CN103243080A - 前导序列定点突变的角蛋白酶基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种前导序列定点突变的角蛋白酶，其具有（1）或（2）所示的氨基酸序列：（1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；（2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白的编码基因及其应用。本发明所述的前导序列定点突变后的角蛋白酶基因sfp2可在链霉菌中高效表达。所述前导序列定点突变后角蛋白酶SFP2的比活是野生型角蛋白酶比活的9倍，前导序列定点突变后的角蛋白酶SFP2在链霉菌中的表达量为野生型角蛋白酶表达量的2倍，并且没有改变角蛋白酶SFP2的酶学特性和动力学参数。

Description

前导序列定点突变的角蛋白酶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种前导序列定点突变的角蛋白酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

角蛋白酶（Keratinases,EC3.4.21/24/99.11）是一类具有分解角蛋白活性的酶的总称。角蛋白化学结构稳定，不溶于水，其链是以α螺旋或β片层结构组成的，通过二硫键、氢键和其他交联键作用形成非常稳定的高度交联的三维结构，很难被一般的蛋白酶（胰蛋白酶和胃蛋白酶）水解。

目前发现的多数角蛋白酶底物范围相当广泛，除能降解角蛋白外，还可分解弹性蛋白、牛血清白蛋白和酪蛋白等，在饲料领域具有广阔的应用前景，角蛋白酶的市场需求在不断增加。我国羽毛资源极为丰富，家禽羽毛蛋白含量高达85%-90%，含13种主要氨基酸，除蛋氨酸、赖氨酸等4种含量稍低外，其它氨基酸含量均高于鱼粉，是极好的动物蛋白资源。把羽毛粉蛋白质降解，转化为能被畜禽消化利用的饲用氨基酸，是目前国际公认的质量最可靠、效果也较好的一种方法。用角蛋白酶酶解的方法既能提高羽毛粉的营养价值，也能节省物理化学法处理羽毛粉耗费的能源。

角蛋白酶能水解多种蛋白的特性使得角蛋白酶具有潜在的应用前景，但是国内外角蛋白酶的商品化生产程度很低，没有广泛的实际应用，其中主要的一个原因就是天然菌株中角蛋白酶的产量太低，使生产成本高昂，难以商品化生产。目前国内外对微生物角蛋白酶的研究主要集中在构建角蛋白酶基因工程菌上，通过异源表达途径来提高角蛋白酶的产量。在大肠杆菌（pEZZl8）系统中，研究者完成了铜绿假单胞菌角蛋白酶（Sharma,R.and R.Gupta(2010)."Extracellular expression of keratinase Ker P from Pseudomonasaeruginosa in E.coli."Biotechnology Letters:1-6.）和地衣芽孢杆菌ER-15角蛋白酶kerBL（Tiwary,E.and R.Gupta(2010)."ExtracellularExpression of Keratinase from Bacillus licheniformis ER-15inEscherichia coli."Journal Of Agricultural and Food Chemistry.）的胞外表达。角蛋白酶kerA的多拷贝基因在地衣芽孢杆菌T399D和枯草芽孢杆菌DBl04系统中也能分泌表达（Wang,J.J.,K.Rojanatavorn,等.(2004)."Increased production of Bacillus keratinase by chromosomalintegration of multiple copies of the kerA gene."Biotechnology andBioengineering87(4):459-464.）。其他研究结果也显示，角蛋白酶基因在毕赤酵母表达系统（Radha,S.and P.Gunasekaran(2009)."Purification and characterization of keratinase from recombinant Pichiaand Bacillus strains."Protein Expression and Purification64(1):24-31.）、巨大芽孢杆菌表达系统（Radha,S.and P.Gunasekaran(2007)."Cloning and expression of keratinase gene in Bacillus megaterium andoptimization of fermentation conditions for the production of keratinaseby recombinant strain."Journal Of Applied Microbiology103(4):1301-1310.）和链霉菌表达系统（李明珠(2010).弗氏链霉菌S.fradiae S-221角蛋白酶基因的异源表达及酶学性质研究,郑州大学.）中都能分泌表达，角蛋白酶产量比野生型都有所提高。

