CN1224757A

CN1224757A - 生产植酸酶的方法

Info

Publication number: CN1224757A
Application number: CN98105114A
Authority: CN
Inventors: 中村武史; 加藤畅夫; 铃木正; 阪井康能; 德田淳子; 望月大资; 高桥均
Original assignee: Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc; Mitsui Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1998-01-27
Filing date: 1998-01-27
Publication date: 1999-08-04
Anticipated expiration: 2018-01-27
Also published as: EP0931837A1; CA2221807C; US6140077A; CA2221807A1; CN1192103C

Abstract

公开了利用博伊丁氏假丝酵母生产植酸酶的方法,采用该方法在基本上没有增加转化体细胞数量的情况下向培养基中分泌植酸酶。在该方法中,在含有磷酸或磷酸盐化合物的液体培养基中培养用重组载体转化的博伊丁氏假丝酵母转化体细胞,所述重组载体具有甲醇诱导型启动子,和定位于所述启动子的下游并且可操作连接到所述启动子上的编码具有植酸酶活性的多肽的基因,所述磷酸或磷酸盐化合物的量有效地限制所述博伊丁氏假丝酵母转化体细胞的增殖,以便当向培养基中加入甲醇的同时,使所述博伊丁氏假丝酵母转化体细胞的量基本上没有增加,从而使细胞分泌所述植酸酶。

Description

生产植酸酶的方法

本发明涉及生产植酸酶的方法，以及涉及该方法中使用的重组载体和转化体。

植酸酶是将植酸钙镁水解产生磷酸盐的酶。近几年来，试图通过向家畜的饲料中加入植酸酶添加剂以便分解植酸钙镁而降低家畜粪便的磷酸盐水平，从而有效地利用饲料中的磷酸盐，而所述植酸钙镁不能被单胃动物例如鸡和猪所消化。

EP-A-0699762公开了来源于西方喜旺氏酵母的植酸酶和编码该植酸酶基因。该植酸酶可以水解植酸为肌醇并且具有极好的热稳定性。因此，由于植酸酶几乎不被失活，甚至在饲料的制备过程中当饲料中含有的植酸酶暴露于高温时也不失活，该植酸酶在工业上是有用的。

EP-A-699762公开了利用啤酒酵母转化体生产植酸酶的方法。但是，就植酸酶的分泌生产而言可以进一步改进该方法。

顺便提及，在利用重组微生物生产重组蛋白质的过程中，通过制备分泌重组蛋白到细胞外的重组微生物细胞而生产重组蛋白质是令人满意的，因为反馈调节很可能被关闭了，所生产的重组蛋白质很可能不会被分解，所以可以以活性形式被回收，所获得的重组蛋白质的纯化是容易的。

另一方面，为了稳定地生产重组蛋白质，优选的重组微生物是酵母，因为酵母易于培养，而且可以将编码重组蛋白质(将其基因导入到酵母中)的基因导入到酵母的染色体中。因此，已经对利用重组酵母分泌生产重组蛋白质进行了研究。但是，由酵母分泌生产重组蛋白质，尤其是当重组蛋白质来源于酵母以外的种时，分泌生产效率低于由细菌例如枯草芽孢杆菌的生产效率。

涉及高产量分泌生产重组蛋白质的参考文献包括EP-A-0558024,EP-A-0794256和Y.Sakai等人，Biochim.Biophys.Acta第1308期，第81-87页(1996)。

EP-A-0558024公开了包括博伊丁氏假丝酵母的醇氧化酶(AOD)基因的启动子和终止子的表达盒；具有该表达盒的表达载体，和具有表达载体的转化酵母。尤其是该专利申请公开了利用该表达盒表达腺苷酸激酶，细胞色素C552和过氧化物酶。

在EP-A-0794256中，制备了具有重组质粒的转化酵母(博伊丁氏假丝酵母)，所述重组质粒是通过将编码来自于啤酒酵母Kex2蛋白酶的多肽的基因插入到上文提到的表达载体获得的，通过向培养转化酵母细胞的液体培养基中加入甲醇的同时培养转化酵母生产来自于啤酒酵母Kex2蛋白酶的多肽。

Sakai等人通过加入甲醇，甘油和浓缩的培养基成分，培养同化甲醇的博伊丁氏假丝酵母的转化体而生产来自于米根霉的葡萄糖淀粉酶，从而积累葡萄糖淀粉酶到3.4克/升的水平。

在这些已知的过程中，虽然大量地生产所需的蛋白质或多肽，随着所需产物的产生，微生物细胞的量也增加。这意味着每单位量微生物细胞的生产效率随时间而降低，所以该生产方法不是有效的。

此外，本发明的发明人发现博伊丁氏假丝酵母将各种各样的粘性多糖分泌到细胞外。由于在培养期间酵母细胞的浓度增加，由酵母细胞分泌的多糖积累到培养基中，所以培养基的粘性增加。因此，给酵母细胞供应足够氧气带来困难，所以不能很好地生产所需的重组蛋白质。

