CN105695542A - 一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法 - Google Patents

一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法 Download PDF

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周鹏
刘大松
李珺珂
王园园
余韵
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Abstract

本发明涉及一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，其是以乳蛋白浓缩物、酪蛋白酸钠、脱脂乳、全脂乳、β-酪蛋白或αs1-酪蛋白等为原料，采用马铃薯酸性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶或牛乳碱性磷酸酶等进行部分脱磷酸化水解处理，然后加热灭除酶活，经超滤浓缩脱盐后，通过喷雾干燥得到部分脱磷酸化牛乳酪蛋白干粉。本发明所采用的技术工艺具有安全性高、特异性强、可控性好等特点，适合工业化生产。制备的部分脱磷酸化牛乳酪蛋白，其磷酸化水平的分布模式接近人乳酪蛋白，而且其更易于被婴幼儿消化，因此可用于婴幼儿配方乳粉的生产，使其蛋白组成在分子水平上更接近人乳蛋白。

Description

一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法
技术领域
本发明涉及一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，属于乳粉加工领域。
背景技术
随着社会的发展，在母乳喂养不足或者母亲体质不好的前提下，越来越多的人会选择用以牛乳蛋白为原料的婴幼儿配方乳粉来代替母乳，但人乳和牛乳蛋白在蛋白组成和分子结构等方面差异较大。牛乳蛋白的主要成分为酪蛋白和乳清蛋白，其比例约为80:20，而人乳蛋白中酪蛋白与乳清蛋白的比例约为40:60。目前，婴幼儿配方乳粉的母乳化研制主要集中在增加牛乳蛋白中乳清蛋白的比例这一方面，而较少考虑到乳蛋白分子结构上的差异。牛乳和人乳酪蛋白分子的氨基酸序列同源性较高(>50％),但其磷酸化水平的分布模式差异较大。牛乳β-酪蛋白被完全磷酸化，含5个磷酸基团；而人乳β-酪蛋白呈6种磷酸化水平的分布模式，分别含0-5个磷酸基团。牛乳αs1-酪蛋白也被完全磷酸化，含8个磷酸基团；而人乳αs1-酪蛋白具有9种磷酸化水平，分别含0-8个磷酸基团。人乳酪蛋白和牛乳酪蛋白磷酸化水平的差异会导致其消化性和消化产物(如磷酸肽)的不同，从而影响婴幼儿的身体发育及其消化系统、免疫系统、神经系统等的形成。因此，降低牛乳酪蛋白的磷酸化程度，可以使其在分子水平上更接近人乳酪蛋白，从而为配方乳粉等婴幼儿食品的生产提供更加优质的乳蛋白配料。
目前，蛋白部分脱磷酸化修饰的方法主要是化学法和酶法，但前者反应条件剧烈，过程不可控，容易生成赖丙氨酸等有毒副产物，且制备过程中产生的废水会造成严重的环境污染；后者条件温和、特异性强、可控性好、无副反应。目前，蛋白部分脱磷酸化修饰的技术瓶颈是磷酸酶作用于蛋白底物的条件依赖性较高。牛乳酪蛋白的存在状态因蛋白原料的不同而变化较大，因而其部分脱磷酸化修饰的条件也差异较大。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，旨在使牛乳酪蛋白在分子水平上更接近人乳酪蛋白，从而推进配方乳粉等婴幼儿食品的研制。该方法工艺条件合理有效，可操作性强，适合工业化生产。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，其是以乳蛋白浓缩物、酪蛋白酸钠、脱脂乳、全脂乳、β-酪蛋白或αs1-酪蛋白等为原料，采用磷酸酶进行部分脱磷酸化水解处理，然后加热灭除酶活，经超滤浓缩脱盐后，通过喷雾干燥得到部分脱磷酸化牛乳酪蛋白干粉。
所述的磷酸酶为马铃薯酸性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶或牛乳碱性磷酸酶等。
本发明科学合理的利用磷酸酶对牛乳酪蛋白原料进行部分脱磷酸化修饰，其特点在于安全性高、特异性强、可控性好。此外，制备的部分脱磷酸化牛乳酪蛋白的磷酸化水平分布模式接近人乳酪蛋白，而且其与人乳酪蛋白一样在婴幼儿胃液中形成疏松状絮凝结构，消化性增加，因此可以用于婴幼儿配方乳粉的研制，具有较好的应用前景和社会经济效益。
附图说明
图1为本发明中实施案例1的酪蛋白酸钠被马铃薯酸性磷酸酶修饰不同时间后的尿素电泳图。
图2为本发明中实施案例1的酪蛋白酸钠被马铃薯酸性磷酸酶修饰0min、8min和5h后，其所含β-酪蛋白的质谱图。
