CN110527690A

CN110527690A - 一种耐热型单宁酶及其应用

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Publication number: CN110527690A
Application number: CN201910716885.8A
Authority: CN
Inventors: 肖安风; 陈会景; 邵嫄; 杨秋明; 翁惠芬; 肖琼; 张永辉
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2019-08-05
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐热型单宁酶及其应用。本发明提供了一种编码耐热型单宁酶的基因，耐热型单宁酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码耐热型单宁酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO：2所示，该基因是从黑曲霉(Aspergillus niger sp.FJ0118)中进行PCR扩增获得的，本发明提供的耐热型单宁酶具有显著大于现有单宁酶的活性及热稳定性，并且可量产单宁酶，使得该单宁酶在同步茶浸提及酶处理应用中，能有效降低茶汤中酯型儿茶素的含量及茶汤的浑浊度。

Description

一种耐热型单宁酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种耐热型单宁酶及其应用。

背景技术

单宁酶，又称单宁酰基水解酶(tannin acyl hydrolase，TAH，EC.3.1.1.20)，是一种用途广泛的生物催化剂，在生物转化中发挥重要的作用，在食品、污水处理、制革、制药，尤其是茶饮料处理方面具有广泛的应用价值。此外，FDA(美国食品及药品管理局)已经公布单宁酶为安全食品，同时日本也允许单宁酶应用于食品制造业。因此，近年来对单宁酶的研究备受关注，具有广阔的应用前景。

目前，工业化单宁酶的生产主要通过传统固态发酵和液态发酵两种方法，相比于液态发酵，固态基质中水不溶性成分高，为微生物尤其是丝状真菌提供了良好的附着位点，微生物生长环境良好，酶产量高且酶系丰富。但固态发酵存在一些不可避免的缺点，例如发酵过程中产生过多次级代谢产物，为后期纯化带来困难。基于此，利用毕赤酵母异源表达单宁酶可有效解决上述问题；与单宁酶发酵方式相比，利用异源表达系统生产单宁酶具有产量高、成本低、操作技术成熟、遗传背景清楚等优点。此外，构建异源表达载体时，利用高效强启动子对重组蛋白进行高效表达，能降低背景表达量，同时也可利用纯化标签(如His标签)解决纯化难题。因此，相比于传统发酵方式，利用异源表达系统进行外源蛋白的表达具有强大的优势。

然而，目前生产的单宁酶的酶活仍然较低和热稳定性也较差。因而现有的单宁酶生产技术仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出一种编码耐热型单宁酶的基因，所述耐热型单宁酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明基于PCR的方法分离克隆了黑曲霉单宁酶An-Tan的基因，DNA全序列分析结果表明，黑曲霉单宁酶An-Tan的基因全长分别为1725bp。根据本发明的实施例，该耐热型单宁酶 An-Tan包括554个氨基酸，An-Tan酶活为390.4U/mL；从而提供了一种酶活较高的单宁酶，且该单宁酶具有较好的热稳定性，在较高的温度范围内仍保持酶活较长时间。

根据本发明的实施例，所述基因是从黑曲霉(Aspergillus niger sp.FJ0118)中进行PCR 扩增获得的，所述黑曲霉(Aspergillus niger sp.FJ0118)于2019年05月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019358，分类命名为Aspergillusniger sp. FJ0123黑曲霉FJ0123，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。

根据本发明实施例的黑曲霉可以利用其单宁酶基因制备出酶活高，酶活可达到390.4U/mL，热稳定好的单宁酶，在较高的温度范围内仍能保持酶活较长时间，并且该单宁酶的产量高，生物量可达到309mg/mL，使得利用该黑曲霉制备出的单宁酶可较好的在高温条件下有效的降低茶汤中酯型儿茶素的含量。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备耐热型单宁酶的方法，包括以下步骤：

1)将上述的编码耐热型单宁酶的基因进行双酶切，以获得酶切片段；

2)将所述酶切片段与经同样双酶切的毕赤酵母pPIC9K连接，以获得表达载体pPIC9K-Tan1；

3)将所述表达载体pPIC9K-Tan分别转化毕赤酵母SMD1168，以获得转化体；

4)在适于单宁酶表达的条件下培养所述转化体，分离纯化，以获得耐热型单宁酶。

根据本发明实施例，本发明通过设计了两对特异引物，将编码黑曲霉单宁酶成熟蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO：2所示)用PCR方法从黑曲霉基因中扩增出来，克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K，构建表达载体pPIC9K-Tan，采用电击转化毕赤酵母SMD1168获得转化体，经甲醇发酵诱导表达出耐热型单宁酶An-Tan。利用本发明实施例的方法，能够制备出酶活高，热稳定好的单宁酶，并且酶产量高，可较好的在高温条件下有效的降低茶汤中酯型儿茶素的含量。

