CN102482675A - 新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、编码它们的基因、及其产品和应用。更具体地，本发明涉及以最优量生产PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情况下对自催化活性敏感的异源多肽。更具体地，本发明涉及融合蛋白，其包括异源多肽，例如融合于脂肪酶信号序列的丝氨酸蛋白酶，其可通过重组宿主细胞以期望量表达。本发明还涉及编码此类融合蛋白的多核苷酸、涉及用于表达此类融合蛋白的表达载体、涉及用此类多核苷酸/载体转化的宿主细胞、并且涉及生成此类融合蛋白的方法。

Description

新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白
技术领域
本发明涉及新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白、编码它们的基因、及其产品和应用。更具体地，本发明涉及以最优量生产PLBTR融合蛋白的方法，PLBTR融合蛋白包括正常情况下对自催化活性敏感的异源多肽。更具体地，本发明涉及融合蛋白，其包括异源多肽，例如融合于脂肪酶信号序列的丝氨酸蛋白酶，其可通过重组宿主细胞以期望量表达。本发明还涉及编码此类融合蛋白的多核苷酸、涉及用于表达此类融合蛋白的表达载体、涉及用此类多核苷酸/载体转化的宿主细胞、以及涉及生成此类融合蛋白的方法。
背景技术
胰蛋白酶是一种高价值的蛋白酶，其具有很多工业和生物医学应用。持续增长的对具有特殊性能的非动物源的胰蛋白酶的需求已经促进关注在微生物中克隆和表达蛋白酶。由于与蛋白表达和自催化性能相关的困难，有关重组胰蛋白酶表达的报告在成功程度上有很大的差别。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)似乎是生产胰蛋白酶最具潜力的微生物宿主。
胰蛋白酶是～25kDa的丝氨酸蛋白酶，由胰腺的腺泡细胞以无活性的前体-胰蛋白酶原分泌。激活肽氨基酸DDDDK在成熟胰蛋白酶中出现在胰蛋白酶原前面，其由肠激酶在肠道中切割。激活的胰蛋白酶将在可及精氨酸(R)和赖氨酸(K)氨基酸残基的羧基端切割蛋白。胰蛋白酶不仅消化包含可及R和K的任何蛋白，而且作用于其自身序列的可及R和K并降解本身(自催化活性)。因此在微生物或哺乳动物系统中生产重组胰蛋白酶是一个非常大的挑战。并且表达水平非常低。为克服该问题，本发明的发明人已将97个氨基酸的米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶信号序列融合至牛胰蛋白酶原并在巴斯德毕赤酵母中表达。脂酶原序列的存在稳定了胰蛋白酶原的表达并且似乎防止了体内的活化。
脂酶原作为脂肪酶的N端延伸物，与信号序列不同，信号序列是输送蛋白进入或穿过细胞膜，或分泌进入细胞外基质所必要的。米根霉脂肪酶的69个氨基酸前肽区(propeptide region)在26-氨基酸信号序列之后。现有研究显示脂酶原区中的突变(C56至S)减缓脂肪酶的折叠(Beer H.D.，Wohlfahrt G.，Schmid R.D.，McCarthy J.E.G.，Biochem.J.319：351-359，1996)。用来自于米根霉脂肪酶的脂酶原区替换天然的牛胰蛋白酶原的前区(前肽，propeptide)，惊人地促进了重组牛胰蛋白酶原的稳定性和产量。
现有的技术状态未能提供一种可接受的令人满意的/理想的生产方法，能在合适的宿主细胞中表达异源融合多肽的可纯化形式。
因此广泛认为需要一种没有以上限制的方法，并且有这种方法是非常有利的。
本发明的改进的新型脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白克服了以上讨论的和现有技术中的许多其他缺点和不足。
发明内容
本发明的目的
本发明的主要目的是获得融合多肽，该融合多肽包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶。
本发明的另一个主要目的是获得一种表达融合多肽的方法。
本发明的又一个目的是获得包括上述序列的载体。
本发明的再一个目的是获得转化细胞，该转化细胞包括上述的可表达方式的序列。
本发明的陈述
因此，本发明涉及一种融合多肽，包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母(methyloptropic yeast)中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：1至少80％同源性的氨基酸序列；融合多肽包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ IDNO：2至少80％同源性的核苷酸序列；一种表达融合多肽的方法，包括由甲基营养酵母生产的融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有与SEQ ID No 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列至少80％同源性的核苷酸序列；一种包括上述序列的载体；以及一种包括上述的可表达形式的序列的转化细胞。
附图说明
图1：脂酶原的PCR扩增产物以及牛胰蛋白酶原编码序列。
图2：融合的PLBTR扩增的PCR产物。
图3：通过使用XbaI和BamHI限制酶切分析来筛选阳性克隆。
图4：A、分析从不同克隆获得的脂酶原牛胰蛋白酶原。
B、使用胰蛋白酶原抗体的SDS PAGE和蛋白印记
C、SDS PAGE示出活化的PLBTR
通道1：蛋白分子量标记
通道2：PLBTR克隆#1
通道3：PLBTR克隆#2
通道4：PLBTR克隆#3
通道5：PLBTR克隆#4
通道6：PLBTR克隆#5
通道7：PLBTR克隆#6
通道8：GS115母株
