CN102533833A - 链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法。本发明的链霉菌表达质粒的构建方法，包括如下步骤：选用密苏里游动放线菌木糖异构酶的启动子Xi和阿维链霉菌淀粉酶终止子，启动子-SD序列来自于密苏里游动放线菌木糖异构酶基因的90-269bp；将克隆的sfks基因插入到合成的Xi启动子-SD-amyA2终止子片段中构建表达框结构中，之后采用常规方法构建链霉菌表达质粒。本发明涉及角蛋白酶的生产方法为将链霉菌表达质粒通过接合转移转入表达宿主变铅青链霉菌TK24中，进行重组表达，产生角蛋白酶。本发明构建的表达质粒在变铅青链霉菌TK24中表达后粗酶液的比活为1700U/mg，比出发菌株弗氏链霉菌变种S-221的比活提高50倍，表达后角蛋白酶产量远高于出发菌株。

Description

链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法

技术领域

本发明涉及一种链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法。

背景技术

角蛋白酶（Keratinases, EC 3.4.21/24/99.11）是一种既能专一降解天然角蛋白的蛋白水解酶。角蛋白类蛋白质化学结构稳定，不溶于水，其链是以α螺旋或β片层结构组成的，通过二硫键、氢键和其他交联键作用形成非常稳定的高度交联的三维结构。在一般条件下角蛋白不溶解，甚至动物来源的蛋白酶如酪蛋白酶、胰蛋白酶等都不能降解角蛋白，但能被角蛋白酶降解。

角蛋白酶可以用于饲料行业。家禽羽毛蛋白含量高达85%-90%，含13种主要氨基酸，除蛋氨酸、赖氨酸等4种含量稍低外，其它氨基酸含量均高于鱼粉，是极好的动物蛋白资源。我国羽毛资源极为丰富，据报道每年达几十万吨，而且用角蛋白酶酶解既能提高羽毛的营养价值，也能节省能源（物理、化学方法耗能很大)。所以把羽毛粉蛋白质降解，转化为能被畜禽消化利用的饲用氨基酸，是目前国际公认的质量最可靠、效果也较好的一种方法。 

角蛋白酶还可应用于医药和化妆品行业。研究发现角蛋白酶能改善皮肤外用药物在硬蛋白中的通透性，达到治疗皮肤病如甲癣的目的，还有助于伤口去痴和上皮再生，在协助活性因子透过皮肤屏障、祛除皮肤多余角质、化妆品深层护理等方面都起着重要作用。

角蛋白酶也应用于食品加工、清洁剂生产、皮革脱毛鞣制、浴皂、洗发膏、润肤霜、防晒油（Hagedorn，1998）和脱毛剂等美容品生产。

目前已发现30多种微生物能分泌角蛋白酶，国内外角蛋白酶的研究主要集中在真菌中的皮肤癣菌和白假丝酵母（Candida albicans)，放线菌中的链霉菌（Streptomyces）和高温单胞菌属（Thermonspora）及细菌中的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。

国内针对链霉菌产角蛋白酶的研究相对较少，涂国全等从土壤中分离得到一株对羽毛角蛋白分解能力极强的弗氏链霉菌变种S-221菌株，但是没有进行深入研究。李江等得到一株具有极强降解羽毛能力的弗氏链霉菌变种菌株k11，经过纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2，并通过构建基因文库的方法，获得了该酶完整的基因sfp2。此角蛋白酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶，在较宽的pH范围内保持酶活，热稳定性相对较好，对酪蛋白，角蛋白和弹性蛋白都有较高的活性。

