RS51512B - Postupak za prečišćavanje interferonskih proteina pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije - Google Patents

Abstract

Postupak prečišćavanja interferon proteina, naznačen time, što se sastoji od izvođenja katjonske izmenjivačke hromatografije na čvrstom nosaču na baznijem pH od pH koji odgovara izoelektričnoj tačci, pI, proteina koji se prečišćavaju, pH na kome su pomenuti proteini i dalje absorbovani i eluiranja pomenutih proteina povećavanjem jonske jačine i/ili pH vodenog rastvora pufera.Prijava sadrži još 7 patentnih zahteva.

Description

Veliki đeo biomedicinskih nauka zasniva se na upotrebi farmakološki aktivnih proteina i prirodnog porekla, dobijenih ekstrakcionim tehnikama i sintetičkog porekla, dobijenih pomoću tehnika iz rekobinantnih DNA. Nivo čistoće ovih interesantnih proizvoda je važan u oba slučaja, jer je razumevanje njihove aktivnosti određeno mogućnošću biološkog efekta striktnog vezivanja u prisustvu fiksne količine proteina.

U ovom kontekstu postupak prečišćavanja farmakološki aktivnih proteina je postao važan deo, jer čistoća proizvedenog proteina predpostavlja se da ima značajni doprinos kada su uključeni aktivni principi ili ekscipijenti u medicinskim preparatima. Mogućnost izazivanja toksičnih efekata i/ili izazivanja neželjenih efekata u toku lečenja je ustvari podstakla organe odgovorne za registraciju i dozvole za tržišne lekove zasnovane na proteinima, da uvedu čvršća pravila u cilju određivanja kvaliteta i proizvodne stabilnosti aktivnih principa proteinskog porekla koji se nalaze u tržišnim lekovima.

Prema gore navedenom, jasno se javlja važnost postupka prečišćavanja proteina u kome je glavna teškoća u činjenici da farmakološki aktivni proteini su uvek u složenim smešama zajedno sa mnogo drugih proteina.

Ova činjenica je istinita, i u slučaju prirodnih izvora koji se koriste za ekstrahovanje farmakološki aktivnih proteina, kao na primer krvi, ekstrakati iz životinjskih ili biljnih organa, i u slučaju kada se koriste rekombinantne DNA tehnike jer proteini pokazuju međusobno slične hemijsko-fizičke osobine, nezavisno od njihovog porekla.

Prema tome prema gore navedenom, proizilazi da u slučaju prečišćavanja farmakološki aktivnih proteina, protein je u smeši sa drugim proteinima sa sličnim osobinama koji često obilno prevazilaze količinu željenog proteina, koji treba izolovati sa visokim stepenom čistoće.

Zadatak je pipav i nekoliko stupnjeva prečišćavanja koji se normalno koriste u cilju postizanja željenog nivoa čistoće. Postupci prečišćavanja postaju na ovaj način veoma složeni i uspeh industrijske proizvodnje proteina se suštinski graniči sa efikasnošću postupka prečišćavanja pošto on kasnije obimno određuje cenu proizvodnje.

Mnogo tehnika se koristi u pročišćavanju proteina, kao na primer, selektivnim taloženjem u vodi i organskim rastvaračima ili sa kaotropskim sredstvima; odvajenje pomoću ceđenja i/ili dijalizom; postupci imuno-precipitacije sa pogodnim antitelima; hromatografski postupci. Poslednjih godina povećana je važnost ovih poslednjih, uglavnom jer je omogućeno đobijanje zahtevanog stepena čistoće, kao što je zabeležio Reinger F.E. u J. Chromatogr. 418, 115-143, (1987).

U naučnoj literaturi su citirane mnoge tehnike i mogu biti klasifikovane na osnovu mehanizma dejstva primenjenog za odvajanje proteina kao što su na primer, odvajanje na osnovu molekulske težine, absorpcija na polarnim nosačima, takođe nazvanim normalnim stacionarnim fazama, absorpcija na ne-polarnim nosačima, nazvanim reverznim stacionarnim fazama, absorpcija selektivnim afinitetom za ligande vezane na inertne nosače, kao što su teški metali bakar, cink, gvožđe i platina, hemijske boje kao što je brilijantno plava, proteini kao što su protein A i protein G, ugljeni hidrati kao što su polisaharidi i glukozaminoglikani, imuno-afinitetnom absorpcijom sa specifičnim antitelima na inertnim nosačima, absorpcijom jonskom interakcijom sa elektostički naelektrisanim ligandima na inertnim nosačima.

Selektivnost, tj. sposobnost selektivnog prepoznavanja željenog proteina, cena i mogućnost upotrebe na industrijskom nivou su parametri koji su korišćeni za procenu efikasnosti različitih hromatografskih tehnika.

Na osnovu ovih parametara, imuno-aflnitetna hromatografija se smatra da garantuje visoku selektivnost, ali pokazuje nedostatke kao što je visoka cena upotrebe, rizik denaturacije antitela i rizik vezan za krajnju sigurnost prečišćenog proizvoda zbog toga što su antitela životinjskog porekala.

Hromatografija koja koristi jonske interakcije, takođe zvana jonoizmenjivačka hromatografija se smatra manje riskantnom tehnikom za održavanje farmakološke aktivnosti proteina, iako se izvodi i ima niske cene u industriji, ali pokazuje nedostatak jer je slabo selektivna.

