中含有α_s1-酪蛋白f(91-100)活性肽。

附图说明

图1为本发明实施例1的流程图；

图2为本发明方法中各分离步骤中间产物及最终产物的SDS-PAGE电泳图谱。

M：Marker；1：α_s-Cn标准品；2：β-Cn标准品；3：干酪素；4：步骤(2)离心后的上清液；5：步骤(2)收集的沉淀物；6：步骤(3)离心后的上清液；7：步骤(3)离心后的沉淀物。

具体实施方式

实施例1

(1)称取6.75g酪蛋白溶于30℃的水，保持30℃10min，得到质量-体积百分比浓度为2.7％的酪蛋白水溶液，调节pH值至11.0，溶液静置3min；

(2)向酪蛋白水溶液中加入CaCl₂溶液至Ca²⁺浓度达0.05mol/L，调节pH值至7.0，3000rmp离心10min，收集沉淀物；

(3)将沉淀物溶于6.6mol/L尿素水溶液中，且溶液中含1.8mol/L的NaCl，然后加蒸馏水稀释尿素浓度至3.3mol/L，调节pH值至4.6，3000rmp离心10min，分别收集上清液和沉淀，沉淀经水洗2次后，冷冻干燥，得到α_s-酪蛋白；

(4)向步骤(3)中的上清液中加蒸馏水，以使溶液中的尿素浓度至1.7mol/L，调节pH值至4.6，3000rmp离心10min，收集沉淀，沉淀经水洗2次后干燥，得到β-酪蛋白。具体操作流程可见图1。

将上述方法中步骤(2)的上清液和沉淀物、以及步骤(3)的上清液和沉淀物进行蛋白电泳。通过用凝胶成像仪(XRS型凝胶成像仪)对电泳图片进行扫描，然后用Quantity One软件对图像进行处理和分析，电泳结果见图2。

由图2可见，步骤(2)的上清液(即第4道)中含有κ-Cn及少量α_s-Cn和β-Cn，而沉淀物(即第5道)中保留了α_s-Cn和β-Cn，可见该分离步骤有效的去除了κ-Cn。步骤(3)的上清液(即第6道)中可见β-Cn条带，沉淀物(即第7道)中可见α_s-Cn，由此可见，经过步骤(3)使α_s-Cn和β-Cn两种酪蛋白得到分离。

根据下式计算出α_s-Cn等分离蛋白组分的纯度。本方法α_s-酪蛋白得率、纯度分别为38.3％、97.8％。β-酪蛋白得率、纯度分别为14.5％、68.3％。α_s-Cn等分离蛋白组分的得率和纯度计算公式如下：

用凝胶成像仪对电泳胶进行扫描，然后用Quantity One软件对图像进行处理和分析，根据下式计算出α_s-Cn纯度。

实施例2

(1)称取6.75g酪蛋白溶于30℃的水，保持30℃10min，得到质量-体积百分比浓度为2.7％的酪蛋白水溶液，后调节pH值至11.0，溶液静置1min；

(2)向酪蛋白水溶液中加入CaCl₂溶液至Ca²⁺浓度达0.04mol/L，调节pH值至7.0，3000rmp离心10min，收集沉淀物；

(3)将沉淀物溶于6.6mol/L尿素水溶液中，且溶液中含1.8mol/L的NaCl，然后加蒸馏水稀释尿素浓度至3.3mol/L，调节pH值至4.6，3000rmp离心10min，分别收集上清液和沉淀，沉淀经水洗3次后，冷冻干燥，得到α_s-酪蛋白；

(4)向步骤(3)中的上清液中加蒸馏水，以使溶液中的尿素浓度至1.6mol/L，调节pH值至4.6，3000rmp离心10min，收集沉淀，沉淀经水洗2次后干燥，得到β-酪蛋白。具体操作流程可见图1。

将上述方法中步骤(2)的上清液和沉淀物、以及步骤(3)的上清液和沉淀物进行蛋白电泳。通过用凝胶成像仪(XRS型凝胶成像仪)对电泳图片进行扫描，然后用Quantity One软件对图像进行处理和分析。按照实施例1的方法计算α_s-酪蛋白得率和纯度，分别为37.0％、98.1％。β-酪蛋白得率、纯度分别为14.0％、68.3％。

实施例3

(1)称取6.75g酪蛋白溶于30℃的水，保持30℃10min，得到质量-体积百分比浓度为2.7％的酪蛋白水溶液，后调节pH值至11.0，溶液静置4min；

(2)向酪蛋白水溶液中加入CaCl₂溶液至Ca²⁺浓度达0.06mol/L，调节pH值至7.0，3000rmp离心10min，收集沉淀物；

(3)将沉淀物溶于6.6mol/L尿素水溶液中，且溶液中含1.8mol/L的NaCl，然后加蒸馏水稀释尿素浓度至3.3mol/L，调节pH值至4.6，3000rmp离心10min，分别收集上清液和沉淀，沉淀经水洗2次后，冷冻干燥，得到α_s-酪蛋白；

(4)向步骤(3)中的上清液中加蒸馏水，以使溶液中的尿素浓度至1.8mol/L，调节pH值至4.6，3000rmp离心10min，收集沉淀，沉淀经水洗2次后干燥，得到β-酪蛋白。具体操作流程可见图1。

将上述方法中步骤(2)的上清液和沉淀物、以及步骤(3)的上清液和沉淀物进行蛋白电泳。通过用凝胶成像仪(XRS型凝胶成像仪)对电泳图片进行扫描，然后用Quantity One软件对图像进行处理和分析。按照实施例1的方法计算α_s-酪蛋白得率和纯度，分别为39.1％、96.2％。β-酪蛋白得率、纯度分别为14.8％、67.9％。

Claims (2)

1.一种α_S-酪蛋白的分离方法，以牛乳酪蛋白为原料，采用化学分级分离法进行分离，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

(1)配制质量-体积百分比浓度为2.7％的酪蛋白水溶液，并调节pH值至11.0，静置1-5min；

(2)然后向酪蛋白水溶液中加入CaCl₂至Ca²⁺浓度达0.04～0.06mol/L，调节pH值至7.0，离心收集沉淀；

(3)将沉淀溶于6.6mol/L尿素水溶液中，然后加水稀释使溶液中尿素的浓度为3.3mol/L，调节pH值至4.6，离心并收集沉淀，沉淀经水洗2-3次，冷冻干燥后得α_S-酪蛋白；

(4)将步骤(3)离心后的上清液加水稀释，使其尿素浓度至1.6～1.8mol/L，调节pH值至4.6，离心收集沉淀，沉淀经水洗2-3次、干燥后得β-酪蛋白。

2.根据权利要求1所述的α_S-酪蛋白的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述6.6mol/L尿素水溶液中含有浓度为1.8mol/L的NaCl。

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