根据本发明的实施例，上述方法还可以包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述步骤4)中，将所述转化体接种于罐上发酵培养基中进行甲醇诱导罐诱导表达。

根据本发明的实施例，所述甲醇诱导罐诱导表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。

根据本发明的实施例，所述步骤4)的分离纯化为：采用1.6×20cm的阴离子交换柱纯化蛋白，用柠檬酸缓冲液平衡柱子，流速为1mL/min；加入耐热型单宁酶粗酶液，流速为1mL/min，孵育20min；用含NaCl的柠檬酸缓冲液洗脱，流速为1mL/min，用收集并浓缩各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

在本发明的第三方面中，本发明提出了前述方法制得的耐热型单宁酶。如前所述，根据本发明的实施例，可制备出酶活高，热稳定好的单宁酶，并且酶产量高，使得利用该黑曲霉制备出的单宁酶可较好的在高温条件下有效的降低茶汤中酯型儿茶素的含量。

在本发明的第四方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了上述耐热型单宁酶在同步茶浸提和酶处理降低酯型儿茶素中的应用，包括以下步骤：

取粉碎后的茶叶梗1g置于具塞锥形瓶中，加入70mL蒸馏水和10mL酶活力为100 U/mL耐热型单宁酶液，于60℃下，水浴浸提2h；

趁热利用循环水真空泵减压过滤，用蒸馏水清洗1-2次，合并滤液定容至100mL；

以未经酶处理的茶梗浸提液为对照，利用高效液相色谱法鉴定酶处理效果。

将上述耐热型单宁酶用在茶汤提取过程中，降低酯型儿茶素的含量，与以往先浸提后酶处理的方法相比，可在保证酶法催化效率的基础上，大大缩短处理时间，提高效率，并且减少工业成本消耗。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为单宁酶基因PCR扩增结果；

图2为表达载体pPIC9K-Tan构建示意图；

图3为转化体SMD-Tan菌液破壁PCR验证；

图4为重组质粒线性化验证；

图5为转化体破壁PCR验证；

图6为罐上发酵单宁酶活力变化曲线；

图7为单宁酶DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析；

图8为单宁酶An-Tan的最适温度曲线；

图9为单宁酶Ao-Tan的最适温度曲线；

图10为单宁酶An-Tan温度稳定性曲线；

图11为单宁酶Ao-Tan的温度稳定性曲线；

图12为单宁酶An-Tan的最适pH曲线；

图13为单宁酶Ao-Tan的最适pH曲线；

图14为单宁酶An-Tan的pH稳定性；

图15为单宁酶Ao-Tan的pH稳定性；

图16为未处理及An-Tan处理的茶梗提取液液相色谱图；

图17为Ao-Tan处理及An-Tan处理的茶梗提取液液相色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

本发明是基于下列事实完成的：将现有来自NCBI上公布的单宁酶基因 (XM_001401772)中5’端部分序列切除后获得的蛋白质具有高单宁酶活性。

单宁酶

根据本发明的一个实施例，所述耐热型单宁酶具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列。与NCBI上公布的单宁酶基因(XM_001401772)所编码的单宁酶相比，本发明的耐热型单宁酶的N末端被截短20个氨基酸。将本发明的N端截短20个氨基酸后获得的单宁酶与单宁酶(XM_001401772)相比，具有更高的单宁酶活性和更好的热稳定性。

表达载体

本文中所使用的术语“表达载体”是指含有有效连接到控制元件的基因的构建体。所述控制元件能够影响基因在适当宿主中的表达。这类所述的控制元件包括影响转录的启动子，控制转录的可选操纵子序列，编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。本发明的表达载体包括质粒、基因组、线粒体DNA、病毒或核酸片段。根据本发明的实施例，采用pPIC9K-Tan质粒作为表达载体，由此便于在宿主例如大肠杆菌中表达期望的蛋白质(单宁酶)。此处所使用的术语“质粒”通常指一种环状双链(ds)DNA构健体，其在许多细菌和真核细胞中都能够形成染色体外自主复制遗传元件。

根据本发明实施例，所述表达载体包含根据本发明实施例的编码耐热型单宁酶的基因，其中所编码的耐热型单宁酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该表达载体由毕赤酵母表达载体pPIC9K在其AvrⅡ和NotⅠ酶切位点插入如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的DNA分子获得，经PCR和酶切验证并测序，表明如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的DNA 分子已成功构建至毕赤酵母表达载体pPIC9K中的AvrⅡ和NotⅠ酶切位点间，其质粒图谱见图2。

