CN113930468A - 一种人干扰素α1b及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种重组人干扰素α1b及其制备方法，属于生物医药领域。所述方法操作简单，可使大肠杆菌在周质细胞空间表达人干扰素α1b，无需将细胞破碎即可捕获，减少宿主蛋白释放，简化纯化步骤，所得人干扰素α1b纯度高，活性高，有利于人干扰素α1b的产业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种人干扰素α1b及其制备方法。
背景技术
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，其主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。
重组人干扰素-α是从人白细胞中克隆出干扰素-α基因，通过重组基因技术，将人类干扰素基因连接于载体(如细菌质粒)、转入大肠杆菌，使其表达干扰素，再通过生产和纯化技术，得到高纯度、高活性的制剂。根据个别氨基酸的不同可以分为IFNα-2a及IFNα-1b、IFNα-2b。
发明人在实施过程中，发现现有技术中，重组人干扰素α1b的制备绝大部分都是在大肠杆菌的细胞膜内表达重组人干扰素α1b，导致下游纯化时需要将细胞破碎，释放出大量宿主蛋白，增加纯化工序，使其纯化效率较低。
专利申请CN1724568A公开了一种重组人干扰素α1b的纯化工艺，该工艺需要将工程菌菌体裂解、包涵体的变性、包涵体的复性、henylSepharose疏水柱层析、CM SepharoseFF阳离子交换柱层析、Sephacryl S-100柱层析等工艺才能获得干扰素α1b纯品。
专利申请CN101885767A公开了一种取代单克隆抗体亲和层析的分离纯化重组人干扰素α1b的方法，也是采用将菌体匀浆破碎后柱层析等方法制备重组人干扰素α1b。
因此，仍亟需一种高效、活性高和纯度高的人干扰素α1b的制备方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供以下技术方案。
第一方面，本发明提供一种制备人干扰素α1b的方法。
一种制备人干扰素α1b的方法，其包括：以包含人干扰素α1b基因或其突变体的重组大肠杆菌为发酵菌株，通过种子培养基培养后，接种至发酵培养基进行发酵培养，当OD1.0 600达到5.0～20.0后，添加诱导剂进行诱导和培养，并通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源浓度。
所述诱导剂可以为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
所述重组大肠杆菌可以为重组大肠杆菌BL21。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌为包含人干扰素α1b基因或其突变体基因的重组大肠杆菌。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌为包含可以在周质细胞空间表达人干扰素α1b或其突变体的表达载体的重组大肠杆菌。
所述重组大肠杆菌可以为含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的至少一部分或者所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少99％序列同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的至少一部分或者所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少80％序列同一性的氨基酸序列可以在周质细胞空间表达人干扰素α1b。
所述添加诱导剂进行诱导和培养的温度可以为14℃～35℃。在一些实施例中，所述添加诱导剂进行诱导和培养的温度为16℃-28℃。在一些实施例中，所述添加诱导剂进行诱导和培养的温度为18℃-26℃。在一些实施例中，所述添加诱导剂进行诱导和培养的温度为20℃-25℃。
所述添加诱导剂进行诱导和培养的时间可以为12h～20h。在一些实施例中，所述添加诱导剂进行诱导和培养的时间为15h～20h。
所述发酵培养基可以包括碳源、氮源、无机盐和微量元素。
所述发酵培养基的碳源可以包括选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种。
所述发酵培养基的氮源可以包括选自酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素中的至少一种。
所述发酵培养基的无机盐可以包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁中的至少一种。在一些实施例中，所述发酵培养基的无机盐包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁中的至少两种。在一些实施例中，所述发酵培养基的无机盐包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁中的至少三种。在一些实施例中，所述发酵培养基的无机盐包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁中的至少四种。
所述发酵培养基的微量元素可以包括选自氯化锰，硫酸铜，硫酸铁中的至少一种。在一些实施例中，所述发酵培养基的微量元素包括选自氯化锰，硫酸铜，硫酸铁中的至少两种。在一些实施例中，所述发酵培养基的微量元素包括选自氯化锰，硫酸铜，硫酸铁中的至少三种。在一些实施例中，所述发酵培养基的微量元素包括氯化锰，硫酸铜和硫酸铁。
在一些实施例中，所述发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和微量元素，所述发酵培养基的碳源包括选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种；所述发酵培养基的氮源包括选自酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素中的至少一种；所述发酵培养基的无机盐包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁中的至少一种，所述发酵培养基的微量元素包括选自氯化锰，硫酸铜，硫酸铁中的至少一种。在一些实施例中，所述发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和微量元素，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖；所述发酵培养基的氮源为酵母粉；所述发酵培养基的无机盐为氯化钠、硫酸镁和磷酸二氢钾；所述发酵培养基的微量元素为硫酸铜。
