CN102936588A - 一种热稳定性提高的蛋白酶及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种热稳定性提高的角蛋白酶及其应用，属于遗传工程领域。本发明采用定点突变技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶（ker）基因进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA 0911，转化Bacillus subtilis WB600，经纯化验证得到一株可以产具有较好热稳定性角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisWB600-pMA 0911-kerTB，该菌株表达的角蛋白酶在60℃的T1/2为78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍。这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的重组角蛋白酶及其构建方法和应用，属于遗传工程技术领域。
背景技术
角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。羽毛作为家禽饲养和屠宰工业的副产物每年产量巨大，且蛋白质和氨基酸含量丰富，是潜在的优良蛋白质资源。羽毛的合理利用一方面可以减少废弃物对环境的污染，同时可以作为一种饲科蛋白质应用于畜禽的饲养。在传统利用羽毛过程中主要采用酸碱水解。热降解等方法，前者存在污染环境问题，后者对能源消耗比较大，且可以破坏部分氨基酸，降低了产品的营养价值。其他常见的角蛋白为动物的毛发，如牛毛、羊毛和人发等，这类角蛋白质部分作为商业原料进行加工外，其余多作为废物处理，也造成了环境的污染和蛋白资源的浪费。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于农业肥料的生产，又可作为畜禽的饲料蛋白源；角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，其在皮肤病治疗方面的研究还有待于进一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白，从而可应用于医疗和实验仪器的净化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。
拥有较差热稳定性的酶严重影响该酶在工业上的应用，提高角蛋白酶的热稳定性在利于工业化应用的同时有助于角蛋白酶在应用过程中更好的渗透入底物表面并作用于底物，而且能够减少杂菌的生长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的角蛋白酶。上述角蛋白酶是在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基础上，其成熟区的四个位点发生氨基酸突变，具体为N122Y,N160C,A193P,N217S，其获得方法为以GenBank accession nos.JX504681公布的基因为出发基因,通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的四个位点进行氨基酸的取代。
产所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建产角蛋白酶的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述蛋白酶的基因kerTB；
2）将步骤1）获得的kerTB基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
所述表达载体优选pMA 0911。
应用上述产角蛋白酶基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，将其斜面活化制备种子后，以3%的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养24h。
所述基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖10g/L,0.1g/L MgSO4。
检测重组角蛋白酶热稳定性指标（T1/2）的定义方法：酶在指定温度下酶活损失一半时所需要的时间。
本发明采用定点突变技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶（ker）基因进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA 0911，转化Bacillussubtilis WB600，经纯化验证得到一株可以产具有较好热稳定性角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-pMA 0911-kerTB。该菌株表达的角蛋白酶在60℃的T1/2为78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍。这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。
附图说明
图1：蛋白电泳（SDS-PAGE）实验结果。M：蛋白质分子量标准(Protein Molecular WeightMarker)；1：不含质粒的Bacillus subtilis WB600；2：含质粒pMA0911-ker重组菌；3：含质粒pMA0911重组菌。
图2：分子改造后重组角蛋白酶在60℃的T1/2和野生型（未改造）酶在60℃的T1/2的比较。
具体实施方式
实施例1热稳定性提高的角蛋白酶
本发明的角蛋白酶是在GenBank accessionnos.JX504681公布的基因序列基础上，其成熟区的四个位点发生氨基酸突变，具体为N122Y,N160C,A193P,N217S，可以通过化学全合成或定点突变的方式将其成熟区的四个位点进行氨基酸的取代。
实施例2产角蛋白酶基因工程菌的构建及鉴定
采用化学全合成方法获得编码实施例1中角蛋白酶的ker基因，将其克隆到pMA0911，获得含有kerTB基因的重组表达质粒pMA 0911-kerTB。
重组质粒pMA 0911-kerTB转化Bacillus subtilis WB600感受态细胞，得到能在含有卡那霉素（30mg/mL）的LB平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为Bacillussubtilis WB600-pMA 0911-kerTB。。
实施例3重组菌的酶活测定和蛋白电泳
角蛋白酶酶活测定方法：将发酵液离心10min（10000×g，4℃）取发酵上清液，吸取200uL适当稀释的酶液，加入300uL 0.05mol/L gly-NaOH缓冲液（pH9.0）溶解1%的底物（角蛋白），50℃培养20min，加入500uL 4M TCA溶液以终止反应。离心10min，吸取200uL上清液移入到新的试管中，后依此加入1mL福林酚试剂和200uL 0.5MNa2CO3后50度显色15min。空白为在加入酶液的同时，加入500uLTCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在660nm处检测吸光值，根据酪氨酸标准曲线定义每15min内释放1ug酪氨酸定义为一个酶活单位。
培养基：种子和斜面培养基为LB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为添加葡萄糖的LB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，葡萄糖10g；
培养方法：将37℃、200rpm下培养过夜的种子以3%的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养；
以空载体作为对照，通过蛋白电泳（SDS-PAGE）得到一条分子量大小约为30kDa的蛋白条带（见图1），纯化后测定该重组角蛋白酶在60℃的T1/2为78min，比野生型角蛋白酶T1/2提高了近9倍（见图2）。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种热稳定性提高的角蛋白酶，其特征在于在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基础上，其成熟区的四个位点发生氨基酸突变，具体为N122Y,N160C,A193P,N217S。
2.一种获得权利要求1所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank accession nos.JX504681公布的基因为出发基因,将其成熟区的四个位点进行氨基酸的取代。
3.产权利要求1所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系。
4.权利要求3所述产角蛋白酶的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码权利要求1所述蛋白酶的基因kerTB；
2）将步骤1）获得的kerTB基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3）将步骤2）获得的重组表达载体转化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
5.权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于所述表达载体为pMA0911。
6.应用权利要求4所述基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于以产角蛋白酶基因工程菌为生产菌株，斜面活化制备种子后，以3%的接种量转入已优化的基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养24h。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，葡萄糖10g/L，0.1g/L MgSO4。
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