CN103667155A

CN103667155A - 一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2及其应用

Info

Publication number: CN103667155A
Application number: CN201310716496.8A
Authority: CN
Inventors: 姚青; 顾振红; 刘晓迪; 朱红惠; 谢小林
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: CN103667155B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2及其应用。所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2于2013年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No.M2013555。该菌株的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2能够产生角蛋白酶，经测定，该菌培养3天后，角蛋白酶活性达46.43U/ml，因此可用于生产角蛋白酶，对角蛋白酶的研究和利用具有重要的价值。

Description

一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2及其应用。

背景技术

在现代农业中，随着经济的发展，大型的养殖场越来越多。家禽养殖和加工过程中产生的大量羽毛等角蛋白废弃物每年在全球范围内可至成百上千万吨，我国也达几十万吨，这对环境造成了极大的污染，同时，研究人员发现，角蛋白富含有大量的蛋白质和氨基酸，对其营养成分的研究表明：羽毛中含粗蛋白超过80 %，各种氨基酸总量超过70 %。可见，若加以恰当处理，羽毛等角蛋白废弃物可达到生物转化的目的。

组成家禽羽毛的角蛋白是一种纤维，不可溶性的结构蛋白，大部分以β-折叠成超螺旋结构，多肽链的半胱氨酸残基之间的二硫键高度紧密交叉联结，因而机械稳定性强，一般的蛋白水解酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶都难以将其降解。

然而，在自然界中角蛋白并未有聚积的现象，这表明某些特殊的微生物在发挥降解角蛋白的作用, 其原因就在于这些微生物能分泌一类酶，称为角蛋白酶（keratinase，EC 3.4.21/24/99.11），该类酶能够特异性地分解角蛋白，使其降解为多肽和氨基酸。自1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌（Onygenaequina）能分解角蛋白以来，已先后发现30余种微生物具有降解角蛋白的能力，主要包括真菌、放线菌和细菌3类。其中，产生蛋白酶的细菌多来自芽孢杆菌，研究最为深入的是地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，个别菌株所产角蛋白酶已进行了商业化生产，如地衣芽孢杆菌PWD-1（Bacillius licheniforrmis PWD-1）纯化后角蛋白酶活性很高，商品名称为Versazyme^TM。

我国在羽毛角蛋白分解菌的培养和筛选方面的研究落后于国外，分离与筛选出的高效菌种并不多，且多是真菌与放线菌，因而筛选高产而且具较好稳定性角蛋白酶新的菌群也是一个研究热点。羽毛废弃物经过适当处理，使废弃的羽毛角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸，从而变废为宝，既能保护环境又资源利用，这也将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种枯草芽孢杆菌。

本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一株枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)3-2，本发明中简称枯草芽孢杆菌3-2，该菌于2013年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No. M2013555。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2是发明人从广东温氏食品集团有限公司养殖场采集的土样中分离出来的。

菌株分离后经菌落形态鉴定：该菌在平板上培养24h后的菌落呈白色，圆形，表面光滑不透明，边缘整齐；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有端生纤毛，运动，无荚膜，芽孢周生，椭圆形。

该菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

经生理生化测定，本发明的枯草芽孢杆菌3-2的脲酶试验为阴性，接触酶试验为阴性；能水解明胶、淀粉，对吐温80不具水解性；硝酸还原测定为阳性，苯丙氨酸测定为阴性。生长最适温度范围28～30 ℃。

该菌株具有分解羽毛的功能，能够产生角蛋白酶，经测定，该菌培养3天后，角蛋白酶活性达46.43U/ml，因此可用于生产角蛋白酶的工业生产中，对角蛋白酶的研究和利用具有重要价值。

附图说明

图1. 枯草芽孢杆菌3-2的透射电子显微镜照片(6000倍)。

图2. 枯草芽孢杆菌3-2及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树。

图3. 枯草芽孢杆菌3-2降解羽毛的效果图，其中锥形瓶3-2为加入枯草芽孢杆菌3-2的实验组，锥形瓶CK为空白对照组。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

实施例1 枯草芽孢杆菌3-2的分离

土样取自广东省广州市华南农业大学校内，混入鸡羽毛，待羽毛分解后收集土样，自然阴干，4℃保存备用。

取10g上述土样放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻璃珠)，在180 rpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后，取上层液稀释10倍后，依次制成10^-4、10^-5、10^-6土壤稀释液，取0.1mL均匀涂布在NA琼脂培养基平板上，翻转平板置于30℃培养箱中培养2天。对每个菌落形态不同的菌株做2个平行纯化平板。挑取初筛单菌落于基础盐羽毛培养基中，置于30℃摇床，120rpm培养，以未接种的培养基作对照，观察羽毛降解情况。

NA琼脂培养基配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5g，琼脂20.0g，水1000ml；pH 7.4±0.2。