转化体

在本文中，所采用的术语“转化体”是指接受了外源遗传物质(质粒等)使遗传特性发生了改变的宿主细胞。根据本发明的实施例，该转化体能够表达具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的单宁酶。根据本发明的一些具体实施例，采用毕赤酵母作为宿主细胞，这样便于转化宿主细胞，以及方便回收和纯化所表达的单宁酶。本发明将表达载体pPIC9K-Tan转化至毕赤酵母SMD1168感受态细胞中，得到一种能够产生耐热型单宁酶的转化体，经 PCR和酶切验证并测序，表明所述表达载体已成功转入毕赤酵母SMD1168中。

在本发明中使用的术语“转化”应作广义理解，可以是指任何能够使得宿主细胞表达外源基因的方法。可以采用任何传统的方法，将表达载体导入宿主细胞中，例如电机转化法。经过重组菌株转化的宿主细胞中的载体可以以游离地形式存在，即表达单宁酶的基因在表达载体上主要由表达载体上携带的表达控制元件进行表达单宁酶。根据本发明的实施例，表达重组黑曲霉单宁酶的基因也可以整合到宿主细胞的基因组中，由宿主细胞的基因组控制其表达。在宿主细胞中含有多拷贝的游离型的载体。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1单宁酶基因的PCR扩增

1.设计引物：根据NCBI上公布的单宁酶基因(XM_001401772)序列信息，利用Premier 公司的Primer Premier 5设计引物，引物序列如下：

Tan-F：5’-ATGCGCTCACCCACTCGAGTTTCC-3’(SEQ ID NO：3)；

Tan-R：5’-CTAGTACACAGGCATGGGAACCGCA-3’(SEQ ID NO：4)；

2.黑曲霉基因组提取：

从福建省茶厂采集土壤样品，通过平板初筛，固体发酵产酶复筛，根据酶活力筛选，获得稳定传代菌株，对其进行菌种鉴定后，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO:M2019358，分类命名为Aspergillus niger sp.FJ0118黑曲霉FJ0118。

将黑曲霉(Aspergillus niger sp.FJ0118)接种于固体PDA斜面上，30℃恒温培养4～5 天；将斜面上的孢子用无菌生理盐水洗下，用无菌玻璃珠打散，再用蒸馏水调整其OD₆₀₀为2.0，接种于带有玻璃珠的种子培养基中，30℃、180r/min培养24h，将培养基用抽滤干净，用去离子水清洗三次后，将菌丝体置于预冷的研钵中，边添加液氮边研磨，直至研磨成细小的白色粉末，用天根生化科技(北京)有限公司的Plant Genomic DNA ExtractionKit 试剂盒提取黑曲霉基因组DNA。

3.单宁酶基因扩增：以步骤2获得的黑曲霉基因组DNA作为为模板，对单宁酶基因进行扩增。目的基因的扩增采用50μL体系，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

混匀，瞬时离心，反应条件为94℃变性5min，然后94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸4min，28个循环后72℃保温5min。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证，如图1所示，得到的PCR产物约2000bp，测序结果表明，此单宁酶基因大小为1725bp，预测编码 575个氨基酸。

实施例2表达载体pPIC9K-Tan的构建

1.由于信号肽会对毕赤酵母异源表达造成干扰，因此利用SignalP 4.1Server信号肽预测服务器对实施例1获得的单宁酶碱基序列进行在线信号肽预测，重新设计引物通过PCR扩增去除信号肽，引物序列如下：

Tan-F2：5’-ACGACTCCTAGGGGGACTCCTTCCACGTTGGCGGA-3’(SEQ ID NO： 5)；

Tan-R2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTACACAGGCATGGGAACCGCAT-3’ (SEQ ID NO：6)；

2.用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)，操作按产品说明书提供的步骤进行回收上述去除信号肽的黑曲霉单宁酶基因。

3.将回收的黑曲霉单宁酶基因进行双酶切，双酶切采用20μL体系，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

混匀，离心，37℃酶切12h。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果。在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5mL离心管中。

双酶切产物的回收与纯化：用小量DNA片段快速胶回收试剂盒(购自Takara公司)，操作按产品说明书提供的步骤进行。

4.毕赤酵母表达载体pPIC9K(购自Invitrogen公司)双酶切及其回收

双酶切采用20μL体系，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

混匀，离心，37℃酶切12h。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，观察结果：在紫外灯下，用干净的刀片切下目的条带，放入1.5mL离心管中。按照小量DNA片段快速胶回收试剂盒产品说明书提供的步骤进行双酶切产物的回收与纯化。

5.酶切片段与表达载体的连接

将经AvrⅡ和NotⅠ双酶切的黑曲霉单宁酶基因，插入到经同样双酶切的表达载体pPIC9K中，构建成表达载体pPIC9K-Tan。用20μL体系，在0.2mL PCR管中加入下列成分：

