CN103602653B - 一种热稳定性及比酶活提高的角蛋白酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比酶活和热稳定性提高的角蛋白酶及其应用，属于遗传工程领域。本发明通过对角蛋白前导肽切割位点进行突变及N端改造，获得一种具有广泛工业应用前景的角蛋白酶，其在60℃的t_1/2为20min，比野生型角蛋白酶t_1/2提高了近2倍。同时突变体的比酶活较野生型提高了近50%，这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。

Description

一种热稳定性及比酶活提高的角蛋白酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种比酶活和热稳定性提高的重组角蛋白酶及其构建方法和应用，属于遗传工程技术领域。

背景技术

角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物每年产量巨大，且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对环境的污染，同时可以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。在传统利用羽毛过程中主要采用酸碱水解。热降解等方法，前者存在污染环境问题，后者对能源消耗比较大，且可以破坏部分氨基酸，降低了产品的营养价值。其他常见的角蛋白为动物的毛发，如牛毛、羊毛和人发等，这类角蛋白质部分作为商业原料进行加工外，其余多作为废物处理，也造成了环境的污染和蛋白资源的浪费。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于农业肥料的生产，又可作为畜禽的饲料蛋白源；角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，其在皮肤病治疗方面的研究还有待于进一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白，从而可应用于医疗和实验仪器的净化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。

拥有较差热稳定性的酶严重影响该酶在工业上的应用，提高角蛋白酶的热稳定性在利于工业化应用的同时有助于角蛋白酶在应用过程中更好的渗透入底物表面并作用于底物，而且能够减少杂菌的生长。同时提高重组角蛋白酶的比酶活可以更加有利于工业化应用。地衣芽胞杆菌来源的角蛋白酶同枯草杆菌蛋白酶一样，以信号肽-前导肽-成熟酶区域(Pre-pro-subtilisin precursor)的前体结构进行分泌。角蛋白酶的成熟酶区域由274个氨基酸组成，包括催化三分子结构(D32,H63,S220)。在角蛋白酶的前体未进行折叠前成熟酶的N端与前导肽的C端以非共价形式连接，在前导肽进行自加工切割并被降解后，才能形成具有活性的成熟酶。角蛋白酶的前导肽切割位点区域主要包括前导肽的C端和成熟酶的N端，所以此区域对角蛋白酶的活性及热稳定性可能具有一定的影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的角蛋白酶，其是对现有的角蛋白酶前导肽切割位点进行突变及N端改造。

所述角蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种获得所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登录号为JX504681公布的基因序列基础上，对前导肽切割位点区域进行分子改造，具体为前导肽的C端（-1）位点Leu替换为Ala，成熟酶N端氨基酸AQTVP替换为YTPNDPYFSSRQ。

产所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建产角蛋白酶的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述角蛋白酶的基因；

2）将步骤1）获得的角蛋白酶基因连接到枯草杆菌表达载体，得到重组表达载体；

3）将步骤2）获得的重组表达载体转化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。

所述表达载体优选pMA5。

应用上述产角蛋白酶基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，将其斜面活化制备种子后，以3%的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养24h。

所述基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，葡萄糖10g/L,MgSO₄0.1g/L。

检测重组角蛋白酶热稳定性指标（t_1/2）的定义方法：酶在指定温度下酶活损失一半时所需要的时间。

本发明采用定点突变技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶（ker）基因进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5，转化Bacillus subtilisWB600，经纯化验证得到一株可以产具有较好热稳定性角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis WB600-pMA5-kerTB。该菌株表达的角蛋白酶在60℃的t_1/2为20min，比野生型角蛋白酶t_1/2提高了近2倍。同时突变体的比酶活较野生型提高了近50%，这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。

附图说明

图1：（a）目的基因的扩增。M：DL2,000DNA Marker；泳道1和泳道2：ker基因的PCR扩增条带；（b）菌落PCR挑选阳性重组子。M：DL2,000DNA Marker；泳道1和泳道2：阳性重组子。

图2：（a）重组质粒的提取。M：DL10,000DNA Marker；泳道1和泳道2：重组质粒pMA5-ker；

（b）双酶切验证。M：DL10,000DNA Marker；泳道1：重组质粒pMA5-ker；泳道2：重组质粒用Bam H I和Nde I双酶切后得到的条带。

图3：蛋白电泳（SDS-PAGE）实验结果。（a）M：蛋白质分子量标准(Protein Molecular WeightMarker)；1-9:WT,L(-1)H,L(-1)R,L(-1)A,L(-1)G,L(-1)E,L(-1)D,L(-1)F,L(-1)Y;（b）M：蛋白质分子量标准(Protein Molecular Weight Marker)；1:N-YTPND。

图4：分子改造前导肽（-1）位点后不同突变体重组角蛋白酶的比酶活比较。

图5：分子改造成熟区域N端后重组角蛋白酶在60℃的t_1/2和野生型（未改造）酶在60℃的t_1/2的比较。

具体实施方式

实施例1热稳定性提高的角蛋白酶

本发明的角蛋白酶是在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基础上，在其前导肽切割位点区域进行分子改造，具体为前导肽的C端（-1）位点Leu替换为Ala，成熟酶N端AQTVP替换为来源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜热蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ。其获得方法为以GenBank accession nos.JX504681公布的基因为出发基因,通过化学全合成或定点突变的方式将其前导肽切割位点区域进行氨基酸的取代；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2产角蛋白酶基因工程菌的构建及鉴定