Prema tome bilo bi veoma povoljno naći uslove izvođenja jonoizmenjivačke hromatografije koji povećavaju selektivnost tako da je čine kompetativnom sa drugim tehnikama sa tačke gledišta čistoće dobijenog proizvoda.

Jonoizmenjivačka hromatografija se uglavnom izvodi korišćenjem kolona različitih veličina, napunjenih sa čvrstim nosačima koji sadrže hemijske grupe koje stalno ili pod određenim uslovima imaju elektrostatičko naelektrisanje.

Jedinjenje koje se nanese na jonoizmenjivačku kolonu reaguje pomoću Kulonovih privlačnih/odbojnih sila sa naelektrisanjima na nosaču. Različita jedinjenja koja su sadržana u smeši će biti u stanju da se vezuju za stacionarnu fazu kao funkcija količine posedovanog naelektrisanja i prema tome više ili manje će se zadržati, na taj način određivajući njihovo odvajanje na kraju kolone.

Hromatografija se zove katjonska izmenjivačka hromatografija kada su naelektrisanja nosača negativna, zato što se katjoni zadržavaju, dok se naziva anjonska izmenjivačka hromatografija kada su naelektrisanja na nosaču pozitivna.

Proteini su jedinjenja koja imaju visoku molekulsku masu, veću od 10,000 Daltona, izgrađeni od heterogenih polimera aminokiselina; neke aminokiseline imaju u svom pobočnom lancu funkcionalne grupe koje mogu biti jonizovane kao funkcija pH rastvora negativno, kisele aminokiseline, ili pozitivno, bazne aminokiseline, i prema tome svi proteini sadrže veliki broj negativnih i pozitivnih naelektrisanja. Izoelektrična tačka, pl proteina je pH na kojem protein je neutralan zbog doprinosa negativnog naelektisanja koje je jednako pozitivnom naelektrisanju; protein postavljen u elektornsko polje na pl nije privučen nijednim polom električnog polja.

Broj negativnih naelektrisanja povećava se na pH većim od pl i protein postiže ukupno negativno naelektrisanje dok se suprotno dešava na pH nižim od pl i protein postiže ukupno pozitivno naelektrisanje. Svaki protein ima svoj karakteristični pl koji ga razlikuje od ostalih i neki proteini teže da postanu nerastvorni na izoelektričnoj tačci.

Kad je protein u rastvoru na pH nižem nego pl ima ukupno pozitivno naelektrisanje i tako može reagovati sa negativno naelektrisanim nosačom i može se podvrći katjonskoj izmenjivačkoj hromatografiji dok protein može biti podvrgnut anjonskoj izmenjivačkoj bromatografiji na pH višem od pl, kao što je zabeležio Regnier F. E., Science, 238, 319-323, (1987) i od Yamamoto S. et al.. Chromatographic Science Series, 43, (1988), Marcel Dekker, Inc. Publisher, New York.

Nasuprot tome mi smo neočekujući pronašli, i na toj činjenici se zasniva ovaj pronalazak, da je moguće naći opseg pH vrednosti viših od odgovarajućeg pl proteina na kojim pH, protein još ostaje absorbovan na nosaču katjonske izmenjivačke hromatografije tako da je i dalje moguće izvesti katjonsku izmenjivaču hromatografiju. Takva situacija je naročito važna zbog visoke selektivnosti između proteina postignute pod ovim uslovima, jer tako veoma male razlike pl između proteina postaju dovoljne u cilju dobijanja značajnog odvajanja, tako omogućavajući visoku efikasnost prečišćavanja.

Poslednji aspekt je naročito značajan u postupcima prečišćavanja rekombinantnih proteina gde željeni proizvod je često u vezi sa odgovarajućim nečistoćama, tj. napravljen iz veoma malih strukturnih razlika proizvoda, kao na primer, različito oksidaciono stanje, acetilacija, gubitak amidne funkcije i tako dalje. Ova vrsta nečistoća je veoma teška za uklanjanje, takođe i pomoću imuno-afmitetne hromatografije jer u većini slučajeva antitela nisu u stanju da ih razlikuju.

Mehanizam koji može objasniti pronađenu pojavu zasniva se na činjenici da raspoređivanje naelektrisanja na spoljašnjoj površini proteina nije uniformno, tako da takođe kada je pH nešto veći od pl i protein ima ukupno negativno naelektrisanje, postoje neka pozitivna naelektrisanja locirana na molekulu koja mogu reagovati sa negativnom stacionarnom fazom.

U cilju stvaranja ovog mehanizma efikasnim, važno je da višak negativnog naelektrisanja nije suviše istaknut jer će električna polja stvorena od negativnog naelektrisanja biti takođe visoka, da bi se sprečila interakcija čitavog proteina sa negativno naelektrisanim hromatografskim nosačem.

Povrh svega neophodno je da se jonska jačina rastvora korišćenog kao eluent kontroliše, jer visoka jonska jačina imaće efekt zasenjenja proteina, tako sprečevajući njegovu interakciju sa stacionarnom fazom.

