CN104480087B - 一种耐高温α‑淀粉酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种耐高温α‑淀粉酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型的耐高温α‑淀粉酶及其基因和制备方法，通过PCR定点突变野生型耐高温α‑淀粉酶基因，并使其在枯草芽孢杆菌中高效表达。本发明的新型的耐高温α‑淀粉酶在高温和酸性环境下稳定性高，能够更好的适应工业生产，以达到节能减耗，提高效率的作用。其技术方案是从地衣芽孢杆菌中分离野生型耐高温α‑淀粉酶基因，对其His316的氨基酸残基进行突变，经在枯草芽孢杆菌中高效表达，在90℃和pH4.5的条件下，该新型的耐高温α‑淀粉酶(His316→Arg)比野生型的耐高温α‑淀粉酶稳定性均有提高。

Description

一种耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及基因的定点突变和重组技术，尤其是一种新型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用。
背景技术
目前国内外生产耐高温α-淀粉酶所用菌株大多数是嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheninformis），与其它细菌所产α-淀粉酶相比具有更好的耐热性，而且地衣芽孢杆菌具有较高的生长温度、良好的产物合成效率、优秀的蛋白质合成与分泌能力，因此被广泛的应用于工业生产。
B. licheninformis所产的耐高温α-淀粉酶（BLA）由于良好的耐热性广泛地应用于淀粉水解工艺中，但随着国内外淀粉原料深加工工业的高速发展，造成耐高温α-淀粉酶的应用领域不断扩大，例如应用于淀粉加工、纺织物退浆、食品加工、啤酒和酒精生产、医药行业、发酵行业以及石油开采工业等方面。其中开发稳定性高的α-淀粉酶成为目前α-淀粉酶酶制剂研究领域的一个重要方向。
现阶段应用于淀粉液化过程中的耐高温α-淀粉酶的最适温度和pH一般在95℃和6.5左右，为了保持活力一般需要加入一定浓度的Ca2+，为了保证耐高温α-淀粉酶在淀粉液化过程中发挥较高的活力，需将天然粉浆的原始pH由（3.2-4.5）调至（5.8-6.2），在下一步糖化过程中又要将糖化液的pH调至4.2-4.5，这两步pH调整过程中既增加了工艺的繁琐度也降低了经济效益，所以在理想的工艺步骤中需要开发研制一种在高温和酸性环境下活力稳定的耐高温α-淀粉酶。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过定向进化构建的在高温和酸性环境下酶活力更稳定的高温α-淀粉酶突变体及其制备方法。
本发明实现目的技术方案如下：
一种新型的耐高温α-淀粉酶突变体，是通过对野生型耐高温α-淀粉酶进行定向进化，通过重叠PCR和定点突变，获得氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的耐高温α-淀粉酶突变体，经宿主细胞枯草芽孢杆菌高效表达后获得新型的耐高温α-淀粉酶。
所述耐高温α-淀粉酶突变体为：碱基C946→A、 A947→G、T948→G，氨基酸His316→Arg。（上述表示方法为：原始氨基酸/碱基 位置→替换的氨基酸/碱基。）
所述耐高温α-淀粉酶突变体的基因序列如SEQ ID NO：6所示。
所述野生型耐高温α-淀粉酶的基因序列如SEQ ID NO：5所示。
所述野生型耐高温α-淀粉酶来源是地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
优选的，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600，该菌为6种胞外蛋白酶缺失菌。
所述耐高温α-淀粉酶突变体用于淀粉的水解，酶活力为3270U/mL。所述耐高温α-淀粉酶突变体在90℃、pH6.0的半衰期比野生型提高了93.5%；在pH 4.5、70℃的半衰期比野生型提高了41.2%。
所述新型的耐高温α-淀粉酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
（1）定点突变野生型耐高温α-淀粉酶的成熟肽基因，第946位碱基C→A，第947位碱基A→G，第948位碱基T→G，得到新型的耐高温α-淀粉酶基因；
（2）将上述新型的耐高温α-淀粉酶基因，与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBAPR载体相连，pBAPR带有一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子P APR 、一个果聚糖蔗糖酶基因信号肽序列sacB，得到携带新型的耐高温α-淀粉酶基因的重组表达质粒；
（3）将重组质粒转化入宿主菌株枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600中，得到重组菌株；
（4）将重组菌株进行发酵，分泌表达制备新型的耐高温α-淀粉酶；
（5）分离提取新型的耐高温α-淀粉酶。
本发明的优点和积极效果如下：
本发明使用重叠PCR技术，对野生型耐高温α-淀粉酶进行定点突变。利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，转化枯草芽孢杆菌，得到一种在高温和酸性环境下活力更稳定的高温α-淀粉酶（His316），在90℃和pH 4.5的条件下，该新型的耐高温α-淀粉酶（His316→Arg）比野生型的耐高温α-淀粉酶的半衰期分别高93.5%和41.2%，稳定性明显提高。在高温和酸性条件下具有较高的酶活稳定性，可以降低能耗，符合低碳环保理念，在食品、洗涤剂、化妆品、饲料等应用工业上有着普通α-淀粉酶无法取代的优越性，具有明显的经济效益及社会效益。
