CN101974587A - 一种高效表达人血清白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效表达人血清白蛋白的方法。本发明首次用两个不同类型的启动子在同一细胞内驱动表达人血清白蛋白,大幅度地提高了蛋白表达的效率。本发明的方法表达的蛋白接近天然,且操作简单、成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域;更具体地,本发明涉及一种高效表达人血清白蛋白的方法。
背景技术
人血清白蛋白是血浆中的主要蛋白成分,由585个氨基酸组成,分子量为66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是维持正常渗透压,与钙离子、脂肪酸、氨基酸、胆红素和各种药物相结合,并起到转运载体的作用。临床上人血清白蛋白常用于外科手术、出血性休克、烫伤、肾病综合征导致的白蛋白缺乏症、肿瘤肝腹水等疾病的治疗。
一直以来,人血清白蛋白是从人血液中纯化得到的。由于血源匮乏和病毒(肝炎、AIDS)污染等原因,基因重组人血清白蛋白在近十年中得到了国内外大型制药公司的重视。近年来,采用基因重组的方法,已经在酵母菌(USP5,330,901、JP11-509525、JP6-100592)、大肠杆菌(Lawn,R.M.Constructionof DNA sequences and their use for microbial production of proteins,in particularhuman serum albumin“European Patent Appl.”(1983)73,p646)、转基因牛奶(WO9602573A1 SEPARATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN)中表达人血清白蛋白。
尽管现有技术中已经在酵母等菌株中成功表达过人血清白蛋白,然而表达的效率以及表达的规模仍然不够理想。一般情况下,除了使用强启动子来提高目的蛋白的表达水平外,研究人员还经常使用一些其它方法,最常用的方法是提高插入到酵母基因组的目的蛋白表达盒拷贝数,此法可以提高表达量。但是这个策略也有局限,提高拷贝数不一定必然伴随着目的蛋白表达量的增高。即使有所增高,也不呈现着和表达盒的拷贝数成正相关的状况。蛋白表达量受很多因素的制约,有转录阶段的调控,翻译阶段的制约,以及翻译后的蛋白修饰等,因此特定的蛋白,需要找到合适的策略并结合大量的研究试验工作来优化 表达。
综上,本领域还有必要进行进一步的研究,以提高人血清白蛋白的表达效率,使得人血清白蛋白真正实现高效地大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效表达人血清白蛋白的方法。
本发明的另一目的在于提供用于高效表达人血清白蛋白的重组载体和基因工程菌株。
在本发明的第一方面,提供一种重组表达人血清白蛋白的方法,所述方法包括:
(1)提供一种重组酵母细胞,所述酵母细胞中同时包含有:由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒;
(2)培养(1)的重组酵母细胞,从而表达人血清白蛋白。
在一个优选例中,所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒分别位于表达载体中。
在另一优选例中,所述的表达载体是:pGAPZα表达载体或pPIC9K表达载体。
在另一优选例中,所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pPIC9K表达载体中,所述的由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pGAPZα表达载体中。
在另一优选例中,先将含有AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的pPIC9K表达载体转染酵母细胞,得到重组酵母细胞1;之后将含有GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的pGAPZα表达载体转染重组酵母细胞1,得到(1)所述的重组酵母细胞。
在另一优选例中,所述的人血清白蛋白的表达盒中,从5’至3’依次包括:启动子序列,SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列(部分酵母α信号肽3’端的编码序列),白蛋白成熟肽编码序列,翻译终止子序列,这些序列操作性相连。
在另一优选例中,在启动子序列之前以及翻译终止子序列之后,还包括多克隆位点(酶切位点)。
在另一优选例中,所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
在另一优选例中,所述的毕赤酵母细胞是GS115亚型。
在另一优选例中,所述方法还包括步骤:
(3)分离(纯化)所述的人血清白蛋白。
在本发明的另一方面,提供一种重组表达载体的组合,所述组合中包括:
(a)含有由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的表达载体;和
(b)含有由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的表达载体。
在本发明的另一方面,提供一种重组酵母细胞,所述的重组酵母细胞中,包括:由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒。
