CN100484954C - 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种基于使用固体基质上的阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法，其中所述的固体基质上的离子交换层析在比相当于所纯化蛋白等电点pI的pH更具碱性的pH、即高于相当于所纯化蛋白等电点pI的pH的条件下进行，不过，在该pH下所述的蛋白仍然可以被吸附。使用根据所述类型药物活性蛋白而调节pH值和离子强度的缓冲溶液以便获得这样的结果。本方法主要用于纯化干扰素和白蛋白。

Description

通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
发明背景
大部分生物医学科学本身基于使用通过提取技术获得的天然来源的药物活性蛋白和通过来自重组DNA的技术获得的合成来源的药物活性蛋白。有意义产物的纯度水平在这两种情况中均是重要的，因为可以通过在有固定量蛋白质存在的情况下严格结合生物作用的可能性来确定对其活性的了解。
在上下文中，药物活性蛋白的纯化方法占重要部分，因为当涉及药物制品中包含的活性成分或赋形剂时，所制备的蛋白质的纯度具有重要意义。在治疗过程中导致毒性作用和/或产生不良作用的可能性实际上促使负责基于蛋白质的药品的销售的注册与授权的管理机构引入从未有过的更为严格的法规以便确保在销售药品中包含的蛋白质来源的活性成分的质量和生产一致性。
从上述描述中显然可以看出蛋白质纯化方法的重要性，其中存在的主要困难在于药物活性蛋白始终与许多其它蛋白质一起存在于复合的混合物中。
这一事实在天然来源用于从动物或植物器官中提取类似于血液这样的药物活性蛋白和使用重组DNA技术这两种情况中均是存在的，因为所述的蛋白质表现出与它们来源无关的两者之间相似的化学-物理特性。
因此，从上述描述中可以得出：就纯化药物活性蛋白而言，必须从混有具相似特性且通常大量超过所需蛋白量的其它蛋白质中分离出具有高纯度的蛋白质。
工作方向是明确的且通常使用几个纯化步骤以便获得所需的纯度水平。在这种方式中纯化方法变得极为复杂且成功进行蛋白质的工业化生产主要要与纯化方法的效率结合，因为后者充分决定着生产成本。
许多技术用于纯化蛋白质，例如：在含水和有机溶剂中或使用caotropic agents的选择性沉淀；通过过滤和/或透析的分离；使用适宜抗体的免疫沉淀法；层析法。在这些方法中，后者在近年来已经取得了更大的进展，主要是因为这些方法可以获得所需的纯度，正如Regnier F.E.在J.Chromatogr.418，115-143(1987)中所报导的。
科学文献中引用了许多技术且可以基于用于分离蛋白质的作用机理对其进行分类，例如：基于分子量的分离；在极性基质、也称作常态固定相上的吸附；在非极性基质、也称作反固定相上的吸附；通过使用与惰性基质，诸如铜、锌、铁和铂这样的重金属，类似于亮蓝这样的化学染料，类似于蛋白质A和蛋白质G这样的蛋白质，类似于多糖和葡糖胺聚糖这样的碳水化合物结合的配体进行的选择性亲和吸附；使用结合在惰性基质上的特异性抗体进行的免疫亲和吸附；使用结合在惰性基质上的带静电荷的配体进行的离子相互作用的吸附。
将选择性、即选择性识别所需蛋白质的能力、成本和在工业化水平上使用的可能性用作评价不同层析技术性能的参数。
基于这些参数，将免疫亲和层析看作可确保有更大的选择性，不过，它表现出类似于使用成本高、存在使抗体变性的风险和与纯化产物最终安全性相关的风险这样的缺点，这是因为所述的抗体来源于动物。
将使用离子相互作用、也称作离子交换层析的层析法看作用于保持蛋白质药物活性且易于以使用低成本控制的工业化方式进行的几乎没有风险性的技术，不过，这项技术表现出选择性较差的缺点。