尽管角蛋白酶基因在上述几种表达系统中都已实现了分泌表达，但是表达量都较低，不能满足规模化工业生产的要求。在异源表达的基础上，通过蛋白质工程在分子水平上对目的基因进行分子改造，也可以提高角蛋白酶产量，但至今国内外未取得突破性进展。

角蛋白酶最初合成是以pre-pro-mature前体蛋白形式存在，信号肽（prepeptide）引导前体蛋白穿过细胞质膜，然后pro-mature以无活性的酶原形式被分泌到胞外。接下来的酶原激活则包括三个步骤：（1）折叠（folding）：在前导肽（propeptide）的介导下蛋白酶结构域正确折叠成一定结构；（2）自身加工（autoprocessing）：前导肽和蛋白酶之间相连的肽键被自身的蛋白酶切割，形成前导肽/蛋白酶复合物；（3）降解（degradation）：前导肽从蛋白酶结构域上释放，并被降解。只有前导肽完全降解后酶原才会激活变成有活性的成熟酶。基于上述前导肽介导的酶原激活研究基础，研究者提出了“前导序列工程”概念，它是蛋白质工程的一种新形式。在传统的蛋白质工程中，一般是对蛋白酶结构域进行点突变以改变酶的特性，而前导序列工程则是将定点突变和/或随机突变、基因重组等引入前导序列。“前导序列工程”不仅是研究蛋白质折叠机理的重要工具，更是创造新型蛋白酶的一种十分有前途的新技术。

目前国内外关于前导序列工程的研究主要集中在枯草杆菌蛋白酶家族（subtilisin家族）前导序列的定点突变或随机突变上。Subtilisin家族前导序列的N端和C端各有一段包含疏水性氨基酸残基的高度保守序列，分别称为N1域和N2域。在subtilisin家族前导序列的突变研究中，突变位点有的位于前导序列的保守域N2中（Pulido,M.,Y.Koga,等.(2007)."Directed evolution of Tk-subtilisin from a hyperthermophilicarchaeon:identification of a single amino acid substitution responsiblefor low-temperature adaptation."Protein Engineering Design andSelection20(3):143-153.及Pulido,M.A.,S.Tanaka,等.(2007)."Requirement of left-handed glycine residue for high stability of theTk-subtilisin propeptide as revealed by mutational and crystallographicanalyses."Journal of Molecular Biology374(5):1359-1373.），有的位于保守域N1和N2之间的可变域(Fang N,Zhong CQ,等.2010)"Improvement of extracellular production of a thermophilic subtilaseexpressed in Escherichia coli by random mutagenesis of its N-terminalpropeptide.Applied Microbiology and Biotechnology85(5):1473-1481"，有的则是成熟域中的底物结合位点和前导肽P1位点氨基酸同时置换（Sidhu,S.S.and T.J.Borgford(1996)."SelectionofStreptomyces griseusProtease B Mutants With Desired Alterations inPrimary Specificity Using a Library Screening Strategy."Journal OfMolecular Biology257(2):233-245.），因为前导肽C末端的P1位点Tyr(-1)与枯草杆菌蛋白酶的底物结合位点Gly(127)以产物连接方式连接在一起，Gly(127)置换后，大的芳香族氨基酸Tyr(-1)便不能结合在底物结合位点上，导致前导肽不能被有效切割，而将Tyr(-1)置换为Vla后，蛋白酶的产量和活性均显著增加。可见，前导肽切割位点氨基酸的置换会直接影响蛋白酶的产量和活性。

因此，将弗氏链霉菌角蛋白酶基因sfp2前导序列和成熟域连接处的氨基酸进行突变，并在链霉菌中异源表达，来获得角蛋白酶产量提高的突变体的研究，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种前导序列定点突变的角蛋白酶基因sfp2及其编码蛋白SFP2。

本发明的另一目的是提供所述基因及其编码蛋白的应用。

本发明所述的前导序列定点突变的角蛋白酶，其具有（1）或（2）所示的氨基酸序列：

（1）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

（2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。

本发明还提供了所述前导序列定点突变的角蛋白酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的定点突变的角蛋白酶基因的前导序列含有234个碱基，编码78个氨基酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的定点突变的角蛋白酶SFP2前导序列与野生型角蛋白酶SFP2前导序列相比，其第78位发生单一氨基酸置换。所述第78位为链霉菌角蛋白酶SFP2前导序列和成熟域连接处的Leu(78)。