在本发明的另一方面,提供所述的重组表达载体组合或所述的重组酵母细胞的用途,用于重组表达人血清白蛋白。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1:pGAPZalpha-HSA载体的结构示意图。
图2:pPIC9K-HSA载体的结构示意图。
图3:两种不同白蛋白表达克隆的发酵结果。克隆在含甘油的培养基中生长24小时,然后流加甲醇,发酵总时间为84小时。GAP和AOX1共同驱动的克隆表达量明显高于AOX1启动子驱动的克隆。
图4:SEC-HPLC检测纯化的重组HSA和人血清HSA。左图为重组HSA,右图为人血清HSA。重组HSA的多聚体低于人血清HSA。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究,首次用两个不同类型的启动子在同一细胞内驱动表达人血清白蛋白,大幅度地提高了蛋白表达的效率。
如本文所用,所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列,其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端),能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地,启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中,所述的启动子或启动子区包括启动子的变体,其通过插入或删除调控区域,进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用,所述的“操作性相连”,“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如:启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置,使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导,从而,启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用,所述的“表达盒”是指包含有表达目的蛋白(本发明中为人血清白蛋白)所需的所有必要元件的基因表达系统,通常其包括一下元件:启动子、编码蛋白的基因序列,终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件时操作性相连的。
启动子
本发明所述的AOX1启动子属于AOX基因的启动子,其是一种较多用于酵母表达的启动子。在商品化的pPIC9K表达载体中,携带有所述的AOX1启动子。本发明的方法中,也可使用突变后的AOX1启动子,只要其保留了与野生型启动子相同的功能。
本发明所述的3-磷酸脱氢酶启动子(glyceraldehide 3-phosphatedehydrogenase promoter,GAP)是一种结构性表达启动子。GAP启动子的最大特点是在细胞生长的阶段就驱动重组蛋白的表达。因此不需要在培养中加入甲醇,在常规的碳源如葡萄糖、甘油等非甲醇的碳源存在下目的蛋白就可以表达。这个体系更适用于大规模生产,因为不需要大量的甲醇。
尽管以上两种启动子均是已知的启动子,但本领域技术人员还没有将它们有效结合以提高蛋白表达效率的研究。蛋白的表达受很多因素调节,包括转录,翻译,翻译后的修饰,转运等。转录水平上的调节是提高表达水平的一个重要环节。本发明通过找到合适的启动子组合,在转录水平上促进了人血清白蛋白 的高效表达。
重组表达载体
本发明构建的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒被转染到同一酵母细胞中表达。在转染时,所述的AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒可分别由两个表达载体转染;或者,可选择地,插入到同一表达载体中进行细胞转染。
作为本发明的优选方式,所述的AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒分别被插入到两个表达载体中。较佳地,两个表达载体是pGAPZα表达载体或pPIC9K表达载体。更优选地,所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pPIC9K表达载体中,所述的由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pGAPZα表达载体中。可先将含有AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的pPIC9K表达载体转染酵母细胞;之后将含有GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的pGAPZα表达载体转染入所述重组酵母细胞。
为了便于表达产物分泌胞外,所述的表达盒中还可带有信号肽序列。
作为本发明的优选方式,本发明所述的人血清白蛋白的表达盒中,从5’至3’依次包括:启动子序列,SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列(部分酵母α信号肽3’端的编码序列),白蛋白成熟肽编码序列,翻译终止子序列,这些序列操作性相连。
重组表达的细胞
本发明用于重组表达人血清白蛋白的细胞是酵母细胞。多种酵母细胞都可用于本发明,所述的酵母例如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等。