构建产角蛋白酶基因工程菌的步骤如下：

1）采用PCR方法或化学全合成方法获得ker基因；

2）将ker基因连接到克隆载体pMD19-T，得到重组载体pMD19-T-ker；

3）前导肽C端（-1）位点Leu替换为不同类型的氨基酸。成熟酶N端AQTVP替换为来源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜热蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ（N-YPTND）。

突变可采用定点突变技术或其它技术，只要能实现突变即可。

本专利列举Leu(-1)Ala的引物以为实例：

Leu(-1)Ala：GATCATGTGGCCCATGCCTTG(GCA)GCGCAAACCGTTCCTTACN-YPTND：

TATACGCCTAATGACCCTTATTTCTCATCAAGACAA TACGGCATTCCTCTCATTAAAGC

PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×prime STAR PCR buffer II（Mg²⁺plus）5μl;DNTP Mixture4μl;模板DNA1μl；上下游引物各1μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃（根据不同突变引物而定）退火15s，72℃延伸3min20s（30个循环）；72℃延伸10min。

将胶回收纯化后的PCR产物在37℃,10min条件下用磷酸化试剂盒处理使之磷酸化。然后应用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，并挑选转化子。

4）挑选验证正确的转化子并提取重组质粒pMD19-T-kerTB，以其为模板扩增kerTB基因。

PCR方法引物序列如下：

ker1-F：5’-GGAATTCCATATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGG-3’

ker1-R：5’-CGCGGATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCG-3’

地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011319。

PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×prime STAR PCR buffer II（Mg²⁺plus）5μl;DNTP Mixture4μl;模板DNA1μl；上下游引物各1μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火15s，72℃延伸1min20s（30个循环）；72℃延伸10min。

5）以1%琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8%琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到与文献报道大小相符的ker基因片段(图1a-泳道1、泳道2)。

6)用限制性内切酶Nde I和Bam HI双酶切消化纯化后的ker基因和载体pMA5，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有氨苄青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃过夜培养，以ker1-F和ker1-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子（图1b-泳道1、泳道2），最终获得含有kerTB基因的重组表达质粒pMA5-kerTB（图2a-泳道1、泳道2），用双酶切进行验证（图2b-泳道2）。

大肠杆菌化学转化为：取连接产物5μl加入到含有100μl JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管，42℃水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min；向管中加入600μl LB液体培养基，置于37℃200rpm恒温摇床上培养1h，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37℃向上放置1h，倒置培养12-16h后观察菌落。

7）将重组质粒pMA5-kerTB转化Bacillus subtilis WB600感受态细胞，得到能在含有卡那霉素（25μg/mL）的LB平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为Bacillus subtilisWB600-pMA5-kerTB。

实施例3重组菌的酶活测定和蛋白电泳

角蛋白酶酶活测定方法：将发酵液离心10min（10000×g，4℃）取发酵上清液，吸取200μL适当稀释的酶液，加入300μL0.05mol/L gly-NaOH缓冲液（pH9.0）溶解1%的底物（角蛋白），50℃培养20min，加入500uL4M TCA溶液以终止反应。离心10min，吸取200μL上清液移入到新的试管中，后依此加入1mL福林酚试剂和200μL0.5M Na₂CO₃后50度显色15min。空白为在加入酶液的同时，加入500μL TCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在660nm处检测吸光值，根据酪氨酸标准曲线定义每15min内释放1μg酪氨酸定义为一个酶活单位。通过蛋白电泳（SDS-PAGE）得到一条分子量大小约为30kDa的蛋白条带（见图3）。

实施例4发酵生产角蛋白酶

培养基：种子和斜面培养基为LB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为添加葡萄糖的LB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，葡萄糖10g；

培养方法：将37℃、200rpm下培养过夜的种子以3%的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养。

纯化后测定突变体Leu（-1）Ala重组角蛋白酶的比酶活较野生型提高了50%（图4），将成熟酶N端替换为来源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜热蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ，检测其热稳定性，在60℃的t1/2为20min，比野生型角蛋白酶t1/2提高了近2倍（见图5）。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种热稳定性及比酶活提高的角蛋白酶，其特征在于对现有的角蛋白酶前导肽切割位点进行突变及N端改造；所述角蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.获得权利要求1所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登录号为JX504681公布的基因序列基础上，对前导肽切割位点区域进行分子改造，具体为前导肽的C端(-1)位点Leu替换为Ala，成熟酶N端氨基酸AQTVP替换为YTPNDPYFSSRQ。

3.产权利要求1所述角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系。

4.一种构建产权利要求3所述角蛋白酶的基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述角蛋白酶的基因；

2)将步骤1)获得的角蛋白酶基因连接到枯草杆菌表达载体，得到重组表达载体；

3)将步骤2)获得的重组表达载体转化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述表达载体为pMA5。

6.一种发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于以权利要求4获得的产角蛋白酶基因工程菌为生产菌株，斜面活化制备种子后，以3％的接种量转入已优化的基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养24h。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述已优化的基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖10g/L，0.1g/L MgSO4。