CN101768601B - 一种重组人血白蛋白—干扰素α2b的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在毕赤酵母系统中分泌表达的重组人血白蛋白-干扰素α2b的生产方法。尤其涉及重组人血白蛋白-干扰素α2b在毕赤酵母中的高效表达以及表达产物的纯化。该发明将含有重组人血白蛋白-干扰素α2b的毕赤酵母工程菌高密度发酵，随后将发酵液通过高速离心机离心收集发酵上清，阳离子交换层析，疏水层析和分子筛层析进行组合纯化生产，生产出符合中国药典规定的重组人血白蛋白-干扰素α2b融合蛋白。本发明发酵表达量高，纯化工艺组合合理，操作程序简化，收率高，生产成本低，符合产业化要求。
Description
技术领域
本发明涉及重组DNA技术生产基因工程蛋白药物的方法，尤其涉及重组人血白蛋白—干扰素α2b在毕赤酵母中的高效表达以及表达产物的纯化。
背景技术
普通干扰素(IFN)在体内的半衰期较短，干扰素很快得到分解，治疗期间不能始终保持有效的血药浓度而持久地抑制病毒，从而使IFN治疗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染的潜能受到限制。为克服以上不足，人们开发了多种类型的长效IFN，如聚乙二醇IFN、白蛋白IFN及IFN脂质体等。其中人血白蛋白—干扰素是新的研究的热点之一，其在延长半衰期和用于糖基化修饰方面具有更大的优势。将IFN与人血浆白蛋白融合是长效IFN的新发展方向和研究热点。人血清白蛋白(HSA)是人体血浆的主要成分，无免疫原性.人体相容性好，且本身在体内即作为多种药物的载体，水溶性良好，血浆半衰期长达2周以上。更为重要的是HSA是一种“惰性”蛋白，除作为载体外，本身没有重要的生物活性。将蛋白与HSA融合，增加蛋白的分子量和水化半径，利用HSA的载体作用来延长蛋白的体内半衰期，是长效蛋白研发的一条重要途径。
目前，报道的重组人血白蛋白—干扰素α2b的发酵表达水平在300～400mg/L，纯化出的原液收率在20～30％之间，相当于每升发酵液可获得重组人血白蛋白—干扰素α2b纯品为100mg左右，比活在1.0×106IU/mg左右。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，通过构建的工程菌将人血白蛋白cDNA的C端与IFN cDNA的N端融合，与酵母表达表达载体pPICZα连接后引入毕赤酵母X33表达，获得了高效表达的工程菌。工程菌的发酵表达水平在1000～1100mg/L。纯化工艺采用阳离子交换层析，疏水层析和分子筛层析进行组合生产，纯化出的原液收率在40～50％之间，相当于每升发酵液可获得重组人血白蛋白—干扰素α2b纯品为500mg左右，比活在1.0×106IU/mg以上。本发明适合工业化生产的高纯度、高活性、低成本、高收率的纯化工艺。其他各项指标均要符合中国药典关于生物制品的规定。
本发明通过构建人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白基因的毕赤酵母工程菌株，发酵表达后再进行纯化，其特征在于，工程菌株的构建是将人血白蛋白cDNA的C端与IFN cDNA的N端融合，与酵母表达表达载体pPICZα连接后引入毕赤酵母X33表达，成为重组人血白蛋白—干扰素α2b的工程菌株；发酵表达后的纯化是通过将离心收集发酵上清液，后依次通过阳离子交换层析，疏水层析和分子筛层析得到重组人血清白蛋白—干扰素α2b，具体描述如下：
(1)重组人血白蛋白—干扰素α2b工程菌的构建。
根据人血白蛋白和人干扰素α2b的基因序列设计引物扩增出目的基因，在设计人血白蛋白引物时，在引物的5’端添加限制性内切酶XhoI切点，且在XhoI点与HSA结构基因的5’端之间插入Kex2蛋白酶酶切位点的氨基酸残基Lys-Arg对应的密码子(AAA AGA)，HSA基因的3’端添加了限制性内切酶BamHI对应的DNA序列(GGATCC)，便于同后面的IFN-α2b基因连接。所以将PCR获得的符合目的HSA基因长度的片段用XhoI-BamHI双切，再进行胶回收后就得到了可以用于连接的HSA基因片段。用BamHI-P5和NotI-P3引物获得的IFN-α2b基因时，引物BamHI-P5在基因的5’-端添加了BamHI位点，而NotI-P3引物在IFN-α2b的3’-端添加了终止密码子(TGA)和限制性内切酶NotI的序列GCGGCCGC。这样PCR获得的基因IFN-α2b通过BamHI和NotI双切后，就可以通过BamHI的粘端将HSA和IFN-α2b首尾相连起来的融合基因。