此外，如果微生物细胞增加太多，所需产物的纯化是困难的，增加了处理废弃细胞的成本。因此，在工业生产过程中，微生物细胞的数量增加太多不是令人满意的。

因此，研制加料分批培养方法是令人满意的，其中当将微生物生长限制到一定的程度，可长时间稳定地和连续地，有效地生产所需产物。但是，对于利用酵母分泌生产重组蛋白质，这样的一种加料分批培养方法是未知的。对于其中重组蛋白质是植酸酶的分泌生产方法是完全未知的。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供用于分泌生产植酸酶的新的和有效的方法，该方法包括在液体培养基中培养重组博伊丁氏假丝酵母以便使酵母细胞连续地分泌植酸酶，并且基本上没有增加酵母细胞的量。

本发明人进行了广泛的研究发现通过在一定量的磷酸或磷酸盐化合物存在下，培养含有重组载体的博伊丁氏假丝酵母转化体细胞，所述载体具有甲醇诱导型启动子，和启动子下游的编码植酸酶的基因，其中磷酸或磷酸盐的量限制酵母的生长，在基本上没有增加细胞量的情况下由细胞分泌植酸酶，从而完成本发明。

就是说，本发明提供了用于生产具有植酸酶活性的多肽的方法，包括在含有一定量的磷酸或磷酸盐化合物的培养基中培养用重组载体转化的博伊丁氏假丝酵母转化体细胞，所述载体具有甲醇诱导型启动子，和定位于启动子的下游并且可操作连接到启动子上的编码具有植酸酶活性的多肽基因，所述磷酸或磷酸盐化合物的量限制博伊丁氏假丝酵母转化体细胞的增殖，以便当向培养基中加入甲醇的同时，使博伊丁氏假丝酵母转化体细胞的量基本上没有增加，从而使细胞分泌多肽。本发明也提供了含有甲醇诱导型启动子，和定位于启动子的下游并且可操作连接到启动子上的编码具有植酸酶活性的多肽基因的重组载体，所述重组载体能够在宿主细胞中表达该基因。本发明进一步提供了用本发明的重组载体转化的博伊丁氏假丝酵母转化体。

采用本发明方法，可以大量地有效地生产植酸酶。根据本发明方法，由于没有在更大程度上增加细胞浓度，每单位量的细胞生产的植酸酶是高的。此外，由于植酸酶的生产是长时间连续进行的，基本上没有伴随细胞数量的提高，植酸酶的生产速率是高的，培养基的成分被有效地使用，并且纯化步骤不麻烦。因此，本发明的方法可用作为工业上生产植酸酶的方法。

附图简述

附图1显示含有来自于西方喜旺氏酵母的植酸酶的cDNA的质粒PHY36的结构。

附图2显示用于在宿主博伊丁氏假丝酵母中表达来自于西方喜旺氏酵母的植酸酶基因的重组质粒pNNPH60的结构。

附图3显示当在加入甲醇的同时在不同的磷酸盐浓度下培养转化体酵母MT-40544时，细胞的量和植酸酶的活性随时间的变化。

优选的实施例的详细描述

在本发明中使用的启动子可以是具有启动子活性的核酸序列，它是甲醇可诱导的。优选的启动子是那些来自于同化甲醇的酵母的甲醇氧化酶的启动子，例如博伊丁氏假丝酵母的AOD1基因的启动子(EP-A-0558024)，巴斯德毕赤氏酵母的AOX1或AOX2基因的启动子(J.M.Cregg等人，分子细胞生物学5，第3376-3385页(1985))，多型汉孙氏酵母的MOX基因的启动子(P.E.Sudbery等人，Biochem.Soc.Trans.16，第1081-1083页(1988))。在这些启动子中，博伊丁氏假丝酵母的AOD1启动子是最优选的。包括AOD1启动子的核苷酸序列显示于序列表的SEQ ID NO.1。应该注意到可以利用具有启动子活性的显示于SEQ ID NO.1的序列的一部分。此外，具有与显示于SEQID NO.1的序列或其部分同源的核苷酸序列的启动子也可以被使用，只要它有启动子活性并且被甲醇诱导。尤其是，可以使用与显示于SEQ ID NO.1的序列具有不低于70％，优选的是不低于90％的同源性的序列或在严谨条件下(在42℃,5×SSC,50％甲酰胺，0.1％SDS杂交12小日)与显示于SEQID NO.1的序列可以杂交的序列，只要它具有启动子活性并且被甲醇诱导。