混匀，瞬时离心，16℃下连接20min后，即获得表达载体pPIC9K-Tan，见图2，然后，转化至大肠杆菌DH5α内进行测序验证。

6.大肠杆菌DH5α化学转化感受态细胞的制备(用Takara公司的试剂盒)

①从LB平板(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂粉15g，加入蒸馏水900mL，充分溶解后，定容至1L，121℃高压灭菌20min)上挑取新活化的E.coli DH5α 单菌落，接种于5mL LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加入蒸馏水900mL，充分溶解后，定容至1L，121℃高压灭菌20min)中，37℃振荡培养12 h。

②将上述培养物以1：100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.5左右。

③利用高效感受态细胞制备试剂盒(Takara公司)制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。

④将感受态细胞分装成50μL/管，-80℃保存备用。

7.连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α

从-80℃冰箱中取上述的感受态细胞DH5α，迅速冰浴解冻。取连接产物(表达载体pPIC9K-Tan)加入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，冰浴30min，42℃水浴热击90s，取出后立即冰浴2min，加入1mL LB液体培养基，37℃培养过夜。挑取阳性单菌落接种到氨苄青霉素抗性LB培养基中，37℃、180rpm过夜培养，通过菌液PCR验证阳性单菌落和测序分析表明克隆的目的基因为目的基因。结果如图3所示，使用通用引物及特异性引物均可扩增出正确大小的条带，表明载体构建成功。

实施例3表达载体pPIC9K-Tan转化毕赤酵母SMD1168

1.将测序验证正确的表达载体pPIC9K-Tan利用SalⅠ单酶切线性化，线性化采用20μL 体系，线性化加入下列成分：

混匀，瞬时离心，反应条件：37℃反应12h，反应完成后，用琼脂糖凝胶电泳检测线性化是否完全，结果如图4所示，第一泳道表示原始质粒，第二泳道表示线性化后的质粒，质粒迁移率发生改变，且条带单一，表明线性化完全，回收PCR产物，-20℃储存备用。

2.毕赤酵母SMD1168(购自Invitrogen公司)感受态细胞制备：

①将SMD1168菌液在YPD平板上划线，在30℃培养箱中倒置培养2-3天。

②从平板上挑取单菌落置于10mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养18-20h。

③0.1％接种量接种至100mL YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜，至OD600达到1.3-1.5，取出置于冰上10min，使之完全冷却至0℃。

④在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。

⑤用40mL预冷的无菌水轻轻重悬菌体，在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。40mL预冷的无菌水：先加10mL吸打混匀，再补足至40mL。

⑥用20mL预冷的无菌水轻轻重悬菌体，在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。20mL预冷的无菌水：先加10mL吸打混匀，再加10mL。

⑦用1mL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液轻轻重悬菌体，在4℃，3000rpm条件下离心5min，将上清倒掉。1mL预冷的无菌水：每个50mL离心管加1mL，分装到2个1.5mL EP 管中。

⑧用300uL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液轻轻重悬菌体，置于冰上，当天使用。300uL 预冷的1mol/L D-山梨醇溶液：先加300uL预冷的1mol/L D-山梨醇溶液轻轻重悬菌体，加入第二管中，吸打混匀，不要有气泡。

3.线性化表达载体pPIC9K-Tan电转化毕赤酵母SMD1168感受态细胞

将线性化的表达载体pPIC9K-Tan通过电击转化法转化至毕赤酵母SMD1168感受态细胞内，涂布于MD固体培养板，待MD固体培养板长出单菌落，观察单菌落生长情况。

4.用G418抗性平板筛选阳性转化子

从MD平板上挑取单菌落接种于含有终浓度2.5mg/mL的G148抗性YPD平板内进行筛选阳性克隆，30℃培养至长出菌落。挑取菌落接种于无抗液体YPD培养基中培养16-18 h，取菌液离心破壁验证阳性转化子。

将挑选的阳性转化子放入YPD液体试管(5-7mL)中，培养18h。做破壁PCR鉴定，送测序鉴定。破壁菌液PCR体系如下：

(1)取1mL菌体，4℃，12000rpm，离心2min，彻底去上清。

(2)加入500μL TE/0.1％SDS溶液洗涤，4℃，12000rpm，离心2min，彻底去上清。

(3)加入20μL TE/0.1％SDS重悬菌体，沸水浴10min，4℃，12000rpm，离心10min，取上清作为模板进行PCR验证。

破壁PCR体系如下：

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30Sec，62℃退火30Sec，72℃延伸4min， 28个循环；接下来72℃保温5min，4℃保存。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定，结果如图5所示，第2、4、5、6、7泳道所示有符合续期大小的条带，将这管菌液进行测序，挑选序列正确的菌株进行保藏、备用。

