CN102197047A - 突变的δ5去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及突变Δ5去饱和酶,其具有使二高-γ亚麻酸[DGLA;20:3ω-6]转化为花生四烯酸[ARA;20:4ω-6]和/或使二十碳四烯酸[ETA;20:4ω-3]转化为二十碳五烯酸[EPA;20:5ω-3]的能力并且在细胞色素b5-样结构域的HPGG基序中有至少一个突变。公开了分离的核酸片段和包含编码Δ5去饱和酶的此类片段的重组构建体,以及用这些突变Δ5去饱和酶在含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFAs”]的方法。
Description
本专利申请要求2008年9月19日提交的美国临时申请61/098333的权益,其公开内容全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲,本发明与编码突变Δ5脂肪酸去饱和酶(其中在细胞色素b5-样结构域的HPGG基序发生至少一个突变)的核酸片段的构建和这些去饱和酶在长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的制备中的使用有关。
背景技术
包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在内的多种不同宿主正作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段被研究。基因工程已经证明,一些宿主(即使是亚油酸[LA;18:2ω-6]和α-亚麻酸[ALA;18:3ω-3]脂肪酸生产天然地受限的那些)的天然能力能够被基本上改造以实现多种长链ω-3/ω-6 PUFA的高水平生产。花生四烯酸[ARA;20:4ω-6]、二十碳五烯酸[EPA;20:5ω-3]和二十二碳六烯酸[DHA;22:6ω-3]的生产可能都需要Δ5去饱和酶的表达,无论这是天然能力还是重组技术的结果。
迄今鉴定的大多数Δ5去饱和酶具有将二高-γ-亚麻酸[DGLA;20:3ω-6]转化为ARA的主要活性,和将二十碳四烯酸[ETA;20:4ω-3]转化为EPA的次要活性。在公开文献和专利文献中均已公开了多种Δ5去饱和酶。基于去饱和酶的进化,P.Sperling等人(Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acids,68:73-95(2003)对Δ5去饱和酶的一般特性作了很好的描述。连同Δ6、Δ8和Δ4去饱和酶一起,已知Δ5去饱和酶是长链PUFA“前端”去饱和酶(其中去饱和发生在业已存在的双键和脂肪酸酰基的羧基末端之间,与甲基定向的去饱和相反)。这些去饱和酶的特征在于三个组氨酸框[H(X)3-4H(SEQ ID NO:1和2)、H(X)2-3HH(SEQ ID NO:3和4)和H/Q(X)2-3HH(SEQ ID NO:5和6)],并且是细胞色素b5融合超家族的成员,因为它们在N末端具有融合的细胞色素b5结构域,该的细胞色素b5结构域,该结构域起到电子供体的作用。所述细胞色素b5结构域还包含保守的血红素结合基序(即,组氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列或者叫“HPGG”[SEQ ID NO:180]序列),尽管其余的细胞色素b5结构域序列有差异。这些基序序列是美国专利5,972,664的主题。
一些研究已表明HPGG基序与酶活性有关。Sayanova,O.等人(Plant Physiol.,121:641(1999))进行了定点诱变以在琉璃苣的Δ6去饱和酶中用丙氨酸残基取代HPGG基序的组氨酸残基。在拟南芥中表达了突变酶;然而却未能检测到酶活性,表明去饱和酶的细胞色素b5结构域对于功能是重要的。在大鼠Δ6去饱和酶中进行了类似的研究,其中在HPGG基序中进行了丙氨酸对组氨酸的取代。突变蛋白质同样不具有活性(Guillou,H.,等人,J.Lipid Res.,45:32-40(2004))。最近,Hongsthong,A.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.,72:1192-1201(2006))报告了在螺旋藻(Spirulina)的Δ6去饱和酶中,用丙氨酸残基对HPGG基序的组氨酸残基的取代。与之前的报道一样,突变使得突变酶不能在大肠杆菌中产生GLA,表明细胞色素b5结构域对于活性是重要的并且该基序的改变将导致酶活性的降低。尽管Δ5去饱和酶相对普通并且已被很好地描述,但依然存在对在能制造PUFA的生产宿主细胞中以高水平有效表达的酶的需求。
因此,有待解决的问题是发现适合在商业上有用的宿主细胞中整合到PUFA生物合成途径的、具有高活性的新的Δ5去饱和酶。通过意料之外的发现,即在多种Δ5去饱和酶的细胞色素b5结构域的HPGG基序中的改变,导致了以DGLA向ARA的转化计最高38%的酶活性升高,申请人已解决了上述问题。
发明概述
本发明涉及编码具有Δ5去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体,以及它们在细菌、酵母、藻类、眼虫、原生藻菌(stramenopiles)、卵菌和真菌中用于生产PUFA的使用。
相应地,本文提供具有Δ5去饱和酶活性的突变多肽,所述多肽包含选自下列的氨基酸基序:SEQ ID NO:183(His-Gly-Gly-Gly或HGGG)、SEQ ID NO:184(His-His-Gly-Gly或HHGG)、SEQ ID NO:186(His-Cys-Gly-Gly或HCGG)、SEQ ID NO:187(His-Trp-Gly-Gly或HWGG)和SEQ ID NO:185(His-Pro-Gly-Ser或HPGS)。优选的突变Δ5去饱和酶多肽,是:与突变体所源自的亲本多肽的二高-γ-亚麻酸向花生四烯酸的转化效率相比,表现出更高的二高-γ-亚麻酸向花生四烯酸的转化效率的那些。