编码具有植酸酶活性的多肽的基因可以是编码具有水解植酸的活性的多肽的任何核酸，当将该核酸与启动子下游位点可操作连接时在宿主博伊丁氏假丝酵母中表达并且能够使宿主细胞分泌多肽到细胞外。这样一种基因的优选的例子是来自于西方喜旺氏酵母的植酸酶基因(EP-A-0699762)，其核苷酸序列和其编码的氨基酸序列描述于SEQ ID NO.2。应该注意到也可以利用编码具与植酸酶活性的多肽的显示于SEQ ID NO.2的序列的部分。此外，也可以使用具有不同于显示于SEQ ID NO.2的序列的核苷酸序列的但是编码与显示于SEQ ID NO.2的序列具有相同的氨基酸序列的基因。仍然进一步，具有与显示于SEQ ID NO.2的序列或其部分同源的核苷酸序列的基因也可以被使用，只要它所编码的多肽具有植酸酶活性。尤其是，可以使用与显示于SEQ ID NO.2的序列具有不低于70％，优选的是不低于90％的同源性的序列或在严谨条件下(在42℃,5×SSC,50％甲酰胺，0.1％SDS杂交12小时)与显示于SEQ ID NO.2的序列可以杂交的序列，只要它所编码的多肽具有植酸酶活性。

通过将上述启动子和上述位于启动子的下游位点的编码具有植酸酶活性的多肽的基因插入到能够在宿主博伊丁氏假丝酵母中复制的载体可以构建在本发明中使用的重组载体，其中基因与启动子可重组连接。作为插入启动子和基因的载体，可以使用用于大肠杆菌转化的商品载体例如pUC18和pBR322。

重组载体优选的是具有选择性标记物，以便选择转化的宿主细胞。选择性标记物的例子包括对细胞的生长有影响的基因，例如与核酸或氨基酸的合成有关的基因，和抗药性基因。此外，由于本发明的重组载体保留于转化的宿主细胞，优选的重组载体具有能够使载体在宿主细胞中自主复制的序列或具有与宿主细胞的染色体DNA的序列高度同源的序列，以便通过同源重组将载体或其片段插入到染色体DNA。仍然进一步，为了提高表达效率，优选的是重组载体在编码具有植酸酶活性的多肽的基因的下游位点具有一个终止子。优选的终止子的实施例是博伊丁氏假丝酵母的AOD1基因的终止子。

这样的重组载体的优选的实施例是在下文描述的实际工作实施例中制备的显示于附图2的pNNPH60，它包括博伊丁氏假丝酵母的AOD1基因的启动子和连接到启动子下游位点的西方喜旺氏酵母的植酸酶基因。

用本发明的重组载体转化的宿主是博伊丁氏假丝酵母。采用本领域内技术人员已知的方法，用重组载体转化宿主博伊丁氏假丝酵母。

通过在下文详细描述的特定的液态培养基中，在加入甲醇的同时培养获得的重组博伊丁氏假丝酵母可分泌生产具有植酸酶活性的所需的多肽。现在详细描述培养条件。

在本发明方法中使用的液态培养基是含有可同化的碳源，氮源，无机盐和微量的有机和无机成分的含水培养基，其量是能够维持酵母细胞并且生产所需的多肽。该培养基是合成的或天然的。

甲醇是一种诱导物质，同时是一种碳源。而且在培养开始时向液态培养基中加入的碳源仅限于甲醇，并且可以使用酵母在短时期内充分生长的任何碳源。这样的碳源的实施例包括那些仅起碳源作用的物质例如甘油，葡萄糖，蔗糖，有机酸，以及那些不仅作为碳源也作为氮源或磷源的物质例如糖蜜，胨，酵母提取物，玉米浆和肉汁提取物。这些碳源可以单个使用或结合使用。此外，甲醇可以与一种或多种上述碳源一起加入使用。

氮源的例子包括氨，脲和铵盐例如氯化铵，硫酸铵，乙酸铵，磷酸铵和硝酸铵。

无机盐的例子包括磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氯化钠，硫酸镁，氯化钙，硫酸锌，硫酸铜，硫酸亚铁等等。可以按照需要加入所述无机盐。此外，也可以按照需要加入包括维生素的微量成分例如盐酸硫胺素和生物素。含有可同化碳源，氮源，无机盐和微量的有机和无机成分的液态培养基是本领域内技术人员已知的，培养基的量是能够维持酵母细胞并且生产所需的多肽。

在本发明的方法中，液态培养基含有磷酸或磷酸盐化合物，其量可有效地限制博伊丁氏假丝酵母的生长，就是说，所述量的磷酸或磷酸盐化合物用作为细胞生长的限制因子。在这种意义上，上述的除磷酸和磷酸盐化合物以外的液态培养基成分应该以足够的量加入，以便这些成分在整个培养期间不会耗尽。通过检测加入磷酸或磷酸盐化合物是否促进细胞生长易于判断磷酸的量或磷酸盐化合物的量是否作为限制因子。