作为本发明的优选方式,所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。毕赤酵母菌体内无天然质粒,所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组,将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。所述的外源基因表达框架包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。
表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合;由于毕赤酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源,绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,因此在发酵过程中可以减少杂菌的污染,而且大规模工业发酵技术相对比较成熟。包括培养基、发酵方法等已经经过详尽研究,使得发酵的重现性和自动化程度都极为良好。
白蛋白的表达中,发现两拷贝的克隆表达量最高,而多拷贝的克隆表达量反而降低。其原因有可能是同一系列内的各种转录因子被分散于多拷贝启动子内而无法共同协调发挥作用,使得目的蛋白的表达量反而降低。GAP启动子所需的转录因子系列不同于AOX1启动子,在转录阶段的调控不受AOX1启动子所需的转录因子系列的制约,可以发挥可在的作用使得白蛋白的表达获得大幅度的提高。
作为本发明的一个优选实施方式,提供了一种人血清白蛋白(HSA)在毕赤氏酵母(Pichia)中的重组表达方法。本发明的方法特征在于重组表达质粒pPIC9K-HSA和pGAPZα-HSA的构建,本发明一个更重要的特征表现为在同一个宿主细胞内同时转染由AOX1启动子驱动的HSA表达盒和由GAP启动子驱动的HSA表达盒。具体操作是宿主细胞GS115第一次转染用pPIC9K-HSA载体,以不含组氨酸的培养基进行筛选,在此基础上进一步用测定白蛋白表达量的方法确认转染阳性克隆并选择最佳克隆。紧接着白蛋白最佳表达株在甲醇诱导时表达HSA最高的克隆作为第二次转染的宿主细胞。第二次转染系将带有结构性表达的pGAPZα-HSA载体转染入含pPIC9K-HSA表达盒的宿主细胞内,使其同时带有pPIC9K-HSA表达盒和pGAPZα-HSA表达盒。为了便于筛选,此时用含Zeocin培养基进行加压筛选。最终获得了一组表达白蛋白的克隆,其表达量明显高于pGAPZα-HSA或pPIC9K-HSA单启动子驱动的白蛋白表达克隆。
细胞培养和蛋白分离纯化
本发明的方法中,对于培养毕赤酵母的方法和培养基没有特别的限制,可以采用本领域常规使用的方法和培养基。
在培养重组细胞分泌表达出人血清白蛋白后,还可包括步骤:从培养产物(培养基或发酵液)中分离白蛋白。从培养产物中分离或纯化维白蛋白可采用本 领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化,分子筛;或采用亲和层析法纯化。
本发明的主要优点在于:
表达量高:采用本发明构建的重组表达系统进行表达,可获得非常高的人血清白蛋白表达量;
表达的蛋白接近天然:采用本发明的方法表达、纯化的重组人血清白蛋白在分子量测定、N-端15个氨基酸序列、C-末端2个氨基酸序列、肽图、CD等实验中均与天然的人血清白蛋白没有区别;
操作、培养简单:采用本发明的构建的表达系统和方法,在简单合成培养基中可实现高密度培养;操作简单、成本低廉。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明所用材料及其来源
K1enow片段多聚酶和所有使用的内切酶均为NEB公司产品。
pPIC9K、pGAPZα、Pichia pastoris GS1 1 5(his4 Mut十)为Invitrogen公司产品。
Trizol RNA抽提试剂盒购自Promega公司,YNB(W/O amino acid)购自DIFCO公司。
DNA序列测定、DNA合成为英俊公司。
实施例方法简述
以下实施例提供一种具有2种不同的启动子驱动的高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母重组细胞的构建的方法。
在一个宿主细胞内同时转染由AOX1启动子驱动的HSA表达盒和由GAP启动子驱动的HSA表达盒,最终获得了一组表达人血清白蛋白的克隆。
由人血清白蛋白的cDNA5’端带有部分酵母α信号肽3’端的编码序列CTCGAG AAG AGA紧接着是白蛋白成熟肽的序列,在DNA的3’端添加了翻译终止信号和EcoRI的序列,该DNA插入到PUC18载体中,定名为PUC18-HSA。
将PUC18-HSA克隆载体中带有部分α信号肽序列的HSA基因片段用XhoI和EcoRI双酶切下,1%琼脂糖电泳分离,回收DNA片段。将约2Kb的带有编码末端的-HSA基因回收片段与用相同酶切的pGAPZα表达载体或pPIC9K连接,转化E.coli TGI感受态细胞,分别以含有Zeocin或Kanamycin LB琼脂板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoI和EcoRI双酶切。得到重组质粒pGAPZα-HSA或pPIC9K-HSA。
上述两个重组载体在转染中,各取2个经Xhol和EcoRI双酶切初步鉴定的重组克隆,分别用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer或pGAP forward primer和3’AOX1 primer测定重组质粒HSA cDNA两端序列。
先将pPIC9K-HSA载体转染到毕赤酵母中,后将pGAPZα-HSA载体转染pPIC9K-HSA阳性克隆中,获得pGAPZα-HSA载体转染pPIC9K-HSA阳性克隆,挑选一定量阳性克隆进行白蛋白表达实验,筛选获得高表达人血清白蛋白的毕赤酵母细胞株。