优选地，本发明所述的定点突变改造的角蛋白酶SFP2前导序列的氨基酸取代如下：在前导序列的第78位氨基酸用苯丙氨酸取代亮氨酸。

本发明还提供了含有所述前导序列定点突变的角蛋白酶基因的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体为pJTU4882-F，其构建方法包括如下步骤：

（1）以载体pBluSK(+)-sfp2为模板，通过反向PCR在角蛋白酶前导序列的第78位点的Leu上下游各15bp处分别引入KpnI和BsmI酶切位点，得到的PCR产物经过DpnI限制性内切酶处理后进行自连，构建得到载体pBluSK(+)-KB；载体pBluSK(+)-KB经过AfeI和BamHI酶切，连入同样经过AfeI和BamHI酶切处理的载体pJTU4882，构建得到表达载体pJTU4882-KB；

（2）合成如下2条单链核苷酸链：

F-1:5′-cttcaacaagttcatcgccggcggcgaggcca-3′

R-1:5′-gcctcgccgccggcgatgaacttgttgaaggtac-3′；

所述单链核苷酸链采用退火互补的方法生成双链DNA，通过T4DNA连接酶将上述双链DNA连入经过KpnI和BsmI限制性内切酶处理的pJTU4882-KB，构建得到带有突变核苷酸的表达载体pJTU4882-F；

其中，步骤（1）中载体pBluSK(+)-sfp2的构建方法为：以F-2和R-2为引物，以弗氏链霉菌基因组为模板扩增角蛋白酶基因，并克隆至pBluSK(+)，构建得到pBluSK(+)-sfp2；

F-2：5’-AACATATGCGCTTCACCCCCCG-3’；

R-2：5’-GGGATCCGTCAGATGATGCTGACG-3’；

步骤（1）中载体pJTU4882的构建方法：将pSP72用XbaI和EcoRI双酶切，回收1700bp的酶切片段，同样将pHZ1358用XbaI和EcoRI酶切得到5424bp的片段，将这两片段连接构建A载体，再将全基因合成的XbaI-Xi启动子-SD(核糖体结合位点)-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段通过XbaI和SacI双酶切克隆到上述A载体，构建表达质粒pJTU4882；其中，XbaI-Xi启动子-SD(核糖体结合位点)-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。

其中，步骤（1）中反向PCR引物如下：

F:5′-cccgggtaccttcaacaagctcatcgccggcggcgaatgcatctacgccgcgggcggc-3′

R:5′-tgaaggtacccggggtgcgcttgatctccacggcgccg-3′；

PCR程序：95℃预变性5min；95℃30s，65℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

步骤（2）中退火互补方法如下：合成的2条单链核苷酸链分别溶于蒸馏水，2条核苷酸链等摩尔量混合，95℃处理5min后室温冷却。

本发明还提供了含有所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括重组菌，如大肠杆菌、链霉菌等。

本发明的另一目的是提供所述前导序列定点突变的角蛋白酶基因或所述重组表达载体在提高链霉菌中角蛋白酶表达量中的应用，将所述基因或含有所述基因的重组表达载体转入链霉菌中，使前导序列定点突变后的角蛋白酶基因sfp2在链霉菌中高效表达。

具体的，将所述基因或含有所述基因的重组表达载体通过大肠杆菌向变铅青链霉菌进行两亲本接合转移，使前导序列定点突变后的角蛋白酶基因sfp2在链霉菌中高效表达。

本发明的前导序列定点突变的角蛋白酶基因sfp2具有如下效果：

（1）本发明通过定点突变对角蛋白酶SFP2的前导序列进行改造，使改造后的角蛋白酶SFP2在链霉菌表达系统中的表达量提高。即利用定点突变对角蛋白酶SFP2的前导序列进行基因改造，在不改变角蛋白酶SFP2成熟域氨基酸和角蛋白酶SFP2酶学特性的情况下，使定点突变改造后的角蛋白酶在链霉菌中得到高效表达，为角蛋白酶制剂的工业化生产提供有效途径。