Lampson G.P. et al.. Anal. Biochem., JLL 374-377, (1965) potvrđuju slučaj proteina kao što je humani gama globulin, ribonukleaza, hemoglobin, delta himotripsin, globin i lizozim u kojima pri malim pH promenama održava se visoka jonska jačina, data 0.1 M fosfatnim rastvorom, eluiranje na katjonskoj izmenjivačoj hromatografiji dešava se pri pH gotovo 0.4 jedinice niže od pl.

Gore pomenuti princip, na kome se bazira ovaj pronalazak, nije nikada korišćen koliko je poznato pronalazaču, da bi se izveo efikasan postupak prečišćavanja proteina.

Mogućnost korišćenja razlika izoelektričkih tačaka proteina u cilju optimizacije postupka prečišćavanja opisao je Kontturi A.K. et al., Acta Chem. Scand., 50 ( 21102-106. (1996) i u suštini odnosi se na konvencionalnu primenu jonoizmenjivačke hromatografije, gde se katjonska izmenjivačka hromatografija uvek izvodi na nižim pH od izoelektrične tačke, dok se anjonska izmenjivačka hromatografija izvodi na višim pH od izoelektrične tačke. Postupak opisan u ovoj patentnoj prijavi je suprotan tako da se katajonska izmenjivačka hromatografija izvodi na višem pH nego izoelektrična tačka proteina.

Postupak opisan u ovoj prijavi po svojoj prirodi može se smatrati opštim, što je pokazano u zabeleženim primerima gde je pokazano kao je uspešno primenjen na i proteine prirodnog porekla i na proteine rekombinantne DNA. Razlika između proteina i proteina je u stepenu opsega obima pH, višeg od pl, korisnom za prečišćavanje interesantnih proteina. U stvari, na primer kao što će biti pokazano u primerima koji slede, ovaj opseg je oko 0.2 pH vrednosti u slučaju proteina interferona dok je oko jedne pH jedinice u slučaju albumina.

Primena prikazanog pronalaska za prečišćavanje rekombinantnog alfa interferona (rIFNa) čija izoelektrična tačka je 5.9, kao što je zabeleženo od Thatcher D. i Panavotatos N., Methods Enzvmol. 1_19, 166-177, (1986), će biti zabeležena među primerima i biće pokazano kako je moguće i pogodno prečišćavanje na katjonskom izmenom na pH 6.1. Još će biti prikazani primeri humanog albumina iz seruma Čiji pl je 4.9, kao što je zabeležio Rvlatt D:B. et al., J. Hromatogr., 86JL 145-153, (1999) i biće pokazano kako je moguće i poželjno prečišćavanje katjonskom izmenom na pH 6.0.

Prednosti postupka koji je predmet prikazanog pronalaska su veoma značajne u poređenju sa rezulatima postupaka opisanih u naučnim publikacijama i/ili patentima koji se odnose na prečišćavanje a interferona i humanog albumina iz seruma, postupke koji uglavnom zahtevaju tri ili više uzastopnih lečenja, činjenice da izazivaju visoku industrijsku cenu i opadanje prinosa.

Thatcher D. i Panavotatos N. opisuju prečišćavanje humanog rekombinantnog alfa interferona rIFN-a2, Methods Enzymol., 119. 166-177 (1986) kroz pet uzastopnih postupaka: a) katjonske izmenjivačke hromatografije; b) anjonskea izmenjivačke hromatografije; c) afinitetne hromatografije za teške metale; d) tretiranja sa zasićenim rastvorom amonijum sulfata; e) molekulske ekskluzione hromatografije.

Evropski patent 0108585 opisuje prečišćavanje interferona uzastopnom upotrebom tri tipa hromatografije: a) imuno-afinitetne; b) katjonske izmene; c) molekulsake ekskluzije. US patent 4765903 u prečišćavanju interferona opisuje sledeću upotrebu četiri tipa hromatografije: a) imuno-afinitetne sa monoklonalnim antitelima; b) sa invertnom fazom; c) katjonske izmene; d) molekulske ekskluzije.

Evropski patent 0679718 opisuje postupak za proizvodnju alfa interferona koji predočava sledeća četiri hromatografska stupnja: a) helatiranje sa metalima; b) katjonsku izmenu; c) anjonsku izmenu; d) gel filtraciju.

Ostale publikacije i patenti opisuju tri ili više tretmana neophodnih za prečišćavanje proteina interferona, na primer US patent 4732683, Međunarodna patentna prijava WO 8604067 i publikacija Khan F.R. i Rai V. R:, Bioprocess Technol., 7J61-169, (1990).

Citirani primeri pokrivaju najrelevantnije predmete oko prečišćavanja interferona u opšte i naročito alfa interferona. Oni pokazuju kako prečišćavanje ovog zadnjeg je naročito teško i zahteva mnogo stupnjeva prečišćavanja. Povrh toga, istaknuto je kako visoki nivo čistoće naročito je dobijen pomoću imuno-afinitetnih hromatografija koršćenjem monoklonalnih antitela murinskog porekala. Međutim prisustvo takve hromatografske tehnike u okviru procesa industrijske proizvodnje dovodi do proizvodnje aktivnih principa za humanu farmaceutsku upotrebu koji izazivaju rizik od mogućnih virusnih zagađenja sa virusima murinskog porekala zbog prisustva mogućih imunogenih fragmenata koji nastaju iz murinskih imunoglobulina u krajnjem proizvodu i zbog teškoća u potvrđivanju hromatografskih nosača sa industrijske tačke gledišta.