所述方法详述如下:
实施例1、人血清白蛋白cDNA的获得
按照PUBMED公布的人血清白蛋白mRNA序列(GenBank登录号AY728024),合成cDNA。合成的cDNA 5’端带有部分酵母α信号肽3’端的编码序列CTC GAG AAG AGA(SEQ ID NO:3),紧接着是白蛋白成熟肽(SEQ ID NO:2)的编码序列(SEQ ID NO:1),在DNA的3’端添加了翻译终止信号TAA和EcoRI酶切位点的序列GAATTC,该DNA插入到PUC18载体(购自New England Biolabs)中,定名为PUC18-HSA。
实施例2、重组表达质粒pGAPZα-HSA和pPIC9K-HSA的构建
将PUC18-HSA克隆载体中带有部分α信号肽序列的HSA基因片段用XhoI和EcoRI双酶切下,1%琼脂糖电泳分离,回收DNA片段。将约2Kb的带有编码末端的HSA基因回收片段与用相同酶切的pGAPZα表达载体(购自Invitrogen,自带GAP启动子)或pPIC9K(购自Invitrogen,自带AOX1启动子)连接,转化E.coliTGI(购自New England Biolabs)感受态细胞,分别以含有Zeocin或Kanamycin LB琼脂板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用XhoI和EcoRI双酶切。
鉴定出重组质粒pGAPZα-HSA或pPIC9K-HSA。上述两个重组载体的转染中,各取2个经Xho1和EcoRI双酶切初步鉴定的重组克隆,分别用5’AOX1 primer和3’AOX1 primer或pGAP forward primer和3’AOX1 primer测定重组质粒HSAcDNA两端序列。测序结果显示4个克隆序列正确,均含完全正确的阅读框。引物序列分别如下:
5’AOX1 primer(SEQ ID NO:4):
5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’;
3’AOX1 primer(SEQ ID NO:5):
5’-CAAATGGCATTCTGACATCC-3’;
pGAP forward primer(SEQ ID NO:6):
5’-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3’。
实施例3、HSA在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达
(1)pPIC9K-HSA载体转染巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)
取一个含pPIC9K-HAS载体的大肠杆菌克隆,在含Kanamycin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pPIC9K-HSA载体DNA20微克,用SalI酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中。GS115菌株(购自Invitrogen)在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD600在1.3-1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰的1M山梨糖醇(sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重 悬于1毫升冰的1M山梨糖醇置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS115细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS115细胞内。电击后立即加1毫升冰的1M sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养1-2小时,分别取100微升、200微升酵母细胞液均匀涂布到RDB(无组氨酸)平板,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心弃去上清,加5毫升YPM培养基(甲醇浓度为1.5%)30℃,200rpm诱导表达3天。第3天末,离心取10微升培养上清用SDS-PAGE检测白蛋白的表达。选择表达量最高的1株克隆作为下一轮转染的母株(pPIC9K-HSA阳性克隆)。
(2)pGAPZα-HSA载体转染pPIC9K-HSA阳性克隆
取一个含pGAPZα-HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Zeocin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的pGAPZα-HSA载体DNA 20微克,用AvrII酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中,-20℃保存备用。pPIC9K-HSA阳性克隆在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD600在1.3-1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰1M山梨糖醇(sorbitol),混合物离心去上清,最后细胞重悬于1毫升冰1M山梨糖醇,置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬pPIC9K-HSA阳性克隆细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入pPIC9K-HSA阳性克隆细胞内。电击后立即加1毫升冰1M sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养1-2小时,取200微升酵母细胞液均匀涂布于含100微克/毫升Zeocin的YPD平板上,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心取培养上清用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量。选择表达量最高的5株克隆(克隆1、克隆2、克隆3、克隆4、克隆5)作为工程细胞的候选株。