附图说明
图 1 为本发明定点突变流程图；
图 2 为本发明重组质粒pBAPR-amyM的构建示意图；
图 3 为本发明定点突变基因电泳图（a：M为1kb DNA ladder，1为片段1 amyM1基因，2为片段2 amyM2基因；b：M为1kb DNA ladder，1为片段1和片段2重叠后amyM基因）；
图 4为本发明重组子验证图（M为1kb DNA ladder，1为重组质粒pBAPR-amyM的BamHI和HindIII双酶切，2为原始质粒pBAPR的BamHI和HindIII双酶切）；
图 5 为本发明SDS-PAGE分析新型的耐高温α-淀粉酶的表达（M为蛋白分子量标准，1为pBAPR-amyM/WB600，2为pBAPR/WB600）；
图 6为本发明工程菌表达产物纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（M为蛋白分子量标准，1为野生型耐高温α-淀粉酶，2为新型的耐高温α-淀粉酶）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：野生型耐高温α-淀粉酶基因的获得
（1）地衣芽孢杆菌基因组DNA的提取：
①将菌体在37℃，200 r/min培养18-24 h，收集菌体。
②加入500 μL ddH2O，重悬菌体，洗涤菌体，5000 r/min离心5 min，弃上清。
③加入500 μL ddH2O，重悬菌体，并加入溶菌酶（15 μg/mL），37℃水浴消化1 h。
④加入10% SDS 50 μL，蛋白酶K 30 μL，60℃水浴消化2 h。
⑤加入10%体积的5 mol/L NaCl, 上清转管加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)，反复颠倒离心管数次，12000 r/min离心10 min。
⑥取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1），反复颠倒离心管数次，1200r/min离心10 min。
⑦取上清，加入等体积的氯仿，反复颠倒离心管数次，12000 r/min离心10 min。
⑧重复上一步一次。
⑨取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置20 min后12000 r/mim离心10 min弃上清，用0.5 mL 70%的乙醇洗沉淀2次，晾干并加入80 μL ddH2O，溶解沉淀，-20℃保存。
（2）目的基因的获得
参照地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的序列，并结合所用的pUC19质粒上的酶切位点，设计引物：
上游引物AMY-F（SEQ ID NO：1）: 5′-CGCGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCT-3′（下划线部分为加入的BamHI酶切位点）；
下游引物AMY-R（SEQ ID NO：2）:
5′- CCCAAGCTTTCTTTGAACATAAATTGAAACC-3′（下划线部分为加入的HindIII酶切位点）。
以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR，反应体系为：ddH2O 37μL，10×buffer 5μL，dNTPs (5 mmol/L) 2μL，引物AMY-F（20μmol/L）2μL，引物AMY-R（20μmol/L）2μL，DNA 模板1μL，Pyrobest 高保真DNA聚合酶1μL。扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性25s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min反应30个循环；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测在约1.5 kb处出现特异性条带。
实施例2：野生型耐高温α-淀粉酶基因的定点突变
（1）野生型耐高温α-淀粉酶基因连接入载体pUC19.
将PCR扩增得到的目的基因进行纯化，用BamHI和HindIII双酶切，酶切产物再经纯化后，琼脂糖凝胶电泳检测。同时也将质粒pUC19用BamHI和HindIII进行双酶切，纯化，最后采用T4 DNA连接酶12℃连接8h，构建重组质粒pUC19-amy。利用电转化法将该重组质粒转入大肠杆菌JM109中，双酶切和PCR验证结果表明amy基因已成功克隆到载体pUC19上。
将其测序可知扩增到野生型耐高温α-淀粉酶基因序列如SEQ ID NO：5。
（2）定点突变
基于重叠PCR技术进行定点突变，构建新型的耐高温α-淀粉酶。设计引物如下：
上游引物AMY-F（SEQ ID NO：1）: 5′-CGCGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCT-3′（下划线部分为加入的BamHI酶切位点）；
下游引物AMY-R（SEQ ID NO：2）:
5′- CCCAAGCTTTCTTTGAACATAAATTGAAACC-3′（下划线部分为加入的HindIII酶切位点）。
重叠引物H316R-F（SEQ ID NO：3）：5′-GTTTCCAAGAGGCCGTTGAAAT-3′