图5：pMBL210载体细节
图6：CPLBTR/pMBL210克隆#3的限制性内切酶谱。
通道1：CPLBTR/pMBL210克隆#3，具有EcoRI+XhoI(5400bps+1030bps)
通道2：CPLBTR/pMBL210克隆#3，具有SacI(线性化、6426bps)
通道M：基因标尺1Kb DNA梯度。
通道3：CPLBTR/pMBL210克隆#3，具有NdeI+KpnI(4781bps+1645bps)
通道4：CPLBTR/pMBL210克隆#3，具有XbaI(5104bps+806bps+516bps)
图7：CPLBTR/pMBL210载体细节。
图8：PCR确认基因整合入所有的博莱霉素(Zeocin)抗性克隆的基因组。
通道1-16：9435Zeo25oo抗性克隆。
通道17：9435宿主(阴性对照)。
通道18：阳性对照(CPLBTR/pMBL210质粒)。
通道M：1Kb DNA梯度。
通道19-22：9452Zeo25oo抗性克隆。
通道23：9452宿主(阴性对照)。
图9：A、从多个9450克隆获得的脂酶原牛胰蛋白酶原的分析。
B、从多个9453克隆获得的脂酶原牛胰蛋白酶原的分析。
C、使用胰蛋白酶原抗体的SDS PAGE和蛋白印记。
图9A：通道M＝蛋白分子量标记
通道1＝PLBTR克隆#1
通道2＝CPLBTR 9450克隆#1
通道3＝CPLBTR 9450克隆#2
通道4＝CPLBTR 9450克隆#3
通道5＝CPLBTR 9450克隆#4
通道6＝CPLBTR 9450克隆#5
通道7＝CPLBTR 9450克隆#6
通道8＝CPLBTR 9450克隆#7
通道9＝CPLBTR 9450克隆#8
图9B：通道M＝蛋白分子量标记
通道1＝PLBTR克隆#1
通道2＝CPLBTR 9453克隆#1
通道3＝CPLBTR 9453克隆#2
通道4＝CPLBTR 9453克隆#3
通道5＝CPLBTR 9453克隆#4
通道6＝CPLBTR 9453克隆#5
通道7＝CPLBTR 9453克隆#6
通道8＝CPLBTR 9453克隆#7
通道9＝CPLBTR 9453克隆#8
图9C：通道M：蛋白分子量标记
通道1：标准胰蛋白酶
通道2：宿主对照
通道3：PLBTR克隆#1
通道4：CPLBTR 9450#1
通道5：CPLBTR 9453#6
图10：SDS PAGE上的上清液分析(所有样本均负载15μl)
图11：发酵装置运行的典型趋势：(T、pH、DO、WCW)
(T＝温度、DO＝溶解的氧、WCW＝细胞湿重)
具体实施方式
本发明涉及一种融合多肽，包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：1至少80％同源性的氨基酸序列。
本发明涉及一种融合多肽，包括融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：2至少80％同源性的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，SEQ ID 1或2的68和69号的氨基酸被氨基酸精氨酸和赖氨酸替换。
在本发明的另一个实施例中，68号氨基酸被酪氨酸替换。
在本发明的又一个实施例中，多肽使得胰岛素前体形式或胰岛素类似物或胰岛素衍生物转化为它们对应的活性型，提供至少50％的步骤产率(step yield)。
在本发明的另一实施例中，甲基营养酵母属于毕赤酵母属(Pichiasp.)。
在本发明的另一实施例中，甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母。
本发明涉及一种表达融合多肽的方法，所述融合多肽包括产于甲基营养酵母的融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有与由SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或由SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列具有至少80％同源性的核苷酸序列。
在本发明的一个实施例中，丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶原。
在本发明的另一个实施例中，甲基营养酵母属于毕赤酵母属。
在本发明的又一个实施例中，甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母。
本发明涉及一种载体，包括上述的序列。
本发明涉及一种转化的细胞，包括可表达形式的上述序列。
提供对应于新型脂酶原-牛胰蛋白酶原(PLBTR)融合蛋白核酸序列的分离的核酸分子。此外，包含对应于多核苷酸的氨基酸序列。具体地，本发明提供分离的核酸分子，包括编码以SEQ ID NO：1示出的氨基酸序列的核苷酸序列。还提供了脂酶原-牛胰蛋白酶原，具有由本文中的核酸分子-SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列。
优选融合的胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶样蛋白具有至少一种自然存在的胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶样蛋白所具有的生物活性。
本发明也包括与序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列基本上同源的变异核酸分子和多肽。此外，提供核苷酸和氨基酸序列的片段和基本上同源的片段。
本发明也提供载体和宿主细胞，用于重组表达本文的核酸分子，以及生产此类载体和宿主细胞的方法，并且使用它们通过重组技术生产本发明的多肽或肽。