（2）本发明所述的前导序列定点突变的角蛋白酶基因sfp2可在链霉菌1326中高效表达。与野生型相比，本发明所述的定点突变后角蛋白酶的比活(48935U/mg)为野生型(5233U/mg)的9倍。本发明的前导序列定点突变的角蛋白酶SFP2在链霉菌中的表达量为112mg/L，为野生型角蛋白酶SFP2表达量的2倍，并且没有改变角蛋白酶SFP2的酶学特性和动力学参数。

（3）本发明前导序列定点突变改造后的角蛋白酶基因在链霉菌中高效表达，为角蛋白酶制剂的工业化生产提供有效途径，也为提高其他蛋白酶/角蛋白酶的异源表达量提供参考。

附图说明

图1为载体pBluSK(+)-sfp2的图谱；

图2为载体pJTU4882的图谱；

图3为载体pBluSK(+)-KB的图谱；

图4为载体pJTU4882-KB的图谱；

图5为载体pJTU4882-F的图谱；

图6为本发明定点突变的L(78)F突变体和野生型角蛋白酶SFP2表达量的SDS-PAGE分析图；其中1为L(78)F突变体；2为野生型；M为蛋白Marker；

图7为本发明定点突变的L(78)F突变体和野生型SFP2的最适pH；

图8为本发明定点突变的L(78)F突变体和野生型SFP2的最适反应温度；

图9为本发明定点突变的L(78)F突变体和野生型SFP2的热稳定性比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

载体pBluSK(+)-sfp2构建方法：根据已经公布的弗氏链霉菌角蛋白酶基因序列（EMBL收录号AJ784940），设计引物F-2和R-2，以弗氏链霉菌基因组为模板扩增角蛋白酶基因sfp2，并克隆至pBluSK(+)（购于Stratagene公司），构建得到pBluSK(+)-sfp2，备用。

F-2：5’-AACATATGCGCTTCACCCCCCG-3’；

R-2：5’-GGGATCCGTCAGATGATGCTGACG-3’。

引物F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，引物R-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

载体pJTU4882的构建方法：将pSP72（购于美国Promega公司）用XbaI和EcoRI双酶切，回收1700bp的酶切片段，同样将pHZ1358（载体pHZ1358见"Analysis of functions in plasmid pHZ1358influencing its genetic and structural stability in Streptomyces lividans1326"，Appl Microbiol Biotechnol.2009Feb;82(2):303-10.）用XbaI和EcoRI酶切得到5424bp的片段，将这两片段连接构建A载体，再将全基因合成（上海英骏公司）的XbaI-Xi启动子-SD(核糖体结合位点)-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段通过XbaI和SacI双酶切克隆到上述A载体，构建表达质粒pJTU4882。

XbaI-Xi启动子-SD(核糖体结合位点)-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

其中，Xi启动子和amyA2终止子分别为密苏里游动放线菌（Actinoplanes missouriensis）木糖异构酶的启动子Xi（GenBank登录号X16042.1）和阿维链霉菌淀粉酶终止子（Streptomycesavermitilis MA-4680，amyA2终止子，Gene ID：1210358，2631975-2632040），本发明使用的启动子-SD（核糖体结合位点）来自于密苏里游动放线菌木糖异构酶基因的90-269bp。

各PCR扩增引物均由上海英骏公司(Introvegen)合成；

载体pBluSK(+)购于Stratagene公司；

载体pSP72购于美国Promega公司；

变铅青链霉菌1326和大肠杆菌ET12567（pUZ8002）购于北京北纳创联生物技术研究院；

PCR扩增的酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；

各限制性内切酶购自Fermentas公司；

T4连接酶购自Takara公司；

TSBY（10.3%蔗糖）液体培养基配方：Oxoid胰胨豆汤粉3%，蔗糖10.3%，Oxoid酵母抽提物0.5%；

孢子萌发液的配制：Difco酵母膏1%，Difco酪蛋白氨基酸1%，CaCl₂0.1M。

Bradford蛋白定量试剂盒购于北京博凌科为生物科技有限公司；

suc-AAPF-pNA、suc-AAPL-pNA购自Sigma公司；

各抗生素购自Sigma公司。

实施例1突变点上下游酶切位点的引入

以载体pBluSK(+)-sfp2（图谱如图1所示）为模板，其携带有野生型角蛋白酶基因sfp2，合成下列引物并以引物F和引物R进行反向PCR，通过反向PCR在Leu(78)位点的上下游各15bp处分别引入KpnI和BsmI酶切位点。

