CN109456958A - 利用角蛋白酶进行金纳米粒子制备的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物法制备金纳米粒子，即采用角蛋白酶进行金纳米粒子制备的方法，属于工业生物技术领域。基于本专利所采用的角蛋白酶突出的还原性能，将角蛋白酶液加入到配制好的不同浓度氯金酸溶液中，通过控制氯金酸溶液浓度、酶液添加量和反应时间等因素逐步进行合成反应优化，成功制备获得金纳米粒子，粒径为30nm左右，Zeta电位为‑13mV。该生物法制备金纳米粒子，可以有效解决传统的物理法所需设备的限制和化学法存在环境污染等问题，同时，该方法周期短，工艺简单，适合于工业化大规模的生产。另外，金纳米粒子独特的光学特性以及增强效应，使其被广泛应用于生物及医学检测等领域，具有良好的应用前景。

Description

利用角蛋白酶进行金纳米粒子制备的方法及其应用

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，涉及一种生物法制备金纳米粒子技术，即采用角蛋白酶法进行金纳米粒子的生物制备。

背景技术

角蛋白酶是一种能分解普通蛋白酶难以降解的不溶性角蛋白底物的特殊蛋白酶。近年来，角蛋白酶在各领域的应用越来越广泛。刘柏宏等人从菌株Stenotrophomonasmaltophilia BBE11-1所产角蛋白酶的研究发现，该菌的角蛋白降解活性由三种酶共同作用，其中一种酶蛋白(K3：16kDa)具有二硫键还原能力(两种产角蛋白酶菌株的酶学性质研究及其发酵优化, 中国生物发酵产业年会论文集,上海,2013)；黄林等对弗氏链霉菌S-221变种降解角蛋白的生化机制进行研究发现，该菌诱导产生的角蛋白酶是一种复合蛋白酶,含有二硫键还原酶，具有较高的二硫键还原活性(链霉菌降解角蛋白的生化机制研究.微生物学通报,2006,4:36-42)。

近年来，随着金纳米制备技术的不断发展，金纳米的应用越来越广泛。金纳米具有良好的光学特性、生物相容性及催化活性等独特的物理、化学性质，被广泛用于化学、生物、医药、食品等重要领域：因金纳米粒子有着易制备，表征方法简单，检测灵敏度高等优点，使它在食品安全检测方面有着重要应用；因其会因粒径变化而颜色随之变化的特性，可广泛用于分子识别及检测、免疫分析和生物传感器；基于金纳米粒子良好的生物相容性以及尺寸效应和靶向性等特点，如今金纳米粒子已经成为了肿瘤靶向治疗的热点话题。除此之外，经过表面修饰后的金纳米粒子在细胞成像、药物载体等许多方面能起到非常重要的作用，其性能与纳米金的结构组成、形貌特征、粒径尺寸等息息相关。

金纳米粒子的制备方法主要为物理法和化学法。物理法制备金纳米粒子主要是利用各种分散技术直接将金单质转变为纳米粒子，包括真空沉积法、球磨法、蒸发冷凝法、等离子法等方法。当对所制备的粒子形态要求不高、或需要大规模产业化制备时，通常都使用物理法制备。但物理法在操作过程中对制备设备的要求偏高，反应能耗高，得到的纳米粒子尺寸分布不均匀。化学还原法合成金纳米粒子主要是指在液相中利用还原剂的还原能力将金离子还原成金单质，然后生长得到金纳米粒子的方法。化学法制备得到的金纳米粒子粒度分布较宽，并且易产生团聚现象，所以一般需要加入少量的稳定剂来降低粒子的团聚程度，除此之外还常需要引入其他添加剂，如分散剂、保护剂等。这些添加剂中不乏毒性较大、污染严重的有机溶剂及其他化学试剂，不但对环境造成污染，也不利于所制金纳米的广泛应用。

而本项目中生物法合成金纳米，即采用角蛋白酶合成金纳米，是将角蛋白酶酶液经过0.22μm 微孔滤膜过滤后置于氯金酸溶液中，通过控制合成反应中氯金酸浓度、酶添加量以及合成反应时间进行逐步优化，从而得到金纳米粒子以及其最适制备条件。此方法操作简单易行、绿色环保、成本低廉，制备得到的金纳米粒子仍具有良好的生物相容性等其他优良特性，具有广阔的应用前景。同时，本专利利用角蛋白酶进行生物法制备金纳米粒子为国际上首次报道，因此该研究具有良好的理论意义和实践价值。

发明内容

本发明所采用的产角蛋白酶kerBv的细菌菌株，由本实验室前期构建、改造并保藏，命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600/pMA5-kerBv。