重叠引物H316R-R（SEQ ID NO：4）：5′-ATTTCAACGGCCTCTTGGAAAC-3′
在上游引物和下游引物5’端分别引入BamHI和HindIII酶切位点。重叠引物H316R-F与重叠引物H316R-R互补。重叠引物H316R-F与重叠引物H316R-R中包含了对316位氨基酸残基的突变His316→Arg。
用引物AMY-F、H316R-R扩增上游片段amyM1，AMY-R、H316R-F扩增下游片段amyM2。
PCR反应体系包括：10×PCR反应缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，上游引物AMY-F、H316R-F/下游引物H316R-R、AMY-R各1 μL，重组质粒pUC19-amy 10 ng，Pfu DNA聚合酶5 U，无菌去离子水补充至50 μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。
PCR产物切胶回收，适当稀释。以amyM1、amyM2为引物，进行PCR。PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液 5 μL，dNTP 4 μL，amyM1、amyM2各1 μL，Pfu DNA聚合酶5 U，无菌去离子水补充至48 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，3个循环；然后加入引物AMY-F、AMY-R各1μL，进行PCR，PCR扩增条件同前。
对PCR反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段amyM。得到His316→Arg的耐高温淀粉酶的突变基因（新型的耐高温α-淀粉酶基因）。
将其测序可知扩增到新型耐高温α-淀粉酶基因序列如SEQ ID NO：6。
实施例3：新型的耐高温α-淀粉酶表达载体的构建
pBAPR为以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子P APR 及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。它同时含有枯草杆菌质粒pUB110的复制子和大肠杆菌质粒pGEM3的复制子，既能在大肠杆菌又能在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞中进行自主复制。它带有Ampr和Kmr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记，同时又可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
将经重叠PCR构建获得的新型的耐高温α-淀粉酶基因amyM与pBAPR分别用BamHI、HindIII双酶切，经纯化后在16℃连接12h，构建重组质粒pBAPR-amyM。将10µL的pBAPR-amyM电转化40µL大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素（100µg/mL）的LA平板上，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证，确定构建获得重组菌株JM109/pBAPR-amyM。
实施例4：含有新型的耐高温α-淀粉酶基因工程菌的构建和筛选。
按下述方法制备枯草芽孢杆菌WB600（实验室保存）的感受态细胞。挑取一环孢子接种于少量生长培养基（LB+0.5mol/L 山梨醇）中，过夜培养。将种子以1/16的接种量接种于生长培养基（LB+0.5mol/L 山梨醇）中，37℃摇床震荡培养至OD600在0.85-0.95左右。冰水浴冷却培养物10min，于4℃，5000r/min，离心5 min收集菌体。反复用冰冷的电击缓冲液（0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10%(V/V) 甘油）洗涤细胞收集物4次。用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，细胞浓度应该在1-1.3×1010 cfu/mL。感受态细胞分装为60μL/EP管保存在-80℃（不需要液氮预冻），在转化效率有所下降之前都可以正常使用。转化条件：60μL感受态细胞加入1μL（50ng/μL）pBAPR-amyM混匀并转移到冰冷的电转化杯（1mm）中，冰浴1-1.5min后，电击一次（25μF，200 Ω，4.5-5.0ms）。电击完毕之后，立即加入1 mL复苏培养基（LB+0.5 mol/L山梨醇+0.38 mol/L 甘露醇）。37℃摇床震荡培养3 h之后，将复苏物涂布在LB平板上，37℃培养24-36h，挑取阳性转化子，获得枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR-amyM。
实施例5：枯草芽孢杆菌重组菌株中新型的耐高温α-淀粉酶的表达及分离纯化
将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR-amyM 接种于LB液体培养基(含卡那霉素，30 μg/mL)中，37℃，200 r/min培养过夜，按1%接种量转接于50 mL新鲜培养基中，200 r/min培养24 h，由于表达载体pBAPR为枯草芽孢杆菌组成型表达载体，不需额外加诱导剂诱导，培养24 h后，即可制备获得新型的耐高温α-淀粉酶（H316R）粗酶液。直接取样进行SDS-PAGE及活性检测。