Povrh svega, iz kratko iznetih primera katjonska izmenjivačka hromatografija je široko korišćena, ali nikad kao jedinstvena tehnika za odvajanje, jer joj je efikasnost ograničena u odnosu na povećani nivo nečistoća.

Publikacije Babu K. R. etal., Appl. Microbiol.Biotechnol.. 53 ( 6 \ 655-660.

(2000) i Bouvon R. et al.. Biotecnologia Aplicada, 14, 189-192, (1997), opisuju postupak prečišćavanja alfa interferona u jednom koraku pomoću jonoizmenjivačke hromatografije u gradijentu soli. Međutim u oba slučaja da bi se dobio dovoljno čist proizvod, autori su izolovali samo neke od hromatografskih frakcija koje su sadržale alfa interferon, tako dobijajući veoma nizak prinos, do 7.5% minuimum. Povrh svega, opisani hromatografski postupci prečišćavanja u gradijentu soli nisu pogodni za korišćenje na industrijskom nivou.

Mnoge tehnike hromatografskog prečišćavanja su opisane takođe u slučaju humanog albumina polazeći od preparata albumina dobijenih frakcionisanjem humanog seruma ili pomoću tehnika rekombintne DNA, tehnika kompleksnih i jedva prenosivih na industrijski nivo što potvrđuje kako problem efikasneog prečišćavanja humanog albumina, i prirodnog i rekombinantnog porekla, još uvek postoji.

US patenti 6150504 i 5521287 opisuju prečišćavanje albumina pomoću jonoizmenjivačke hromatografije i hidrofobnih interakcija. Sema prečišćavanja opisana u Patentnu 6034221 predočava prečišćavanje albumina pomoću dva hromatografska koraka, jedan postupkom ultrafiltracije i dva druga stupnja hromatografskim prečišćavanjem.

Manje konvencionalni korišćeni postupci prečišćavanja albumina su jonoizmenjivačka hromatografija u pokretnom nosaču ili afinitetna hromatografija koja reaguje sa komercijalno dostupnim nosačima kao što su Streamline<®>ili pogodno pripremljen, zrnast ili modifikovan cirkonijum ili emulzije perfluoro hidrokarbonata, kao što je opisano u US patentu 5962649 i publikacijama Sumi A. et al., Bioseparation, 8 ( 1- 5), 195-200,

(1999), Mullick A. i Flickinger M. C, Biotechnol. Bioeng., 65 ( 3), 282-290, (1999) i Mc Creath G. E. et al, J. Chromatogr., 597 ( 1- 2), 189-196,

(1992).

Poslednje tehnike prečišćavanja albumina na teškim metalima takođe su opisane i od strane Yang L. et al., Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16( 1), 74-77, (2000) i afinitetnim tehnikama na nosačima za koje su vezani molekuli boje kao Cibacron Blue F3G, su opisane od strane Compagnini A. et al„ J. Chromatogr. A., 736 ( 1- 2), 115, (1996).

Sve ove tehnike pokazuju na različite načine probleme složenosti realizacije i visoke cene, tako da nije rešen problem individualizacije novog postupka prečišćavanja farmakološki aktivnih proteina i lake i efikasne industrijske izvodljivosti sa ekonomskom prednošću.

Dole opisan pronalazak daje odgovor na ove važne zahteve obezbeđivanjem postupka prečišćavanja farmakološki aktivnih proteina lakih za industrijsko korišćenje i niske cene sa značajnim ekonomskim prednostima.

Opis pronalaska

Ovaj pronalazak odnosi se na postupak prečišćavanja farmakološki aktivnih proteina zasnovan na upotrebi katjonske izmenjivačke hromatografije na čvrstom nosaču pri naročitim uslovima koji obuhvataju, posle nanošenja uzorka, kondicioniranje kolone sa eluentom pogodnog pH i jonske jačine tako da u koloni je uniformno prisutan više bazni pH, tj. viši, od odgovarajuće izoelektrične tačke, pl, farmakološki aktivnih proteina, na kom pH međutim pomenuti proteini ostaju i dalje absorbovani na čvrsti nosač korišćen za katjonsku izmenjivačku hromatografiju. Posle ove faze kondicioniranja, faramakološki aktivni proteini se eluiraju sa kolone povećavanjem jonske jačine i/ili pH eluenta.

Efikasnost izvođenja ovog pronalaska zahteva individualizaciju prave kombinacije među hromatografskim nosačima koji se koriste, za korišćene eluente za hromatografiju pH vrednosti višu nego pl i jonsku jačinu, jer kada je jednom određen hromatografski nosač, efikasno prečišćavanje može se dobiti pripremanjem ograničenih varijacija pH i/ili jonske jačine često u desetinama pH vrednosti i/ili varijacija jonske jačine od nekoliko stotina[ iS.