角蛋白酶能水解多种蛋白的特性使得角蛋白酶具有潜在的应用前景，但是国内外角蛋白酶的商品化生产程度很低，没有广泛的实际应用，其中主要的一个原因就是天然菌株中角蛋白酶的产量太低，使生产成本高昂，难以商品化生产。而基因工程方法有望通过大幅提高角蛋白酶的单位产量来解决这个难题。李江等将sfp2蛋白酶原编码基因和成熟蛋白编码基因分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中进行异源表达。尽管sfp2在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中成功表达，但是表达水平很低，因此李江等又采用毕赤酵母表达系统诱导表达sfp2基因。毕赤酵母表达此蛋白的产量和活性高于在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达，但是表达量不能满足工业生产要求，表达的角蛋白酶也存在糖基化问题，影响酶的活性，而且诱导表达在工业生产上也不具备优势。提高sfp2角蛋白酶基因的表达产量成了此酶产业化的关键。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法。本发明的方法获得的质粒在变铅青链霉菌 TK24 中表达后角蛋白酶的产量远远高于弗氏链霉菌变种S-221菌株的角蛋白酶产量，是一种非常理想的链霉菌表达质粒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种链霉菌表达质粒的构建方法，包括如下步骤：选用密苏里游动放线菌木糖异构酶的启动子Xi和阿维链霉菌淀粉酶终止子，启动子-SD序列来自于密苏里游动放线菌木糖异构酶基因的90-269bp；将克隆的sfks基因插入到合成的Xi启动子-SD-amyA2终止子片段中构建表达框结构中，之后采用常规方法构建链霉菌表达质粒。

优选地，所述采用常规方法构建链霉菌表达质粒包括如下步骤：构建的表达质粒pJTU4881基本框架，该基本框架由质粒pSP72和pHZ1358酶切的不同片段组成；所述不同片段通过PCR连接构建质粒pJTU4880，再将克隆的sfks基因插入到合成的Xi启动子-SD-amyA2终止子片段中构建表达框结构中，表达框通过XbaI和SacI双酶切克隆到同样用XbaI和SacI处理的pJTU4880上，得到链霉菌表达质粒pJTU4881。

优选地，所述不同片段包括pSP72上XbaI和EcoRI双酶切回收的1700bp片段和pHZ1358上XbaI和EcoRI酶切回收的5424bp片段。

优选地，所述sfks基因通过引物扩增，所述引物为：序列如SEQ ID NO:3所示的sfksPF，序列如SEQ ID NO:4所示的sfksPR。

本发明还涉及一种角蛋白酶的生产方法，包括如下步骤：将前述方法制备的链霉菌表达质粒通过接合转移转入表达宿主变铅青链霉菌TK24中，进行重组表达，产生角蛋白酶。

优选地，所述角蛋白酶的生产方法包括如下步骤：将重组质粒pJTU4881通过接合转移转入表达宿主变铅青链霉菌TK24中，进行重组表达，产生角蛋白酶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明构建的表达质粒pJTU4881在变铅青链霉菌TK24中表达后粗酶液的比活达到1700U/mg以上，比出发菌株弗氏链霉菌S-221的酶活(34.8U/mg)提高了将近50倍。脱脂牛奶平板上也可以看到pJTU4881 在变铅青链霉菌 TK24 中表达后角蛋白酶的产量远远高于弗氏链霉菌变种S-221菌株的角蛋白酶产量。充分说明该质粒可以用于外源基因在链霉菌中的高效表达，是一种理想的链霉菌表达质粒。

附图说明

图1中A为pSP72的质粒图谱，B为pHZ1358的质粒图谱。

图2为表达框结构示意图。

图3中A为载体pJTU4880构建图，B为表达质粒pJTU4881构建图。

图4为携带重组质粒 pJTU4880和pJTU4881的变铅青链霉菌TK24 在SFM平板上生长情况示意图，其中：A为正面示意图，B为反面示意图。

图5中A为脱脂牛奶平板检测蛋白酶活性示意图，B为弹性蛋白平板检测蛋白酶活性示意图，其中：SF：弗氏链霉菌原始菌株；pJTU4880：携带有空载体的异源表达菌株；pJTU4881：携带有重组载体的异源表达菌株。