基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的碳源的含量可以为0.04wt％-0.3wt％。在一些实施例中，基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的碳源的含量为0.1wt％-0.2wt％。
基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的氮源的含量可以为0.04wt％-0.3wt％。在一些实施例中，基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的氮源的含量为0.05wt％-0.3wt％。在一些实施例中，基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的氮源的含量为0.05wt％-0.2wt％。
基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的无机盐的含量可以为0.005wt％～0.1wt％。在一些实施例中，基于所述发酵培养基的总质量，所述发酵培养基的无机盐的含量可以为0.01wt％～0.1wt％。
基于所述发酵培养基的总质量，微量元素的含量可以为0.00004wt％-0.00065wt％。
在一些实施例中，所述发酵培养基可以包括碳源、氮源、无机盐和微量元素，所述发酵培养基的碳源包括选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种；所述发酵培养基的氮源包括选自酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素中的至少一种；所述发酵培养基的无机盐包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙中的至少一种；所述发酵培养基的微量元素包括选自氯化锰，硫酸铜，硫酸铁中的至少一种；基于所述发酵培养基的体积，所述发酵培养基的碳源的含量为0.04wt％～0.3wt％，所述发酵培养基的氮源的含量为0.04wt％～0.3wt％，所述发酵培养基的无机盐的含量为0.005wt％～0.1wt％，微量元素的含量为0.00004wt％-0.00065wt％。
在一些实施例中，所述发酵培养基可以包括碳源、氮源、无机盐和微量元素，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖；所述发酵培养基的氮源为酵母粉；所述发酵培养基的无机盐为氯化钠；或者所述发酵培养基的微量元素为硫酸铁；基于所述发酵培养基的体积，所述发酵培养基的碳源的含量为0.2wt％，所述发酵培养基的氮源的含量为0.2wt％，所述发酵培养基的微量元素的含量为0.0001wt％，所述发酵培养基的无机盐的含量为0.05wt％。
所述种子培养基可以包括一级种子培养基和二级种子培养基。
所述一级种子培养基可以为LB培养基。
所述二级种子培养基可以包括碳源和氮源。
所述二级种子培养基的碳源可以包含选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种。
所述二级种子培养基的氮源可以包含选自酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氨水、尿素中至少一种。
基于二级种子培养基的总质量，所述二级种子培养基的碳源的含量可以为0.04wt％-0.3wt％。在一些实施例中，基于二级种子培养基的总质量，所述二级种子培养基的碳源的含量为0.05wt％-0.2wt％。
基于二级种子培养基的总质量，所述二级种子培养基的氮源的含量可以为0.05wt％-0.3wt％。在一些实施例中，基于二级种子培养基的总质量，所述二级种子培养基的氮源的含量为0.05wt％-0.2wt％。
在一些实施例中，所述二级种子培养基包括碳源和氮源，所述二级种子培养基的碳源包含选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种；所述二级种子培养基的氮源包含选自酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氨水、尿素中至少一种。在一些实施例中，所述二级种子培养基包括碳源和氮源，所述二级种子培养基的碳源包含选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种；所述二级种子培养基的氮源包含选自酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氨水、尿素中至少一种；基于二级种子培养基的总质量，所述二级种子培养基的碳源的含量为0.04wt％-0.3wt％。，所述二级种子培养基的氮源的总质量为0.05wt％-0.3wt％。在一些实施例中，所述二级种子培养基包括碳源和氮源；所述二级种子培养基的碳源为葡萄糖，所述二级种子培养基的氮源为酵母粉。在一些实施例中，所述二级种子培养基包括碳源和氮源；所述二级种子培养基的碳源为葡萄糖，所述二级种子培养基的氮源为酵母粉；基于二级种子培养基的总质量，所述二级种子培养基的碳源的含量为0.2wt％，所述二级种子培养基的氮源的含量为0.2wt％。
所述通过种子培养基培养包括按体积百分比可以为0.1％～2.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm～200rpm，36℃～38℃培养4h～12h，得一级种子液；以体积百分比为1.0％～5.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速≥150rpm，溶氧量≥50％，36℃～38℃，培养3h～6h，得到二级种子液。
所述接种至发酵培养基可以包括按体积百分比为5.0％-10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基。
所述发酵培养可以包括在搅拌转速≥200rpm，溶氧量≥20％，36℃～38℃的条件进行培养。