实施例4转化体在发酵罐上诱导表达出耐热型单宁酶An-Tan

罐上发酵培养基：85％磷酸80.1mL，CaSO₄ 2.79g，K₂SO₄ 54.6g，KOH 12.39g，MgSO₄·7H₂O 44.7g，甘油120g，酵母膏15g，蛋白胨15g，消泡油3mL，溶解后定容至3L，注入发酵罐中，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。用于毕赤酵母的培养。

(1)将筛选得到的转化体接种于YPD培养基中进行活化，30℃，250rpm培养16-18h。

(2)将活化后的菌种按1％的接种量接种于YPD种子培养基内，30℃，250rpm培养16～18h，得到150mL的种子液。

(3)配制3L发酵培养基，加入发酵罐灭菌，冷却后加入微量元素PTM 13.2mL，在罐上用氨水调整pH为5.2。

(4)甘油分批发酵阶段：于30℃和溶解氧(DO)>40％下发酵培养(转速：600rpm；通气量：4L)，直至培养基中甘油耗尽(表现为DO迅速回升)，补加甘油至菌体量达到180 mg/mL。

(5)饥饿阶段：甘油流加培养至菌体达到所需密度后，停止补加甘油，溶氧(DO) 迅速回升，此时不添加碳源，保证菌体饥饿状态30min，以避免影响菌体对甲醇的利用。

(6)甲醇流加阶段：饥饿30min后，将发酵温度调整为至28℃，pH维持在5.0左右，开始甲醇诱导阶段。诱导前12h，甲醇(含1.2％PTM)按3mL/L/2h添加；经12h诱导后，甲醇按3mL/L/h添加，诱导四天(96h)后，可以获得发酵的粗酶液。

(7)甘油补加阶段每隔8h取样测定生物量，甲醇诱导阶段每隔8h取样测定酶活力及生物量，结果如附图6，发酵过程中生物量最高达到309mg/mL；罐上发酵诱导96h后，酶活力达到390.4U/mL，蛋白浓度为0.48mg/mL，计算得比酶活为813U/mg。

实施例5耐热型单宁酶的分离纯化

采用DEAE Sepharose Fast Flow对耐热型单宁酶进行纯化，层析柱规格为1.6×20cm。分离纯化方法如下：

(1)将实施例4获得的粗酶液用0.22μm滤膜过滤，去除杂质，4℃冷藏备用。

(2)用柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH 5.0)平衡柱子1-2个柱体积，去除杂蛋白，平衡至OD280数值为零。

(3)粗酶液过滤后上样3mL，在柱子中室温孵育20min，使目的蛋白与柱子充分结合；

(4)将柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH 5.0)按1mL/min的流速流洗柱子，洗脱未结合上柱子的杂蛋白，直至OD280数值为零。

(5)用含0.05mol/L NaCl的柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH 5.0)进行洗脱，流速1mL/min，每管收集3mL，直至OD280数值为零。

(6)用含0.1mol/L NaCl的柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH 5.0)进行洗脱，流速1mL/min，每管收集3mL，直至OD280数值为零。

(7)分别测定每管的蛋白含量及单宁酶活力，合并具有单宁酶酶活的洗脱液，用10kDa 的超滤膜超滤浓缩，进行SDS-PAGE验证分析纯化情况，结果见图7，整个层析过程共收集100管，其中，0.05mol/L NaCl洗脱后可检测到少量具有单宁酶活力的蛋白，用0.1mol/L NaCl洗脱后，出现明显的蛋白峰及酶活峰，收集此浓度下具有酶活力的各管(55-60管，共 18mL)进行超滤浓缩，最终得到约0.5mL酶液。

实施例6单宁酶的热稳定性测定

将单宁酶An-Tan与异源表达的文献来源单宁酶Ao-Tan(Yu X W,Li Y Q,etal.2008) 酶学特性进行比较，详细描述如下：

(1)最适温度测定：保持底物添加量为0.25mL，与0.25mL单宁酶酶液混匀，使反应体系为0.5mL，分别在30、40、50、60、70、80、90℃条件下反应5min，测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，灭活10min的酶液为空白对照，研究单宁酶的最适反应温度。结果见图8和图9，An-Tan的最适反应温度为80℃，70℃下相对酶活可达到85％以上， 90℃使单宁酶活力降低；Ao-Tan的最适反应温度为70℃。以上结果显示，An-Tan相比于 Ao-Tan是一个高温酶。

(2)温度稳定性测定：重组黑曲霉单宁酶酶液在60℃、70℃、80℃条件下处理一段时间后，在30℃，pH＝5.0条件下测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，灭活10min的酶液为空白对照，温度稳定性结果见图10和图11。重组单宁酶An-Tan在70℃处理20min 后，依然保留50％以上的酶活力，处理120min后单宁酶活力基本丧失。60℃保温120min 不会对重组单宁酶活力造成显著性影响；Ao-Tan在70℃的水浴环境中处理10min后，单宁酶活力剩余10％左右，而在60℃和50℃的半衰期分别为8min和20min。以上结果表明，An-Tan在高温下具有更好的耐受性，在工业高温加工过程中具有更大的应用潜力。