可以使用的磷酸盐化合物的例子包括无机磷酸盐例如磷酸铵，磷酸钾，磷酸钠，磷酸钙等等，以及天然培养基中含有的成分的有机磷酸盐，这些成分来源于生物体。磷酸或磷酸盐化合物的优选的浓度是基于最终的目的细胞的浓度而变化，考虑到为了确保多肽的分泌程度和避免细胞的过量增殖，其浓度通常为0.3-3克/升，优选的是0.5-2.0克/升的磷酸根。

在本发明的方法中，将上面介绍的重组博伊丁氏假丝酵母接种到上面介绍的液态培养基并且在其中培养。培养温度，通气和搅拌条件，培养基的pH值和其它条件可以是常规用于培养博伊丁氏假丝酵母的一般条件。特别是，培养温度优选的是20-40℃和培养基的pH优选的是3.0-7.0。为了有效地生产具有植酸酶活性的多肽，优选的是连续培养不低于10天，更优选的是不低于15天。

在培养开始时，随着重组博伊丁氏假丝酵母的生长，碳源被耗尽，溶解氧的水平增加。在到达该阶段后，在氮源存在下边加入甲醇和仅作为pH调节剂的碱连续培养。除非从培养开始时包含于培养基中的碳源是一种几乎不被同化的碳源，碳源耗尽后开始加入甲醇的时间点通常是开始培养后24-96小时。在开始培养时培养基中有足够量的氮源的情况下，可以将腐蚀性碱例如氢氧化钠或氢氧化钾的溶液用作为pH调节剂。而且，通常，加入也作为氮源的氨水和氨气调节pH。

通过伴随加入甲醇而连续培养，基本上终止了细胞浓度的增加，因为磷酸或磷酸盐化合物的量具有限制因子的作用。这里，酵母细胞的浓度基本上没有增加的状态是指在一个星期内酵母细胞的量没有增加到不超过两倍的水平。

通过保持甲醇的添加速率，具有植酸酶活性的多肽的分泌与时间呈连续线性关系。考虑到适合商业生产的生产效率，优选的细胞浓度是以细胞干重计算为5克/升-120克/升，优选的是10克/升-80克/升。如果细胞浓度是低于5克/升，多肽的生产效力是低的。如果细胞浓度是高于120克/升，则培养基的浓度用于增殖细胞而浪费，所产生的多肽的纯化是麻烦的，处理所使用的酵母细胞的成本增大。

此外，如上所述，由于博伊丁氏假丝酵母分泌各种各样的多糖，如果培养基中细胞浓度太高，则在培养基中积累多糖并且培养基的粘度增加。从而向酵母细胞供应氧气就困难，从而所需重组多肽的生产效率降低。

向液态培养基中连续地或间断地加入甲醇。在这种情况下，如果在短时间内加入大量的甲醇，所需多肽的产生降低并且在某些情况下，细胞被杀死以致于多肽的产生被停止。因此，通常优选的是在限制作为诱导物质和作为碳源的甲醇的水平到低于1.0％(V/V)的同时连续培养。

通过将小量的培养基进行气相色谱能够测定培养基中甲醇的水平。在用甲醇传感器连续监测甲醇水平的同时加入甲醇是一种实用的方法。另一种可选择的方法，在其中除甲醇以外的碳源被耗尽的情况下，通过用被溶解氧的电极测定溶解氧的水平可以连续地监测甲醇的消耗。

当进行连续培养时，博伊丁氏假丝酵母的量基本上没有增加或没有显著降低。博伊丁氏假丝酵母长时间保持细胞浓度的事实总的来说是预料不到的并且由本发明人发现的。

根据多肽的生产效率和生产成本选择培养结束的时间。通常，在培养开始后约100天时，优选的是在约50天时终止培养。

然后通过离心等等从获得的培养基中去除细胞并且采用回收蛋白质的常规方法回收具有植酸酶活性的多肽。可以进一步纯化回收的多肽。考虑到具有植酸酶活性的多肽可用作为家畜饲料的添加剂的事实，从培养基回收的粗制多肽可作为终产品，或含有对家畜没有毒害作用的培养基成分的多肽作为终产品。

现在借助于实施例更具体地详细地描述发明。而且应该注意到实施例仅用于说明目的，不应该认为是任何限制方式。在实施例中，“％”是指W/V％，除非另有说明或从说明书的内容可以清楚地看出。