图3为本发明中实施案例1的酪蛋白酸钠被马铃薯酸性磷酸酶修饰0min、8min和5h后，其所含αs1-酪蛋白质谱图。
图4为本发明中实施案例1的酪蛋白酸钠被马铃薯酸性磷酸酶修饰0min、8min和5h后，其在模拟婴幼儿胃液中的激光共聚焦图。
图5为本发明中实施案例1的酪蛋白酸钠被马铃薯酸性磷酸酶修饰0min、8min和5h后，其在模拟婴幼儿胃液和肠液中经连续消化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施案例1
一种利用马铃薯酸性磷酸酶对酪蛋白酸钠进行部分脱磷酸化修饰的方法，其具体工艺步骤如下：
将酪蛋白酸钠用水溶解配制为5mg/mL的蛋白溶液，再将马铃薯酸性磷酸酶溶于pH为6.8的Tris-HCl缓冲液中，配成0.24U/mL的酶溶液。将上述蛋白溶液和酶溶液等体积比例混合后在37℃条件下保持0min、2min、4min、6min、8min、10min、20min、0.5h、1h、2h、3h和5h，所得的水解液在80℃保持10min以灭除酶活，然后采用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤浓缩脱盐，最后在175℃进风温度、75℃出风温度和0.4MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，得不同程度脱磷酸化牛乳酪蛋白干粉。
从图1可以看出，随着反应时间的延长，β-和αs1-酪蛋白因磷酸基团的脱除其条带迁移率逐渐降低，且条带呈多分布模式。基于尿素电泳的结果选择反应0min、8min和5h的样品分别代表未脱磷、部分脱磷和高度脱磷的酪蛋白酸钠，测定其磷酸基团的脱除率分别为0.0％、70.7％和87.8％，还可采用质谱鉴定其所含磷酸基团的个数。从图2和3可以看出，部分脱磷酸化酪蛋白酸钠中β-和αs1-酪蛋白都呈现4种磷酸化水平，分别含1-4和3-6个磷酸基团，相比未脱磷的酪蛋白酸钠，其磷酸化水平的分布模式与人乳的更接近。
从图4可以看出，在模拟婴幼儿胃液中，相比未脱磷的酪蛋白酸钠，部分脱磷的酪蛋白酸钠形成疏松状絮凝结构，这种类似于人乳在婴幼儿胃液中形成的絮凝状物更容易被消化；从图5还可以看出，部分脱磷的酪蛋白酸钠在模拟婴幼儿胃肠液中降解的速度更快；从表1还可以看出，部分脱磷的酪蛋白酸钠经胃肠液连续消化后产生的多肽，其数量更多，且平均分子量更小，进一步说明部分脱磷的酪蛋白酸钠消化性增加。
表1.酪蛋白酸钠被马铃薯酸性磷酸酶修饰0min、8min和5h后，其在模拟婴幼儿胃液(60min)和肠液(60min)中经连续消化后产生的多肽
实施案例2
一种利用小牛肠碱性磷酸酶对酪蛋白酸钠进行部分脱磷酸化修饰的方法，其具体工艺步骤如下：
将酪蛋白酸钠用水溶解配制为5mg/mL的蛋白溶液，并将小牛肠碱性磷酸酶溶解于pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中，以配制浓度为0.8U/mL的酶溶液。将上述蛋白溶液和酶溶液等体积比例混合后在37℃条件下水浴0min、0.5h和7h，然后于80℃高温保持10min灭除酶活。将灭酶水解液用截留分子量为10kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤浓缩并脱去矿物质得到截留浓缩液。最后，将浓缩液在175/75℃下喷雾干燥得到部分脱磷酸化酪蛋白酸钠干粉，其磷酸基团的脱除率分别为0.0％、45.7％和71.5％。
实施案例3
一种利用马铃薯酸性磷酸酶对乳蛋白浓缩物(MPC85)进行部分脱磷酸化修饰的方法，其具体工艺步骤如下：
将MPC85用水溶解配制为5mg/mL的蛋白溶液，并将小牛肠碱性磷酸酶溶解于pH为6.8的Tris-HCl缓冲液中，配制成浓度为0.24U/mL的酶溶液。将上述蛋白溶液和酶溶液等体积比例混合后在37℃条件下水浴0min，8min和5h，然后在80℃高温灭除酶活10min。将灭酶水解液用截留分子量为5kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤浓缩，将浓缩液在175/75℃下喷雾干燥得到脱磷酸化MPC85干粉，其磷酸基团的脱除率分别为0.0％、64.7％和85.8％。
实施案例4
一种利用小牛肠碱性磷酸酶对乳蛋白浓缩物(MPC85)进行部分脱磷酸化修饰的方法，其具体工艺步骤如下：
将MPC85用水溶解配制为5mg/mL的溶液，并将小牛肠碱性磷酸酶溶解于pH为6.5的Tris-HCl缓冲液中，使其酶浓度为1.5U/mL。将上述蛋白溶液与酶溶液等体积比例混合后在37℃条件下水浴0min，1h和7h，然后于80℃高温灭活10min。将灭酶水解液用截留分子量为10kDa的聚醚砜超滤膜进行超滤浓缩以脱去矿物质和水，然后将浓缩液在180/80℃下喷雾干燥得到部分脱磷酸化MPC85干粉，其磷酸基团的脱除率分别为0.0％、42.5％和69.0％。