Mogu biti korišćeni svi funkcionalizovani čvrsti nosači koji se uobičajeno koriste kao stacionarne faze za katjonsku izmenu, prema tome naročito su poželjene stacionarne faze za jaku katjonsku izmenu koje se izvode kada pl proteina koje treba prečistiti je niži od 6, dok stacionarna faza sa katjonskom izmenom i jakom i slabom, može biti korišćena bez izuzetaka za proteine koji imaju pl viši od 6. Pomenute stacionarne faze mogu imati silikatni ili polimerni nosač, funkcionalizovan pomoću sulfonskih ili karboksilnih grupa obe u obliku protonovanih ili alkalnih soli. Komercijalno dostupne stacionarne faze kao što su na primer Source<®>S (Pharmacia Biotech), Sepharose<®>SP-Fast Flow, Sepharose<®>SP-Hight Performance, Sp Sepharose<®>XL (Pharmacia Biotech), Fractogel<®>S (Merk, Darmstadt), Mustang<®>S (Pali Corporate), CM Sepharose<®>FF (Pharmacia Biotech), Dowex<®>, Bio-Rad<®>AG (Bio-Rad), Poros<®>S (PerSeptive Biosvstems), Shodex<®>-S, Tovopearl<®>SP (Tosohass) mogu biti uspešno korišćene.

Opseg pH vrednosti u kojima se ovaj pronalazak može se efikasno izvoditi je veoma širok, u zavisnosti od izoelektričnih tački interferon proteina koji su prečišćavani, i uključuje vrednosti između 2 i 11, poželjno između 4 i 8.5.

Proširenje opsega pH vrednosti viših od pl u okviru kojih se postupak opisan prema ovom pronalasku primenjuje može varirati od pH vrednosti koje odgovarju pl interferon proteina do jedne pH jedinice iznad pomenute pl, pokazujući značajne razlike od proteina do proteina.

Na primer, nađeno je da u slučaju rekombinantnog alfa 2b interferona (rIFNa-2b) moguće je dobiti adsorpciju proteina na nosaču za izmenu katjona do 0.2 pH jedinice preko njegovog pl od 5.9 i prema tome moguće je izvesti prečišćavanje pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije, dok je nađeno da u slučaju humanog albumina iz seruma, protein ostaje ađsorbovan do jedne pH jedinice iznad njegovog pl.

Opseg koncentracije soli vodenog rastvora korišćenog kao eluenta za efikasnu upotrebu, zavisi od vrste interferon proteina koji se prečišćava i nađeno je da uključuje vrednosti između IraM i 100 mM, poželjno između lmMi 30mM.

Na primer, u slučaju prečišćavanja rekombinantnog alfa 2b interferona (rIFNoc-2b), koncentracija vodenog rastvora soli uključuje između lmM i 30mM , poželjno između 5 i 15 mM.

Potreba za fiksnim i stabilnim pH vrednostima eluenta korišćenog u hromatografiji koja predmet ovog pronalaska čini veoma korisnim, čak i kada to nije apsolutno neophodno, je korišćenje vodenih rastvora pogodno puferisanih koji uključuju 5 do 100 mM, poželjno 10 do 20 mM smeše pufera. Svaka hemijska supstanca ili smeša hemijskih supstanci koja ima kapacitet pufera u opsegu pH između 2 i 11, može poželjno biti korišćena jer pH vrednosti eluenata koji mogu biti korišćeni uključuju vrednosti između 2 i 11.

Mnogi vodeni rastvori pufera mogu imati prednost pri korišćenju u izvođenju ovog pronalaska i uključuju one koji sadrže: glicin i natrijum hlorid, maleinsku kiselinu i natrijum hidroksid, malonsku kiselinu i natrijum hidroksid, mlečnu kiselinu i natrijum hidroksid, mravlju kiselinu i natrijum ili litijum hidroksid, ćilibarnu kiselinu i natrijum hidroksid, N-metilpiperazin i hlorovodoničnu kiselinu, piperazin i hlorovodoničnu ili sirćetnu kiselinu, L-histidin i hlorovodoničnu kiselinu, 4-(2-hidroksietil)-l-piperazinetansulfonsku kiselinu i natrijum ili litijum hidroksid, N-metildietanolamin i sumporna kiselina, N-metildietanolamin i hlorovodoničnu kiselinu ili sirćetnu kiselinua, piridin i mravlju kiselinu, dibazni natrijum citrat i natrijum hidroksid, monobazni kalijum ftalat i hlorovodoničnu kiselinu, monobazni kalijum ftalat i natrijum hidroksid, monobazni kalijum fosfat i dibazni natrijum fosfat, bicin i natrijum hidroksid, natrijum barbital i hlorovodonična kiselina, natrijum borat i hlorovodoničnu kiselinu, natrijum borat i natrijum hidroksid, 1,3-diaminopropan i hlorovodoničnu kiselinu, limunsku kiselinu i dibazni natrijum fosfat, natrijum acetat i sirćetnu kiselinu, imidazol i hlorovodoničnu kiselinu, trietanolamin i hlorovodoničnu ili sirćetnu kiselinu, tris(hidroksimetilaminometan) i hlorovodoničnu kiselinu, natrijum karbonat i natrijum kiseli karbonat, etanolamin i hlorovodoničnu kiselinu, piperidin i hlorovodoničnu kiselinu, trimetilamin i mravlju kiselinu, piridin i sirćetnu kiselinu, trietilamin i sirćetnu kiselinu, trimetilamin i hlorovodoničnu kiselinu, amonijum hidroksid i mravlju kiselinu, amonijum hidroksid i sirćetnu kiselinu, trimetilamin i natrijum karbonat, amonijum karbonat i amonijum hidroksid.