F:5′-cccgggtaccttcaacaagctcatcgccggcggcgaatgcatctacgccgcgggcggc-3′

R:5′-tgaaggtacccggggtgcgcttgatctccacggcgccg-3′

引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

PCR反应体系见表1。

PCR程序：95℃预变性5min；95℃30s，65℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

表1

PCR产物经过DpnI限制性内切酶处理后进行自连，测序验证。构建好的载体命名为pBluSK(+)-KB（图谱如图3所示）。pBluSK(+)-KB再经过AfeI和BamHI酶切，连入同样经过AfeI和BamHI酶切处理的pJTU4882（图谱如图2所示），构建表达载体pJTU4882-KB（图谱如图4所示）。

限制性内切酶和T4连接酶反应体系分别见表2和表3。其中，DpnI限制性内切酶切反应体系中DpnI为1μl，AfeI和BamHI酶切反应体系中AfeI和BamHI分别为0.5μl。

表2

组分	体积（μl）
		10×buffer缓冲液(含BSA)	3
DNA	20
		RNA酶（0.1mg/ml）	1
限制性内切酶	1
		ddH2O	5
总体积	30μl

表3

组分	体积（μl）
		10×buffer缓冲液	2
载体DNA	3
		目标片断DNA	10
T4连接酶（400U/μl）	1
		ddH2O	4
总体积	20μl

实施例2  定点突变

将SFP2前导序列的第78位亮氨酸置换为苯丙氨酸，即L(78)F，合成如下2条单链核苷酸链。其中下划线标出序列为突变后的核苷酸。

F-1:5′-cttcaacaagttcatcgccggcggcgaggcca-3′

R-1:5′-gcctcgccgccggcgatgaacttgttgaaggtac -3′

引物F-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，引物R-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

合成的单链核苷酸链采用退火互补的方法生成双链DNA，通过T4 DNA连接酶将上述双链DNA连入经过KpnI和BsmI限制性内切酶处理的pJTU4882-KB。退火互补具体方法如下：合成的2条单链核苷酸链分别溶于蒸馏水，2条核苷酸链等摩尔量混合，95℃处理5min后立即室温冷却，4℃保存备用。pJTU4882-KB的酶切和连接反应按实施例1中的方法操作，克隆，测序验证。构建好的带有突变核苷酸的表达载体命名为pJTU4882-F（图谱如图5所示）。

其中，前导序列定点突变的角蛋白酶基因sfp2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；定点突变的角蛋白酶SFP2前导序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例3pJTU4882-F从大肠杆菌向变铅青链霉菌的两亲本接合转移及工程菌筛选

本实施例提供了前导序列定点突变后的角蛋白酶基因在变铅青链霉菌1326中高效表达的方法，包括受体菌的接合转移方法、重组子的筛选与鉴定以及角蛋白酶的表达方法。

1、大肠杆菌ET12567（pUZ8002）的感受态细胞的制备。将大肠杆菌ET12567(pUZ8002)贮存液在含卡那霉素和氯霉素抗生素的LB平板划线，37℃过夜培养。挑取单菌落，接种于5ml LB培养基(含有卡那霉素和氯霉素)中振荡培养过夜。次日按1%（v/v）接入新鲜的LB液体培养基(含有卡那霉素和氯霉素)，37℃200rpm振荡培养2.5h至OD600=0.4-0.6；4℃5000rpm离心5min，用20ml预冷的终浓度为0.2mM的CaCl₂溶液重悬菌体，4℃5000rpm离心5min；弃上清，再将菌体悬浮于2ml的预冷的0.2mM的CaCl₂溶液中，置于冰上备用。