因此，极为有利的是找到实施离子交换层析的条件，这些条件可增加其选择性以便从获得产物的纯度的观点来看使它与其它技术相差无几。
通常使用各种大小的柱进行离子交换层析，这些柱上填充了含有持久或在特定条件下带静电荷的化学基团的固体基质。
上离子交换柱的化合物通过库仑引力/斥力与结合基质的电荷发生相互作用。混合物中含有的不同化合物自身能够与起所带电荷量的作用的固定相结合且结果是它们或多或少被保留，从而确保它们在柱口分离。
当基质的电荷是负性时，所述的层析法称作阳离子交换层析，因为阳离子被吸附，而当基质的电荷是正性时，所述的层析法称作阴离子交换层析。
蛋白质是具有高于10,000道尔顿的高分子量的由氨基酸的非均相聚合物构成的化合物；某些氨基酸在其侧链上带有可以在带负电的酸性氨基酸或带正电的碱性氨基酸溶液的pH作用下离子化的官能基且由此所有的蛋白质均带有大量的负电荷和正电荷。蛋白质的等电点pI是蛋白质呈中性时的pH，因为提供的负电荷等于提供的正电荷；进入pI下的电场的蛋白质不被电场中任意的极性端所吸引。
负电荷的数量在高于pI的pH下增加且蛋白质获得了净负电荷，而相反的情况在低于pI的pH下发生且蛋白质获得了净正电荷。每种蛋白质均具有其自身的特征pI，它可使该蛋白质与其它蛋白质区别开来且某些蛋白质在等电点下倾向于变得不溶。
当蛋白质在低于pI的pH下的溶液中时，它带有净正电荷且由此可以与带负电荷的基质发生相互作用且可以进行阳离子交换层析，而该蛋白质在高于其pI的pH下可以进行阴离子交换层析，正如RegnierF.E.在Science，238，319-323(1987)和Yamamoto S.等在Chromatographic Science Series，43，(1988)，Marcel Dekker，Inc.Publisher，New York中所报导的。
相反，我们已经令人意外地且基于本发明目的本身发现能够找到高于蛋白质相应pI的pH值范围，在该pH下所述蛋白质仍然能够被吸附在阳离子交换层析的基质上，使得仍然能够进行阳离子交换层析。这类情况特别重要，因为在这些条件下获得了对蛋白质之间的高选择性，这也是由于蛋白质之间pI的极小的差异足以获得显著的分离的结果，从而得到高效率的纯化。
后一方面在重组蛋白的纯化方法中特别重要，其中所需产物中通常附带有相关的杂质、即由极小结构变化的产物构成的杂质，例如象不同的氧化态、乙酰化、缺乏酰胺官能基等。通过免疫亲和层析也极难清除这种类型的杂质，因为在大多数情况下抗体不能区别它们。
可以解释所发现的现象的机理以其自身的事实为基础，即电荷沿蛋白质的外表面的分布不均匀，也使得当pH略高于pI且蛋白质带有总的净负电荷时，分子中仍然存在一定数量的(than)可以与带负电的固定相发生相互作用的正电荷。
为了使这一机理有效，重要的是过量的负电荷不能增加得过多，否则，由负电荷产生的电场会高至出现阻止蛋白质整体与带负电荷的层析基质发生相互作用的情况。
此外，必要的是要适当控制用作洗脱剂的溶液的离子强度，因为高离子强度具有屏蔽蛋白质的作用，从而防止其与固定相发生相互作用。
Lampson G.P.等在Anal.Biochem.，11，374-377(1965)中确切报导了下列情况：在类似于人γ球蛋白、核糖核酸酶、血红蛋白、δ胰凝乳蛋白酶、珠蛋白和溶菌酶这样的蛋白质中，使pH发生小的变化而通过给予0.1M磷酸盐溶液得到的保持极高离子强度这样的阳离子交换层析中的洗脱步骤发生在低于pI大约0.4个单位(unite)的pH下。
就本发明者的知识而言，本发明自身所基于的上述机理从未被用于纯化蛋白质的有效方法。