所述通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源浓度包括通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源的含量为0.001wt％～0.01wt％。
所述通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源浓度包括当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，流加补料液控制发酵培养基中的碳源的含量为0.001wt％～0.01wt％。
基于发酵培养基的体积，所述诱导剂的含量可以为0.1mmol/L～2.0mmol/L。在一些实施例中，基于发酵培养基的体积，所述诱导剂的含量为0.5mmol/L～1.5mmol/L。在一些实施例中，基于发酵培养基的体积，所述诱导剂的含量为0.5mmol/L～1.0mmol/L。
所述补料液可以包括含碳源的溶液，含碳源和氮源的溶液，含碳源、氮源和无机盐的溶液，或者发酵培养基。
所述方法还可以包括以下步骤：诱导和培养结束后，离心，收集菌体。
所述方法还可以包括以下步骤：诱导和培养结束后，离心，收集菌体，分离和纯化。
所述分离和纯化可以包括用pH＝6.0-8.0的柠檬酸酸盐或磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h-3.0h，12000g-15000g离心15min-30min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述方法制备所得人干扰素α1b。
一种第一方面所述方法制备所得人干扰素α1b。所述人干扰素α1b纯度高，生物活性高。
有益效果
相比现有技术，本发明至少具有包括以下有益技术效果中的一种：
(1)通过优选采用20℃-25℃的诱导和培养温度，提高酶的转录效率，促使蛋白正确折叠，有利于提高人干扰素α1b的表达量和生物学活性；过高的诱导和培养温度虽然提高了人干扰素α1b的表达量，但却大大降低了其生物学活性；过低的诱导和培养温度不利于人干扰素α1b的表达，表达量会有所降低。
(2)现有技术中，大肠杆菌基本都在细胞膜内表达人干扰素α1b，导致下游纯化时需要将细胞破碎，释放出大量宿主蛋白，增加纯化工序，使其纯化效率较低。为了克服以上技术缺陷，本发明采用可以在周质空间表达人干扰素α1b的大肠杆菌进行培养，使大肠杆菌在周质空间表达人干扰素α1b，无需将细胞破碎即可捕获，减少宿主蛋白释放，简化纯化步骤。
(3)相比其他培养工艺，本发明通过优化培养工艺，如采用20℃-25℃的诱导和培养温度，以及采用合适的发酵培养基组分，诱导剂加入时机和合适培养条件等，大大提高了人干扰素α1b的表达量和生物学活性。
(4)发酵培养基中通过加入硫酸镁和硫酸铜，起到协同作用，大大提高了人干扰素α1b的表达量。
(5)由于采用的诱导温度偏低，所以本发明优选采用碳源含量为0.1wt％-0.2wt％的发酵培养基，补充更多的能源，有利于提高表达量和表达速率。
(6)采用本发明所述技术方案制备所得人干扰素α1b的纯度高，生物活性高。
(7)本发明通过优化培养工艺，例如诱导和培养温度，发酵培养基组分(尤其是采用合适范围的发酵培养基碳源含量)以及其他培养工艺，更适用在周质细胞空间表达的大肠杆菌的培养，更有利于大肠杆菌在周质细胞空间表达。
术语定义：
在本发明的上文中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现±10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如±1％、±2％、±3％、±4％或±5％的差异。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项的组合。
离心过程中的“g”表示相对离心力，例如“15000g离心”表示以15000倍重力加速度的离心加速度进行离心。
术语“OD1.0 600”是指用光程为1.0cm的比色皿检测的600nm波长处的光密度。
术语“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相说明书8/17页12 CN 108570109 A 12似性。同源性可通过比较各序列中可为比较目的来比对的位置而确定。当所比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么这些分子在那个位置上是同源的。序列之间的同源性程度随着序列共有的匹配或同源位置的数目而变化。“无关”或“非同源的”序列与本公开的序列中之一共有小于40％的同一性，或替代地小于25％的同一性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例以对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
实施例1：重组大肠杆菌的制备
1.1重组人干扰素α1b突变体C86S基因
采用基因合成技术已经十分成熟，可委托第三方生物技术服务公司进行合成，程序比较固定。可以根据指定的基因序列直接合成，实现定点突变的目的。
目标重组人干扰素α1b突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码基因为SEQ IDNO：2，委托第三方生物技术服务公司直接合成目标编码基因。
1.2重组人干扰素α1b突变体C86S表达菌株构建、转化和鉴定。
本实施例中宿主菌选择的是大肠杆菌BL21(DE3)。
合成pelB-IFNa1b-86ser基因，Hind III和Nde I酶切回收目的片段，连接到pET-22b(+)的Hind III和Nde I位点，构建出重组人干扰素α1b突变体C86S表达质粒。通过化学转化导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，氨苄青霉素筛选阳性克隆子，阳性克隆子液体LB中过夜培养，提取质粒，酶切验证，得到重组人干扰素α1b突变体C86S表达菌株，即目标重组大肠杆菌。
实施例2：诱导温度的考察(15℃)
一级种子培养基：LB培养基。
二级种子培养基：基于二级种子培养基的总质量，含0.1wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05wt％的氯化钠和0.01wt％的磷酸二氢钾。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.1wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05％的氯化钠、0.01wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁和0.0005wt％的硫酸铜。