参考附图和所附的说明书可更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用并不限于以下说明的或实例示例性列出的细节。本发明可以有其他实施例或通过不同的方式实施或进行。并且，应当理解，本文采用的措辞和术语仅用于说明的目的而不应理解为限制。
现将详细参考本发明的优选实施例，与以下实例一起，用于说明本发明的原理。
以下列出的实例是用于帮助理解本发明，但不旨在，并且不应解释为，以任何方式限制本发明范围。实例不包括用于载体的构造、编码多肽的基因插入至此类载体或将得到的质粒引入至宿主的传统方法的详细说明。实例也不包括用于分析由此类宿主载体系统产生的多肽中使用的传统方法的详细说明。此类方法已为本技术领域人员公知并在大量出版物中进行说明，包括以实例的方式。
标准技术已用于各种重组DNA技术、转化(例如，电穿孔、脂质转染)和试验。根据本领域中公知的传统方法和本说明书中引用和讨论的各种一般和专用参考，常规进行重组技术和重组实验。见例如Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y(2001))，其通过引证结合于此。
在本发明的说明书和权利要求中，下面术语将依据本文的定义使用。
除非本文另有定义，本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员公知的含义。此外，除上下文另有要求，单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。本发明的方法和技术通常根据本领域公知的传统方法进行。通常，与本文描述的分子和细胞生物学、生物化学、蛋白和核酸化学和杂交技术相关的命名是公知的且在本领域中通用的。本发明的方法和技术通常根据本领域公知的传统方法进行。
如本文中使用的，术语“方法”指的是用于完成给定任务的方式、方法、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学从业人员公知的方式、方法、技术和程序或由已知的方式、方法、技术和程序易于得到的方式、方法、技术和程序。
如本文中使用的，术语“载体”指的是能输送与其连接的另一个核酸的核酸分子。术语“表达载体”包括能够合成目标蛋白的质粒、粘粒或噬菌体，此类蛋白由它们各自的载体携带的重组基因编码。优选载体是那些能自我复制和表达它们所连接的核酸的载体。在本说明书中，“质粒”和“载体”可交换使用，因为质粒是最常用的载体形式。此外，本发明旨在包括此类其他方式的表达载体，其提供等同的功能且在本领域中随后是已知的。
本文使用的术语“重组”用于描述一种蛋白或多肽，是指通过重组多核苷酸表达生产的多肽。本文提到细胞时使用的术语“重组”是指能用作或已被用作重组载体或其他转化DNA的受体，并且包括已转染的原始细胞的后代。应当理解，单个亲本细胞的后代由于意外或故意的突变可能在形态或基因上不完全相同或与原始亲本不完全DNA互补。与亲本足够相似的亲本细胞的后代具有相关特征，例如出现编码期望的多肽的核苷酸序列，也被视为后代。
“感兴趣基因”(GOI)是期望转录表达增加的核酸序列。GOI可编码功能性核酸分子(例如，RNA，如反义RNA分子)或，更典型地，编码期望产量增加的肽、多肽或蛋白。本发明的载体可用作表达“异源”蛋白。如本文使用的，术语“异源”是意核酸序列或多肽，其来源于外来品种，如果来源于同种，其一般是经过从原始形态修饰的。此外，细胞中非正常表达的修饰的或未修饰的核酸序列或多肽被认为是异源的。本发明的载体可具有一种或多种GOI，在相同或不同的插入位点插入，其中每个GOI可操作地连接于调整的核酸序列，其允许GOI的表达。
脂酶原作为脂肪酶的N端延伸，与信号序列不同，它是输送蛋白进入或穿过细胞膜或分泌到细胞外基质中所必需的米根霉脂肪酶的69氨基酸前肽区位于26-氨基酸信号序列之后。现有研究已示出脂酶原区中的突变(C56至S)减缓脂肪酶的折叠(Beer H.D.，Wohlfahrt G.，Schmid R，D.，McCarthy J.E.G.，Biochem J.319：351-359，1996)。用来自于米根霉脂肪酶脂酶原区替代天然的牛胰蛋白酶原的前区(proregion)，惊人地提高了重组牛胰蛋白酶原的稳定性和产量。
如本文讨论的“可操作元件”包括至少一个启动子、至少一个操作子、至少一个前导序列、至少一个Shine-Dalgamo序列、至少一种终止密码子、和需要或优选用于载体DNA的适当转录和随后翻译的任何其他DNA序列。尤其是，考虑此类载体可包含至少一个宿主微生物识别的复制起点，以及至少一个可选标记，和至少一个能启动DNA序列转录的启动子序列。此外，在一个实施例中，优选载体包含能发挥调控子作用的某些DNA序列、以及能为调控子蛋白编码的其他DNA序列。在一个实施例中，此类调控子用于在某些环境情况下或在其他环境情况下防止DNA序列的表达，允许由DNA序列编码的蛋白的转录和随后的表达。
本文使用的“氨基酸”指的是肽或蛋白序列或其部分。术语“蛋白”、“肽”和“多肽”可替换使用。
本发明提供新型融合的脂酶原胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶分子。“脂酶原胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶分子”是指一种称为PLBTR的新序列、及其变体和片段。这些全长基因或其片段被称为“PLBTR”序列，表示它们具有与胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶基因相似的序列。提供了包括编码氨基酸序列在SEQ ID NO：2中给出的PLBTR多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子，或其变体或片段。编码PLBTR多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO：1中示出。此类序列是胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族成员。