由Kontturi A.K.等在Acta Chem.Scand.，50(2)，102-106，(1996)中所述使用蛋白质等电点的差异以使纯化方法最优化的可能性指的是离子交换层析的常规应用，其中始终在低于等电点的pH下进行阳离子交换层析，而在高于等电点的pH下进行阴离子交换层析。本专利申请中所述的方法恰好相反，使得阳离子交换层析在高于蛋白质等电点的pH下进行。
本专利申请中所述的方法可以认为是所报导的实例中表现出的一般性质，其中已经证实如何将其成功地用于天然来源的蛋白质和用于来自重组DNA的蛋白质。蛋白质与蛋白质之间的差异在用于纯化有意义的蛋白质的pH、高于pI的范围内。实际上，例如，正如下列实施例中所示，就干扰素蛋白质而言，这类范围在约0.2个pH单位；而就白蛋白而言，它在约一个pH单位。
本发明用于纯化如Thatcher D.和Panayotatos N.在MethodsEnzymol.119，166-177，(1986)中所报导的等电点为5.9的重组α干扰素(γIFNα)的方法在实施例中报导且表明了如何能够并有利于在pH为6.1下的阳离子交换中纯化它。此外，该实施例表示了如RylattD.B.等在J.Chromatogr.，865，145-153，(1999)中所报导的pI为4.9的人血清白蛋白且证明了如何能够和有利于在pH为6.0下的阳离子交换中纯化它。
如果与涉及纯化α干扰素和人血清白蛋白的科学出版物和/或专利中所述的方法、通常需要三次或多次连续处理、导致高工业化成本和产量降低的事实的方法所致结果相比，本发明主题的方法的优点是极为显著的。
Thatcher D.和Panayotatos N.在Methods Enzymol.119，166-177，(1986)中描述了通过下列5种处理方法纯化人重组α干扰素γIFN-α2的方法：a)阳离子交换层析；b)阴离子交换层析；c)重金属的亲和层析；d)使用饱和硫酸铵溶液处理；e)分子排阻层析。
欧洲专利EP 0108585中描述了依次使用三种类型的层析法纯化干扰素：a)免疫亲和层析；b)阳离子交换层析；c)分子排阻层析。
美国专利US 4765903在于扰素的纯化方面描述了依次使用四种类型的层析法：a)使用单克隆抗体的免疫亲和层析；b)可逆相；c)阳离子交换层析；d)分子排阻层析。
欧洲专利EP 0679718中描述了预计采用下列四种层析步骤的α干扰素的生产方法：a)金属-螯合；b)阳离子交换；c)阴离子交换；d)凝胶过滤。
其它出版物和专利中描述了纯化干扰素蛋白质必不可少的三个或多个处理步骤，例如美国专利US 4732683、国际专利申请WO 8604067和来自Khan F.R.和Rai V.R.在Bioprocess Technol.，7，161-169，(1990)中公开的内容。
引用的实例包括报导有关干扰素的一般纯化和α干扰素的特别纯化的大部分相关主题。它们表明纯化后者是如何困难且需要许多纯化步骤。此外，必须特别强调如何通过使用鼠源的单克隆抗体进行免疫亲和层析而获得高纯化水平。然而，目的在于生产人用药的活性成分的工业化生产方法中这类层析技术的存在因鼠源的病毒而可导致出现病毒污染风险的可能，这是因为从工业化观点来看在终产物中可能存在来源于鼠免疫球蛋白的免疫原性片段和难以验证的层析基质。
此外，从上述简单的解释性实例中可以看出，阳离子交换层析广泛使用，但从未作为独特的分离技术，因为其性能在增加纯度水平方面受到限制。
来自Babu K.R.等的Appl.Microbiol.Biotechnol.，53(6)，655-660，(2000)和Bouyon R.等的Biotecnologia Aplicada，14，189-192，(1997)的公开出版物中描述了通过使用盐水梯度的离子交换层析以一步方式纯化α干扰素的方法。然而，在获得足够纯的产物的两种情况中，作者必须仅分离某些层析级分，其中包含α干扰素，从而获得极低的产率，甚至为7.5％的最低值。此外，所述使用盐水梯度层析的纯化方法并不易于在工业化水平上应用。
