CN111996225A - 一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法 - Google Patents

一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，属于发酵工程技术领域。本发明以重组大肠杆菌BL21为发酵菌株，通过一级种子培养和二级种子培养后，接种至大肠杆菌培养基进行发酵培养，当OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加诱导剂进行降温诱导，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。本发明对培养基、培养工艺、诱导条件进行了集中改进；基于优化的发酵配方及培养条件，使培养效果得到显著提升；同时，发酵过程中进行降温诱导，促使蛋白正确折叠，发酵产物活性高。本发明所得的发酵产物，其中重组人干扰素α2b的生物学活性可达3.18×108IU/ml，同时其工艺稳定，具有突出的技术优势。

Description

一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法。
背景技术
干扰素是机体免疫细胞产生的一种细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过免疫应答而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白。干扰素在机体的免疫系统中发挥着重要的作用。干扰素有很多亚型，其中最大的一类亚型是α干扰素。α干扰素主要具有广谱抗病毒作用、免疫调节作用、抗肿瘤作用。
重组人α干扰素，是从人白细胞中克隆出α干扰素编码基因，通过基因工程技术，将其转化至外源微生物基因中，进而通过发酵方法规模化生产的人α干扰素。与天然α干扰素相比，其纯度更高、副作用较低、疗效更确切。重组人α干扰素亚型较多，其中α2b是一种常用的亚型，临床上广泛用于治疗急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣等病毒性疾病以及毛状细胞白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤等肿瘤疾病。
目前，在以重组大肠杆菌发酵表达重组人干扰素α2b的工艺中，普遍存在着产物活性较低的问题，而且，其工艺过程较为落后。因此，有必要对发酵工艺加以改进。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，以解决常规发酵方法所得产物的生物学活性较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，常规发酵方法的工艺过程不够先进。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，包括：以重组大肠杆菌BL21（Escherichia coli BL21）为发酵菌株，通过一级种子培养和二级种子培养后，接种至大肠杆菌培养基进行发酵培养，当OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加诱导剂进行降温诱导，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。其中，所述重组大肠杆菌BL21，是本领域中常规的重组人干扰素α2b表达菌株；该菌株可自市面购得，亦可采用常规基因工程方法，通过质粒载体将人α2b干扰素编码基因转化至大肠杆菌BL21而获得。
作为优选，所述一级种子培养的条件包括：一级种子培养基为LB培养基；按0.1~2.0%接种量接种至装有50±5ml培养液的250ml三角瓶中，150~200rpm，37.0±1.0℃培养4~12h，控制菌体密度OD1.0 600在1.0~6.0之间。
作为优选，所述二级种子培养的条件包括：二级种子培养基含有以下成分的至少一种：葡萄糖，丙三醇，蔗糖，乳糖；同时，二级种子培养基含有以下成分的至少一种：酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素；以1.0~5.0%接种量将一级种子液接种至含有二级种子培养基的发酵罐中，控制搅拌转速大于等于150rpm，溶氧大于等于50%，37.0±1.0℃，培养3~6h后，得到二级种子液；所述二级种子液的菌体密度OD1.0 600在1.0~3.0之间。
作为优选，所述发酵培养的条件包括：发酵培养基含有以下成分的至少一种：葡萄糖，丙三醇，蔗糖，乳糖；同时，发酵培养基含有以下成分的至少一种：酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素；同时，发酵培养基含有以下成分的至少三种：氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，氯化锰，硫酸铜，硫酸铁，硫酸镁；以1.0~10.0%接种量将二级种子液接种至发酵罐，控制搅拌转速大于等于200rpm，溶氧大于等于50%；当OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加0.1~2mmol/L的诱导剂并将温度降至14~35℃，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。
作为优选，发酵培养时，接种量为10.0%。
作为优选，添加0.1~2mmol/L的诱导剂时，OD1.0 600为15.0。
作为优选，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；添加诱导剂的终浓度0.1~2mmol/L。
作为优选，降温诱导的温度为14~35℃。
作为优选，在发酵培养的过程中，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L。
作为优选，该方法还包括以下步骤：在发酵培养结束后，10000rpm，10℃离心，收集菌体。
本发明提供了一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法。该技术方案对培养基、培养工艺、诱导条件进行了集中改进；基于优化的发酵配方及培养条件，使培养效果得到显著提升；同时，发酵过程中进行降温诱导，促使蛋白正确折叠，发酵产物活性高。本发明所得的发酵产物，其中重组人干扰素α2b的生物学活性可达3.18×108IU/ml，同时其工艺稳定，具有突出的技术优势。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
重组大肠杆菌BL21（Escherichia coli BL21）为发酵菌株，通过一级种子培养和二级种子培养后，接种至大肠杆菌培养基进行发酵培养，当OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加诱导剂进行降温诱导，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。所选用的发酵菌株为常规基因工程方法改造得到的、带有人α2b干扰素核苷酸序列质粒的重组大肠杆菌BL21。
进一步：在上述发酵工艺中，一级种子培养基为LB培养基，按0.1~2.0%接种量接种至装有50±5ml培养液的250ml三角瓶中，150~200rpm，37.0±1.0℃培养4~12h，控制菌体密度OD1.0 600在1.0~6.0之间。
进一步：二级种子培养基的碳源为葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种，培养基中的碳源为酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氨水、尿素中至少一种。并且以1.0~5.0%接种量将一级种子液接种至含有二级种子培养基的发酵罐中，控制搅拌转速大于等于150rpm，溶氧大于等于50%，37.0±1.0℃，培养3~6h后，得到二级种子液的菌体密度OD1.0 600在1.0~3.0之间。
进一步：发酵培养基的碳源为葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种，培养基中的碳源为酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氨水、尿素中至少一种，培养基的无机盐为氯化钠、磷酸二氢钾、氯化铵、磷酸氢二钾、氯化钙、氯化锰、硫酸铜、硫酸铁、硫酸镁中至少三种。并且以1.0~10.0%接种量将二级种子液接种至发酵罐，控制搅拌转速大于等于200rpm，溶氧大于等于50%。当培养OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加0.1~2mmol/L的诱导剂并将温度降至14~35℃，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。