(3)最适pH测定

将酶液用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液稀释到合适的倍数后，取0.25mL与等体积底物混匀，在30℃下测定单宁酶活力。以最高酶活力为100％，不同pH条件下灭活10min的酶液为空白对照，研究单宁酶的最适pH。结果如图12和图13所示，An-Tan的最适反应pH为6.0；Ao-Tan最适反应pH为5.0。

(4)pH稳定性测定

将酶液用pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的缓冲液稀释后，4℃放置24h，在30℃条件下测定酶活力，以最高酶活力为100％，不同pH条件下灭活10min的酶液为空白对照，研究单宁酶的pH稳定性。结果见图14和图15，An-Tan在酸性及中性(3.0～8.0) 范围内活力相对稳定，残余酶活60％以上；当酶液处于碱性条件下时，酶活力逐渐降低； pH达到10.0时酶活力基本丧失。Ao-Tan在pH为3.0时，残余酶活为30％；在pH范围3.0-7.0 之间，残余酶活60％以上；但当pH达到9.0时酶活力基本丧失。综上，An-Tan具有更宽泛的pH稳定性范围，在工业应用上具有相对优势。

实施例7单宁酶酶学性质比较

据文献报道，不同来源的单宁酶的酶学性质存在差异。微生物来源的单宁酶温度稳定范围一般在30-60℃之间；最适温度大多为20-60℃。有关单宁酶酶学性质数据列于表1，对比表1中的大多数真菌来源的单宁酶，最适温度在30-50℃之间，而我们的酶最适温度为80℃，高于绝大多数已报道的单宁酶；并且其在高温条件下具有非常好的稳定性，表1 中不同来源单宁酶60℃保持2h后，残余酶活降至20％以下，而本发明所述单宁酶在60 ℃下处理2h后残余酶活89.6％，另外其在70℃下处理20min后依旧保留50％以上活力，我们的酶最适温度高于绝大多数已报道的单宁酶，并且其在高温条件下具有非常好的稳定性，此特性使其在食品加工中有很大应用价值。

表1不同来源单宁酶酶学性质

*ng:文献中未给出数据

实施例8单宁酶在茶梗浸提液处理中的应用

取粉碎后的茶叶梗1g置于具塞锥形瓶中，加入70mL蒸馏水及10mL单宁酶液，60℃水浴浸提2h，浸提后趁热利用循环水真空泵减压过滤，用少量蒸馏水清洗1-2次，合并滤液定容至100mL。高效液相色谱法定性分析儿茶素，分别取未处理茶梗浸提液及不同酶处理茶梗浸提液进行液相色谱分析。结果如图16和图17所示，峰1为GA，峰2为GC，峰 3为EGC，峰4为咖啡因，峰5为EC，峰6为EGCG，峰7为GCG；其中峰6、峰7为酯型儿茶素。酯型儿茶素是茶饮料中苦涩味的主要来源，并且其大量存在时易于蛋白络合形成茶乳，不利于茶饮料的贮藏。经本发明的单宁酶处理后，6、7峰面积显著降低，而1、2、 3、5峰面积都有不同程度提高，咖啡因含量没有变化。其中，相比单宁酶Ao-Tan处理后的茶梗提取液，峰6(EGCG)经耐热型单宁酶An-Tan处理后完全降解，并且An-Tan处理使更多的酯型儿茶素降解生成非酯型儿茶素。并且，相较现有的单宁酶处理茶叶梗是在茶叶浸提后，再进行酶处理步骤，而本申请因耐热型单宁酶的耐高温特征，可同步进行茶叶浸提和酶处理。表明此单宁酶An-Tan可在高温条件下更有效的降低茶汤中酯型儿茶素的含量，有利于提高茶饮料的稳定性及口味。

将以上处理后的茶汤灭菌，在25℃的室温下连续放置30天，每天观察检测茶汤品质，以未添加单宁酶巴氏消毒灭菌的茶汤为对照。经耐高温单宁酶An-Tan处理后的茶汤，在室温放置30天，茶汤一直处于澄清透明状态；经单宁酶Ao-Tan处理后的茶汤，在室温放置 30天，茶汤有浑浊物产生。对照组茶汤在冷却后出现浑浊，放置第一天后出现沉淀。证明在使用同步浸提/酶处理应用时，耐高温单宁酶An-Tan提高茶饮料贮藏性能上更具有优势。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 一种耐热型单宁酶及其应用

<130> 2019

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 554

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Thr Pro Ser Thr Leu Ala Glu Leu Cys Thr Asp Ser Ile Val Lys