就通过对人血清进行分级分离或通过重组DNA技术获得的白蛋白制品作为原料的人白蛋白的情况而言，还描述了许多层析纯化的技术，仍然存在工业化水平上复杂和难以转化的技术，这些技术证实了有效纯化天然和重组来源的人白蛋白中存在多少难题。
美国专利US 6150504和US 5521287中描述了通过离子交换层析和疏水作用纯化白蛋白的方法。美国专利US 6034221中描述的纯化流程预计可通过两个层析步骤、一种超滤工艺和两个其它层析纯化步骤来进行白蛋白的纯化。
使用应用在流化床中进行的阴离子交换层析或与类似于或适当制备的类似于改性锆颗粒或全氟代烃乳剂这样商购基质发生相互作用的亲和层析对白蛋白进行纯化的较少用的方法描述在美国专利US 5962649和公开出版物Sumi A.等Bioseparation，8 (1-5)，195-200，(1999)、Mullick A.和Flickinger M.C.，Biotechnol.Bioeng.，65(3)，282-290，(1999)和Mc Creath G.E.等，J.Chromatogr.，597(1-2)，189-196，(1992)中。YangL.等在Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao，16(1)，74-77，(2000)中还描述了使用重金属纯化白蛋白的最新技术，结合类似于Cibacron Blue F3G这样的染料分子的基质上的亲和技术描述在Compagnini A.等的J.Chromatogr.，A 736(1-2)，115，(1996)中。
所有这些技术均以不同方式证实了实施复杂性和高成本的难题，从而使得方便而有效的工业化可行性和在经济上有利的药物活性蛋白的各个新型纯化方法的难题没有得到解决。
下述的本发明通过提供一种用于方便工业化开发和具有经济上明显有利的低成本的药物活性蛋白的纯化方法而满足了这些重要需求。
发明的详细描述
本发明涉及一种基于使用固体基质上的阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法，该方法在上样后以使用适宜pH和离子强度的洗脱剂调节的柱的特定条件下进行，使得在该柱上均匀地存在更具碱性的pH、即高于药物活性蛋白的相应等电点pI的pH，不过，在该pH下所述的蛋白仍然可以被吸附在用于阳离子交换层析的固体基质上。在该调节阶段后，通过增加洗脱剂的离子强度和/或pH而从柱上洗脱下药物活性蛋白。
本发明的有效性能需要所用层析基质、层析洗脱剂中所用的高于(higher then then)pI的pH值和离子强度的正确组合中的各个因素，因为一旦确定了层析基质，则可以通过使pH和/或离子强度发生通常为十分之一pH单位的有限改变和/或几百μS的离子强度的改变而获得有效纯化。
可以使用通常用作阳离子交换层析的固定相的所有官能化固体基质，然而，当所纯化蛋白质的pI低于6时，特别优选称作强阳离子交交换的固定相；尽管可以使用进行强和弱的离子交换的固定相，但不排除具有高于6的pI的蛋白质。所述的固定相可以具有通过质子或碱式盐形式的磺酸或羧酸基官能化的硅或聚合物基质。可以成功地使用例如
Figure C02140217D00101
 S(Pharmacia Biotech)、
Figure C02140217D00102
 SP-Fast Flow、
Figure C02140217D00103
 SP-High Performance、SP 
Figure C02140217D00104
 XL(PharmaciaBiotech)、 S(Merck，Darmstadt)、
Figure C02140217D00106