实施例1

(1)表达质粒的构建

从博伊丁氏假丝酵母MT-10743(根据布达佩斯条约的规定，于1994年4月21日保藏于国家生物科学和人类技术研究院，工业科学和技术所，1-3,Higashi1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki，日本，保藏号为FERM BP-5108)提取含有编码西方喜旺氏酵母的植酸酶的cDNA的质粒，利用ZAP-cDNA试剂盒克隆该cDNA(从Stratagene购买)，所提取的质粒命名为pPHY36。pPHY36的结构显示于附图1。在附图1中，“Ampr”是指氨苄青霉素抗性基因，和“ori”是指复制源点。在pPHY36中，来源于商品载体pBluescript SK-(从Stratagene购买)的区域是2958碱基对，编码植酸酶的约1800碱基对的cDNA被插入到EcoRⅠ位点和XhoⅠ位点之间。该区域也含有终止子和多聚(A)区域。用T4聚合酶在该质粒的EcoRⅠ位点和NotⅠ位点转化为平齐末端，用具有NotⅠ位点的接头(从TAKARA SHUZO,Kyoto，日本购买)连接获得的产物以导入NotⅠ位点。用T4聚合酶将XhoⅠ位点转化为平齐末端并且用NotⅠ接头连接获得在cDNA的5＇-和3末端具有NotⅠ位点的质粒。用NotⅠ消化质粒并且将获得的cDNA片段连接到质粒pNoteⅠ的NotⅠ位点(EP-A-0558024)，该质粒是博伊丁氏假丝酵母的外源蛋白质的表达质粒以获得质粒pNNPH60。pNNPH60的结构显示于附图2。在附图2中，“Ampr”是指氨苄青霉素抗性基因，“博伊丁氏假丝酵母URA3”是指从博伊丁氏假丝酵母获得的URA3基因。

(2)转化体

将描述于EP-A-0558024中的博伊丁氏假丝酵母TK62接种到5毫升的YPD培养基(1％酵母提取物，2％多胨，2％葡萄糖)并且在28℃振荡培养30小时以获得预培养基。将获得的预培养基接种到100毫升的YPD培养基至浓度为610nm的光密度(OD₆₁₀)是0.2，在28℃将获得的培养基培养约12小时直到OD₆₁₀达到约1.0。收集在获得的培养基中的细胞并且悬浮于25毫升的含有锂的溶液(10毫摩尔Tris-HCl(pH8.0),1毫摩尔EDTA,3毫摩尔乙酸锂)。然后通过离心收集细胞并且又悬浮于5毫升的含有锂的溶液，随后在30℃振荡培养获得的悬浮液1小时以将细胞转化为感受态细胞。将10微升的10微克/微升的热变性的小牛胸腺溶液，用BamHⅠ消化的5微升的1微克/微升的pNNPH60和100微升的感受态细胞悬浮液置于1.5毫升的试管中，并且缓慢混合获得的溶液，随后在30℃静止保温30分钟。此后，加入700微升的45％PEG溶液(45％(W/V)聚乙二醇#4000(PEG),10毫摩尔Tris-HCl(pH8.0),1毫摩尔EDTA,3毫摩尔乙酸锂)，缓慢混合获得的溶液，随后在30℃静止保温1小时。此后，将培养基在42℃热休克5分钟并且将获得的溶液置于30℃保持5分钟。通过离心收集细胞之后，将细胞悬浮于1毫升无菌水，其各200微升体积的等分样品置于YNB平板(0.67％酵母氮源w/o氨基酸(从Difco购买)，2％葡萄糖，2％琼脂)，在28℃,YNB平板上培养3天。进行该操作后，仅转化细胞形成菌落。

(3)筛选高植酸酶生产能力的菌株

为了从章节(2)获得的博伊丁氏假丝酵母转化体筛选生产西方喜旺氏酵母植酸酶能力高的菌株，进行随后培养，比较培养上清液中获得的植酸酶活性。

就是说，在28℃于5毫升的YPD培养基中预培养各单个菌落。将获得的预培养基接种到20毫升YPGM培养基(1％酵母提取物，2％多胨，3％甘油，1.5％甲醇)至浓度达到OD₆₁₀为0.2，在28℃培养获得的产物3小时，随后离心获得的产物以获得含有植酸酶的上清液。通过超滤将上清液浓缩10倍，用离子交换水替代培养基成分。将植酸酶溶液浓缩或稀释到适合于酶反应的浓度，将900微升的含有5毫摩尔植酸钠的60毫摩尔乙酸钠缓冲液(pH4.2)加入到100微升的酶溶液，随后在70℃反应30分钟。在反应之后，向反应溶液中加入100微升的5N的磺酸以终止反应。因此，使用含有底物的缓冲溶液，其中加入100微升的5N的磺酸和酶溶液。反应之后，适当地稀释反应混合物，采用Heinonen和Lahti的方法(Anal.Biochem.,Vol.113，第313-317(1981))，通过比色测定检测所产生的磷酸盐的量。