Naročito, u slučaju prečišćavanja rekombinantnog alfa 2b interferona (rIFNa-2b) svi rastvori pufera koji imaju kapacitet pufera pri pH koji uključuje 5.9 i 6.1 mogu biti korišćeni, poželjno rastvori pufera sa pH između 5.9 i 6.1 koji sadrže monobazne kalijumove fosfate i dibazne natrijumove fosfate, monobazne kalijum ftalate i natrijum hidroksid, dibazni natrijum citrat i natrijum hidroksid, limunsku kiselinu i dibazni natrijum fosfat, imidazol i hlorovodoničnu kiselinu, dok u slučaju prečišćavanja humanog albumina iz seruma, mogu biti korišćeni rastvori pufera koji sadrže iste smeše hemijskih jedinjenja koje imaju kapacitet pufera pri pH koji uključuje 4.9 i 6.0.

Vodeni rastvori korišćeni kao eluenti mogu sadržati, pored hemijskih supstanci korišćenih za puferisanje pH, takođe hemijske supstance koje imaju zadatak da modifikuju jonsku jačinu rastvora. Sa ove tačke mogu imati prednost pri korišćenju organske soli, kao što su na primer karboksilati, alkilsulfonati, ftalati ili neorganske soli, kao što su na primer sulfati, hloridi, fosfati koji mogu biti soli sa natrijumom, kalijumom, amonijumom, primarnim, sekundarnim, tercijarnim ili aromtičnim aminom.

Ova jedinjenja mogu imati prednost pri korišćenju u koncentracijama koje uključuju vrednosti između od 1 mM do 100 mM, poželjno između 1 mM i 30 mM.

Na primer, u slučaju prečišćavanja rekombinantnog alfa 2b interferona (rIFNct-2b), koncentracija ovih jedinjnjena može varirati između 1 mM i 30 mM, poželjno između 2 i 20 mM.

Efikasnost prečišćavanja može biti povećana, pre eluiranja farmakološki aktivnih proteina, pomoću jednog ili više ispiranja izvedenih sa eluentima koji imaju pogodan pH i jonsku jačinu, tako daje kolona uvek na pH višem od pl.

Na primer, u slučaju humanog albumina iz seruma čiji pl je 4.9, ispiranje može biti izvršano sa rastvorom pufera sa pH koji uključuje između 5.5 i 5.8, dok u slučaju rekombinantnog alfa 2b interferona (rIFNa-2b) čiji j pl 5.9, ispiranje može biti izvedeno sa rastvorom pufera na pH koji uključuje vrednosti između 6.0 i 6.1.

Količina eluenta koja je propuštena u toku ove faze ispiranja je promenjiva, i normalno je između 5 i 100 zapremina kolone (CV-column volumes), dok u slučaju rekombinantnog alfa 2b interferona (rIFNa-2b) između 10 i 80

CV.

Količina koja može biti naneta na kolonu proizvoda koji se prečišćava, zavisi od korišćenog hromatografskog nosača i može biti maksimalno do 100 miligrama ukupnih proteina za svaki mililitar stacionarne faze čak i ako se uglavnom koriste'manje količine, uključujući između 5 i 20 mg/ml.

Eluent može proći kroz kolonu linearnom brzinom kompatibilnom sa stacionarnom fazom do maksimalne vrednosti jednake 10 cm/min.

Gore prikazani postupak prečišćavanja može biti primenjen na prečišćavanje proteina interferona sa naročitim pogledom na interferone alfa, beta, gama, delta, omega, tau do prirodnih alfa interferona iz leukocita do rekombinantnih alfa 2b i konsezusnih interferona i prirodnog i rekombinantnog porekla.

Obim gore opisanog postupka prečišćavanja je dobijanje na industriski i ekonomski način farmakološki aktivnih proteina stepena čistoće za direktno korišćenje u proizvodnji medicinskih preparata koji ih sadrže.

Naročito, medicinski preparati poželjni u okviru obima prikazanog pronalaska su oni koji sadrže interferon, poželjnije rekombinantni alfa 2 b interferon (rIFNot-2b) i prirodnog i rekombinatnog porekla.

Dole su zabeleženi neki ilustrativni primeri predmeta postupka prikazanog pronalaska u okviru jedinstvenog obima da bi pojasnili pronalazak ali ne da ga na bilo koji način ograniče.

PRIMER 1

Proizvodnja rekombinantnog alfa2 binterferona ( rIFNctr- 2b")

Deo ćelija Escherichia coli BL21 DE3 soja je transformisan sa 5 ng pET9a-IFNa-2b plazmidom, dobijenim kloniranjem sintetičkog gena reprodukcijom sekvence IFNa-2b humenog gena, pogodno modifikovanog u cilju češćeg ukapanja sekvence u kodone kod Escherichia coli u pET9a plazmidu (Novagen).

Ekspresija proteinske sekvence iz modifikovanih ćelija Escherichia coli kao što je gore prikazano, je jednaka onoj zabeleženoj u Methods in Enzymology, Interferons, part C, editor Pestka S., 119. 3-14, (1986) objavljenog od Academic Press Inc.