为表达本发明的融合蛋白，核酸可操作地连接至指导基因表达的信号。当位于与另一个核酸序列成功能性关系时，核酸为“可操作地连接”。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，该启动子或增强子可操作地连接至编码序列。一般地，“可操作地连接”是指连接的核酸序列是连续的，并且在需连接两个蛋白编码区域处是连续的并且在阅读框中。
一般很希望在选定用于表达的宿主细胞类型中用启动子和/或增强子有效地指导重组核酸序列的表达。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子、以及用于重组多肽表达的细胞类型重组的使用(例如，见Sambrook等人，1989，下文)。在适当的情况下，采用的控制序列可以是构成的、组织特异性的、可诱导的、和/或有用的，以指导重组核酸序列的高水平表达，例如在重组多肽的大规模生产中是有利的。
优选地，本发明的融合多肽具有氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1或2至少65％相似。更优选的，与本发明载体多肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1或2的相似度为约66％，更优选67％，更优选68％，更优选69％，更优选70％，更优选71％，更优选72％、更优选73％、更优选74％、更优选75％、更优选76％、更优选77％、更优选78％、更优选79％、更优选80％、更优选81％、更优选82％、更优选83％、更优选84％、更优选85％、更优选86％、更优选87％、更优选88％、更优选89％、更优选90％、更优选91％、更优选92％、更优选93％、更优选94％、更优选95％、更优选96％、更优选97％、更优选98％、更优选99％、并且最优选100％、
更优选地，本发明的融合多肽具有与SEQ ID NO：1或2相同的氨基酸序列。
从原核宿主和真核宿主选择重组表达系统。真核宿主包括酵母细胞(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))、哺乳动物细胞或植物细胞。细菌和真核细胞可从许多不同来源获得，包括于本领域技术人员公知的商业途径，例如，美国典型培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC；Rockville Md.)。用于重组蛋白表达的细胞的商业途径也提供使用这些细胞的说明。表达系统的选择取决于用于表达多肽的需要的特征。
因此，本发明的目的是表达系统或表达盒，其在来源于选自由毕赤酵母菌株组成的组中，尤其是选自由巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)组成的组中的细胞是有功能的，并且允许编码其蛋白片段的期望多肽的表达，位于其表达所需的元件控制下。
优选用表达载体转化或转染宿主细胞，宿主细胞包括重组多核苷酸，并且其还包括以及至少一种表达控制序列，其可操作地连接于重组多核苷酸并且能够控制宿主细胞中的重组多核苷酸的表达，从而能够生产可溶融合蛋白。
本发明最优选的方面，最优选的宿主细胞是甲基营养酵母。可使用本发明改造的甲基营养酵母菌株包括，但不限于，能在甲醇上生长的酵母菌株，例如毕赤酵母属、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母(Torulopsis)。优选的甲基营养酵母是毕赤酵母属。可使用本发明方法改造的甲基营养酵母菌株也包括那些甲基营养酵母菌株，它们已被设计成表达感兴趣的一种或多种异源蛋白。
如本文中使用的，术语“转化”和“稳定转化”指的是一种细胞，该细胞中已将一种非自身(异源)多核苷酸序列整合入游离质粒，而该游离质粒保存至少两代。
如本文中使用的，“重组”包括是指一种细胞或载体，其已通过引入异源核酸序列被改造或该细胞源于经如此改造的细胞。
载体可转化到宿主细胞中，使用的方式包括，但不限于，电穿孔、病毒感染、磷酸钙沉淀、二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、直接显微注射、负载DNA的脂质体和lipofectamine-DNA复合物、细胞声波降解法、使用高速微粒的基因轰击或本文中描述的或本领域中公知的任何其他方式。该载体还可包括DNA序列编码功能以利于基因表达，通常为启动子、转录起始位点、转录终止和多腺苷酸化功能。
本发明也涉及一种生产期望蛋白的方法，包括发酵，在一定情况下并且在适合于生产此类蛋白化合物或其类似物，在诸如毕赤酵母属的有机物中，其中也包含编码足以指导生产期望的终端产物的多肽的基因。
根据另一个方面，本发明涉及重组生产牛胰蛋白酶的方法，所述方法包括：
(a)用重组DNA载体转化宿主，其包括融合于编码脂酶原的核苷酸序列的编码牛胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列。
(b)在合适的培养基中，在有利于牛胰蛋白酶原表达并分泌到培养基中的情况下培养转化的宿主，以及
(c)从培养基中回收牛胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
对本领域技术人员，本发明的其他目的、优点、和新型特征将通过对以下实例的解释变得显而易见，实例不是限制的目的。此外，如以上描述和如权利要求部分中要求的本发明的各种实施例和各个方面在以下实例中找到实验支持。
参考以下实例更充分说明并理解本发明，以下实例以说明的方式给出并且不以任何方式限制本发明的范围。
一个本领域的技术人员将拥有必要的专门知识获取或利用合适表达的载体，用于生产本发明的可溶融合蛋白，取决于应用和目的。以下提供关于获取和利用表达载体的相关通常指导，其可用于转化或转染宿主细胞从而使宿主细胞表达重组多肽。更优选地，根据以下实例部分提供的指导原则来获取和利用本发明的表达载体。如以下实例部分的实例说明和示出，本发明的融合蛋白可由本发明的宿主细胞适当地表达，宿主细胞由表达载体转化。