基于下列计算方法计算所产生的植酸酶的量，即1毫克植酸酶催化每分钟释放320微摩尔的磷酸盐的反应。通过该步骤，获得具有各种植酸酶生产性能的转化体。在这些转化体中，获得了显示高植酸酶生产能力的菌株并且命名为MT-40544。根据布达佩斯条约的规定，该菌株于1996年5月31日保藏于国家生物科学和人类技术研究院，工业科学和技术所，1-3,Higashi 1-chome,Tsukuba-shi,Ibaraki，日本，保藏号为FERMBP-5936。

实施例2

植酸酶的分泌生产(1)

采用下列方法培养在实施例1中获得的转化体MT-40544：

就是说，将含有1％玉米浆，0.5％硫酸铵，0.1％磷酸氢二钾和2％葡萄糖的100毫升培养基置于500毫升的带Buffle的锥形瓶中，在121℃灭菌20分钟。将1铂金环的MT-40544接种到该培养基中，在28℃振荡培养24小时。将1200毫升的培养基(0.5％的酵母提取物(含有3.3％的磷酸根)，3％甘油，0.5％的硫酸铵，0.2％的磷酸二氢钾和0.1％的七水硫酸镁)置于21倍体积的发酵罐并且灭菌。然后加入18毫升的甲醇，加入上面描述的整个预培养基。在28℃，以通气速率为1.0vvm，搅拌叶片为700rpm，用5％氨水调节到pH为5.5的情况下培养获得的培养物。

在开始培养之后，一旦溶氧水平降低到0％，然后开始上升。在溶氧水平开始上升60小时之后，开始加入甲醇，之后仅加入甲醇和作为pH调节剂的氨水。监测溶氧水平，当溶氧水平达到30％的饱和度时加入甲醇。虽然以约1克/升/小时的速率加入甲醇，由于没有从发酵罐的废气中回收水，培养基的体积在整个培养时期基本上保持不变。

结果以环状标记显示于附图3。涂黑的环状标记表示细胞浓度，空心的环状标记表示植酸酶活性。如图所示，植酸酶的分泌生产从培养开始连续50天，并且其中保持细胞量(细胞干重)基本上不增加。

实施例3

植酸酶的分泌生产(2)

重复实施例2相同的操作，所不同的是磷酸二氢钾的浓度是0.1％或0.05％(w/v)。

结果以方形(0.05％)和三角形(0.1％)标记显示于附图3。涂黑的标记表示细胞浓度，空心的标记表示植酸酶活性。如图所示，获得了类似于实施例2获得相对于时间的概况，即使最后达到的细胞浓度和植酸酶活性是不同的。因此，证明了利用培养基中的磷酸根的量作为生长抑制因子，可以在保持细胞数量基本上没有增加的情况下连续地进行植酸酶的分泌生产。

序列表SEQ ID NO:1序列长度：734序列类型：核酸链型：双链几何结构：线性分子类型：基因组DNA原始来源

生物体：博伊丁氏假丝酵母

发育阶段：野生型序列描述TCTAGAATTT CATTATTTAT TTTTTATTGA CTGGAAATTT TCAATCAATT TTATTTATTT 60TTATTTATTT ATTTTCATAT TCTTAGATTT AAACTTTTTA GATGACCGCT ATTTTACTTA 120CTTACTTACT TACTTACTTA CTTACTTACT TACATACCTA CTTACTGTGA TTTTATAATA 180TGATAAGAAT TAATTTTCAT ATTTATGATG ATGTAAATTT AACCTAGTAT ACTATTTTAA 240AGTTATCACT ATCTTTTAGT GCTGGCATTT TTTATTCTAT TTTCATATAT GTATATAAGT 300AAATTAAGTA TCATCACGCT GCTTACTGTA CGTTTAAAAT GTGGAGATGG AAATAGAGAT 360GGGGATGAAG ATGAAGATGA TGAGAATTAT AAACCATTCA TTCATTAATC AATCAATATA 420ACTTATAAAA AAATTTATAT TTAAATGAAT TAATTTCCTT TATTTTAATA ATATCGTTAA 480TTCTTTTAAA TTCTATTTTA TTTTAATTCT TTCTTTATCA TAGTTATCAT ATAACAATTA 540TATAACATAG ATACACAATT ATTATTTTAT TATCATATTA TTTTTTAAAA TATTGATTAT 600TTTTAAAATA ATATCTTAAT TAATTAATTT TTACGAATAT ACAAATTTTA ACGACTTTCT 660TTTTTTAACG AATTTTAACG AACTTTTAAA AAAACAAAAA AAAAAAAACA AAATTATTTT 720TCAATAGCGG CCGC 734SEQ ID NO:2序列长度：1631序列类型：核酸链型：双链几何结构：线性分子类型：cDNA原始来源