Claims (3)

1.一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，其特征在于，经过如下具体的工艺步骤：
a.牛乳酪蛋白溶液的配制：取牛乳酪蛋白原料溶于水中，配成0-200mg/mL的蛋白溶液；
b.磷酸酶溶液的配制：取磷酸酶溶于pH为5-10的Tris-HCl缓冲液中，配成0-100U/mL的酶溶液；
c.脱磷酸化反应：将步骤a和b得到的蛋白溶液和酶溶液等体积比例混合，并于20-60℃进行脱磷酸化水解处理0-10h后，得水解液；
d.酶活灭除：将步骤c得到的水解液加热至中心温度达75-100℃，保持5-20min，得灭酶水解液；
e.浓缩与脱盐：将步骤d得到的灭酶水解液采用截留分子量为2-20kDa的超滤膜进行超滤浓缩，并脱除矿物质，得浓缩液；
f.干燥：将步骤e得到的浓缩液在170-190℃进风温度、70-90℃出风温度和0.3-0.5MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，得部分脱磷酸化牛乳酪蛋白干粉。
2.根据权利要求1所述的一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，其特征在于，步骤a所述的牛奶酪蛋白原料包括但不局限于乳蛋白浓缩物、酪蛋白酸钠、脱脂乳、全脂乳、β-酪蛋白或αs1-酪蛋白等。
3.根据权利要求1所述的一种制备部分脱磷酸化牛乳酪蛋白以模拟人乳酪蛋白磷酸化水平的方法，其特征在于，步骤b所述的磷酸酶包括但不局限于马铃薯酸性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶或牛乳碱性磷酸酶等。
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