因而，本发明还提供用重组多肽和/或表达载体转染或转化的宿主细胞。根据应用和目的，本领域的技术人员可按各种方式常规地实践获得表达载体。
进一步借助于以下实例和图说明本发明。然而，这些实例不应解释为对本发明范围的限制。
实例1：
脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的核苷酸序列在SEQ ID 1中示出并且对应的氨基酸序列在SEQ ID 2中示出。
从米根霉脂肪酶/pPIC9K载体扩增脂酶原基因片段，使用的是高保真度PWO聚合酶和以下引物：
PRORHILIPFP2＝5’CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTTCCT GTT TCT GGT AAA TC3’
PLBTRRP＝5’TTG TCA TCG TCA TCG GCG CTG TTG GTA GATCCA GA 3’
从牛胰蛋白酶原/TA载体扩增牛胰蛋白酶原基因，使用的是高保真度PWO聚合酶和以下引物：对该牛胰蛋白酶原基因进行密码子优化，使用的是用于密码子优化的基于软件的Entechelon网。
PLBTRFP＝5’CTA CCA ACA GCG CCG ATG ACG ATG ACA AGATTG TCG GA 3’
BTRPRP1＝5’GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGCTTG 3’
使用Qiagen公司的凝胶提取试剂盒纯化这些产品。这些纯化产品每个2μl用作模板。使用以下引物进行重叠延伸PCR(overlapping PCR)，以融合脂酶原和牛胰蛋白酶原阅读框内编码序列。将融合的产品命名为PLBTR。
PRORHILIPFP2＝5’CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GTTCCT GTT TCT GGT AAA TC 3’
BTRPRP1＝5’GCG GCC GCT TAG TTA GAC GCA ATT GTT TGCTTG 3’
得到的PCR产品在1％的琼脂糖凝胶上分析。
从以上琼脂糖凝胶切出正确大小的基因产品，并通过凝胶提取纯化。该产品在16℃下连接入pTZ57R/T载体过夜。该连接混合物转化入感受态E.coli DH5α细胞，在包含100μ/ml氨比西林的LB琼脂平板上选择克隆。使用沸腾微量制备法(boiling miniprep method)筛选获得的菌落。通过释放用限制性内切酶Xbal和BamHI消化的插入片段来确认插入片段的存在。选择克隆#11并使用Qiagen miniprep kit分离更多的质粒。
实例2：
将该产品亚克隆入pPIC9K：
使用Xhol和EcoRI位点切出PLBTR片段并在相同位点连接入pPIC9K。该连接混合物转化入感受态E.coli DH5α细胞，在包含100μ/ml氨比西林的LB琼脂平板选择克隆。使用沸腾微量制备法筛选获得的克隆。插入片段的存在是通过释放用限制性内切酶Xhol和EcoRI消化的插入片段确认的。名为PLBTR/pPIC9k的正确克隆通过限制消化验证。
用PLBTR/pPIC9K质粒进行巴斯德毕赤酵母GS115菌株转化：
使用SacI线性化PLBTR/pPIC9K载体并遵循Invitrogen手册中描述的方法通过电穿孔转化入巴斯德毕赤酵母GS115。在0.5mg/ml的G418上筛选约1200个克隆。发现四十一个克隆抵抗0.5mg/ml的G418。这些克隆放于2mg/ml的G418上。
检测所有六个抗性克隆，以检测感兴趣基因的基因组整合的情况。对这些克隆进行脂酶原-牛胰蛋白酶原融合蛋白的诱导表达研究。
下表收集了所有筛选数据
Figure BDA0000141929520000151
Mut+和Muts的筛选：
使用AOX启动子FP和AOX终止子RP引物进行PCR筛选Mut+和Mut-转化体的。
GS115小规模表达研究：
在摇瓶中进行小规模表达研究。简要地，克隆在BMGY中在30℃下生长，随后在BMMY中在30℃下用甲醇诱导。总共用3天进行甲醇的诱导。用六个克隆进行表达研究。简要地，克隆在BMGY中在30℃下生长，随后在BMMY中在30℃下用甲醇诱导。总共用3天进行甲醇的诱导。
实例3：
在自制巴斯德毕赤酵母菌株中，毕赤酵母优化密码子的脂酶原-牛胰蛋白酶原(CPLBTR)的表达：
毕赤酵母优化密码子的脂酶原-牛胰蛋白酶原(CPLBTR)的合成基因在SEQ ID：3中表示。
pMBL210中胰蛋白酶原的克隆。
1.PCR扩增：
使用质粒0900098 Seq 3 pMA进行脂酶原-牛胰蛋白酶原的PCR扩增，质粒0900098 Seq 3 pMA是使用引物CPLBTRFP和CPLBTRRP从Geneart得到的。
·CPLBTRFP：5’ACC TCG AGAAGA GAG TTC CAG T 3’
·CPLBTRRP：5’GGG AAT TCT TAG TTA GAA GCG ATA GTT TGC 3’
PCR反应混合物：
  水   37μl
  0900098 Seq 3 pMA，   1.5μl(50ng)
  dNTP混合物   5μl
  CPLB TRFP   1μl(0.01μmol)
  CPLB TRRP   1μl(0.01μmol)
  10X扩增高保真试验缓冲液   5μl
  扩增高保真聚合酶   0.5μl
  总体积   50μl
PCR条件：
Figure BDA0000141929520000161
在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。
该PCR产物具有全长CPLBTR编码序列。
Poly‘A’尾：
 水   5.5μl
 Taq缓冲剂   1.5μl
 dATP   1.5μl