纯化新型的耐高温α-淀粉酶的步骤如下：采用分级盐析法，先以30%饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到70%，沉淀α-淀粉酶，收集30%-70%范围内蛋白质沉淀部分，溶解后，透析除盐。然后使用弱阴离子交换剂DEAE-Sepharose Fast Flow对硫酸铵盐析得到的活性组分进行分离（2mL上样量，上样后用0.02 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗脱未吸附的蛋白，3mL/管分部收集，第51管开始梯度洗脱，缓冲液为0-1.0mol/L NaCl的0.02mol/L Tris-HCl(pH 7.0)，流速1.5 mL/min，3 mL/管分步收集），经DEAE-Sepharose FastFlow离子交换后获得的活性组分再用Sephadex G-75凝胶过滤（2mL上样量，上样后用含0.15mol/L NaCl的 0.02 mol/L Tris-HCl(pH 7.0)洗脱，流速0.5 mL/min，2 mL/管分部收集），制备获得电泳纯的新型的耐高温α-淀粉酶（H316R）。
实施例6：新型的耐高温α-淀粉酶的纯化分析。
收集经过纯化的α-淀粉酶液，浓缩后，经过SDS-PAGE检测，分离得到的组分呈单一条带，其分子量为53KDa。
产品性能测定：
1、α-淀粉酶活力的测定
采用QB/T2306-97方法进行检测，将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR-amyM发酵液，12000r/min离心10min去除细胞，测定上清液中的酶活（记为细胞外酶活）。酶活力单位定义：在70℃、pH6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL（U/g）表示。测定方法如下：1．酶液制备：用缓冲液配制成酶溶液，使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之内。2．测定：(1) 吸取可溶性淀粉溶液（20g/L）20mL和磷酸缓冲液（相应pH）5mL于试管中。在70℃恒温水浴中预热3min-5min。(2) 加入稀释好的待测酶液1.00mL，立即计时，摇匀，准确反应5min。(3) 立即吸取1.00mL反应液移入预先装有0.1mol/L HCl 0.5mL和5mL稀碘液的试管中摇匀。(4) 以0.1mol/L HCl 0.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定吸光度(A)。根据吸光度查表，求得测试酶液的浓度(C)。3．计算：X=C×N×16.67 式中：X-样品的酶活力U/mL（U/g）；C-测试的酶液浓度U/mL；N-样品的稀释倍数；16.67-换算常数。所得结果表示至整数。
在此条件下进行α-淀粉酶活力检测，枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR-amyM发酵液中制备获得的新型的耐高温α-淀粉酶的活力为3270U/mL。
2、新型的耐高温α-淀粉酶性质的研究
经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析分离纯化后，得到电泳纯的新型的耐高温α-淀粉酶（H316R），以野生型耐高温α-淀粉酶（AMY）为对照，对其进行酶学性质研究。
⑴温度对酶活力的影响
最适反应温度的测定：在不同温度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)，pH6.0的条件下测定重组酶纯化酶液的酶活，AMY和H316R最适作用温度为90℃。
热稳定性的测定：在90℃、pH 6.0条件下测定重组酶的半衰期，AMY在90℃、pH6.0的半衰期为3.1 min，H316R的半衰期为6.0min，比AMY的半衰期提高了93.5%。
⑵pH对酶活力的影响酶
最适反应pH的测定：在不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)，70℃下测定重组酶纯化酶液的酶活，AMY的最适作用pH为6.5，H316R的最适作用pH为6.0。
pH稳定性的测定：在pH4.5、70℃测定重组酶的半衰期，AMY在pH4.5、70 ℃下的半衰期为1.7 min，H316R在pH4.5、70℃下的半衰期为2.4 min，比AMY的半衰期提高了41.2%。
重组酶性质的分析：
通过研究可知，新型的耐高温α-淀粉酶和耐高温α-淀粉酶最适作用温度均为90℃；于90℃、pH6.0下，新型的耐高温α-淀粉酶比耐高温α-淀粉酶的半衰期提高了93.5%，说明突变位点提高了突变酶的耐高温性能。新型的耐高温α-淀粉酶最适作用pH为6.0，耐高温α-淀粉酶最适作用pH为6.5；于70℃、pH4.5下，新型的耐高温α-淀粉酶比耐高温α-淀粉酶的半衰期提高了41.2%，说明突变位点提高了突变酶的耐酸性能。
由此说明，耐高温α-淀粉酶由原316位的L-组氨酸变为L-精氨酸 (CAT→AGG)后，可提高耐高温α-淀粉酶在高温和酸性环境中的稳定性，说明耐高温α-淀粉酶基因经定点突变后，构建获得新型的耐高温α-淀粉酶基因，经克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表达分泌表达型载体pBAPR，转化6种胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌WB600，实现新型的耐高温α-淀粉酶分泌表达，成功制备获得一种新型的耐高温α-淀粉酶。