发酵菌株：实施例1所得重组大肠杆菌。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为5.0％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至15℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为8.9％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.0×106IU/ml，纯度：99.5％。
实施例3：诱导温度的考察(30℃)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为7.5％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至30℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为9.8％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：7.5×106IU/ml，纯度：99.2％。
实施例4：诱导温度的考察(37℃)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于37℃进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为12.6％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：6.5×106IU/ml，纯度：99.0％。
实施例5：诱导温度的考察(20℃)以及发酵培养基碳源含量的考察(发酵培养基含0.1wt％的葡萄糖)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为9.4％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.5×106IU/ml，纯度：99.8％。
实施例6：诱导温度的考察(25℃)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至28℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为9.5％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：9.0×106IU/ml，纯度：99.4％。
实施例6：诱导温度的考察(24℃)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至24℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为9.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：9.0×106IU/ml，纯度：99.4％。
实施例8：诱导剂加入时机考察
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到10.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为7.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.0×106IU/ml，纯度：99.7％。
实施例9：诱导剂加入时机考察
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵培养基、发酵菌株：同实施例2。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到15.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为6.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：7.5×106IU/ml，纯度：99.6％。
实施例10：发酵培养基的考察(不含微量元素和硫酸镁)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.1wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05wt％的氯化钠和0.015wt％的磷酸二氢钾。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至30℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为5.6％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.0×106IU/ml，纯度：99.7％。
实施例11：发酵培养基的考察(不含硫酸镁)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.1wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05wt％的氯化钠、0.015wt％的磷酸二氢钾和0.0005wt％的硫酸铜。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至30℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为6.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.0×106IU/ml，纯度：99.8％。
实施例12：发酵培养基的考察(不含硫酸铜)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.1wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05wt％的氯化钠、0.015wt％的磷酸二氢钾和0.005wt％的硫酸镁。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至30℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为6.5％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.0×106IU/ml，纯度：99.8％。