 CPLBTR片段   6μl
 Taq DNA聚合酶   0.5μl
  总体积   15μl
以上反应混合物在72℃下孵育20分钟。
加上‘A’尾后，其用作TA连接的插入片段。
2.TA连接
载体-pTZ57R/T(2894bp)55ng/μl
插入片段-对PCR产物CPLBTR(1050bp)加‘A’尾，然后连接入TA载体。
连接反应：
连接反应混合物：
  5X连接酶缓冲液   4μl
  TA载体   4μl
  插入片段   11μl
  T4DNA连接酶   1μl
  总体积   20μl
连接反应混合物在16℃下孵育过夜。
3.转化：
使用热休克法将连接混合物转化入化学感受态E.coli DH5 alpha细胞。再生混合物放于LB琼脂平板，该LB琼脂平板包含100μg/ml的氨比西林。平板在37℃下培育过夜。
4.筛选：
使用侧翼载体引物M13FP和M13RP通过克隆性PCR筛选二十四个克隆。预期的扩增子大小是1180bp。发现十八个克隆是阳性的。从克隆#2制备质粒DNA用于进一步分析。
实例4：
CPLBTR亚克隆入pMBL210。
1.连接：
载体-用Xhol和EcoRI限制酶消化pMBL210(5422bp)，凝胶纯化载体带40ng/μl。
插入片段-用Xhol和EcoRI消化CPLBTR/TA-55ngs/μl。
连接反应混合物：
  水   4μl
  10X连接酶缓冲液   2μl
  载体   5μl
  插入片段   8μl
  T4DNA连接酶   1μl
  总体积   20μl
进行连接反应，在16℃下孵育过夜。
已示出了pMBL210载体细节。
 F1(IG). 2-457bp
 AOX1启动子 615-1575bp
 Matα信号序列 1593-1865bp
 PIC正向引物结合区 1801-1820bp
 PIC正向引物序列 5′CTA TTG CCA GCA TTG CTG CT 3′
 PIC反向引物结合区 1913-1932bp
 PIC反向引物序列 5′TGC CCA ACT TGA ACT GAG GA 3′
 AOX终止子 1890-2230bp
 pTEFl启动子 2262-2673bp
 PEM7 2674-2741bp
 博莱霉素标记 2742-3116bp
 氨比西林标记 4419-5279bp
用于生产毕赤酵母中的PLBTR的载体是pMBL 210(5422bp)，其是一种pTZ57R载体的衍生物。该载体的一些特征是：
·AOX1启动子：从BICC #9450分离的包含AOX1的启动子的A··960bp片段，其允许甲醇可诱导巴斯德毕赤酵母中的高水平表达并且目标质粒也整合到AOX1基因座。
·α-因子信号序列：一种270bp片段，编码酿酒酵母(S.cerevisiae)Matα-因子信号序列，其允许期望的蛋白分泌到培养基中。
·MCS：多个克隆位点，其允许将期望的基因克隆到表达载体中。α-因子分泌信号阅读框内用于克隆的独特限制位点是XhoI、EcoRI。
·两个限制位点：Bgl II和Sac I，用于载体线性化，其有助于有效地整合入毕赤酵母基因组。
·3’AOX1终止子：AOX1基因中的340bp序列还是3’至TT序列并且靶向于在AOX1基因座处的质粒的整合。
·博莱霉素标记：允许在巴斯德毕赤酵母中选择转化体。
·氨比西林抗性基因：允许在E.coli中选择并维持载体。
2.转化：
使用热休克法将连接混合物转化为化学感受态E.coli DH5 alpha细胞。再生混合物置于LB琼脂平板上，该LB琼脂平板包含25μg/ml的博莱霉素。平板在37℃下孵育过夜。
3.筛选：
PCR使用侧翼载体引物PICFP和PICRP通过克隆性PCR筛选二十个克隆。预期的扩增子大小是1128bp。十八个克隆是阳性的。从克隆#3中制备质粒DNA，用于进一步分析。
4.重组质粒的分析：
CPLBTR/pMBL 210克隆#3通过限制性消化进行分析，然后进行测序。
实例5：
[B]巴斯德毕赤酵母中脂酶原-牛胰蛋白酶原的表达。
1.巴斯德毕赤酵母的转化：
用SacI消化[CPLBTR/pMBL210]克隆#3质粒DNA并用于转化自制巴斯德毕赤酵母菌株的电解感受细胞，BICC#9450、#9452和#9453。以2000伏特、200Ω和25μFusing Bio-Rad Gene Pulsor XL电穿孔感受态细胞。再生混合物置于YNBD板上并在30℃下孵育48小时。
实例6：
筛选多拷贝部分：
来自BICC#9450的约1000个转化体、来自BICC#9452的200个转化体以及来自BICC#9453的600个转化体在适当控制下在96孔微滴定板中接种入YPD培养基。该板在30℃下孵育24小时并且然后印于包含2.5mg/ml博莱霉素(Zeocin)的YPD琼指平板。这些平板在30℃下孵育48小时。然后获得BICC#9450的Zeo2500抗性克隆、4个#9452的Zeo2500抗性克隆和21个#9453的Zeo2500抗性克隆。
实例7：
通过PCR确认在基因组中的基因整合：
基因组DNA是由通过细胞裂解作用方法选择的重组毕赤酵母克隆制备的。使用载体特异性引物(PICFP和PICRP)进行PCR，以确认基因组中的CPLBTR的整合。BICC#9450、#9452和#9453宿主菌株各自用作阴性对照。
实例8：
巴斯德毕赤酵母中的小规模表达研究：
在摇瓶中进行小规模表达研究。简要地，克隆在BMGY中在30℃下生长，随后在BMMY中在30℃下诱导甲醇。总共用3天完成甲醇的诱导。从BICC#9450和#9453中各提取八个克隆以及从#9452宿主中的3个克隆用于表达研究。简要地，这些克隆在BMGY中在30℃下生长，随后在30℃下在BMMY中用甲醇诱导。进行甲醇诱导总共3天(图9)。
实例9：
表达分析：
在用考马斯蓝染色的SDS-PAGE上分析每个克隆的粗上清液(诱导第二天和第三天)。CPLBTR以··35kDa蛋白分泌。
结果：
1.通过以上的诱导研究证实，用于CPLBTR、BICC#9450表达的三个巴斯德毕赤酵母菌株为最佳。