进一步：发酵培养时，接种量为10.0%。
进一步：发酵培养时，诱导OD1.0 600为15.0。
进一步：发酵培养时，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，且终浓度为1mmol/L。
进一步：发酵培养时，降温诱导的温度为30℃。
进一步：发酵培养时，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L。
进一步：发酵结束培养时，10000rpm，10℃，离心收集菌体。
实施例1
发酵菌株（重组大肠杆菌BL21）经一级种子、二级种子培养后，按1.0%接种量接种至含有葡萄糖、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙的发酵培养基中，使用150L发酵罐，通风量100~200L/min，转速200~500rpm，pH7.0，温度37℃培养。当菌液OD1.0 600为14.7时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并降温至28℃，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L，发酵16h。通过测定发酵液中的重组人干扰素α2b生物学活性，结果为1.17×108IU/ml。
实施例2
发酵菌株（重组大肠杆菌BL21）经一级种子、二级种子培养后，按5.0%接种量接种至含有葡萄糖、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜的发酵培养基中，使用150L发酵罐，通风量100~200L/min，转速200~500rpm，pH6.8，温度37℃培养。当菌液OD1.0 600为15.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并降温至30℃，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L，发酵18h。通过测定发酵液中的重组人干扰素α2b生物学活性，结果为2.07×108IU/ml。
实施例3
发酵菌株（重组大肠杆菌BL21）经一级种子、二级种子培养后，按5.0%接种量接种至含有葡萄糖、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁的发酵培养基中，使用150L发酵罐，通风量100~200L/min，转速200~500rpm，pH7.0，温度37℃培养。当菌液OD1.0 600为14.2时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并降温至30℃，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L，发酵18h。通过测定发酵液中的重组人干扰素α2b生物学活性，结果为1.38×108IU/ml。
实施例4
发酵菌株（重组大肠杆菌BL21）经一级种子、二级种子培养后，按10.0%接种量接种至含有葡萄糖、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、硫酸铁的发酵培养基中，使用150L发酵罐，通风量100~200L/min，转速200~500rpm，pH7.0，温度37℃培养。当菌液OD1.0 600为15.2时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并降温至30℃，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L，发酵18h。通过测定发酵液中的重组人干扰素α2b生物学活性，结果为3.18×108IU/ml。
实施例5
发酵菌株（重组大肠杆菌BL21）经一级种子、二级种子培养后，按10.0%接种量接种至含有葡萄糖、酵母粉、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜的发酵培养基中，使用150L发酵罐，通风量100~200L/min，转速200~500rpm，pH7.0，温度37℃培养。当菌液OD1.0 600为10.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，并降温至30℃，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L，发酵20h。通过测定发酵液中的重组人干扰素α2b生物学活性，结果为1.17×108IU/ml。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，包括：以重组大肠杆菌BL21为发酵菌株，通过一级种子培养和二级种子培养后，接种至大肠杆菌培养基进行发酵培养，当OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加诱导剂进行降温诱导，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。
2.根据权利要求1所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，所述一级种子培养的条件包括：一级种子培养基为LB培养基；按0.1~2.0%接种量接种至装有50±5ml培养液的250ml三角瓶中，150~200rpm，37.0±1.0℃培养4~12h，控制菌体密度OD1.0 600在1.0~6.0之间。
3.根据权利要求2所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，所述二级种子培养的条件包括：二级种子培养基含有以下成分的至少一种：葡萄糖，丙三醇，蔗糖，乳糖；同时，二级种子培养基含有以下成分的至少一种：酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素；以1.0~5.0%接种量将一级种子液接种至含有二级种子培养基的发酵罐中，控制搅拌转速大于等于150rpm，溶氧大于等于50%，37.0±1.0℃，培养3~6h后，得到二级种子液；所述二级种子液的菌体密度OD1.0 600在1.0~3.0之间。
4.根据权利要求3所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：发酵培养基含有以下成分的至少一种：葡萄糖，丙三醇，蔗糖，乳糖；同时，发酵培养基含有以下成分的至少一种：酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素；同时，发酵培养基含有以下成分的至少三种：氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，氯化锰，硫酸铜，硫酸铁，硫酸镁；以1.0~10.0%接种量将二级种子液接种至发酵罐，控制搅拌转速大于等于200rpm，溶氧大于等于50%；当OD1.0 600达到5.0~20.0后，添加0.1~2mmol/L的诱导剂并将温度降至14~35℃，并通过流加补料控制发酵液中的碳源浓度，培养12~20h为止。
5.根据权利要求4所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，发酵培养时，接种量为10.0%。
6.根据权利要求4所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，添加0.1~2mmol/L的诱导剂时，OD1.0 600为15.0。
7.根据权利要求4所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；添加诱导剂的终浓度0.1~2mmol/L。
8.根据权利要求4所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，降温诱导的温度为14~35℃。
9.根据权利要求4所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，在发酵培养的过程中，控制发酵液中的碳源浓度在0.01~0.05mol/L。
10.根据权利要求4所述的一种利用微生物生产高活性重组人干扰素α2b的发酵方法，其特征在于，该方法还包括以下步骤：在发酵培养结束后，10000rpm，10℃离心，收集菌体。
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