图6为PJTU4880、PJTU4881 和PJTU4884在脱脂牛奶平板表达的比较图。

图7为重组蛋白SFKS在链霉中表达的SDS-PAGE验证图，其中：1．目的蛋白SFKS，2．标准蛋白分子量。           

    图8中A为携带重组质粒pJTU4880的链霉菌降解羽毛情况对照示意图，B 为携带重组质粒pJTU4881的链霉菌降解羽毛情况示意图。

图9中A为重组表达的角蛋白酶对猪肉嫩化的对照图，B为重组表达的角蛋白酶对猪肉嫩化的效果图。

具体实施方式

以下是结合附图和具体实施例对本发明的实施方式做具体说明。本实施例是在以本发明技术方案为前提进行实施，给出详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于本实施例。

本发明立足于提高蛋白表达量，构建组成型表达质粒，启动子和终止子分别为密苏里游动放线菌（Actinoplanes missouriensis）木糖异构酶的启动子Xi（GenBank登录号 X16042.1）和阿维链霉菌淀粉酶终止子（Streptomyces avermitilis MA-4680，amyA2 终止子，Gene ID：1210358，2631975-2632040），本发明使用的启动子-SD（核糖体结合位点）来自于密苏里游动放线菌木糖异构酶基因的90-269bp，其中Xi启动子-SD序列如SEQ ID NO:1所示：

gatctgtgctgtttgccacggtatgcagcaccagcgcgagattatgggctcgcacgctcgactgtcggacgggggcactggaacgagaagtcaggcgagccgtcacgcccttgacaatgccacatcctgagcaaataattcaaccactaaacaaatcaaccgcgtttcccggaggtaacc。

amyA2终止子的序列如SEQ ID NO:2所示：

ggggcggcgcgtatgcgcttgcgtaaacgcttgcgcaagcgtttacgcatcgtccg。

对于来源于弗氏链霉菌的蛋白来说，链霉菌相比大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有更加相似的细胞环境和遗传背景，所以在链霉菌表达系统中表达来源于其它链霉菌的基因，有更高的可靠性。此外，链霉菌在工业规模的培养和发酵技术方面已积累了相当丰富的经验，并且链霉菌中很少是致病菌，生产外源基因比较安全，在医用和食品生产中具有广阔的前景。而变铅青链霉菌由于具有较为清楚的遗传背景，能够识别多种不同的启动子， 对外源DNA 缺乏限制修饰作用，以及良好的蛋白分泌机制等优点，目前已成为链霉菌遗传操作中最常用的宿主菌，所以本发明选用变铅青链霉菌作为表达宿主。

本发明中基因克隆的模板是产角蛋白酶的弗氏链霉菌变种S-221，提取菌株的质粒进行PCR克隆，本发明也以弗氏链霉菌变种S-221的产酶量和角蛋白酶活性作对照，判断构建的表达质粒在变铅青链霉菌TK24（覃重军; 邓子新; 周 启; 陈华癸。利用弗氏链霉菌的修饰系统克服吸水链霉菌的限制性障碍——发展吸水链霉菌转化系统的尝试，遗传学报1993, 20(2) 180-184）中的异源表达效果。

本发明的表达质粒是在pSP72(Promega，普洛麦格)和pHZ1358（由本实验室构建, 已广泛应用于链霉菌遗传操作）（Yuhui Sun, Xinyi He, Jingdan Liang, Xiufen Zhou and Zixin Deng，Analysis of functions in plasmid pHZ1358 influencing its genetic and structural stability in Streptomyces lividans 1326，Applied Microbiology and Biotechnology，2009，82（2）： 303-310）基础上构建的，质粒图谱见图1；其中，A为pSP72的质粒图谱，B为pHZ1358的质粒图谱。pSP72 质粒购于promega（普洛麦格）公司，该载体含有一个紧靠多克隆位点区域的SP6 和T7 RNA 聚合酶启动子，这个多克隆位点区域含有一些限制性位点，如XhoI， PvuII， Hind III， SphI，PstI，SalI， AccI， XbaI，BamHI， SmaI， KpnI，SacI， EcoRI， ClaI，EcoRV 和BglII。pHZ1358是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，导入了大肠杆菌质粒RK2的接合转移起点，赋予了该质粒从大肠杆菌向链霉菌接合转移的特征，大肠杆菌噬菌体l cos位点的导入也使该质粒具备柯斯质粒的特征。不含启动子的neo基因上游酶切位点可用来克隆启动子并通过卡那霉素抗性来初测启动子的活性，带有β-内酰胺酶基因和硫连丝抗性基因，多克隆位点上的T3和T7启动子则可直接用于在体外扩增克隆片段。