实施例13：发酵培养基碳源含量的考察(发酵培养基含0.04wt％的葡萄糖)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.04wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05％的氯化钠、0.01wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁和0.0005wt％的硫酸铜。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为6.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.2×106IU/ml，纯度：99.7％。
实施例14：发酵培养基碳源含量的考察(发酵培养基含0.20wt％的葡萄糖)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.20wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05％的氯化钠、0.01wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁和0.0005wt％的硫酸铜。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为10.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.4×106IU/ml，纯度：99.9％。
实施例15：发酵培养基碳源含量的考察(发酵培养基含0.25wt％的葡萄糖)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.25wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05％的氯化钠、0.01wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁和0.0005wt％的硫酸铜。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为8.0％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.3×106IU/ml，纯度：99.6％。
实施例16：发酵培养基碳源含量的考察(发酵培养基含0.30wt％的葡萄糖)
一级种子培养基、二级种子培养基、发酵菌株：同实施例2。
发酵培养基：基于发酵培养基的总质量，含0.30wt％的葡萄糖、0.1wt％的酵母粉、0.05％的氯化钠、0.01wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁和0.0005wt％的硫酸铜。
一级种子培养：按体积百分比为1.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm，37℃培养8h，得一级种子液；
二级种子培养：以体积百分比为2.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速150rpm，溶氧量50％，37℃，培养3h，得到二级种子液；
发酵培养：按体积百分比为10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基，在搅拌转速200rpm，溶氧量20％，37℃的条件进行培养，当OD1.0 600达到5.0后，降温至20℃，并添加1mmol/L(基于发酵培养基的体积)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导和培养15h，当发酵培养基中碳源含量≤0.01wt％时，通过流加发酵培养基控制发酵培养基中的碳源浓度为0.001wt％～0.01wt％。
后处理：发酵培养结束后，于10000rpm，离心10min，收集菌体，通过SDS-PAGE方法测定收集的菌体中的重组人干扰素α1b表达量，结果为6.5％。
分离和纯化：用pH＝6.0的磷酸盐缓冲液进行菌体重悬1.0h，12000g离心15min，收集上清液，即抽提液，再经过离子层析和疏水层析即可获得人干扰素α1b原液。
检测：测定所得人干扰素α1b生物学活性和纯度，结果为生物学活性：8.4×106IU/ml，纯度：99.8％。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
序列表
<110> 深圳科兴药业有限公司
<120> 一种人干扰素α1b的制备方法
<130> KXYY-2021-0002CN
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> (人工序列)
<400> 1
Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Asp Asn Arg Arg Thr Leu Met
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
35 40 45
Gln Lys Ala Pro Ala Ile Ser Val Leu His Glu Leu Ile Gln Gln Ile
50 55 60
Phe Asn Leu Phe Thr Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Asp
65 70 75 80
Leu Leu Asp Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
100 105 110
Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130 135 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu
145 150 155 160