生物体：西方喜旺氏酵母

发育阶段：野生型

序列描述GTCAATC ATG GTC TCG ATC TCA AAA TTA ATT AAT AAC GGT TTA CTC TTA 49

Met Val Ser Ile Ser Lys Leu Ile Asn Asn Gly Leu Leu Leu

5 10GCT GGT CAA AGT GTT TAC CAA GAT TTA GCT ACT CCA CAA CAA TCT TCC 97Ala Gly Gln Ser Val Tyr Gln Asp Leu Ala Thr Pro Gln Gln Ser Ser15 20 25 30GTC GAG CAG TAT AAT ATT ATT AGG TTT TTA GGT GGT TCG GGT CCT TAC 145Val Glu Gln Tyr Asn Ile Ile Arg Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro Tyr

35 40 45ATT CAA CGC AGT GGT TAT GGT ATT TCC ACT GAT ATT CCT GAT CAG TGC 193Ile Gln Arg Ser Gly Tyr Gly Ile Ser Thr Asp Ile Pro Asp Gln Cys

50 55 60ACA ATT AAG CAA GTT CAG TTG ATG TCA AGG CAT GGG GAA AGA TAC CCT 241Thr Ile Lys Gln Val Gln Leu Met Ser Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro

65 70 75TCA AAA AAC TCT GGT AAG AAG TTA AAA ACA ATA TAT GGT AAA TTA AAG 289Ser Lys Asn Ser Gly Lys Lys Leu Lys Thr Ile Tyr Gly Lys Leu Lys

80 85 90AGC TAC AAT GGC ACT TTC ACA GGT AGC TTA GCT TTT TTG AAT GAC TAT 337Ser Tyr Asn Gly Thr Phe Thr Gly Ser Leu Ala Phe Leu Asn Asp Tyr 95 100 105 110GAA TAT TTT GTT CCG GAT GAT AGT TTG TAC GAA AAG GAA ACA AGT GCA 385Glu Tyr Phe Val Pro Asp Asp Ser Leu Tyr Glu Lys Glu Thr Ser Ala

115 120 125CTG AAC TCG CAA GGT TTA TTT GCA GGT ACT ACA GAT GCC TTA AGA CAT 433Leu Asn Ser Gln Gly Leu Phe Ala Gly Thr Thr Asp Ala Leu Arg His

130 135 140GGT GCT GCT TTT AGA GCT AAA TAT GGA TCA TTG TAT AAA CAA AAT TCT 481Gly Ala Ala Phe Arg Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Tyr Lys Gln Asn Ser

145 150 155ACC TTG CCA GTT TTC ACT TCA AAT TCC AAC AGA GTC TAC CAG ACT TCT 529Thr Leu Pro Val Phe Thr Ser Asn Ser Asn Arg Val Tyr Gln Thr Ser

160 165 170GAA TAC TTT GCC AGA GGT TTC TTA GGT GAT GAA TTT TCT GAT GCT ACT 577Glu Tyr Phe Ala Arg Gly Phe Leu Gly Asp Glu Phe Ser Asp Ala Thr175 180 185 190GTT CAC TTT GCT ATC ATT GAT GAA GAC CCT AAA ATG GGT GTT AAT TCA 625Val His Phe Ala Ile Ile Asp Glu Asp Pro Lys Met Gly Val Asn Ser

195 200 205TTA ACA CCA AGA GCC GCT TGT GAC AAT TAT AAT GAG GAT GTG AAT GAC 673Leu Thr Pro Arg Ala Ala Cys Asp Asn Tyr Asn Glu Asp Val Asn Asp

210 215 220GGC ATT GTC AAT CAA TAT AGC ACT GAC TAT TTG GAT GAA GCC CTT AAA 721Gly Ile Val Asn Gln Tyr Ser Thr Asp Tyr Leu Asp Glu Ala Leu Lys

225 230 235AGA TTC CAA TCA TCA AAT CCA GGA TTG AAT TTG ACC TCG GAA GAC GTT 769Arg Phe Gln Ser Ser Asn Pro Gly Leu Asn Leu Thr Ser Glu Asp Val

240 245 250TAC CAA CTT TTC GCT TAC TGT GCA TAT GAG ACT AAT GTT AAG GGT GCA 817Tyr Gln Leu Phe Ala Tyr Cys Ala Tyr Glu Thr Asn Val Lys Gly Ala255 260 265 270TCC CCA TTC TGT GAC TTA TTT ACT AAT GAA GAA TAC ATT CAA TAT TCC 865Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr Asn Glu Glu Tyr Ile Gln Tyr Ser

275 280 285TAC AGC GTT GAT CTT TCT AAT TAT TAT TCT CAC GGG GCA GGT CAT AAT 913Tyr Ser Val Asp Leu Ser Asn Tyr Tyr Ser His Gly Ala Gly His Asn

290 295 300CTA ACT AAA ACC ATT GGT TCT ACT TTA TTA AAT GCC TCA TTA ACC TTA 961Leu Thr Lys Thr Ile Gly Ser Thr Leu Leu Asn Ala Ser Leu Thr Leu