重组人血白蛋白—干扰素α2b的工程菌株，使用基因重组技术将人血白蛋白基因(HAS)与干扰素-α2b(IFN-α2b)基因连接起来，为了更好的保证两种蛋白各自独立的空间结构，中间使用GlySer(GGATCC)两个氨基酸的连接子进行连接。将基因HSA(XhoI-BamHI)、IFN-α2b(BamHI-NotI)和载体pPICZα(XhoI-NotI)建立连接反应，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，酶切和测序鉴定。将经测序确认的表达载体pPICZα-HSA-IFN-α2b电转化毕赤酵母X33，筛选高表达的克隆。最终将确定高表达的作为原始菌种，成为重组人血白蛋白—干扰素α2b的工程菌株。
(2)重组人血白蛋白—干扰素α2b的发酵表达。
参照Invitrogen公司酵母发酵手册，对重组人血白蛋白—干扰素α2b工程菌发酵工艺参数进行了优化筛选。筛选了培养基的pH值、诱导pH值、诱导温度以及诱导时间。建立的发酵工艺时工程菌表达水平在1000～1100mg/L。
(3)重组人血白蛋白—干扰素α2b发酵表达产物的纯化。
所述阳离子交换层析，需要用冰醋酸调节，使pH为4.6，再用蒸馏水将发酵液稀释使电导率为≤20mS/cm，将发酵上清直接上样capto MMC柱，收集目的蛋白峰。
所述疏水层析步骤中，在阳离子目标蛋白收集液中加入Na2SO4，使Na2SO4的终浓度达到0.7M，直接上样PHenyl Sepharose High Performance柱，收集目的蛋白峰。
所述分子筛层析步骤中，将疏水层析收集目的蛋白峰过Superdex 200prepgrand分子筛层析柱，用20mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰，得到重组人血清白蛋白—干扰素α2b。
根据重组人血白蛋白—干扰素α2b的性质，将重组人血白蛋白—干扰素α2b的发酵上清采用阳离子交换层析(capto MMC)，疏水层析(Phenyl SepharoseHigh Performance)和分子筛层析(Superdex 200prep grand)进行组合纯化生产，得到符合中国药典关于生物制品质量要求的原液。重组人血白蛋白—干扰素α2b在发酵过程中采用基础盐培养基，发酵上清的色素、离子强度和电导比较高，在采用普通离子交换层析时，需要利用超滤系统进行脱盐，发酵上清才能结合在柱子上。本发明在第一步层析过程中采用capto MMC阳离子交换层析，发酵上清不需要任何处理直接上样。因为capto MMC是一种复合配基的阳离子交换层析介质，其吸附过程具有耐盐特性，表明该配基在高电导下直接进样，并且蛋白结合在配基上，该介质结合在高强度的琼脂碱性配基上，放大时具有流率快、低反压的特点。不需要超滤系统对发酵上清进行处理，可以避免超滤系统在发酵液脱盐的过程中因剪切力比较高可能造成目的蛋白活性减低。这样不但节约了生产设备成本，而且提高了产品的质量。
第二步层析采用疏水层析(Phenyl Sepharose High Performance)，因为疏水层析具有高盐吸附，低盐洗脱的特性。而capto MMC阳离子交换层析需要高盐的条件下洗脱蛋白，从capto MMC阳离子交换层析中收集的目的蛋白液加入适当盐后可直接上疏水层析(Phenyl Sepharose High Performance)，这样操作简单，减少了样品的处理过程，降低了生产成本，提高了产率。
第三步采用分子筛层析(Superdex 200prep grand)，不但可以去除前两步无法去除的二聚体，而且可以直接更换样品的缓冲系统，可以直接用于制剂的配制，不需要采用其他更换缓冲体系的处理。整个层析过程采用阳离子交换层析(capto MMC)，疏水层析(Phenyl Sepharose High Performance)和分子筛层析(Superdex 200prep grand)三种不同分离机制的层析组合，具有很好的纯化效果。可以出除绝大部分的杂蛋白和色素、热源和核酸片段等非蛋白类杂质。整个纯化组合合理，不需要其他处理过程，操作简单，工艺稳定，易于产业化放大。
本发明工程菌的发酵表达水平在1000～1100mg/L。纯化出的原液收率在40～50％之间，相当于每升发酵液可获得重组人血白蛋白—干扰素α2b纯品为500mg左右，比活在1.0×106IU/mg以上。适合工业化生产的高纯度、高活性、低成本、高收率的纯化工艺。其他各项指标均要符合中国药典关于生物制品的规定。
附图说明
图1发酵产物和纯化各步SDS-PAGE电泳图