(3)pGAPZα-HSA载体转染GS115细胞
取一个含pGAPZα-HSA载体的大肠杆菌克隆,在含Zeocin的LB培养基中生长过夜。第二天,离心收集菌体,采用碱裂解法制备质粒DNA。取抽提纯化的 pGAPZα-HSA载体DNA20微克,用AvrII酶切使之线性化。线性化后的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀后溶于20微升纯水中,-20℃保存备用。GS115克隆在5毫升YPD中生长过夜,取其中0.5毫升加到500毫升新鲜YPD培养基中生长过夜,直至培养液的OD600在1.3-1.5之间,离心去上清。细胞重悬于500毫升无菌冰纯水,混合物离心去上清。沉淀加250毫升无菌冰纯水重悬后再离心去上清,沉淀重悬于20毫升冰1M sorbitol,混合物离心去上清,最后细胞重悬于1毫升冰1M sorbitol,置冰浴备用。取10微升线性化DNA(10微克)和80微升重悬GS 115细胞置于0.2cm电击杯中,混匀后将电击杯在冰浴中放置5分钟后电击将DNA转染入GS 115细胞内。电击后立即加1毫升冰1M sorbitol,然后转移到15毫升无菌管,30℃静止培养1-2小时,取200微升酵母细胞液均匀涂布于含100微克/毫升Zeocin的YPD平板上,置30℃培养直至克隆生长。选择100个克隆接种到5毫升YPD培养基,30℃,200rpm生长2天,离心取培养上清用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量。选择表达量最高1株的克隆作为pGAPZα-HSA克隆对照株。
实施例4、高表达克隆的比较
(1)DNA水平上的确认:为了进一步确认重组克隆的基因组内插入了目的蛋白表达盒,提取上述实施例3中(2)获得的5株工程细胞候选株的基因组DNA,同时也提取了用作转染pGAPZα-HSA用的母株(pPIC9K-HSA阳性克隆)的基因组DNA和GS115的基因组DNA。这7种细胞的基因组DNA作为模板,分别用5’AOX1 primer/3’AOX1 primer引物对和pGAP forward primer/3’AOX1 primer引物对进行PCR。PCR结果显示除GS115细胞株外,其它6株用5’AOX1 primer/3’AOX1 primer引物对均能获得插入的目的基因信号。用pGAP forwardprimer/3’AOX1 primer引物对进行PCR检测,pGAPZα-HSA用的母株(pPIC9K-HSA阳性克隆)和GS115株无插入的目的基因信号,而5株工程细胞候选株均呈现插入的目的基因信号。
(2)蛋白表达水平上的确认:为了验证双启动子的要比单启动子的转染时的目的蛋白的表达量高。设计了几组实验。
第一组:
上述8个克隆(包括GS115、实施例3中(2)获得的5株工程细胞候选株、pPIC9K-HSA阳性克隆和pGAPZα-HSA克隆对照株)在30℃,200rpm条件下,5 毫升YPD培养基中生长2天,离心取培养上清检测白蛋白的含量和细胞密度。在这一组实验中,各株的细胞密度基本相同,GS115株和pPIC9K-HSA阳性克隆株没有检测到白蛋白的表达,而5株工程细胞候选株都检测到白蛋白的表达,其表达量在70-80毫克/升的范围内。pGAPZα-HSA克隆对照株也检测到白蛋白的表达,其表达量与5株工程细胞候选株相似,为76毫克/升。
第二组:
上述8个克隆(包括GS115、实施例3中(2)获得的5株工程细胞候选株、pGAPZα-HSA克隆对照株和pPIC9K-HSA阳性克隆)均在30℃,200rpm条件下,5毫升YPD培养基中生长2天,离心取沉淀,加含1%甲醇的YP培养基,使各株的细胞密度相同,体积均为5毫升,仍置于30℃,200rpm条件下培养3天,每天取上清检测白蛋白的含量(取第3天作为最终含量)。在这个实验中,GS115没有目的蛋白的表达,pPIC9K-HSA阳性克隆株的表达量为187毫克/升,pGAPZα-HSA克隆对照株的表达量为112毫克/升、5株工程细胞候选株的表达量在250-280毫克/升之间,明显高于pPIC9K-HSA阳性克隆株。
第三组:
上述8个克隆(包括GS115、实施例3中(2)获得的5株工程细胞候选株、pGAPZα-HSA克隆对照株和pPIC9K-HSA阳性克隆)均在5毫升YPD培养基中生长2天,培养条件为30℃,200rpm。第2天末,各添加5毫升含2%甲醇的YP培养基,在相同条件下继续生长3天,每天取样品检测白蛋白的表达水平(取第3天作为最终含量)。检测结果表明GS115株没有白蛋白表达,pPIC9K-HSA阳性克隆pPIC9K-HSA阳性克隆株的表达量为132毫克/升,5株工程细胞候选株表达量为240-260毫克/升之间,pGAPZα-HSA克隆对照株表达量为138毫克/升。实验结果符合预想的状况。
实施例5、工程细胞株表达的白蛋白确认