1 5 10 15

Ala Ala Leu Pro Pro Ser Glu Phe Ile Gln Gly Ile Thr Ile Asp Ser

20 25 30

Asp Ser Val Thr Thr Glu Val Val Thr Asn Ser Ser Phe Ser Ser Asp

35 40 45

Phe Tyr Pro Ser Ala Thr Ile Asp Tyr Cys Asn Val Thr Phe Ala Tyr

50 55 60

Ser His Asp Gly Ile Asp Gly Asp Gln Val Phe Leu Glu Ile Trp Leu

65 70 75 80

Pro Ala Pro Thr Asp Phe Lys Asn Arg Trp Leu Ser Thr Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Asp Gln Ser Leu Pro Gly Gly Val Met

100 105 110

Tyr Gly Ala Ala Ser Gly Met Thr Asp Gly Gly Phe Gly Gly Phe Ser

115 120 125

Asn Asn Ala Asp Thr Ala Met Leu Leu Ala Asn Gly Thr Leu Asn Tyr

130 135 140

Glu Thr Leu Tyr Met Phe Ala Tyr Lys Ala His Arg Glu Leu Ser Leu

145 150 155 160

Leu Gly Lys Ala Leu Thr Arg Asn Val Tyr Gly Met Ser Asp Ser Asp

165 170 175

Lys Leu Tyr Ala Tyr Tyr Gln Gly Cys Ser Glu Gly Gly Arg Glu Gly

180 185 190

Trp Ser Gln Val Gln Arg Phe Gly Asp Glu Trp Asp Gly Ala Ile Ile

195 200 205

Gly Ala Pro Ala Phe Arg Trp Ser Phe Gln Gln Thr Gln His Leu Tyr

210 215 220

Ser Asn Val Val Glu Lys Thr Leu Asp Tyr Tyr Pro Pro Pro Cys Glu

225 230 235 240

Leu Asp Lys Ile Val Asn Glu Thr Ile Ala Ala Cys Asp Ala Met Asp

245 250 255

Gly Lys Val Asp Trp Val Val Ala Arg Thr Asp Leu Cys Leu Leu Asp

260 265 270

Phe Asp Ile Ser Thr Ile Glu Gly Lys Pro Tyr Ser Cys Ala Ala Ser

275 280 285

Arg Gly Thr Pro Ala Gln Asn Gly Thr Val Ser Ala Lys Gly Ile Glu

290 295 300

Val Ala Lys Thr Ile Ile Asn Gly Leu His Asp Ser Gln Gly Arg Arg

305 310 315 320

Val Tyr Phe Ser Tyr Gln Pro Thr Ala Ala Phe Asp Asp Ala Glu Thr

325 330 335

Gln Tyr Asn Ser Thr Thr Gly Lys Trp Gly Leu Asp Ile Asp Gln Leu

340 345 350

Gly Gly Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Val Asp Lys Asn Gly Thr Thr Leu

355 360 365

Asp Ser Leu Asp Gly Ile Thr Tyr Asp Thr Leu Lys Asp Trp Met Ile

370 375 380

Ser Gly Leu Gln Glu Tyr Tyr Ser Thr Leu Gln Thr Thr Trp Pro Asp

385 390 395 400

Leu Thr Pro Phe His Asn Ala Gly Gly Lys Val Ile His Tyr His Gly

405 410 415

Asp Ala Asp Phe Ser Ile Pro Thr Ala Ala Ser Ile Arg Tyr Trp Glu

420 425 430

Ser Val Arg Ser Ile Met Tyr Pro Asn Gln Asp Tyr Asn Ser Ser Ala

435 440 445

Glu Ala Leu Asn Glu Trp Tyr Arg Leu Tyr Thr Val Pro Gly Ala Gly

450 455 460

His Cys Ala Thr Asn Asp Ala Met Pro Asn Gly Pro Phe Pro Gln Thr

465 470 475 480

Asn Met Ala Val Met Ile Asp Trp Val Glu Asn Gly Val Val Pro Thr

485 490 495

Thr Leu Asn Ala Thr Val Leu Gln Gly Glu Asn Glu Gly Gln Asn Gln

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Trp Pro Leu Arg Pro Leu Trp Thr Asn Asn Gly Thr