实施例1、角蛋白酶基因（ sfks ）的分离

根据网上公布的弗氏链霉菌k-11（Streptomyces fradiae var. k-11）角蛋白酶基因sfp2（EMBL收录号AJ784940）的序列，设计了引物

sfksPF：  5’-AACATATGCGCTTCACCCCCCG-3’（SEQ ID NO:3）

sfksPR：5’-GGGATCCGTCAGATGATGCTGACG-3’ （SEQ ID NO:4）。

通过此引物扩增sfks基因，包括角蛋白酶成熟酶基因（编码191aa），一段N端前导肽（编码78aa）以及链霉菌外分泌信号肽（编码38aa）。

反应体系为：10×KOD-plus buffer 5μl，dNTP mix(2.5mmol/L) 5μl，MgSO₄(25μM) 1.5μl，50%DMSO 3μl，模板DNA 1μl，Primer R(20μM) 1μl，Primer F(20μM) 1μl，KOD-plus（1U/μl）1μl，ddH₂O 31.5μl。反应条件为：95℃ 变性5min，95℃ 30s，65℃ 30s，72℃延伸1min30S，共30个循环，72℃ 5min。所得 PCR 产物以 0.8%琼脂糖凝胶电泳分析结果，可见约为1kb的扩增条带，大小与预期的结果一致。割胶回收目标条带，用 Tiangen 公司胶回收试剂盒回收，回收的实验步骤参照试剂盒说明书进行。由于 TOYOBO 公司的高保真 KOD-plus-DNA 聚合酶所产生的 PCR 产物为平末端，因此不适宜用作 T-A 克隆，而通过用 TAQ 酶 70℃处理 30min 后与pMD18-T 连接。限制性内切酶反应体系为：10×buffer(with BSA) 3μl，DNA 20μl，RnaseA（0.1mg/ml）1μl，Enzyme 1μl，ddH₂O 5μl，共30μl。T4 连接酶反应体系为：10×buffer 2μl，载体DNA 3μl，目标片断DNA 10μl，T4 liagase（400U/μl）1μl，ddH ₂ O 4μl，共20μl。solution I Kit 连接体系为：10×buffer 2μl，载体DNA 3μl，目标片断 DNA  10μl，T4 liagase（400U/μl）1μl，ddH₂O 4μl，共20μl。连接过夜后，取已制备好的，保存于-70℃的电转感受态细胞 E.coli DH10B，冰上解冻后加入 5μl 连接产物，37℃热激 2min，转入冰上，加入 500μl LB 培养液、40μl  X-gal 显色剂（20mg/ml）、4μl IPTG（0.8M），混匀后，涂布含有终浓度为 100mg/ml 的氨苄青霉素（Amp）的 LA 平板，吹干后置 37℃培养箱培养约14-16 小时。挑取白斑作质粒快检，跑胶后选择正确插入大小的克隆，摇瓶培养：取一已灭菌的旋盖小瓶，做好标记后加入 5ml LB 培养液，5μl Amp（100mg/ml），挑取目标克隆于此瓶中，37℃ 220rpm 培养约 10 小时以后，小量提取质粒 DNA，酶切验证，验证正确后取 2ml 菌液于菌种管中，3500rpm 3min离心后弃上清，加入 1ml 已灭菌的20%甘油混匀后-20℃保存，其中取一部分保存菌液送测。