Claims (6)

1.一种耐高温α-淀粉酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
2.如权利要求1所述的一种耐高温α-淀粉酶突变体，其特征在于，其基因序列如SEQ IDNO：6所示。
3.权利要求1所述耐高温α-淀粉酶突变体的用途，其特征在于，所述耐高温α-淀粉酶突变体在90℃、pH6.0的半衰期比野生型提高了93.5%；或者所述耐高温α-淀粉酶突变体在pH4.5、70℃的半衰期比野生型提高了41.2%。
4.一种包含权利要求1所述的耐高温α-淀粉酶突变体的克隆载体、表达载体或宿主细胞。
5.如权利要求4所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体为pUC19，所述的表达载体为pBAPR，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600；pBAPR为以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子PAPR及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得。
6.权利要求1所述的耐高温α-淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）定点突变野生型耐高温α-淀粉酶的成熟肽基因，第946位碱基C突变为A，第947位碱基A突变为G，第948位碱基T突变为G，得到新型的耐高温α-淀粉酶基因；
（2）将上述新型的耐高温α-淀粉酶基因，与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBAPR载体相连，得到携带新型的耐高温α-淀粉酶基因的重组表达质粒；pBAPR为以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pBE2为骨架，克隆入一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子PAPR及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶信号序列sacB而获得;
（3）将重组质粒转化入宿主菌株枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌株；
（4）将重组菌株进行发酵，分泌表达制备新型的耐高温α-淀粉酶；
（5）分离提取新型的耐高温α-淀粉酶。
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Application publication date: 20150401

Assignee: Shandong Longkete Enzyme Preparation Co., Ltd.

Assignor: Tianjin University of Science & Technology

Contract record no.: 2017370000085

Denomination of invention: High-temperature resistant alpha-amylase, preparing method of novel high-temperature resistant alpha-amylase and application of novel high-temperature resistant alpha-amylase

Granted publication date: 20170315

License type: Exclusive License

Record date: 20171222