Soj Escherichia coli BL21 DE3 transformisn pomoću pET9a-IFNa-2b plazmiđa je kultivisan u balonu sa pogodnim medijumom za kultivisanje, na primer rastvorom koji sadrži 12g/l fitopeptona (Phyto pepton, BBL), 24 g/l ekstrakta kvasca (Yeast extract, DIFICO), 4 g/l glicerola (BDH) i neomicina na 37°C u toku vremena dovoljnog da bi se postigla optička gustina od 600 nm jednaka 0.6-0.8, što je uglavnom 7-9 sati. Tako dobijena kultura je zatim korišćena u razblaženom obliku od 1 do 100 za inoakulaciju fermentora od 5 1 u kome se nalazio medij um za kultivisanje identičan onom prethodno opisanom u balonu. Kultura se drži 14 sati na 37°C sa aeracijom jednakom jednoj zapremini vazduha u svakom minutu u odnosu na zapreminu kulture.

Bakterijske ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 6000 obrtaja u minuti (rpm) na kraju kultivisanja, suspendovni su u pogodnom vodenom rastvoru koji sadrži 1 mM ditiotreitol-a (DDT) u količini ne višoj od 6 ml za svaki gram vlažne mase centrifugiranih bakterija. Bakterijska suspenzija je podvrgnuta ćelijskoj lizi pomoću utvrđenih i opisanih tehnika, kao što je na primer raskidanje ultrazvukom ili hidrauličkim pritiskom.

Rezultujuća suspenzija je ponovo dobijena centrifugiranjem i čvrsti deo je suspendovan u 50 ml rastvora soli koji sadrži 1 mM DTT i ponovo je centrifugiran.

Čvrsta komponenta, koja sadrži uključena tela, je sakupljena i suspendovana energičnim mešanjem na sobnoj temperaturi u 450 ml rastvora koji sadrži 6 M guanidinijum hlorida, 50 mM Tris-HCl pri pH 8 i 0.1 mM EDTA. Suspenzija je centrifugirana i supernatant je razblažen u odnosu od 1 do 100 do 1 do 200 u rastvoru soli koji sadrži 50 mM Tris-HCl pri pH 8 i 0.1 mM EDTA na pH 8 pogodnom za renaturaciju proteina. Rastvor za renaturaciju može da sadrži amino kiseline, kao što su na primer glicin ili arginin; smeše jedinjenja koja sadrže sulfide u oksidovanom i redukovanom obliku sa formiranim disulfidnim mostovima, kao što su na primer glutation, etanolamin, cistein. Renaturacija je izvedena pod energičnim mešanjem rastvora na 4°C za gotovo 72 sata i rastvor je proceđen i zatim koncentrovan pomoću postupka dia-filtracije naspram pufera napravljenog od 40 mM Tris-HCl pri pH 8 do krajnjeg faktora koncentracije od 5 do 10 puta. Krajnja koncentracija rastvora uglavnom uključuje između 0.4 i 1.0 mg/ml.

PRIMER 2

Prečišćavanje rekombinantnog alfa- 2b interferona (rIFNa-2b)

IM rastvor natrijum acetata je dodat do krajnje koncentracije 20 mM proteinske smeše koja sadrži rIFNa-2b iz primera 1 i smeša je dovedena do pH 5.5 sa sirćetnom kiselinom. Tako dobijen rastvor je nanesen na jaku katjonsku izmenjivaču kolonu koja sadrži komercijalno dostupan hromatografski nosač Mustang<®>S (Pali Corporate). Katjonska izmenjivačka kolona je uravnotežena, pre nanošenja proteinskog rastvora, pomoću 20 mM rastvora natrijum acetata na pH 5.5 u količini jednakoj 20 zapremina kolone (CV).

Proteinski rastvor je zatim nanesen u količini koja nije prelazila vrednost od 10 mg proteina na svaki milimetar stacionarne faze, poželjno u količini koja uključuje 6 i 8 mg/ml.

Posle nanošenja, proizvod se vezuje za stacionarnu fazu i podvrgnut je prvom ciklusu ispiranja pomoću rastvora soli sa pH 6.1 napravljenom od smeše monobaznog kalijum fosfata i dibaznog natrijum fosfata u celokupnoj koncentraciji koja uključuje između 5 i 15 mM. Optimalna koncentracija rastvora je bilo kako fiksirana činjenicoma da provodljivost nije prešla oko 1800 \ xS. Ukupna količina korišćenog rastvora uključuje između 5 i 60 CV, poželjno između 25 i 35 CV.

Drugi ciklus ispiranja je zatim izveden korišćenjem istog rastvora kao u prvom ciklusu ispiranja za koji je dodata količina kalijum hlorida jednaka krajnjoj koncentraciji koja ne prevazilazi 3 mM, poželjno 2 mM; ukupna korišćena količina rastvora uključuje između 10 i 100 CV, poželjno između 30 i 60 CV.

Posle ciklusa ispiranja ,eluaciona faza je izvedena korišćenjem rastvora kao u prvom ciklusu, ispiranja sa krajnjom količinom kalijum hlorida pri koncentraciji između 15 i 25 mM. Celokupna količina rastvora korišćena za eluiranje uključuje između 15 i 40 CV, poželjno između 20 i 30 CV.