 S(PallCorporate)、CM 
Figure C02140217D00107
 FF(Pharmacia Biotech)、
Figure C02140217D00108
Figure C02140217D00109
 AG(Bio-Rad)、
Figure C02140217D001010
 S(PerSeptive Biosystems)、 (Tosohass)这样商购的固定相。
可以有效实施本发明的pH值范围很宽，这取决于需要纯化的药物活性蛋白的等电点；且该范围包括2-11、优选4-8.5。
高于用于本发明中所述方法的pI的pH值范围的扩展可以从相当于药物活性蛋白pI的pH值到超过所述pI 1个pH单位的范围内改变，从而表明蛋白质与蛋白质之间存在显著差异。
例如，已经发现就重组α2b干扰素(rIFNα-2b)而言，能够获得在超过其5.9的pI 0.2个pH单位的情况下使蛋白质在阳离子交换基质上吸附的结果且由此能够通过阳离子交换层析对其进行纯化，同时已经发现就人血清白蛋白而言，可以在超过其pI一个pH单位时使所述蛋白质保持吸附。
用作有效利用的洗脱剂水溶液的盐浓度的范围取决于所纯化的药物活性蛋白的种类且已经发现它包括在1mM-100mM的值、优选1mM-30mM内。
例如，就纯化重组α2b干扰素(rIFNα-2b)而言，盐水溶液的浓度为1mM-30mM、优选5-15mM。
尽管并不是绝对必要，但是对用于本发明层析目的的洗脱剂具有固定和稳定的pH值的需求使得使用含有5-100mM、优选10-20mM缓冲的混合物的适当缓冲的水溶液是极为有用的。可以有利地使用具有pH为2-11范围的缓冲能力的每种化学物质或混合物，因为可以使用的洗脱剂的pH值在2-11的范围。
可以将许多缓冲水溶液有利地用于实施本发明，包括那些含有下列物质的缓冲液：甘氨酸和氯化钠、马来酸和氢氧化钠、丙二酸和氢氧化钠、乳酸和氢氧化钠、甲酸和氢氧化钠或氢氧化锂、琥珀酸和氢氧化钠、N-甲基哌嗪和盐酸、哌嗪和盐酸或乙酸、L-组氨酸(hystidine)和盐酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸和氢氧化钠或氢氧化锂、N-甲基二乙醇胺和硫酸、N-甲基二乙醇胺和盐酸或乙酸、吡啶和甲酸、柠檬酸二钠和氢氧化钠、邻苯二甲酸一钾和盐酸、邻苯二甲酸一钾和氢氧化钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠、N-(二羟乙基)甘氨酸和氢氧化钠、巴比妥钠和盐酸、硼酸钠和盐酸、硼酸钠和氢氧化钠、1，3-二氨基丙烷和盐酸、柠檬酸和磷酸氢二钠、乙酸钠和乙酸、咪唑和盐酸、三乙醇胺和盐酸或乙酸、三(羟甲基氨基甲烷)和盐酸、碳酸钠和酸式碳酸钠、乙醇胺和乙酸、哌啶和盐酸、三甲胺和甲酸、吡啶和乙酸、三甲胺和乙酸、三甲胺和盐酸、氢氧化铵和甲酸、氢氧化铵和乙酸、三甲胺和碳酸钠、碳酸铵和氢氧化铵。
特别就纯化重组α2b干扰素(rIFNα-2b)而言，可以使用在5.9-6.1的pH下显示出缓冲能力的所有缓冲溶液，优选在5.9-6.1的pH下含有磷酸二氢钾和磷酸氢二钠、邻苯二甲酸一钾和氢氧化钠、柠檬酸二钠和氢氧化钠、柠檬酸和磷酸氢二钠、咪唑和盐酸的缓冲溶液；而就纯化人血清白蛋白而言，可以使用含有在4.9-6.0的pH下显示出缓冲能力的相同化学化合物混合物的缓冲溶液。
用作洗脱剂的缓冲溶液除含有用于缓冲pH的化学物质外还可以含有用于改变所述溶液离子强度的化学物质。为了这一目的，可以有利地使用可以与钠、钾、铵、伯胺、仲胺、叔胺或芳香胺类成盐的诸如羧酸盐、烷基磺酸盐、邻苯二甲酸盐这样的有机盐或诸如硫酸盐、氯化物、磷酸盐这样的无机盐。
可以以包括1mM-100mM、优选1mM-30mM值的范围内的浓度有利地使用这些化合物。