2.CPLBTR 9450克隆#1给予该菌株试验的八个克隆中更高的滴定量。
3.决定在后面的工作中使用该菌株。
细胞库制备：
发现CPLBTR 9450克隆#1在产量和甲醇消耗方面最佳。将该克隆给予细胞培育组以制备研究细胞库。
分配至CPLBTR 9450克隆#1的RCB数是BICC#9580。
实例10：
上游和下游工艺优化
工艺优化：
评估两个表达胰蛋白酶原的克隆在50L量时的发酵和产品的回收。一般的工艺细节如下：
发酵培养基成分：
  组分   量(g/L)
  CaSO4.2H2O   0.93
  MgSO4.7H2O   29.8
  K2SO4   36.4
  KOH   4.13
  甘油   40
  H3PO4(密度-1.7)   22.95
  尿素   6.0
单个组分按以上的顺序溶解于最小量的水中，并且在121℃下杀菌1小时。微量盐溶液和D-生物素(通过过滤进行预消毒)无菌添加至培养基中，每个的比率为4.35ml/L培养基(微量盐溶液的密度是1.05并且D-生物素的密度是1.0)。
微量盐溶液的成分：
  组分(盐)   量(g/L)
  硫酸铜，CuSO4.5H2O   6.0
  碘化钠，NaI   0.08
  硫酸锰，MnSO4.H2O   3.0
  钼酸钠，Na2MoO4.2H2O   0.20
  硼酸，H3BO3   0.02
  氯化钴，CoCl2.6H2O   0.50
  氯化锌，ZnCl2   20.0
  硫酸亚铁，FeSO4.7H2O   65.0
  硫酸，H2SO4   5.0mL
所有的盐逐个溶解在引用水中并且通过灭菌等级过滤设备过滤进行消毒。
生物素溶液的制备：
D-生物素0.2g/L
将生物素溶解于饮用水中并通过灭菌等级过滤设备过滤进行消毒。
酵母抽提物和大豆蛋白胨原料：
此外，在发酵期间添加酵母提取物和大豆蛋白胨(YEP)原料。可如下进行制备：
  组分   浓度(g/L)
  大豆蛋白胨   200
  酵母提取物   100
组分被溶解并且根据需要用饮用水来补偿体积。然后该溶液在121℃-123℃杀菌90分钟。YEP原料的密度约为1.05。酵母提取物可由非活性/活性酵母的衍生物替代。此外，大豆蛋白胨也可由大豆粉/粗粉的衍生物替代。
甲醇原料：
在供料前，每升甲醇添加12.0ml的微量盐溶液、12mL的D-生物素溶液和40g的尿素。
发酵过程：
发酵过程包括批次细胞生长阶段、可选甘油进料批次阶段和甲醇诱导阶段。
批次细胞生长阶段
批次监控和控制
初始设定生产发酵罐参数并控制如下：
温度：30°±2℃
pH：5±0.2
DO：＞10％
运行时间：22-26hr
甲醇诱导阶段(MIP)
在批阶段结束后立即开始供给甲醇。甲醇的消毒(在线)是通过使用可商购到的灭菌级过滤器的过滤。
在MIP的开始，调整pH至6.0±0.2并且温度调整至约23±2℃
同时，其他补料，酵母提取物和大豆蛋白胨补料(YEP)也在发酵罐中以开始量的0.4g/L/h的比率开始给料。
MIP监控和控制
温度：23.0±2℃
pH：6.0±0.2
DO：＞1％(用于控制在培养基中的甲醇浓度)
运行时间：10-12天
根据本发明的另一方面，通过培育冻干的甘油原培养物至最小甘油(MGY)培养基制备种菌。基础发酵罐培养基来源于“控制毕赤酵母工艺指南”Invitrogen，培养基包含正磷酸、脱水的硫酸钙、硫酸钾、七水硫酸镁、氢氧化钾、甘油、微量盐和D-生物素。营养培养基也必须包含少量或微量已知的化合物，它们通常包含于发酵培养基中，例如水溶性的化合物，如Ca、Mg、Mn、Fe、K、Co、Cu、Zn、B、Mo、Br和I。也可含有其他微量盐。
下游工艺：
以下是下游的方案：
离心分离：
发酵液端(EOF)和部分回收须在4-8℃下以5000rpm离心30分钟。
微细过滤：
用离心的上清液(CFS)的PO 1.4mm ID进行微细过滤。过程中pH保持在3.0±0.05(pH非常重要)。将其浓缩至最小的体积并使用无菌水pH3.0进行渗滤(diafiltration)。进行渗滤以从渗余物中获得产物。
超滤：
使用PAN 6000 MWCO进行超滤。上清液浓缩至MF原料量的约20倍。使用无菌水进行渗滤(pH-3.0+/-0.05)，以获得最终渗余物的的导电率接近在pH 3.0+0.05时的2+1mS/cm。在超滤之前和之后记录下无细胞上清液和超滤浓缩液(UFC)的体积、导电率和pH。
试剂：
A.67mM磷酸钠缓冲液，在25℃下pH 7.6
B.0.25mM Na-苯甲酰-L-精氨酸乙酯溶液(BAEE)
(在试剂A中制备50ml)
C.5mM盐酸溶液(HCl)
D.1M氯化钙溶液(CaCl2)
E.1mM盐酸溶液(HCl)
F.400mM Tris HCl缓冲液，在25℃下pH 8.4(缓冲液)
G 0.02％(w/v)胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶)(使用前，在试剂C中使用标准胰蛋白酶制备3ml)
H.胰蛋白酶原酶溶液(胰蛋白酶原)(使用前，在试剂C中制备包含5mg/ml胰蛋白酶原的溶液。)
步骤：
通过球管(以毫升为单位)将以下试剂移至适当的容器中制备活化混合物：
试剂D(CaCl2)-2.00
试剂F(缓冲液)-38.00
试剂G(胰蛋白酶)-2.00
搅动混合。
步骤1：总胰蛋白酶活性
在零时间点将0.1ml的试剂H(胰蛋白酶原)添加至1ml活性混合物并在5℃下孵育96-120小时。然后用试剂E(HCl)稀释0.2ml至10.2ml。继续进行胰蛋白酶实验。
计算：
以下示出的计算可用于确定胰蛋白酶原的总胰蛋白酶活性。
胰蛋白酶活性(U/ml)＝(ΔA253nm/3分钟试验-ΔA253nm/3分钟空位)X DF(0.2*0.003*3)DF-稀释倍数
实例11
按以上提及的方案取有12L初始培养基体积的50L发酵量。最终收集的培养基量是25L。以不同时间间隔和10000rmp离心回收培养基样本以获得清亮的上清液。从第三日起开始将该上清液进行SDS-PAGE凝胶试验并且下面给出了试验结果。