在第二实施方案中,本文提供了基本上编码本发明的多肽的分离的核酸分子。
在第三实施方案中,本发明提供了表达本发明的多肽的微生物宿主细胞。
在第四实施方案中,本发明提供了用于生产花生四烯酸的方法,所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二高-γ-亚麻酸的存在下生长,其中二高-γ-亚麻酸被转化为花生四烯酸。
在第五实施方案中,本发明提供了用于生产二十碳五烯酸的方法,所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二十碳四烯酸的存在下生长,其中二十碳四烯酸被转化为二十碳五烯酸。
附图简述和序列表
图1A和图1B示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径,并且当考虑下文对该途径的描述时应一起观看。
图2提供了下列的质粒图谱:(A)pDMW369;和(B)pZUF17。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明,下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”(“Requirements for Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”)),并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO:7-19、58、97-100、139、140和179-195为编码基因或蛋白质(或其部分)或质粒的ORF,如表1中所示。
表1:核酸和蛋白质SEQ ID编号摘要
SEQ ID NO:20-57对应于用于通过定点诱变个别地使EgD5S的HPGG基序的脯氨酸残基突变的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:59-96对应于用于通过定点诱变个别地使EgD5S的HPGG基序的第二个甘氨酸残基突变的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:101-138对应于用于通过定点诱变个别地使EaD5S的HPGG基序的脯氨酸残基突变的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:141-178对应于用于通过定点诱变个别地使RD5S的HPGG基序的脯氨酸残基突变的寡核苷酸引物。
发明详述
本文中公开了新的突变Δ5去饱和酶和编码所述去饱和酶的基因,它们可用于操纵生产有益健康的PUFA的生化途径。这些突变Δ5去饱和酶在细胞色素b5结构域的HPGG基序(SEQ ID NO:180)中有至少一个突变。
PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂,尤其是婴儿代乳品(formula),用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择,可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中,以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中,并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地,该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
本文引用的全部专利和非专利文献均以引用方式并入本文。
在本公开中,使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。
“开放阅读框”缩写为“ORF”。
“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
如本文所用,术语“发明”或“本发明”不旨在局限于本发明的任一具体实施方案,而是在一般情况下适用于如权利要求和说明书中所描述的本发明的任何实施方案和所有实施方案。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸),链长为从约C12至C22,尽管更长和更短链长的酸均是已知的。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示,其中X表示具体脂肪酸中碳[“C”]原子的总数,而Y表示双键的数目。美国专利7,238,482中提供了关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”[“PUFA”]、以及“ω-6脂肪酸”[“ω-6”或“n-6”]对“ω-3脂肪酸”[“ω-3”]或[“n-3”]之间的区别的更多细节,该专利以引用方式并入本文。
本文中用于描述PUFA的命名法显示于表2中。在名为“简化符号”的列中,ω-参考系统被用于表示碳原子数量、双键数量和距ω碳最近的双键位置,从ω碳(因此其被编号为1)数起。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的俗名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。
表2:多不饱和脂肪酸及前体的命名法