实施例2、表达质粒构建

本发明将pSP72 用XbaI和EcoRI双酶切，回收1700bp的酶切片段，同样将pHZ1358用XbaI和EcoRI酶切得到5424bp的片段，通过PCR方法将这两片段连接构建质粒pJTU4880，再将克隆的sfks基因插入合成的Xi启动子-SD(核糖体结合位点)-amyA2终止子片段中构建表达框结构，表达框结构示意图如图2所示，其对应的表达框基因序列如SEQ ID NO:5所示：

tctagagcatgcgcccaccggcgatcaggtcgtcgacgagcgcggagacggtggcccgggtgagcccggtgacggcggcaactcccgcgcgggagagccgatctgtgctgtttgccacggtatgcagcaccagcgcgagattatgggctcgcacgctcgactgtcggacgggggcactggaacgagaagtcaggcgagccgtcacgcccttgacaatgccacatcctgagcaaataattcaaccactaaacaaatcaaccgcgtttcccggaggatgcagtgaacctcaagcgcttcaccccccgcggcggactcgcgagaggcgcgcggctgaccgccgtggccgccgccctggtcaccgccaccgcgcttgccgccccgagcgccggcgcggagaccgccgacgcgacccgggcgagcgtcgccgagctggcgcgcgtcagcgacgccgtgctcgacgccgacgtgccgggcaccgcctggtacaccgacgccgagagcggcaagctggtggtcaccgccgacgccaccgtgtcggccgccgagctggcccagctgaagaaggcggcgggcgacaaggccggcgccgtggagatcaagcgcaccccgggcaccttcaacaagctcatcgccggcggcgaggccatctacgccgcgggcggcggccgttgctccctcggcttcaacgtccgcagcagcagcggcgcgacctacgccctgacggccggccactgcacggagatcgcctccacctggtacacgaactccggccagacctcgctgctcggcacccgtgccggcacgagcttccccggcaacgactacggcctgatccgccactccaacgcgtccgcggcggacggccgcgtgtacctgtacaacggctcgtaccgggacatcaccggcgccggcaacgcctacgtgggccagaccgtccagcgcagcggctccacgaccggtctgcacagcggccgtgtcacgggcctcaacgccacggtcaactacggcggcggcgacatcgtctccggcctgatccagaccaacgtctgcgccgagcccggcgacagcggcggcgccctgttcgccggctccaccgccctcggcctgacctccggcggcagcggcaactgccgtacgggcggcaccacgttcttccagcccgtcaccgaggcgctcagcgcgtacggcgtcagcatcatctgataacctggatcccgggcggtggcgggtgggttggggcggcgcgtatgcgcttgcgtaaacgcttgcgcaagcgtttacgcatcgtccgtcacgtcacctctcgccgccccgccggacaggactagtaagcttgagctc。

表达框通过XbaI和SacI双酶切克隆到同样用XbaI和SacI处理的pJTU4880上，构建表达质粒pJTU4881（见图3），并酶切验证。

实施例3、角蛋白酶的异源表达

带有 oriT 的目的质粒转化进入大肠杆菌 ET12567（pUZ8002）（陶韦新，吴菁，邓子新，陶美凤。阿维链霉菌NLLL8165中bldA的克隆及其对形态分化与阿维菌素合成的影响。微生物学报（2007）47（1）：34-38）的感受态细胞后，过夜培养转化子细胞，以 1:20 接种量将培养物接于新鲜 LB 中，37℃培养3-4h；收集天蓝色链霉菌的孢子，用无菌水洗涤一次，4500rpm 离心 3min，洗干上清，再用 0.05 mol/L TES（pH8.0）洗一次，50℃热激处理 10min，水冷后加入750μL 孢子萌发液，37℃培养 2 小时，4500rpm 离心 10min，沉淀用 LB 洗涤两次以除去抗生素，最后悬浮在 300μl LB 中。离心收集二次培养的大肠杆菌，用 LB洗三次，加入 300μl LB 后与上述处理过的孢子混合，稀释 50 倍涂在 SFM 平板上，30℃培养 16h 后，以含 40μl 萘啶酮酸和合适的抗生素的水溶液覆盖平板，30℃培养。当重组质粒 pJTU4881 转入变铅青链霉菌 TK24，在SFM平板上 30℃培养三四天后，可以明显观察到因sfks 基因的表达产物水解黄豆饼粉而在菌落周围出现透明圈，作为空质粒对照的 pJTU4880 没有透明圈出现（见图4）。在脱脂牛奶上平板上检测蛋白酶活性时，携带pJTU4881的变铅青链霉菌TK24的水解圈明显大于弗氏链霉菌S-221出发菌株和作为对照的携带pJTU4880的变铅青链霉菌TK24（见图5），构建的表达质粒使得sfks在链霉菌中得到了很好的表达。为了观察本发明选用的Xi启动子的效果，将pJTU4881中的Xi启动子用链霉菌中的强启动子红霉素启动子erme替换组成表达质粒pJTU4884。除此之外，本发明还将目的基因克隆至整合型质粒（pJTU4882）和高拷贝质粒（pJTU4883）中以作比较。结果发现，尽管pJTU4882、pJTU4883和pJTU4884都能实现sfks基因的表达，但是表达量相对较低（见图6）。因此，本发明构建的pJTU4881表达质粒在表达外源基因时具有很大的优势。