其中：1Mark 2发酵液 3阳离子 4疏水 5分子筛
图2阳离子层析(capto MMC)色谱图
其中：峰1为穿越峰 峰2为目的蛋白峰 峰3为杂质峰
图3疏水层析(Phenyl Sepharose High Performance)色谱图
其中：峰1为穿越峰 峰2为目的蛋白峰 峰3为杂质峰
图4分子筛层析(Superdex 200prep grand)色谱图
具体实施方式
一.重组人血清白蛋白—干扰素α2b毕赤酵母工程菌株的构建
1.目的基因获得
根据GeneBank中公布的HSA基因的序列信息，设计PCR引物
XhoI-HSA-P5：5’-cat ctc gag(内切酶XhoI位点)aaa aga(Kex2蛋白酶酶切位点)gat gca cac aag agt gag gtt-3’
BamHI-HSA-P3：5’-cat gga tcc(内切酶BamHI位点)taa gcc taa ggc agc ttgact tgc agc-3’
根据从现有干扰素α2b工程菌的质粒pHC16IFN-α2b序列信息，设计PCR引物BamHI-2b-P5：5’-cat gga tcc(内切酶BamHI位点)tgt gat ctg cct caa accca-3’
NotI-2b-P3：5’-cat gcggccgc(内切酶NotI位点)tca ttc ctt act tct taaact ttc-3’
用引物XhoI-HSA-P5和BamHI-HSA-P3将人的HSA基因从cDNA第一链文库中扩增出，XhoI-HSA-P5引物就在HSA基因5’-端添加限制性内切酶XhoI切点，且在XhoI点与HSA结构基因的5’-端之间插入Kex2蛋白酶酶切位点的氨基酸残基Lys-Arg对应的密码子(AAA AGA)，这就保证在毕赤酵母分泌表达融合蛋白时能够顺利切除信号肽序列，分泌产生的HSA同天然的HSA的N-端序列完全相同，而BamHI-HSA-P3引物在HSA基因的3’-端添加了限制性内切酶BamHI对应的DNA序列(GGATCC)，便于同后面的IFN-α2b基因连接。所以将PCR获得的符合目的HSA基因长度的片段用XhoI-BamHI双切，再进行胶回收后就得到了可以用于连接的HSA基因片段。用BamHI-P5和NotI-P3引物获得的IFN-α2b基因时，引物BamHI-P5在基因的5’-端添加了BamHI位点，而NotI-P3引物在IFN-α2b的3’-端添加了终止密码子(TGA)和限制性内切酶NotI的序列GCGGCCGC。这样PCR获得的基因IFN-α2b通过BamHI和NotI双切后，就可以通过BamHI的粘端将HSA和IFN-α2b首尾相连起来的融合基因。
用购买的Strategene公司的正常成人肝脏cDNA第一链中的cDNA作模板，用XhoI-HSA-P5和BamHI-HSA-P3引物，建立如下的PCR反应：
模板cDNA---------1μl
XhoI-HSA-P5--------2μl
BamHI-HSA-P3--------2μl
10X Polymerase BufferII-------3μl
DNA聚合酶--------0.2μl
dH2O--------------------------21.8μl
总体积30μl
PCR条件：95℃变性3分钟，按94℃-40秒、54℃-50秒、73℃-2分钟循环30次，最后73℃延伸5分钟。
以pHC16-IFN-α2b载体为模板，用BamHI-P5和NotI-P3引物PCR出IFN-α2b基因，PCR反应如下：
模板pHC16-IFN-α2b-----1μl
BamHI-2b-P5--------2μl
NotI-2b-P3--------2μl
10X Polymerase BufferII-------3μl
DNA聚合酶--------0.2μl
dH2O--------------------------21.8μl
总体积30μl
PCR条件：94℃变性2分钟，按94℃-30秒、54℃-30秒、72℃-80秒循环30次，最后72℃延伸3分钟
2.表达载体的构建
Invitrogen公司的表达载体pPICZα经XhoI和NotI双酶切-胶回收纯化处理，作插入用载体。将双切胶回收后的基因HSA(XhoI-BamHI)、IFN-α2b(BamHI-NotI)和载体pPICZα(XhoI-NotI)建立如下的连接反应：
pPICZα-XhoI-NotI(插入用载体)---------2μl
HSA基因片段(XhoI-BamHI双切)---------3.5μl
IFN-α2b基因片段(BamHI-NotI双切)-----3μl