基础盐羽毛培养基配方：磷酸氢二钠0.3g，磷酸二氢钠0.4g，氯化钠 0.5g，水1000ml，0.1%天然羽毛，pH 7.4±0.2。

经过基础盐羽毛培养基的进一步培养，筛选出分解羽毛效率最高的菌株，经过形态学及生理生化和DNA鉴定后，命名枯草芽孢杆菌3-2。

实施例2 枯草芽孢杆菌3-2的生物学性状及生理生化和分子鉴定

S1.形态特征

枯草芽孢杆菌3-2在电镜下的形态见于图1，该枯草芽孢杆菌在平板上培养24h后的菌落呈淡黄色，圆形，表面光滑半透明，边缘整齐；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有周身纤毛，运动，无荚膜，芽孢端生，椭圆形。

S2.生理生化特征：经生理生化测定，本发明的枯草芽孢杆菌的脲酶试验为阴性，接触酶试验为阴性；能水解明胶、淀粉，对吐温80不具水解性；硝酸还原测定为阳性，苯丙氨酸测定为阴性。生长最适温度范围28～30℃，如表1所示。

表1 枯草芽孢杆菌3-2的生理生化特性

生理生化特征	3-2
		菌落颜色	LO
细胞形状	R
		芽孢位置	T
运动性	＋
		NaCl（%）耐受性	10%
生长：pH 5.6	＋
		4℃	－
25℃	＋
		42℃	－
接触酶	＋
		氧化酶	＋
卵黄卵磷脂酶	－
		脲酶	－
柠檬酸盐利用	＋
		水解性：明胶	＋
水解性：淀粉	＋
		水解性：吐温80	－
硝酸还原作用	＋
		苯丙氨酸测定	－

注：＋，阳性；－，阴性；LO，淡黄色；R，杆状；T，端生。

S3.枯草芽孢杆菌3-2的16S rDNA的序列测定与分析

S31.PCR模板DNA的快速准备：将枯草芽孢杆菌3-2划线接种在NA培养基的平板上，30℃培养过夜。取单一菌落悬浮于10μL无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA。

S32. 16S rDNA基因PCR扩增

PCR引物由上海英骏公司合成。

Primer A：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO:2）；

Primer B：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’ （SEQ ID NO:3）；

PCR反应体系如下：

10×PCR缓冲液	5μL
		2mmol/L d NTP	4μL
10pmol/L Primer A	1μL
		10pmol/L Primer B	1μL
2U/L Taq酶	0.4μL
		DNA模板	1μL
灭菌ddH₂O	37.4μL
		总体积	50μL

PCR扩增条件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃ 7min。

S3.序列测定：PCR产物纯化后，送上海英骏公司用3730全自动测序仪测序，其序列如SEQ ID NO：1所示。该序列与GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA序列，构建系统发育树，见于图2。经比较分析发现，本发明的枯草芽孢杆菌3-2与菌株 (Bacillus siamensis KCTC 13613^T)亲缘关系最近，枯草芽孢杆菌3-2的16S rDNA基因序列与Bacillus siamensis KCTC 13613^T有99.93%的同源性。

综合16S rDNA序列分析生理生化特性分析，表明本发明属于枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌3-2（Bacillus subtilis 3-2），该菌于2013年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No. M2013555。

实施例3枯草芽孢杆菌3-2产生的角蛋白酶产生测定

挑取实施例1筛选出的枯草芽孢杆菌3-2的单菌落，接种至基础盐羽毛培养基，在30℃的振荡摇床上培养7天，观察在培养基中是否出现降解。

角蛋白酶活性的测定按照文献“Brandelli A, Daroit D J, Riffel A. Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications[J]. Applied microbiology and biotechnology. 2010, 85(6): 1735-1750”的方法，稍加修改。取上述培养液500uL加入500uL含5mg天青角蛋白(Keratin Azure, Sigma-Aldrich)于50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)中。混合液30℃温育1h，3 000 ×g，4℃离心10 min，在595nm处测定OD值。计算Δ_OD595。酶活力单位定义：实验条件下，595nm处吸收值升高0.001所需的酶量为一个活力单位(U)。

测试结果发现，培养基中的羽毛被降解（见图3），表明本发明的枯草芽孢杆菌3-2具有降解羽毛的能力，经测定，该菌培养3天后，可以将羽毛降解，角蛋白酶活性达46.43U/ml。因此可用于角蛋白降解的研究和利用。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<400> 1

atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 120

gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga 180

tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat 420

agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480

cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc 540

ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg 600

ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660

tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga 720

aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780

taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg 840

gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900

agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac 960

aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080

tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag 1200

aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga 1260

tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380

cacccgaagt cggtgaggta acctttatgg agccagccgc 1420

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Primer A

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Primer B

<400> 3

aaggaggtga tccaccccca 20

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 3-2，该菌于3013年11月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No. M2013555。

2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形态为：菌落呈白色，圆形，表面光滑不透明，边缘整齐；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，具有端生纤毛，运动，无荚膜，芽孢周生，椭圆形。

3. 根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4. 权利要求1至3任一项所述枯草芽孢杆菌在分解角蛋白中的应用。

5. 权利要求1至3任一项所述枯草芽孢杆菌在生产角蛋白酶中的应用。