虽然表2列出的ω-3/ω-6PUFA是最有可能在使用本发明所述方法的微生物宿主的油级分中积聚的,但是该列表不应理解为限制性的或完全的。
术语“油脂”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物种,油脂构成了总脂质的主要部分。“油脂”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成,但还可包含其他中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的;因此,总脂质中的PUFA浓度的升高或降低将对应于油脂中的PUFA浓度的升高或降低,反之亦然。
“中性脂质”指那些一般作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质,它们之所以被称为“中性脂质”,是因为在细胞的pH下,所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的,对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯,也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油,或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸,必须发生水解反应。
术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸,以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。
本文所用术语“总脂肪酸”[“TFA”]是指所有细胞脂肪酸的总量,所述脂肪酸在给定样品中能通过碱酯交换方法(如本领域所已知的)被衍生为脂肪酸甲酯[“FAME”],所述样品可以是例如生物质或油脂。因此,总脂肪酸包括来自中性脂质级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)和来自极性脂质级分(包括磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级分)的脂肪酸,但不包括游离脂肪酸。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度,以占干细胞重量[“DCW”]的百分比的形式表示,不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比[“FAME%DCW”]量度。因此,总脂质含量[“TFAs%DCW”]等于,例如,脂肪酸毫克数每100毫克DCW。
总脂质中的脂肪酸浓度在本文中表示为占TFA的重量百分比[“%TFA”],例如,给定脂肪酸的毫克数每100毫克TFA。在本公开中,除非另有特别说明,所提及的给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于所述脂肪酸以%TFA表示的浓度,例如%EPA对总脂质等同于EPA%TFA。
术语“脂质谱”和“脂质组成”是可互换的,并且指在特定脂质级分中,例如在总脂质或油脂中,包含的各种脂肪酸分别的量,其中所述量以占TFA的重量百分比形式表示混合物中存在的各个脂肪酸的总量应当是100。
术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献中详细描述了该过程。参见如美国专利申请2006-0115881-A1。简而言之,该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和,这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲,“PUFA生物合成途径酶”指下列与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因),包括:Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸,但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其关注的是使脂肪酸在从该分子的羧基端计数的第五个和第六个碳原子之间去饱和,并且能够(例如)催化DGLA向ARA的转化和/或ETA向EPA的转化的Δ5去饱和酶。其他脂肪酸去饱和酶包括,例如:Δ8去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶和Δ9去饱和酶。在本领域中,基于Δ15和Δ17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化为它们的ω-3对应物的能力(例如分别将LA转化为ALA和将ARA转化为EPA),偶尔也将它们称作“欧米茄-3去饱和酶”、“ω-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布的作用,从而经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。
术语“EgD5”是指从小眼虫中分离的由本文SEQ ID NO:7编码的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO:8)。类似地,术语“EgD5S”是指来源于小眼虫的、针对在解脂耶氏酵母中的表达进行过密码子优化的合成的Δ5去饱和酶(即,SEQ ID NO:9和10)。关于EgD5和EgD5S的更多细节描述于国际申请公布WO 2007/136671中。