本发明对提供的产角蛋白酶的枯草芽孢杆菌株发酵条件进行了初步优化，获得了对该菌株进行培养的发酵培养基及发酵条件，培养基配方为：甘油30g/L、酵母粉:蛋白胨＝2:1(复合氮源)42g/L、磷酸盐100mmol/L、K₂SO₄(无机盐)2.5mmol/L、自然初始pH。

发酵培养条件为：培养温度37℃、转速为220rpm，发酵周期为36h，产生角蛋白酶活力为8949U/mL。

该角蛋白酶发酵液经过滤后，可还原氯金酸溶液制备纳米金粒子，经反应变量控制后的最优反应条件为：氯酸金溶液1mM、1400U角蛋白酶、培养温度40℃，振荡反应时间5h。

所述产品金纳米粒子表征过程中将上述反应条件作为实验组，同时用失去酶活的角蛋白酶进行上述反应作为对照组。表征结果如下：粒径约为30nm，Zeta电位值为-13mV，红外吸收光谱测定中对照组金纳米粒子有关吸收峰明显弱于实验组的吸收峰。

本发明提供了一种适用于工业化生产角蛋白酶KerBv的枯草芽孢杆菌菌种及发酵方法，发酵酶活力可达8949U/mL，为目前最高水平。该菌株所产细菌角蛋白酶，可用于生物法还原制备粒径较小的金纳米粒子，有效解决物理方法中的制备设备限制及减少传统化学试剂合成方法产生的污染。该方法操作简单易行、绿色环保、成本低廉，制备得到的金纳米粒子具有良好的生物相容性等其他优良特性。且基于金纳米粒子的电、光、热性和催化活性，可制备金纳米粒与抗癌药物复合物用于癌症的精准治疗。与此同时，在多功能金纳米探针的蛋白检测方法中，可通过金纳米颗粒偶联等多步信号放大作用提高蛋白检测灵敏度，简化检测步骤和缩短检测时间，可应用于肿瘤等疾病的临床早期蛋白检测。

附图说明

图1.生物法制备纳米金粒子时不同氯金酸溶液浓度下反应液吸收峰。

图2.生物法制备纳米金粒子时不同反应时间下反应液吸收峰。

图3.生物法制备纳米金粒子时不同酶添加量下的反应液吸收峰。

图4.实验组纳米金溶液在振荡反应5h的粒径。

图5.对照组纳米金溶液在振荡反应5h的粒径。

图6.角蛋白酶生物法合成金纳米粒子透视电镜图。

图7.角蛋白酶生物法合成金纳米粒子的红外吸收光谱。

图8.角蛋白酶生物法合成对照组与实验组反应5h的红外吸收峰。

图9.CGMCC No.12935在300mM、400mM和500mM底物浓度下以及添加不同浓度葡萄糖后产3-羟基丙酸变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不受这些实施例的限制。

实施例1角蛋白酶的产酶发酵优化及高效表达

选择B.subtilis WB600为宿主菌，将角蛋白酶基因kerBv重组构建获得重组菌B.subtilis WB600/pMA5-kerBv，该重组菌能够利用角蛋白酶自身信号肽将角蛋白酶分泌到细胞外，将重组菌进行摇瓶及5L发酵罐产酶实验。

(1)碳源实验

根据48h取出的酶液所测得的酶活显示，在所选取的不同碳源中，以甘油为碳源的菌体所产酶活更高，培养基中甘油含量为2％。目前已有其他研究表明，在培养基中添加葡萄糖对菌株产酶有抑制作用，这与本实验的研究结果一致。

(2)碳源浓度的优化

在确定甘油为最佳碳源后，配制不同浓度的甘油培养基进行发酵培养，48h后测定酶活。结果显示随着甘油浓度上升到2％时，酶活有较大提升，在甘油浓度为3.5％时酶活最高。甘油浓度超过3.5％后，随着浓度继续提升，酶活开始下降。原因可能为碳源浓度过高导致菌体生长过于旺盛，致使溶氧不足而酶活降低。

(3)单一氮源种类的优化

根据48h取出的酶液所测得的酶活显示，在所选取的单一氮源中，只有以酵母粉和蛋白胨为氮源的菌体产出的酶的酶活较高；另外还可以看出该菌株基本不利用无机氮源(如硫酸铵、氯化铵)、羽毛粉及豆饼粉等作为氮源进行生长。根据该实验结果，后续将使用酵母粉和蛋白胨的复合氮源进行优化试验。而其他已有的研究成果也表明，无机氮源(如尿素、硫酸铵等铵盐)会对菌株产酶有明显抑制作用。

(4)复合氮源比例优化

在酵母粉和蛋白胨比例从1:4至2:1变化时，48h酶活逐渐上升，在比例为2:1时达到最高，超过这个比例之后酶活则逐渐下降，所以酵母粉或者蛋白胨含量过高都会抑制菌体酶活。在酵母粉：蛋白胨＝2:1时，菌株酶活最高。