2、带有oriT的目的质粒pJTU4882-F转化进入大肠杆菌ET12567（pUZ8002）的感受态细胞后，过夜培养转化子细胞，以1:20接种量将培养物接于新鲜LB中，37℃培养3-4h；收集变铅青链霉菌1326的孢子，用无菌水洗涤一次，4500rpm离心3min，吸干上清，再用0.05mol/L TES（pH8.0）洗一次，50℃热激处理10min，水冷后加入750μl孢子萌发液，37℃培养2小时，4500rpm离心10min，沉淀用LB洗涤两次以除去抗生素，最后悬浮在300μl LB中。离心收集二次培养的大肠杆菌，用LB洗三次，加入300μl LB后与上述处理过的孢子混合，稀释50倍涂在SFM平板上，30℃培养16h后，以含40μl萘啶酮酸和20μl硫链丝菌素的水溶液覆盖平板，30℃培养。

3、用棉签轻轻刮取上述平板上的链霉菌在含10μg/ml硫链丝菌素的SFM平板上划单，挑取3-4个溶解圈较大的单菌落保存，用于进一步的角蛋白酶表达实验。

4、保存的L(78)F突变体单菌落接种于TSBY（10.3%蔗糖）液体培养基，硫链丝菌素以终浓度5μg/ml添加，30℃200rpm振荡培养4d，发酵液上清用来测定酶活和进行SDS-PAGE电泳分析表达量，定点突变前（野生型）、后SFP2的表达量见图6。凝胶分析软件分析结果显示本发明的前导序列定点突变的角蛋白酶SFP2在链霉菌中的表达量为112mg/L，为野生型角蛋白酶SFP2表达量的2倍。

实施例4本发明所述的角蛋白酶的活性测定

（一）以酪蛋白为底物时，本发明采用紫外分光光度法测定角蛋白酶活性。

1、配制100μg/mL酪氨酸标准溶液。

2、配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后直接用紫外分光光度计于275nm测定其吸光度（A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）,根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。

3、酶活测定吸取适量稀释的发酵上清液2.00mL、酪素2.00mL、三氯乙酸4.00mL，其它操作条件同福林法测定中的反应、静止沉淀，直到过滤。滤液用紫外分光光度计，在275nm波长下，用10mm比色皿，测定其吸光度（A）。所述方法为常规方法。

4、根据公式X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E计算酶活。

式中：X—样品的酶活力，(U/ml)；A—试样溶液的平均吸光度；K—吸光常数；n—稀释倍数；E—紫外法与福林法的换算系数（碱性蛋白酶系数为0.50）。所得结果表示至整数。

（二）以合成四肽suc-AAPF-pNA为底物时，本发明采用酶标仪405nm测定生成产物4-硝基苯胺（4-nitroaniline）的纳摩尔数计算酶活。suc-AAPF-pNA底物贮存液浓度为100mM(用DMSO配置)。96微孔板中每孔加入10ul的底物suc-AAPF-pNA（10mM）和90ul缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5)稀释适当倍数的发酵上清液，50℃反应10min，测定吸光度。根据从Sigma购买的4-硝基苯胺（4-nitroaniline）制作标准曲线，根据由标准曲线得出的公式X(U/ml)=(A₄₀₅-0.061)×1000×n/0.029×10×10计算发酵上清液酶活(n为稀释倍数)。

以suc-AAPF-pNA为底物，按照此方法计算得L(78)F突变体发酵上清液酶活为6851U/ml，而野生型WT发酵上清液酶活为3454U/ml。同时用Bradford蛋白定量试剂盒（购于北京博凌科为生物科技有限公司）测定L(78)F突变体和野生型发酵上清液中总蛋白含量，分别为0.14mg/ml和0.66mg/ml。以此计算出L(78)F突变体和野生型发酵上清液中比活分别为48935U/mg和5233U/mg。L(78)F突变体发酵上清的比活是野生型的9倍。

实施例5定点突变前、后的角蛋白酶的部分酶学特性分析和动力学常数测定

1、以酪蛋白为底物测定最适pH

对改造前、后的角蛋白酶的酶活按实施例4中所述方法测定，所取pH值范围为7-11。结果见图7。由图7可知，定点突变前、后的角蛋白酶的最适pH均为10.0，但是改造后的最高酶活达到了200U/ml，是野生型酶活的2倍（101U/ml）。

2、以酪蛋白为底物测定最适反应温度

根据实施例4中的方法测定发酵上清液在pH8.5的50mMTris-HCl缓冲液中不同温度下的蛋白酶活力，所取温度为30-60℃。结果见图8。由图8可知，定点突变前、后的角蛋白酶的最适反应温度均为50℃。