Arg Leu Arg Arg Lys Glu
165
<210> 2
<211> 579
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 2
catatgaaat acctgctgcc gaccgctgct gctggtctgc tgctcctcgc tgcccagccg 60
gcgatggcct gcgacctgcc ggaaacccac tctctggaca accgtcgtac cctgatgctg 120
ctggctcaga tgtctcgtat ctctccgtct tcttgcctga tggaccgtca cgacttcggt 180
ttcccgcagg aagaattcga cggtaaccag ttccagaaag ctccggctat ctctgttctg 240
cacgaactga tccagcagat cttcaacctg ttcaccacca aagactcttc tgctgcttgg 300
gacgaagacc tgctggacaa attctctacc gaactgtacc agcagctgaa cgacctggaa 360
gcgtgcgtta tgcaggaaga acgtgttggt gaaaccccgc tgatgaacgc tgactctatc 420
ctggctgtta aaaaatactt ccgtcgtatc accctgtacc tgaccgaaaa aaaatactct 480
ccgtgcgctt gggaagttgt tcgtgctgaa atcatgcgtt ctctgtctct gtctaccaac 540
ctgcaggaac gtctgcgtcg taaagaataa tgaaagctt 579
Claims (10)
1.一种制备人干扰素α1b的方法，其包括：以包含人干扰素α1b基因或其突变体基因的重组大肠杆菌为发酵菌株，通过种子培养基培养后，接种至发酵培养基进行发酵培养，当OD1.0 600达到5.0～20.0后，添加诱导剂进行诱导和培养，并通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源浓度。
2.根据权利要求1的方法，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；和/或
所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌BL21；和/或
所述重组大肠杆菌为包含人干扰素α1b基因或其突变体基因的重组大肠杆菌；和/或
所述重组大肠杆菌为包含可以在周质细胞空间表达人干扰素α1b或其突变体的表达载体的重组大肠杆菌；和/或
所述重组大肠杆菌含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的至少一部分或者所述重组大肠杆菌含与SEQ ID NO：2至少80％序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，所述添加诱导剂进行诱导和培养的温度为14℃～35℃；或者所述添加诱导剂进行诱导和培养的温度为20℃-25℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述添加诱导剂进行诱导和培养的时间为12h～20h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，所述发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和微量元素；和/或
所述发酵培养基的碳源包括选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种；和/或
所述发酵培养基的氮源包括选自酵母粉，酵母膏，牛肉膏，蛋白胨，氨水，尿素中的至少一种；和/或
所述发酵培养基的无机盐包括选自氯化钠，磷酸二氢钾，氯化铵，磷酸氢二钾，氯化钙，硫酸镁中的至少一种；和/或
所述发酵培养基的微量元素包括选自氯化锰，硫酸铜，硫酸铁中的至少一种；和/或
所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基；和/或
所述一级种子培养基为LB培养基；和/或
所述二级种子培养基包括碳源和氮源；和/或
所述二级种子培养基的碳源包含选自葡萄糖、丙三醇、蔗糖、乳糖中的至少一种；和/或
所述二级种子培养基的氮源包含选自酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氨水、尿素中至少一种。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，所述通过种子培养基培养包括按体积百分比为0.1％～2.0％的接种量将发酵菌株接种至一级培养基中，150rpm～200rpm，36℃～38℃培养4h～12h，得一级种子液；以体积百分比为1.0％～5.0％的接种量将一级种子液接种至二级种子培养基中，于搅拌转速≥150rpm，溶氧量≥50％，36℃～38℃，培养3h～6h，得到二级种子液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，所述接种至发酵培养基包括按体积百分比为5.0％-10％的接种量将二级种子液接种至发酵培养基；和/或
所述发酵培养包括在搅拌转速≥≥200rpm，溶氧量≥20％，36℃～38℃的条件进行培养；和/或
所述通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源浓度包括通过流加补料液控制发酵培养基中的碳源的含量为0.001wt％～0.01wt％。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，基于发酵培养基的体积，所述诱导剂的含量为0.1mmol/L～2.0mmol/L。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，所述补料液包括含碳源的溶液，含碳源和氮源的溶液，含碳源、氮源和无机盐的溶液，或者发酵培养基；和/或
所述方法还包括以下步骤：诱导和培养结束后，离心，收集菌体。。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的方法制备所得人干扰素α1b。
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