在该批次中，从带宽可清楚看出表达水平较低。较低水平的关键营养素如碳源甲醇、残余磷酸盐以及氮源-铵离子(以下列表)可导致不利情况，导致饥饿和/或导致蛋白的降解。
 时间(h)   PO4(ppm)   NH4(ppm)   残余甲醇浓度(g/L)
 52   3200   3400   0.25
 64   2286   3030   0.15
 76   1832   3462   0.00
 88   1610   3110   0.10
 100   1519   2631   0.05
 120   850   2080   0.07
 138   211   1961   0.00
实例12
获取另外50L发酵量，目的在于避免残余磷酸盐和铵离子的任何限制。这通过在甲醇诱导阶段期间补给一种现存营养物正磷酸实现。在诱导初始之后允许pH下降(由于正磷酸的补给)。发现在约38-40小时的时间内pH降至3.0。按照以上的方法，可提高主要氮源-铵离子以及磷酸盐的浓度，比之前的批次中观察到的多很多(见下表)。最后收集的培养基量(发酵端和部分溢流)是41L。从第四天开始通过SDS-PAGE凝胶试验培养基上清液并且结果在图10中显示。
磷酸盐和铵趋势：
 时间(h)   PO4(ppm)   NH4(ppm)   残余甲醇浓度(g/L)
 39   14109   3246   0.24
 60   10106   1954   0.16
 85   7267   1164   0.01
 91   16195   4254   0.00
 116   25120   6100   0.03
 131   30038   6800   0.04
 156   28352   6500   0.00
 188   30250   10557   0.01
 203   29335   6262   0.04
 227   23510   6100   0.00
 251   24712   5993   0.01
实例13：
在胰岛素下游工艺中的应用：
自制毕赤酵母宿主中表达的重组胰蛋白酶：在处理胰岛素前体和胰岛素类似物至产品的应用
以自制巴斯德毕赤酵母表达胰蛋白酶原并进行发酵。分离的胰蛋白酶原被激活为活性胰蛋白酶并用于加工胰岛素和胰岛素类似物样甘精胰岛素(Insulin Glargine)、赖脯胰岛素(Insulin Lispro)和门冬胰岛素(InsulinAspart)。在每个试验中将正规供应商的胰蛋白酶(r-DNA来源的)设为对照样本。
胰岛素及其类似物的对应前体形式被放入合适的缓冲液。为每套反应条件保持合适的反应条件。r-DNA来源的胰蛋白酶(自制的(in-house)和来自于供应商)被添加至对应的反应混合物。以不同的时间间隔监控反应情况并在当最终产物的步骤产率达到最大时停止。
使用自制r-DNA来源的胰蛋白酶和来自于正规供应商的r-DNA胰蛋白酶的相应胰岛素或从其前体形式至产品形式的胰岛素类似物的转化的步骤产率的结果在下表中示出。
Figure BDA0000141929520000281
Figure IDA0000141929610000011
Figure IDA0000141929610000021
Figure IDA0000141929610000031
Figure IDA0000141929610000041
Figure IDA0000141929610000051

Claims (13)

1.一种融合多肽，包含融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：1至少80％同源性的氨基酸序列。
2.一种融合多肽，包含融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽在甲基营养酵母中表达，其中所述融合多肽具有与SEQ ID NO：2至少80％同源性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其中SEQ ID 1或2的68和69号氨基酸被氨基酸精氨酸和赖氨酸取代。
4.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其中68号的氨基酸被酪氨酸取代。
5.权利要求1、2、3或4所述的融合多肽的应用，其中所述多肽能够使胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物的前体形式转化为它们对应的活性形式，有至少50％的步骤产率。
6.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述甲基营养酵母属于毕赤酵母属(Pichia sp.)。
7.根据权利要求1或2所述的融合多肽，其中所述甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
8.一种表达融合多肽的方法，所述融合多肽包括由甲基营养酵母生产的融合于脂肪酶信号序列的至少一种丝氨酸蛋白酶，所述融合多肽具有与SEQ ID NO 1表示的核苷酸序列或SEQ ID NO 2表示的氨基酸序列至少80％同源性的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶原。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述甲基营养酵母属于毕赤酵母属。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母。
12.一种载体，包括权利要求1、2、3、或4所述的序列。
13.一种转化细胞，包括可表达形式的根据权利要求9的权利要求1或2所述的序列。
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