例如，就纯化重组α2b干扰素(rIFNα-2b)而言，这些化合物的浓度可以在1mM-30mM、优选2mM-20mM之间改变。
在洗脱药物活性蛋白之前，可以通过使用具有适宜pH和离子强度的洗脱剂进行一次或多次洗涤以使得柱的pH始终保持高于pI来提高纯化效率。
例如，就pI为4.9的人血清白蛋白而言，可以使用包括5.5-5.8范围pH下的缓冲溶液进行洗涤，而就pI为5.9的重组α2b干扰素(rIFNα-2b)而言，可以使用包括6.0-6.1范围pH下的缓冲溶液进行洗涤。
在这些洗涤过程中通过的洗脱剂的量是可变的，一般占5-100个柱体积(CV)。
例如，就人血清白蛋白而言，所用的洗涤体积占20-40CV，而就重组α2b干扰素(rIFNα-2b)而言，洗涤体积占10-80CV。
可以上柱的所纯化的产物的量取决于所用的层析基质；且尽管通常使用较低的量、包括5-20mg/ml，但是对于每毫升固定相而言最高可达100毫克总蛋白。
洗脱剂可以以与固定相相容的线性速率通过柱，直到最大值等于10cm/分钟为止。
可以将上述解释的纯化方法用于所有的药物活性蛋白；在实施本发明的过程中优选对特别有关干扰素α、β、δ、γ、ω、σ这样的干扰素蛋白质、对来自白细胞的天然α干扰素、对重组α2b和公认干扰素进行纯化并纯化特别有关天然和重组来源的人白蛋白的白蛋白。
上述纯化方法的范围达到了以工业化和经济方式将药物活性蛋白纯化至一定纯度的水平，该纯度诸如可以直接用于生产含有所述药物活性蛋白的药物制品。
在本发明范围内优选的药物制品特别是那些含有干扰素、更优选重组α2b干扰素(rIFNα-2b)和白蛋白、更优选天然和重组来源的人白蛋白的药物制品。
下文报导了一些本发明主题方法的解释性实施例，它们仅使得本发明更为清楚，但不必将它们看作以任何方式来限定本发明自身。
实施例1
重组α2b干扰素(rIFNα-2b)的生产
已经用5ng的pET9a-IFNα-2b质粒将大肠埃希氏杆菌BL21DE3菌株的部分细胞转染入pET9a质粒(Novagen)，其中所述的pET9a-IFNα-2b质粒通过克隆再生人IFNα-2b基因序列的合成基因获得、适当修饰以便使所述序列适合于更频繁出现在大肠埃希氏杆菌中的密码子。
由如上所示修饰的大肠埃希氏杆菌细胞表达的蛋白质序列与Academic Press Inc.出版的Methods in Enzymology，Interferons，part C，editor Pestka S.，119，3-14，(1986)中所报导的相同。
在37℃下将通过pET9a-IFNα-2b质粒转染的大肠埃希氏杆菌BL21DE3菌株置于烧瓶内合适的培养基中培养足够的时间以便达到600nm下等于0.6-0.8的光密度值、通常需要7-9小时，其中所述的培养基例如是含有12g/l植物蛋白胨(Phyto peptoton，BBL)、24g/l酵母提取物(Yeast extract，DIFCO)、4g/l甘油(BDH)和新霉素的溶液。然后按照以1-100稀释的方式使用如此获得的培养物以便将其接种入51的发酵罐，其中包含与上述烧瓶中相同的培养基。在37℃下将该培养物保持14小时，同时给其中每分钟通入相应于培养物的体积而言等于一个体积的空气。
在结束培养时通过以6000转/分钟(rpm)离心来收集细菌细胞，将它们悬浮于在含有用量不高于6ml/克湿重所离心的细菌的1mM二硫苏糖醇(DTT)的合适的水溶液中。通过固结和所述的技术、例如通过超声或通过液压破碎而使细菌混悬液进行细胞裂解。
通过离心回收所得的混悬液并将固体部分悬浮于含有1mM DTT的50ml盐水溶液中且再次离心。