T4连接缓冲液(10X)--------------------1μl
T4 DNA连接酶---------------------------0.5
总体积10μl
连接反应条件：25℃，1小时后，65℃，10分钟。
将上述连接反应液转化CaCl2法制备的大肠杆菌NovaBlue(Novagen公司产品)感受态细胞，铺板于LB+25ug/ml Zeocin+1.5％Agar平板上，37℃培养箱培养20小时，挑取平板上的阳性克隆，接种到LB+25ug/mlZeocin培养液中，培养后收集菌体，用Watson质粒小量提取试剂盒，采用XhoI-NotI双酶切法筛选含有HSA-IFN-α2b融合基因长度的阳性克隆，并进行DNA序列测定确认，最终得到序列完全符合设计要求的表达载体pPICZα-HSA-IFN-α2b。
3.重组质粒转化及高表达菌株的筛选
将上述经测序确认的表达载体pPICZα-HSA-IFN-α2b用DNA限制性内切酶PmeI酶切线性化，取2ul酶切后样品电泳检视线性化完全后，将剩余的质粒用苯酚抽提-无水乙醇沉淀-75％乙醇洗涤-干燥等处理后，将全部质粒溶解于5.0ul的重蒸水中，按照操作手册中描述的方法电转化巴斯德毕氏酵母X-33，在含有YPD+Zeocin的平板上筛选阳性转化子，按pPICZαA，B，and C操作手册中的筛选方法，筛选高表达的克隆。最终将确定高表达的作为原始菌种，成为重组人血白蛋白—干扰素α2b的工程菌株。
二、重组人血清白蛋白—干扰素α2b的高密度发酵
参照invitrogen毕赤酵母发酵手册，用毕赤酵母表达外源蛋白基本过程是：挑取在平板中活化的生产菌种的单菌落，接种YPD液体培养基(YPD液体培养基：酵母粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％)。30℃、250～300rpm条件下培养16～24小时，直到OD600＝2～6作为种子液。以5～10％的接种量接种基础盐培养基(基础盐培养基配方：磷酸(85％)26.7ml，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，硫酸镁-7H2O 14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40g，PTM1微量元素4.4ml，用去离子水加至1L中)。接种前用氨水将发酵培养基pH调到5.0，温度设定为30℃，溶氧始终大于20％饱和度。培养直到甘油被完全耗尽后，开始补加50％的甘油(每升甘油补料中需添加12ml微量元素)，设定补料速率为18.15ml/小时/升初始发酵液体积。至菌体湿重180～220g/L时，停止补甘油，甘油耗尽维持饥饿状态0.5～1h左右，开始补100％甲醇(每升甲醇中含12ml微量元素)进入诱导阶段，诱导前用氨水将培养基pH调到6.0，温度设定为25℃，开始设定甲醇补料速度为3.6ml/小时/L初始发酵液体积。在适应后补料速度再加倍到7.3ml/小时/L初始发酵液体积。以7.3ml/小时/L初始发酵液体积速度补料2小时后，提高补料速度至10.9ml/小时/L初始发酵液体积。并且这个补料速度保持到发酵的其余整个过程。维持溶氧20％以上，诱导70小时左右下罐。离心收集发酵液上清。发酵液上清作SDS-PAGE电泳检测表达量(图1)，表达水平在1000mg/l左右。
三、重组人血清白蛋白—干扰素α2b的纯化
1.重组人血清白蛋白—干扰素α2b的阳离子纯化
层析填料为capto MMC(美国GE公司)，缓冲液A为25mM醋酸-醋酸钠(pH＝4.6)，缓冲液B为50mM磷酸钠(pH7.0)+1M NaCl。用缓冲液A预先平衡capto MMC柱，用冰醋酸调节发酵上清液使pH为4.6后，再用蒸馏水将发酵液稀释使电导率为≤20mS/cm，将发酵上清直接上样capto MMC柱，上完样后以缓冲液A平衡柱子，将未结合到柱子的物质冲洗干净，再用100％的缓冲液B洗脱目的蛋白。收集目的蛋白峰(图2)，测蛋白浓度计算回收率，作SDS-PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度(图1)。经此步纯化，蛋白回收率为80％左右，蛋白纯度90％。
2.重组人血清白蛋白—干扰素α2b的疏水层析纯化