515 520 525

Thr Met Glu Cys Val Tyr Asn Gln Arg Ser Ile Asp Ser Trp His Tyr

530 535 540

Asp Leu Asp Ala Val Pro Met Pro Val Tyr

545 550

<210> 2

<211> 1725

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgttcac ccgcctgggc tcccatagcc accacagcct ttgcggcatt ggcaaatgct 60

gcaactccct ccacgttggc agagctttgc actgattcca tcgtgaaggc agctctacca 120

ccatctgagt tcatccaagg cataacaatt gactcagact ccgtgacgac agaagtcgta 180

acaaacagca gtgtctccag cgagttctac cccagcgcca caatcaatta ttgcaatgtc 240

acattcgcct actcccacga tggcattgac ggtgaccaag tccttttgga aatctggctt 300

cctgcaccca cggatttcca aaaccgctgg ctctccactg gtggaggagg ttatgccatt 360

aactccggag accagtcgct gccgggaggc gtaatgtacg gtgctgcgtc aggtatgacg 420

gatggtggtt ttggaggatt ttcaaacaat gcggacacgg ctatgctgtt ggcaaatggc 480

acccttgact acgagacgct ttacatgttt gcatacaaag cgcatcggga gcttagtttg 540

attggaaaag ccttgacccg caatgtatac gggatgagcg acagcgataa gctgtatgca 600

tattatcaag gctgctctga aggaggccgt gaaggttgga gtcaagtgca gcgcttcggt 660

gatgaatggg atggagccat tattggcgct ccagctttcc gatggtcatt ccaacagacg 720

cagcatcttt attccaacgt cgtcgagaag acactggatt actacccacc cccctgtgag 780

ctggacaaga tcgtcaacga gaccatcgct gcctgtgatg ccatggacgg aaaggtagat 840

tgggtggttg cacggaccga tctctgcttg ctcgacttcg acattagtac catcgagggt 900

aagccctact cgtgcgctgc atcaaggggt acccctgcac agaatggcac ggtctccgcc 960

aagggtatcg aagtcgcaaa aaccatcatc aatggattgc atgattcgca gggtcgccgg 1020

gtctactttt cctaccagcc aacggccgcc ttcgatgacg ctgagacgca gtacaactcc 1080

acgacaggtc agtgggggct ggatatcgat cagctcggag gcgaatatat tgctctcttg 1140

gtagacaaga acggcactac actagacagc ctggatggtg tcacctatga taccctcaag 1200

gactggatga tctcgggcct gcaggaatac tacagcacct tgcagaccac ttggccggac 1260

ctcacgccct tccacgaagc aggaggcaaa gtcatccatt tccacggtga tgccgacttc 1320

agtattccca ccgccgcatc catccgctat tgggaatcag tacgcagcat catgtacccc 1380

aatcaagact ataactccag tgccgaggcg cttaacgagt ggtaccgtct gtacactgtc 1440

ccaggagcgg gtcattgtgc gaccaacgat gctatgccca acggcccctt cccacagacg 1500

aacatggctg tgatgatcga ctgggtggag aatggagtag tacctacaac gctcaatgcg 1560

accgtgctcc agggagagaa cgaaggacag aaccaacagc tttgtgcctg gccactgcgg 1620

cccttgtgga ccaacaacgg aaccaccatg gagtgcgtgt acaaccagcg ttcgattgat 1680

agctggcatt atgacttgga tgcggttcct atgcctgtgt actaa 1725

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcgctcac ccactcgagt ttcc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagtacaca ggcatgggaa ccgca 25

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgactccta gggggactcc ttccacgttg gcgga 35

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ataagaatgc ggccgcctag tacacaggca tgggaaccgc at 42

Claims

1.一种编码耐热型单宁酶的基因，其特征在于，所述耐热型单宁酶的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的编码耐热型单宁酶的基因，其特征在于，所述基因是从黑曲霉(Aspergillus niger sp.FJ0118)中进行PCR扩增获得的，所述黑曲霉(Aspergillus nigersp.FJ0118)于2019年05月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019358。

3.一种制备耐热型单宁酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的编码耐热型单宁酶的基因进行双酶切，以获得酶切片段；

2)将所述酶切片段与经同样双酶切的毕赤酵母pPIC9K连接，以获得表达载体pPIC9K-Tan；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，将所述转化体接种于罐上发酵培养基中进行甲醇诱导罐诱导表达。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲醇诱导罐诱导表达包括：甘油分批发酵阶段、饥饿阶段及甲醇流加阶段。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤4)的分离纯化为：采用1.6×20cm的阴离子交换柱纯化蛋白，用柠檬酸缓冲液平衡柱子，流速为1mL/min；加入耐热型单宁酶粗酶液，流速为1mL/min，孵育20min；用含NaCl的柠檬酸缓冲液洗脱，流速为1mL/min，用收集并浓缩各步洗脱液，SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。

7.权利要求3～6中任一项所述的方法制得的耐热型单宁酶。

8.权利要求7所述的耐热型单宁酶在同步茶浸提和酶处理降低酯型儿茶素中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

取粉碎后的茶叶梗1g置于具塞锥形瓶中，加入70mL蒸馏水和10mL酶活力为100U/mL耐热型单宁酶液Tan，于60℃下，水浴浸提2h；