收集固体成分即包含体组分(constituent the included bodies)并通过在室温下剧烈搅拌而将其混悬入含有6M氯化胍、pH8的50mMTris-HCl和0.1mM EDTA的450ml溶液中。将该混悬液离心并按照1-100至1-200的比例将上清液稀释入含有pH8的50mM Tris-HCl和pH8的0.1mM EDTA的盐水溶液中以便适合于蛋白质的复性。用于复性的溶液可以含有：氨基酸，诸如甘氨酸或精氨酸；含有通过二硫键形成的氧化和还原形式的硫化物的化合物混合物，诸如谷胱甘肽、乙醇胺、半胱氨酸。复性在4℃下的剧烈搅拌的溶液中进行大约72小时，然后将该溶液过滤并通过对由40mM、pH8的Tris-HCl制备的缓冲液进行渗滤的方法浓缩至5-10倍的终浓集因数。该溶液的终浓度通常为0.4-1.0mg/ml。
实施例2
重组α2b干扰素(rIFNα-2b)的纯化
向来源于实施例1的含有rIFNα-2b的蛋白质混合物中添加1M乙酸钠溶液至终浓度为20mM，并用乙酸将该混合物的pH调节至5.5。将如此获得的溶液上含有商购的层析基质
Figure C02140217D00141
 S(由具有交联到聚醚砜膜上的磺酸基团的亲水性聚合物组成)(Pall Corporate)的强阳离子交换柱。在上蛋白质溶液前，通过用量等于20个柱体积(CV)的pH5.5下的20mM乙酸钠溶液调节阳离子交换柱。
然后以每毫升固定相不超过10mg蛋白质数值、优选6-8mg/ml这样的用量使蛋白质溶液上柱。
在上样后，通过总浓度为5-15mM磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合物制备的pH6.1的盐水溶液对与固定相结合的产物进行第一次洗涤循环。通过使导电率不超过约1800μS而都能使该溶液的最佳浓度固定。使用总量占5-60CV、优选25-35CV的溶液。
接着使用加入了一定量氯化钾而使终浓度不超过3mM、优选2mM的相同的第一次循环洗涤溶液来进行第二次洗涤循环；使用总量占10-100CV、优选30-60CV的溶液。
在洗涤循环后，通过使用类似于第一次洗涤循环的溶液，其含有浓度不低于10mM、优选浓度为15-25mM的最终用量氯化钾，来进行洗脱步骤。将总量占15-40CV、优选20-30CV的溶液用于洗脱。
使全部溶液和所上的样品以0.1-1cm/分钟、优选0.4-0.7cm/分钟的线性速率通过柱。
在这些条件下，从该柱上洗脱下纯度高于98％的rIFNα-2b；而起始溶液的纯度约为40％，回收的所需产物的产率高于80％。
层析纯化前后的层析分布图如附图1a和1b中所示。
附图1a表示纯化前干扰素溶液的层析分布，而附图1b表示纯化后的层析分布。
已经通过液相层析HP1090、通过使用Vydac C18柱和设定在214nm下的UV检测器实施了层析流程。已经通过使用由两种洗脱剂制成的混合物以1ml/分钟的流速进行了洗脱，所述的两种洗脱剂是由700ml水、298ml乙腈和2ml三氟乙酸制成的洗脱剂A和由198ml水、800ml乙腈和2ml三氟乙酸制成的洗脱剂B。在洗脱过程中按照下表混合两种洗脱剂。
 
时间(分钟) ％A ％B
015203040425060 727267635740402872 282833374360607228
实施例3
按照与实施例2所述相同、通过使用由邻苯二甲酸一钾和氢氧化钠制成的缓冲溶液实施该方法。
实施例4
按照与实施例2所述相同、通过使用由柠檬酸二钠和氢氧化钠制成的缓冲溶液实施该方法。
实施例5
按照与实施例2所述相同、通过使用由柠檬酸和磷酸氢二钠制成的缓冲溶液实施该方法。
实施例6
按照与实施例2所述相同、通过使用由咪唑和盐酸制成的缓冲溶液实施该方法。
实施例7
人血清白蛋白的纯化