层析填料为Phenyl Sepharose High Performance(美国GE公司)，缓冲液A为20mM pH7.0的PB缓冲液加0.7M Na2SO4，缓冲液B为20mM pH7.0的PB缓冲液加0.3M Na2SO4。用缓冲液A预先平衡Phenyl Sepharose High Performance柱，在阳离子目标蛋白收集液中加入Na2SO4，使Na2SO4的终浓度达到0.7M，直接上样用缓冲液A平衡好的Phenyl Sepharose High Performance柱，上完样后以缓冲液A平衡柱子，将未结合到柱子的物质冲洗干净，再用100％的缓冲液B洗脱目的蛋白。收集目的蛋白峰(图3)，测蛋白浓度计算回收率，作SDS-PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度(图1)。经此步纯化，蛋白回收率为70％左右，蛋白纯度可达97％。
3.重组人血清白蛋白—干扰素α2b的分子筛纯化
层析填料为Superdex 200prep grand(美国GE公司)，用20mM的磷酸盐缓冲液平衡Superdex 200柱子，将疏水目的蛋白收集液直接上样，用20mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰(图4)。测蛋白浓度计算回收率，作SDS-PAGE电泳用凝胶成像系统扫描计算蛋白纯度(图1)。经此步纯化，蛋白回收率为90％，蛋白纯度可达100％。
四、重组人血清白蛋白—干扰素α2b原液的检测
根据中国药典有关规定对重组人血清白蛋白—干扰素α2b原液进行了相关检测，主要是原液的纯度和生物学活性
1.纯度分析
采用HPLC-C8反相柱(Waters，USA)，10％～80％含0.1％TFA乙腈梯度，流速为0.8ml/min，检测为280nm。所得原液的纯度可达100％。
2.体外生物活性分析
体外生物学活性测定采用WISH细胞病变抑制法，参照《中国药典2005年版》中《干扰素效价测定(细胞病变抑制法)》。蛋白定量采用lowry法，重组人血清白蛋白—干扰素α2b原液的比活在1.5×106IU/mg。其他各项质量标准均符合规定。
Claims (3)
1.一种重组人血白蛋白-干扰素α2b的生产方法，通过构建人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白基因的毕赤酵母工程菌株，发酵表达后再进行纯化，其特征在于，工程菌株的构建是将人血白蛋白cDNA的C端与IFN cDNA的N端融合，与酵母表达表达载体pPICZα连接后引入毕赤酵母X33表达，成为重组人血白蛋白-干扰素α2b的工程菌株；发酵表达后的纯化是通过将离心收集发酵上清液，后依次通过阳离子交换层析，疏水层析和分子筛层析得到重组人血清白蛋白-干扰素α2b；
所述阳离子交换层析，需要用冰醋酸调节，使pH为4.6，再用蒸馏水将发酵液稀释使电导率为≤20mS/cm，将发酵上清直接上样capto MMC柱；
所述疏水层析步骤中，在阳离子目标蛋白收集液中加入Na2SO4，使Na2SO4的终浓度达到0.7M，直接上样Phenyl Sepharose High Performance柱，收集目的蛋白峰；
所述分子筛层析步骤中，将疏水层析收集目的蛋白峰过Superdex 200prep grand分子筛层析柱，用20mM的磷酸盐缓冲液洗脱，收集目的蛋白峰，得到重组人血清白蛋白-干扰素α2b。
2.如权利要求1重组人血白蛋白-干扰素α2b的生产方法，其特征在于，所述重组人血白蛋白-干扰素α2b的工程菌株，在设计用于扩增人血白蛋白基因HSA引物时，在引物的5’端添加限制性内切酶XhoI切点，且在XhoI点与HSA结构基因的5’端之间插入Kex2蛋白酶酶切位点的氨基酸残基Lys-Arg对应的密码子AAA AGA，HSA基因的3’端添加了限制性内切酶BamHI对应的DNA序列GGATCC便于同后面的IFN-α2b基因连接；工程菌株在设计用于扩增人干扰素-α2b，即IFN-α2b基因引物时，在引物的5’端添加了BamHI位点，在引物的3’端添加了终止密码子TGA和限制性内切酶NotI的序列GCGGCCGC，这样PCR获得的基因IFN-α2b通过BamHI和NotI双切后，就可以通过BamHI的粘端将HSA和IFN-α2b首尾相连起来的融合基因；将基因HSA、IFN-α2b和载体pPICZα建立连接反应，转化毕赤酵母X33，筛选高表达的克隆。
3.如权利要求1或2重组人血白蛋白-干扰素α2b的生产方法，其特征在于，所述重组人血白蛋白-干扰素α2b的工程菌株，使用基因重组技术将人血白蛋白基因HSA与干扰素-α2b基因连接起来，中间使用GlySer两个氨基酸的连接子进行连接。
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