(5)复合氮源浓度优化

随着复合氮源浓度上升，菌株产酶酶活也逐渐上升，在复合氮源浓度为42g/L时酶活达到最高。在超过这个浓度之后，复合氮源浓度的上升会导致酶活下降。原因可能为氮源浓度过高使菌体快速生长，导致溶氧不足而使酶活下降。

(6)磷酸盐浓度优化

在磷酸盐浓度从40增加至80mmol/L的过程中，酶活也在提高，在磷酸盐浓度为80mmol/L 时，酶活达到最高。超过该浓度后，酶活随着磷酸盐浓度的增加而不断降低，可以推测出磷酸盐浓度过高会抑制酶活。

(7)无机盐种类优化

在培养基中添加不同种类无机盐(浓度5mmol/L)，考察结果表明，只有加入硫酸钾的酶活高于空白对照组，由此可以推测在培养基中加入少量K⁺可以起到提高酶活的作用，而Al³⁺和Fe³⁺等对酶活有明显的抑制作用。硫酸钾实验组的酶活最高。而其他实验组的无机盐均会抑制酶活，使酶活显著降低。

(8)无机盐浓度优化

当培养基中硫酸钾浓度为2.5mmol/L时，酶活达到最高，超过该浓度后，硫酸钾浓度的升高会导致酶活降低，可以得知过高浓度的无机盐会抑制酶活，在硫酸钾浓度为2.5mmol/L 时，菌株产酶酶活最高。

(9)正交优化实验结果

在前期的单因素实验中，碳源浓度(A)、复合氮源浓度(B)、磷酸盐浓度(C)、无机盐浓度(D)4个因素对产酶影响较大，因此选取这4个因素，每个因素选取4个水平，进行 L16(4⁴)正交试验。实验结果显示，最优发酵培养基成分为：甘油30g/L，复合氮源42g/L，磷酸盐100mmol/L，无机盐2.5mmol/L，在37℃，自然pH，接种量为2％，220rpm条件下培养酶活最高。

(10)培养温度优化

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600在37℃时产酶酶活最高，低于37℃，酶活随着温度的升高而增加；当温度高于37℃时，温度升高会导致酶活降低。而该温度也符合枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600的最适生长温度。

(11)发酵培养基初始pH优化

在自然pH(pH约为7.3)条件下发酵48h酶活已经较高，只有培养基初始pH＝8.0的实验组酶活超过对照组，由此可以推测弱碱性条件对产酶有促进作用；而在培养基初始pH＝5.5的实验组酶活比较低，可以推测出酸性或者弱酸性环境对产酶不利，会抑制酶活。在培养基初始 pH＝8.0的实验组发酵48h最高。

(12)接种量优化

相比于其他实验组，接种量为2％时的酶活明显高于其他接种量的实验组，而在之前的实验中接种量均采用2％，因此该优化结果与之前实验基本相当。另外，由实验结果还可以得出，接种量过低时，菌体浓度较低，生长缓慢，从而延长了发酵周期，酶活降低；接种量过高时，发酵初期菌体生长速度过快，导致培养基中菌体密度过大，营养物质大部分用来合成菌体细胞，而蛋白质的合成分泌受到阻遏，导致酶活降低。

(13)7L罐发酵结果

采用分批发酵的方法，在7L发酵罐中进行发酵，每6h取样测定酶活和菌体浓度。菌体浓度在前36h保持上升状态，在前期菌种上升速度较快，因为发酵罐溶氧充足，菌体生长速度快，在36h达到最高，之后开始下降，因为菌体密度过大，营养物质缺乏，部分菌体开始裂解，此时最高OD600值为36.1；在前36h，酶活一直呈现上升趋势，与菌体生长基本同步，在36h酶活达到最高，在超过36h后酶活开始下降。达到的最高酶活为8949U/mL，是目前报道最高水平。

实施例2角蛋白酶制备金纳米粒子

通过生物还原法，采用菌种发酵过的酶液作为还原剂，将氯金酸还原成原子态，制得球形呈分散状的金纳米粒子。具体过程如下：

将罐上发酵获得的角蛋白酶酶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。纳米金生物合成过程通过控制合成反应中的三个因素进行逐步优化，分别为氯金酸浓度(0.5、1、1.5、2、2.5、5 mM；图1)、合成反应时间(1、2、3、4、5、6h等；图2)、以及酶添加量(700、875、1050、1225、1400、1575、1750U；图3)。该生物合成反应在10mL离心管中进行，反应体积为8mL，用锡纸包裹反应容器，在摇床中以40℃、120rpm振荡反应。