人血清白蛋白(HSA)商购自Sigma(2000年的目录号A1653)。该白蛋白制品标称为99.6％，但如果将类似于白蛋白的产品看作杂质的话，那么RP-HPLC分析显示实际为88％。在pH3下用20mM柠檬酸溶液将HSA溶液制成终浓度等于1mg/ml，并使其上含有商购的层析基质
Figure C02140217D00161
S(Pall Corporate)的强阳离子交换柱。在上柱前用pH3.0的用量等于20个柱体积(CV)的20mM柠檬酸溶液调节该阳离子交换柱。
上样溶液的用量为每毫升固定相不超过10mg上样蛋白质、优选6-8mg/ml的用量。
上样后，使与固定相结合的产物进行下列洗涤循环：
1.洗涤循环-40CV的20mM的乙酸钠溶液、pH5.5；
2.洗涤循环-30CV的20mM的乙酸钠溶液、pH5.8。
通过浓度为5-100mM的磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的混合物制备的pH6.0的盐水溶液从柱上洗脱下所需的产物，其中所述混合物的浓度取决于该混合物的组成。然而，必须使该溶液的导电率不超过140μS。使用总量占25-35CV的溶液。
使全部溶液和所上的样品以0.1-1cm/分钟、优选0.4-0.7cm/分钟的线性速率通过柱。
在这些条件下，从该柱上洗脱下纯度高于99％的HSA，其中回收的所需产物的产率高于56％。
附图2a和2b表示纯化前后HSA的HPLC层析分布。使用与用于附图1a和1b相同的仪器进行该分析，其中使用两种洗脱剂的混合物，所述的两种洗脱剂是由950ml的0.1％三氟乙酸和50ml乙腈制成的洗脱剂A和由950ml乙腈和50ml的0.1％三氟乙酸制成的洗脱剂B。通过使用洗脱剂A和B的混合物以线性梯度1ml/分钟的流速进行洗脱，其中洗脱剂A和B混合物的线性梯度从20％的B开始并在20分钟后达到60％的B。

Claims (5)

1.一种用于纯化重组α-2b干扰素的方法，该方法由下列步骤组成：
-将溶解于1M乙酸钠溶液中的通过大肠杆菌发酵获得的重组α-2b干扰素上柱，所述乙酸钠溶液用乙酸使pH达到5.5，所述柱填充了用20mM乙酸钠溶液将pH调节为5.5的强阳离子交换树脂，使得每毫升树脂中含有6-8mg的蛋白质；
-对该柱进行两次洗涤循环，第一次使用浓度为5-15mM、pH为6.1的缓冲溶液，第二次使用添加有2mM氯化钾的相同缓冲溶液，和
-使用含有浓度为15-25mM氯化钾的5-15mM浓度、pH6.1的缓冲溶液从该柱上洗脱下纯的重组α-2b干扰素。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述树脂是强阳离子交换树脂，由具有交联到聚醚砜膜上的磺酸基团的亲水性聚合物构成，并且所述缓冲溶液选自下列的缓冲液混合物：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠、邻苯二甲酸一钾和氢氧化钠、柠檬酸二钠和氢氧化钠、柠檬酸和磷酸氢二钠、咪唑和盐酸。
3.纯化α干扰素蛋白的方法，该方法由下列步骤组成：在比相当于所纯化蛋白质等电点pI的pH更具碱性的pH下的固体基质上进行阳离子交换层析，所述干扰素蛋白在该pH下仍然保持被吸附；并且通过提高洗脱剂的离子强度和/或pH来洗脱蛋白质以获得干扰素蛋白的纯化。
4.根据权利要求3的方法，其中所述洗脱剂含有5-100mM选自下列的缓冲液混合物：磷酸二氢钾和磷酸氢二钠、邻苯二甲酸一钾和氢氧化钠、柠檬酸二钠和氢氧化钠、柠檬酸和磷酸氢二钠、咪唑和盐酸。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于所述洗脱剂含有1-100mM的适于改变该溶液离子强度的有机或无机盐。
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