为了在蛋白分子结构水平上确认与天然的人血白蛋白一致。工程细胞株之一(克隆1)在200毫升YPD培养基中生长2天,然后添加200毫升含2%甲醇的YP培养基继续生长3天,培养条件为30℃,200rpm。培养结束后离心,收集培养上清。上清液用醋酸调pH至3.5,过pH 3.5,20mM醋酸钠缓冲液平衡过的SP-Sepharose FF离子交换柱,目的蛋白用pH 7.0,含500mM氯化钠,20mM 磷酸钠缓冲液洗脱。洗脱蛋白过用pH 7.0,含50mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱,进行缓冲液交换。交换了缓冲液后的SP-Sepharose FF洗脱蛋白过pH 7.0,含50mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液平衡过的DEAE-Sepharose FF层析柱,白蛋白为pH 7.0,含500mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液洗脱下来的组分。DSD-PAGE显示其纯度大于98%。
纯化的重组白蛋白用TRYPSIN消化后用C18柱进行肽图分析,结果与人血清白蛋白的TRYPSIN酶切肽图完全一致。N-端15个氨基酸序列测定结果为Asp-Ala-His-Lys-S er-Glu-Val-Ala-His-Arg-Phe-Lys-Asp-Leu-Gly(SEQ ID NO:7),C-末端两氨基酸的序列测定结果为Gly-Leu,与人血清白蛋白的C-末端两个氨基酸相同。纯化的重组白蛋白还进行了园二色谱检测,检测的结果与人血清白蛋白一致。
上述实验确认本发明的方法可以高效正确地表达人血白蛋白。
实施例6、工程细胞株的发酵罐发酵工艺研究
将工程细胞株(克隆1)接种到YPD平板生长2天,挑取单克隆接种到装有400毫升YPD培养基的摇瓶中,30℃250-300rpm条件下生长16-24个小时直到OD600在2-6之间。
发酵罐内加含4%甘油的基础盐培养液8升,加热高压灭菌。设置发酵温度30℃、pH控制5.6、转速200-1500rpm、通气条件为0.1-1.0vvm空气,用28%氢氧化铵调节基础培养盐培养液pH到5.6,每升培养液加4.35ml PTM1痕量盐。待发酵罐内基础盐培养液的温度降至30℃后,将400毫升来自摇瓶中培养的OD600在2-6之间的种子液.加入发酵罐。启动发酵罐温度、pH、通气和搅拌等装置使酵母细胞生长,继续细胞生长直到甘油消耗完毕。一旦所有的甘油都消耗完毕,启动甘油流加步骤来增加细胞的量,甘油补料中甘油的浓度为50%,每升甘油补料内需含有12毫升PTM1痕量盐溶液,设置补料速度为18.15ml/hr/liter(起始体积),甘油流加持续4小时。甘油流加结束后开始流加甲醇,流加的甲醇补料含100%甲醇,每升甲醇添加12毫升PTM1痕量盐。设置流加速度为3ml/hr每升起始发酵体积。4小时后甲醇流加速度增加至6ml/hr每升发酵体积,以此速度补加2小时后甲醇补加速度调整至9ml/hr每升起始发酵体积,此补料速度一直维持到发酵结束,整个甲醇流加时间为60小时。发酵结束后,放罐收集 发酵液,发酵液通过陶瓷过滤膜过滤方法分离发酵上清,含重组白蛋白的发酵上清用离子交换,分子筛等方法进行进一步处理。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种重组表达人血清白蛋白的方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)提供一种重组酵母细胞,所述酵母细胞中同时包含有:由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒;
(2)培养(1)的重组酵母细胞,从而表达人血清白蛋白。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒分别位于表达载体中。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的表达载体是:pGAPZα表达载体或pPIC9K表达载体。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pPIC9K表达载体中,所述的由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒位于pGAPZα表达载体中。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的人血清白蛋白的表达盒中,从5’至3’依次包括:启动子序列,SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,白蛋白成熟肽编码序列,翻译终止子序列,这些序列操作性相连。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括步骤:
(3)分离(纯化)所述的人血清白蛋白。
8.一种重组表达载体的组合,其特征在于,所述组合中包括:
(a)含有由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的表达载体;和
(b)含有由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒的表达载体。
9.一种重组酵母细胞,其特征在于,所述的重组酵母细胞中,包括:由AOX1启动子驱动的人血清白蛋白表达盒和由GAP启动子驱动的人血清白蛋白表达盒。
10.权利要求8所述的重组表达载体组合或权利要求9所述的重组酵母细胞的用途,用于重组表达人血清白蛋白。
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