实施例4、重组角蛋白酶Sfks酶活测定

以脱脂羽毛粉为底物，在19mL pH 8.0的50mM PBS缓冲液中加lmL经适当稀释的角蛋白酶液，40℃水浴中酶解10h，测定溶液中酪氨酸的含量。角蛋白酶活力单位定义为在上述酶反应体系中以每分钟催化降解产生l                                                

g酪氨酸所需的酶量称为一个活力单位(U)；比活力为每毫克蛋白质具有的活力单位(U/mg)。

本实施例构建的表达质粒在变铅青链霉菌TK24中表达后发酵液中角蛋白酶的比活达到1700U/mg，比出发菌株弗氏链霉菌变种S-221发酵液中角蛋白酶的比活34.8 U/mg（江西农业大学学报，1997，19（4）：60-65）提高了50倍。脱脂牛奶平板上水解圈的大小也直观的体现出了pJTU4882 在变铅青链霉菌TK24 中表达的蛋白酶产量远远高于弗氏链霉菌本身的蛋白酶产量，表明成功实现了角蛋白酶在异源宿主中的高量表达；同时将携带重组质粒 pJTU4881 的变铅青链霉菌 TK24 点样到含有弹性蛋白的平板上，可以看到水解弹性蛋白后出现的透明圈（图5），这表明 sfks 基因的表达产物能够水解弹性蛋白，这预示此角蛋白酶有着不可估量的应用前景。

实施例5、角蛋白酶的分离纯化

首先进行角蛋白酶的丙酮沉淀，携带重组质粒pTU4881的变铅青链霉菌TK24菌株在发酵培养基TSBY中上罐培养4～5天后，4℃，12000rpm离心取上清酶液，用60%丙酮沉淀蛋白，置冰上2小时，然后12000rpm离心20min，取沉淀，将丙酮处理得到的沉淀用10mM pH为8.0的 PBS重溶得到粗提酶。通过此方法角蛋白酶的提取率达到了70%（提纯酶总活力与粗酶液总活力之比为提取率），角蛋白酶纯度达到了80%，此方法纯化角蛋白酶的提取率和纯度基本达到了工业生产此酶的中试要求。对粗酶进行阴离子交换层析和分子筛层析纯化制得纯酶，可以用于研究。将粗提酶上Q-Sepharose阴离子交换柱进行进一步纯化，取5mL上柱，先用pH8.0的10mM的PBS缓冲液洗脱平衡柱子，改用相同缓冲液配制的0-1mol/L NaCl梯度洗脱，流速为2ml/min，每管1.5mL分部收集，然后测定收集管中溶液的酶活。合并有酶活的溶液再进行分子筛层析得到纯角蛋白酶，纯角蛋白酶的比活达到了7200U/mg。纯化后的角蛋白酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量约为19.1kDa（见图7），符合理论值大小。