Svi rastvori i uzorci naneseni na kolonu prolazili su linearnom brzinom koja obuhvata između 0.1 i 1 cm/min. Pod ovim uslovima rIFNa-2b je eluiran sa kolone sa stepenom čistoće višim od 98% dok u početnom rastvoru stepen čistoće je oko 40%, sa prinosom ponovnog dobijanja željenog proizvoda višim od 80 %.

Hromatografski profili pre i posle prečišćavanja hromatografijom su prikazani na slikama la i lb.

Slika la pokazuje hromatografski profil rastvora interferona pre pročišćavanja i slike lb hromatografskog profila posle prečišćavanja.

Hromatografski profili koji su izvedeni na HPLC-u pomoću tečnog hromatografa HP 1090, korišćenjem Vydac C18 kolone i UV detektora podešenog na 214 nm. Eluiranje je izvedeno sa protokom 1 ml/min korišćenjem smeše napravljene od dve eluenta, eluenta A napravljenog od 700 ml vode, 298 ml acetonitrila i 2 ml trifluorosirćetne kiseline i eluenta B 198 ml vode, 800 ml acetonitrila i 2 ml trifluorosirćetne kiseline. Dva eluenta su mešana u toku eluiranja prema sledećoj tabeli:

PRIMER 3

Postupak je izveden prema opisu primera 2 korišćenjem rastvora pufera napravljenog od monobaznog kalijum ftalata i natrijum hidroksida.

PRIMER 4

Postupak je izveden prema opisu primera 2 korišćenjem rastvora pufera napravljenog od dibaznog natrijum citrata i natrijum hidroksida.

PRIMER 5

Postupak je izveden prema opisu primera 2 korišćenjem rastvora pufera napravljenog od limunske kiseline i dibaznog natrijum fosfata,

PRIMER 6

Postupak je izveden prema opisu primera 2 korišćenjem rastvora pufera napravljenog od imidazola i hlorovodonične kiseline.

Claims (8)

1. Postupak prečišćavanja interferon proteina, naznačen time, što se sastoji od izvođenja katjonske izmenjivačke hromatografije na čvrstom nosaču na baznijem pH od pH koji odgovara izoelektričnoj tačci, pl, proteina koji se prečišćavaju, pH na kome su pomenuti proteini i dalje absorbovani i eluiranja pomenutih proteina povećavanjem jonske jačine i/ili pH vodenog rastvora pufera.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, Što vodeni rastvori pufera sadrže od 5 do 100 mM smeše pufera i što je smeša pufera izabrana od onih koje se sastoje od: monobaznog kalijum fosfata i dibaznog natrijum fosfata, monobaznog kalijum ftalata i natrijum hidroksida, dibaznog natrijum citrata i natrijum hidroksida, limunske kiseline i dibaznog natrijum fosfata ili imidazola i hlorovodonične kiseline.

3. Postupak prema zahtevu 2, naznačen time, što rastvori pufera mogu sadržati od 1 do 100 mM organskih ili neorganskih soli pogodnih za modifikovanje jonske jačine rastvora.

4. Postupak prema zahtevima 1 do 3, naznačen time, što su interferon proteini alfa, beta, gama, delta, omega, tau, prirodni alfa iz leukocita, rekombinantni alfa-2b i konsezusni interferoni.

5. Postupak prečišćavanja rekombinantnog alfa-2b interferona, rIFNa, prema zahtevu 1, naznačen time, što obuhvata nanošenje proteinske smeše koja je dobijena fermentacijom rIFNa-2b dodavanjem 1 M rastvora natrijum acetata i dovedena na pH 5.5 sa sirćetnom kiselinom, na kolonu napunjenu jakom katjonskom izmenjivačkom smolom uravnoteženom na pH 5.5 pomoću 20 mM rastvora natrijum acetata, tako da je između 6 i 8 mg proteina bilo prisutno po svakom ml stacionarne faze, izvođenja dva ciklusa ispiranja kolone, prvo sa rastvorom pufera na pH 6.1 pri koncentraciji između 5 i 15 mM, zatim sa istim rastvorom pufera kome je dodato 2 mM kalijum hlorida i na kraju je sa kolone eluiran čisti rIFNa-2b, korišćenjem rastvora pufera na pH 6.1 koji sadrži kalijum hlorid u koncentraciji između 15 i 25 mM.

6. Postupak prema zahtevu 5, naznačen time, što je korišćena smola jak katjonski izmenjivački medijum koji se sastoji od hidrofilnih polimera sa grupama sulfonske kiseline umreženim na polietarskim sulfon membranama i smeše pufera su odabrane od onih napravljenih od monobaznog kalijum fosfata i dibaznog natrijum fosfata, monobaznog kalijum ftalata i natrijum hidroksida, dibaznog natrijum citrata i natrijum hidroksida, limunske kiseline i dibaznog natrijum fosfata ili imidazola i hlorovodonične kiseline.

7. Upotreba postupka prema bilo kom od prethodnih zahteva za proizvodnju aktivnih principa koji se nalaze u medicinskim preparatima na bazi interferon proteina.

8. Upotreba prema zahtevu 7, naznačen time, što je interferon protein rekombinantni alfa-2b interferon.