305 310 315TTA AAA GAT GGC ACC AAT GAC AAT AAA ATC TGG TTA TCT TTT TCA CAC 1009Leu Lys Asp Gly Thr Asn Asp Asn Lys Ile Trp Leu Ser Phe Ser His

320 325 330GAT ACT GAT TTG GAA ATC TTC CAT AGT GCC TTA GGA ATT GTT GAG CCA 1057Asp Thr Asp Leu Glu Ile Phe His Ser Ala Leu Gly Ile Val Glu Pro335 340 345 350GCT GAA GAT TTA CCA GTT GAT TAC ATT CCT TTT CCA TCG CCA TAT ATT 1105Ala Glu Asp Leu Pro Val Asp Tyr Ile Pro Phe Pro Ser Pro Tyr Ile

355 360 365CAC TCA CAA ATT GTT CCA CAA GGT GCT AGA ATT TAT ACT GAG AAA TAT 1153His Ser Gln Ile Val Pro Gln Gly Ala Arg Ile Tyr Thr Glu Lys Tyr

370 375 380TCA TGT GGC AAC GAA ACC TAT GTT AGA TAT ATA CTT AAT GAT GCA GTT 1201Ser Cys Gly Asn Glu Thr Tyr Val Arg Tyr Ile Leu Asn Asp Ala Val

385 390 395GTT CCA ATT CCA AAA TGC TCT TCT GGT CCA GGG TTC TCA TGT GAG CTT 1249Val Pro Ile Pro Lys Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Glu Leu

400 405 410AGT AAA TTC GAA GAA TAT ATT AAT AAA AGA CTT AGG GAT GTT GAC TTT 1297Ser Lys Phe Glu Glu Tyr Ile Asn Lys Arg Leu Arg Asp Val Asp Phe415 420 425 430GTT GAA CAA TGT GAT TTA AAA GAT GCT CCA ACT GAA GTT ACT TTT TAC 1345Val Glu Gln Cys Asp Leu Lys Asp Ala Pro Thr Glu Val Thr Phe Tyr

435 440 445TGG GAT TAC ACG TCG GTG AAC TAT AGT GCG TCC CTT ATT AAT GGT TAA 1393Trp Asp Tyr Thr Ser Val Asn Tyr Ser Ale Ser Leu Ile Asn Gly

450 455 460ATTGAGTATA GGAGAATATC TTATTTCTAG TTTGATCACT ATCTGAATCC ACTTTGCTCT 1433TTCTCCTTGT TTTGATTGCT TATCCATTGT TTAGAAATAC GTTATAAAGC AATCATTTTT 1463ACAACTATGT CGTCTAATAC TTTGTTTCTA GAATTAAAAA AATAAATAGT ATACCTGTGT 1493AAAGTCTTAC TTGATAGCTA ACTAGTCACT TCTTAATCAT ACACCTAATC TATCCTAA 1631

Claims

1．用于生产具有植酸酶活性的多肽的方法，包括在含有一定量的磷酸或磷酸盐化合物的液体培养基中培养用重组载体转化的博伊丁氏假丝酵母转化体细胞，所述载体具有甲醇诱导型启动子，和定位于所述启动子的下游并且可操作连接到所述启动子上的编码具有植酸酶活性的多肽的基因，所述磷酸或磷酸盐化合物的量限制所述博伊丁氏假丝酵母转化体细胞的增殖，以便当向培养基中加入甲醇的同时，使所述博伊丁氏假丝酵母转化体细胞的量基本上没有增加，从而使所述细胞分泌所述多肽。

2．根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子是博伊丁氏假丝酵母的乙醇氧化酶1基因的启动子。

3．根据权利要求1所述的方法，其中所述的液体培养基中含有所述磷酸或磷酸盐化合物的量以磷酸根计算为0.3-3.0克/升。

4．根据权利要求1所述的方法，其中连续培养不少于10天。

5．根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述的具有植酸酶活性的多肽是西方喜旺氏酵母的植酸酶。

6．根据权利要求5所述的方法，其中所述的博伊丁氏假丝酵母转化体是MT-40544(FERM BP-5936)。

7．一种重组载体，它含有甲醇诱导型启动子，和定位于启动子的下游并且可操作连接到所述启动子上的编码具有植酸酶活性的多肽的基因，所述重组载体能够在宿主细胞中表达所述基因。

8．根据权利要求7所述的重组载体，其中所述启动子是博伊丁氏假丝酵母的醇氧化酶1基因的启动子。

9．根据权利要求7所述的重组载体，其中所述的具有植酸酶活性的多肽是西方喜旺氏酵母的植酸酶。

10．博伊丁氏假丝酵母转化体，它是用权利要求7-9任一项所述的重组载体转化的。

11．根据权利要求10所述的博伊丁氏假丝酵母转化体，它是MT-40544(FERM BP-5936)或其突变体。