实施例6、重组角蛋白酶的应用研究

本实施例构建的表达质粒在变铅青链霉菌TK24菌株中表达后，表达量大大提高，能有效水解羽毛角蛋白和弹性蛋白，在饲料、医药和食品上都有很好的应用前景。应用例如下：

（1）、水解羽毛

取两支装有7mL羽毛培养基（0.1%尿素，0.1% KH₂P0₄，0.1% (NH₄) ₂SO₄，自然pH值）的玻璃小瓶，两支小瓶中放置等量适量剪碎的鸡羽毛。羽毛培养基灭菌后接入少量新鲜已培养好的菌种。其中一支作为对照接种不含重组质粒pTU4881的变铅青链霉菌TK24种子液，另外一支作为试验管接种带有pTU4881的变铅青链霉菌TK24种子液，在30℃摇床震荡培养一周左右可观察到，携带有空质粒pJTU4880的菌株不能产生角蛋白酶而无法降解羽毛，因此可看到培养基仍清澈无混浊；同时，携带有目的基因sfks的重组质粒pJTU4881菌株能产生角蛋白酶从而降解羽毛，在羽毛被降解后产物出现浑浊（见图8）。 

（2）、酶解弹性蛋白

弹性蛋白酶由于其可以专一性的酶解弹性蛋白，同时也能更有效地对其他蛋白质如胶原蛋白进行酶解，因此弹性蛋白酶食品工业上具有广泛的应用价值，具有很好的肉类嫩化效果。通过含弹性蛋白的平板检测，表明该重组角蛋白酶具有弹性蛋白酶活性，因此本发明就用表达的角蛋白酶酶解猪肉中的弹性蛋白来定性观察此角蛋白酶对猪肉的嫩化效果。材料为市售猪里脊肉，将材料修整，顺着肌纤维的方向取长约4cm，宽2cm的肉块。取2支10mL 离心管，分别加入50mM pH8.0 的PBS缓冲液，其中一支作为对照不加粗提酶，而试验管加入适量粗提酶，50℃恒温水浴2h进行酶处理，处理后的样品制片，显微镜下观察猪肉纤维状组织的变化。结果发现试验管的制片在光学显微镜下能清晰的看到猪肉纤维和纹理的变化，定性的说明了此角蛋白酶的弹性蛋白酶活性对猪肉具有嫩化作用（见图9）。这种弹性蛋白酶活性扩展了此角蛋白酶的应用范围，使得此酶具有更广泛的应用前景，可以用于饲料，医药和食品等多个行业。

<120>  链霉菌表达质粒的构建方法及角蛋白酶的生产方法

 

<130>  1234

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  180

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  1

gatctgtgct gtttgccacg gtatgcagca ccagcgcgag attatgggct cgcacgctcg       60

 

actgtcggac gggggcactg gaacgagaag tcaggcgagc cgtcacgccc ttgacaatgc      120

 

cacatcctga gcaaataatt caaccactaa acaaatcaac cgcgtttccc ggaggtaacc      180

 

 

<210>  2

<211>  56

<212>  DNA

<213>  Streptomyces avermitilis MA-4680

 

<400>  2

ggggcggcgc gtatgcgctt gcgtaaacgc ttgcgcaagc gtttacgcat cgtccg           56

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  3

aacatatgcg cttcaccccc cg                                                22

 

 

<210>  4

<211>  24

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  4

gggatccgtc agatgatgct gacg                                              24

 

 

<210>  5

<211>  1341

<212>  DNA

<213>  Artificial Sequence

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  5

tctagagcat gcgcccaccg gcgatcaggt cgtcgacgag cgcggagacg gtggcccggg       60

 

tgagcccggt gacggcggca actcccgcgc gggagagccg atctgtgctg tttgccacgg      120

 

tatgcagcac cagcgcgaga ttatgggctc gcacgctcga ctgtcggacg ggggcactgg      180

 

aacgagaagt caggcgagcc gtcacgccct tgacaatgcc acatcctgag caaataattc      240

 

aaccactaaa caaatcaacc gcgtttcccg gaggatgcag tgaacctcaa gcgcttcacc      300

 