在实验中，通过控制氯金酸溶液浓度、酶液添加量和反应时间三个因素逐步进行优化。图1证明纳米金粒子仅在1mM浓度的氯酸金溶液中较多产生。选择1mM氯金酸溶液和1400 U角蛋白酶用于生物合成反应，考察了作用时间对实验结果的影响，由图2可知，反应5h 后，反应液变为明显的紫色，用酶标仪扫描其在480nm-600nm的吸收值，发现在550nm左右有最大吸收峰，随着反应时间的推移，最大吸收值有所下降，可能归因于反应时间过长纳米粒子聚集产生沉淀。图3为不同酶添加量对金纳米粒子合成影响的研究，不同酶量下吸收峰证明金纳米粒子的生物合成与酶添加量在一定范围内呈正相关，在加入酶量超过1400U时酶量增加会使吸收峰下降。最终，选择1mM氯金酸溶液、1400U角蛋白酶反应5h为生物合成金纳米粒子的最佳条件。

实施例3金纳米粒子的表征

将上述有明显吸收峰的溶液用粒径仪对其进行粒径的测量，实验组结果如图4，从图中可以看出所得纳米金溶液粒径大约在75nm左右，DLS测得的粒径会高于其真实值，这一现象在其他研究中也有多次报道。但振荡时间超过5h后，会导致纳米金粒子大量聚集并产生肉眼可见的沉淀；振荡反应不足5h时，在550nm左右未产生明显的吸收峰，说明粒子还没有大量形成。

图5为对照组合成的纳米金粒子的粒径测量结果，可以看出对照组的粒径明显比实验组的大，大约在90nm左右，并且溶液均一度也不高，微小颗粒杂质较多，并且也存在大颗粒沉淀。另外，经过粒径仪检测该样品的多分散指数(PDI)为0.29，说明粒径分布宽，样品尺度均一性仍有待进一步改进。

ζ电位测量分析中显示所得金纳米粒子的Zeta电位值为-13mV，这表明金纳米粒子的稳定性源于负电荷之间的静电排斥。

通过透射电镜(型号为HITACHI H-7650)对金纳米粒子的形态进行观察，如图6所示，大部分粒子的形状为球形，均匀分散在溶液中，没有发生聚集现象。对视野范围内的粒子进行测定，可知粒径大约在30nm左右。并且纳米金粒子之间间距比较明显，没有聚集。

从图7红外光谱中显示，3100-3500cm^-1之间的吸收带推测为酰胺N-H不对称伸缩振动，而1650cm^-1处谱带则为酰胺I带。为进一步验证生物法合成中活性角蛋白酶是否对金纳米粒子合成具有促进作用，进行了对照试验，从图8可以看出，对照组吸收峰明显弱于实验组的吸收峰，说明实验组合成能力强于对照组，从而推测，角蛋白酶对纳米金粒子的形成具有促进作用。

本实验制得纳米粒子粒径较小，制备周期较短，说明具有优异还原性能的角蛋白酶可应用于金纳米粒子的制备。生物法金纳米粒子独特的光学特性以及增强效应，可广泛应用于生物及医学检测等领域，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

本发明不限于这些公开的实施例，本发明将覆盖技术方案所描述的范围，以及权利要求范围的各种变形和等效变化，在不偏离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域技术人员容易实现的任何修改或改进均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种用于金纳米粒子制备的重组角蛋白酶及其发酵产酶方法，其特征在于：(1)采用重组枯草芽孢杆菌进行液体发酵，发酵培养基组成成分包括：甘油5-50g/L，复合氮源5-50g/L由酵母粉：蛋白胨重量比例为1:4-2:1构成，磷酸盐10-200mmol/L，无机盐1-10mmol/L，pH6.0-8.0；(2)发酵培养条件为：培养温度20-40℃、转速为50-300rpm，发酵周期为15-60h。

2.一种利用角蛋白酶进行金纳米粒子制备的方法，其特征在于：将权利要求1所述的重组角蛋白酶置于氯金酸溶液中，以20-60℃、10-200rpm振荡反应1-20h，制得金纳米粒子，即为生物法金纳米粒子。

3.如权利要求2所述的利用角蛋白酶进行金纳米粒子制备的方法，其特征在于：纳米金生物合成过程中氯金酸浓度为0.5-5mM、酶添加量200-2000U。

4.如权利要求2所述的利用角蛋白酶进行金纳米粒子制备的方法，其特征在于：所述生物法金纳米粒子的粒径约为30nm。

5.如权利要求2所述的利用角蛋白酶制备的金纳米粒子的应用，其特征在于：该生物法金纳米粒子具备独特的光学特性以及增强效应，可应用于生物及医学检测领域。