3、以合成四肽suc-AAPF-pNA为底物测定热稳定性

按照下述方法我们分别测定定点突变前、后的角蛋白酶在60℃和70℃的热稳定性。合成的四肽底物suc-AAPF-pNA用DMSO溶解使其终浓度为100mM，作为贮存液备用。160倍稀释的发酵上清液90μl和10μl1mM的底物suc-AAPF-pNA混合，50℃反应2min，405nm测定剩余酶活，结果见图9。如图9所示，定点突变前、后的角蛋白酶的热稳定性没有发生改变，60℃热处理45min时酶活下降了50%，而70℃处理5min剩余酶活已不到未处理酶活的50%。

4、以合成四肽suc-AAPF-pNA和suc-AAPL-pNA为底物测定动力学常数

采用Lineweaver-Burk作图法计算出定点突变前、后的角蛋白酶水解两种底物的米氏常数K_m，计算出k_cat和k_cat/K_m，结果如下表4。

表4

由表4可知，定点突变前、后的角蛋白酶SFP2的动力学常数没有发生改变。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种前导序列定点突变的角蛋白酶，其特征在于，其具有（1）或（2）所示的氨基酸序列：

（1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

（2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述前导序列定点突变的角蛋白酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述前导序列定点突变的角蛋白酶编码基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为pJTU4882-F，其构建方法包括如下步骤：

（1）以载体pBluSK(+)-sfp2为模板，通过反向PCR在角蛋白酶前导序列的第78位点的Leu上下游各15bp处分别引入KpnI和BsmI酶切位点，得到的PCR产物经过DpnI限制性内切酶处理后进行自连，构建得到载体pBluSK(+)-KB；载体pBluSK(+)-KB经过AfeI和BamHI酶切，连入同样经过AfeI和BamHI酶切处理的载体pJTU4882，构建得到表达载体pJTU4882-KB；

（2）合成如下2条单链核苷酸链：

F-1:5′-cttcaacaagttcatcgccggcggcgaggcca-3′

R-1:5′-gcctcgccgccggcgatgaacttgttgaaggtac-3′；

所述单链核苷酸链采用退火互补的方法生成双链DNA，通过T4DNA连接酶将上述双链DNA连入经过KpnI和BsmI限制性内切酶处理的pJTU4882-KB，构建得到带有突变核苷酸的表达载体pJTU4882-F；

其中，步骤（1）中载体pBluSK(+)-sfp2的构建方法为：以F-2和R-2为引物，以弗氏链霉菌基因组为模板扩增角蛋白酶基因，并克隆至pBluSK(+)，构建得到pBluSK(+)-sfp2；

F-2：5’-AACATATGCGCTTCACCCCCCG-3’；

R-2：5’-GGGATCCGTCAGATGATGCTGACG-3’；

步骤（1）中载体pJTU4882的构建方法：将pSP72用XbaI和EcoRI双酶切，回收1700bp的酶切片段，同样将pHZ1358用XbaI和EcoRI酶切得到5424bp的片段，将这两片段连接构建A载体，再将全基因合成的XbaI-Xi启动子-SD-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段通过XbaI和SacI双酶切克隆到上述A载体，构建表达质粒pJTU4882；其中，XbaI-Xi启动子-SD-sfp2基因-amyA2终止子-SacI片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（1）中反向PCR引物如下：

F:5′-cccgggtaccttcaacaagctcatcgccggcggcgaatgcatctacgccgcgggcggc-3′

R:5′-tgaaggtacccggggtgcgcttgatctccacggcgccg-3′；

PCR程序：95℃预变性5min；95℃30s，65℃30s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

7.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（2）中退火互补方法如下：合成的2条单链核苷酸链分别溶于蒸馏水，2条核苷酸链等摩尔量混合，95℃处理5min后室温冷却。

8.含有权利要求4-7任一项所述重组表达载体的宿主细胞。

9.权利要求2或3所述的基因或权利要求4-7任一项所述重组表达载体在提高链霉菌中角蛋白酶表达量中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求2或3所述的基因或权利要求4-7任一项所述重组表达载体转入链霉菌中，使前导序列定点突变后的角蛋白酶基因在链霉菌中表达。

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