ccccgcggcg gactcgcgag aggcgcgcgg ctgaccgccg tggccgccgc cctggtcacc      360

 

gccaccgcgc ttgccgcccc gagcgccggc gcggagaccg ccgacgcgac ccgggcgagc      420

 

gtcgccgagc tggcgcgcgt cagcgacgcc gtgctcgacg ccgacgtgcc gggcaccgcc      480

 

tggtacaccg acgccgagag cggcaagctg gtggtcaccg ccgacgccac cgtgtcggcc      540

 

gccgagctgg cccagctgaa gaaggcggcg ggcgacaagg ccggcgccgt ggagatcaag      600

 

cgcaccccgg gcaccttcaa caagctcatc gccggcggcg aggccatcta cgccgcgggc      660

 

ggcggccgtt gctccctcgg cttcaacgtc cgcagcagca gcggcgcgac ctacgccctg      720

 

acggccggcc actgcacgga gatcgcctcc acctggtaca cgaactccgg ccagacctcg      780

 

ctgctcggca cccgtgccgg cacgagcttc cccggcaacg actacggcct gatccgccac      840

 

tccaacgcgt ccgcggcgga cggccgcgtg tacctgtaca acggctcgta ccgggacatc      900

 

accggcgccg gcaacgccta cgtgggccag accgtccagc gcagcggctc cacgaccggt      960

 

ctgcacagcg gccgtgtcac gggcctcaac gccacggtca actacggcgg cggcgacatc     1020

 

gtctccggcc tgatccagac caacgtctgc gccgagcccg gcgacagcgg cggcgccctg     1080

 

ttcgccggct ccaccgccct cggcctgacc tccggcggca gcggcaactg ccgtacgggc     1140

 

ggcaccacgt tcttccagcc cgtcaccgag gcgctcagcg cgtacggcgt cagcatcatc     1200

 

tgataacctg gatcccgggc ggtggcgggt gggttggggc ggcgcgtatg cgcttgcgta     1260

 

aacgcttgcg caagcgttta cgcatcgtcc gtcacgtcac ctctcgccgc cccgccggac     1320

 

aggactagta agcttgagct c                                               1341

 

 

Claims (6)

1.一种链霉菌表达质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：选用密苏里游动放线菌木糖异构酶的启动子Xi和阿维链霉菌淀粉酶终止子，启动子-SD序列来自于密苏里游动放线菌木糖异构酶基因的90-269bp；将克隆的sfks基因插入到合成的Xi启动子-SD-amyA2终止子片段中构建表达框结构中，之后采用常规方法构建链霉菌表达质粒。

2.如权利要求1所述的链霉菌表达质粒的构建方法，其特征在于，所述采用常规方法构建链霉菌表达质粒包括如下步骤：构建的表达质粒pJTU4881基本框架，该基本框架由质粒pSP72和pHZ1358酶切的不同片段组成；所述不同片段通过PCR连接构建质粒pJTU4880，再将克隆的sfks基因插入到合成的Xi启动子-SD-amyA2终止子片段中构建表达框结构中，表达框通过XbaI和SacI双酶切克隆到同样用XbaI和SacI处理的pJTU4880上，得到链霉菌表达质粒pJTU4881。

3.根据权利要求2所述的链霉菌表达质粒的构建方法，其特征在于，所述不同片段包括pSP72上XbaI和EcoRI双酶切回收的1700bp片段和pHZ1358上XbaI和EcoRI酶切回收的5424bp片段。

4.根据权利要求1所述的链霉菌表达质粒的构建方法，其特征在于，所述sfks基因通过引物扩增，所述引物为：序列如SEQ ID NO:3所示的sfksPF，序列如SEQ ID NO:4所示的sfksPR。

5.一种角蛋白酶的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1制备的链霉菌表达质粒通过接合转移转入表达宿主变铅青链霉菌TK24中，进行重组表达，产生角蛋白酶。

6.如权利要求6所述的角蛋白酶的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：将重组质粒pJTU4881通过接合转移转入表达宿主变铅青链霉菌TK24中，进行重组表达，产生角蛋白酶。

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