术语“EaD5”是指从Euglena anabaena中分离的由本文SEQ ID NO:11编码的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO:12)。类似地,术语“EaD5S”是指来源于Euglena anabaena的、针对在解脂耶氏酵母中的表达进行过密码子优化的合成的Δ5去饱和酶(即,SEQ ID NO:13和14)。关于EaD5和EaD5S的更多细节描述于美国专利申请公布2008-0274521-A1中。
术语“RD5”是指Δ5去饱和酶(SEQ ID NO:16),该酶分离自多甲藻属未定名种CCMP626,由本文的SEQ ID NO:15编码。类似地,术语“RD5S”是指合成的Δ5去饱和酶,该酶来源于多甲藻属未定名种CCMP626,其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即,SEQ ID NO:17和18)。关于RD5和RD5S的更多细节描述于国际申请公布WO 2007/136646中。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化,但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定,所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。普遍存在于动物、植物和真菌的Δ5去饱和酶中的基序包括,三个组氨酸框(即,H(X)3-4H[SEQ ID NO:1和2]、H(X)2-3HH[SEQ ID NO:3和4]和H/Q(X)2-3HH[SEQ ID NO:5和6])和位于N端的融合的细胞色素b5结构域中的血红素结合基序(即,His-Pro-Gly-Gly或HPGG[SEQ ID NO:180])。
术语“突变Δ5去饱和酶”是指如本文所述的Δ5去饱和酶,该酶在细胞色素b5结构域的HPGG基序(SEQ ID NO:180)中具有至少一个突变,其中所述突变导致保守的或者非保守的氨基酸取代。虽然所述突变可包括任何氨基酸取代,突变Δ5去饱和酶优选地包含至少一种选自His-Xaa-Gly-Gly(或者记为“HXGG”,SEQ ID NO:181)和His-Pro-Gly-Xaa(或者记为“HPGX”,SEQ ID NO:182)的突变基序,并且所述突变Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性为至少与野生型Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性功能上大约等同。更优选的,所述突变基序选自:SEQ ID NO:183(His-Gly-Gly-Gly或“HGGG”)、SEQ ID NO:184(His-His-Gly-Gly或“HHGG”)、SEQ ID NO:186(His-Cys-Gly-Gly或“HCGG”)、SEQ ID NO:187(His-Trp-Gly-Gly或“HWGG”)和SEQ ID NO:185(His-Pro-Gly-Ser或“HPGS”)。参见,例如SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:179所示的Δ5去饱和酶。
每种“突变Δ5去饱和酶”具有“对应的野生型Δ5去饱和酶”。具体而言,突变Δ5去饱和酶和对应的野生型Δ5去饱和酶之间,除了野生型在细胞色素b5结构域中包含HPGG基序(SEQ ID NO:180),而突变在该基序中包含至少一个突变(如上文所述)之外,具有相同的氨基酸序列。
当突变Δ5序列的酶活性和特异选择性比得上对应的野生型Δ5去饱和酶的酶活性和特异选择性时,突变Δ5去饱和酶为与对应的野生型Δ5去饱和酶“至少功能上大约等同”的。因此,当比较每种酶的“转化效率”时,功能上等同的突变Δ5去饱和酶将具有相对于对应的野生型Δ5去饱和酶活性基本上不降低的Δ5去饱和酶活性(即,突变Δ5去饱和酶将具有野生型Δ5去饱和酶活性的至少约50-75%,优选至少约75-85%,更优选至少约85-95%,最优选至少约95%的酶活性)。两种多肽的Δ5去饱和酶活性可以是基本上相同的。优选地,突变Δ5去饱和酶在与对应的野生型Δ5去饱和酶进行比较时将具有提高的酶活性和特异选择性,即,具有野生型Δ5去饱和酶活性的至少约101-105%,更优选至少约106-115%以及最优选至少约116-125%的酶活性。
术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率按照下列公式计算:([产物]/[底物+产物])*100。因此,“DGLA向ARA的转化效率”是指底物DGLA被转化为产物ARA的转化效率。
术语“延伸酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生,如美国专利申请公布2005/0132442中所述。延伸酶体系催化的反应的实例如GLA向DGLA、STA向ETA以及EPA向DPA的转化。
通常,延伸酶的底物选择性有些广泛,但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如,C14/16延伸酶将利用C14底物(例如肉豆蔻酸),C16/18延伸酶将利用C16底物(例如棕榈酸),C18/20延伸酶将利用C18底物(例如GLA、STA、LA、ALA)而C20/22延伸酶[也称为Δ5延伸酶]将利用C20底物(例如ARA、EPA)。出于本文的目的,可确定两种不同类型的C18/20延伸酶:Δ6延伸酶将催化GLA和STA分别向DGLA和ETA的转化,而Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别向EDA和ETrA的转化。
重要的是,须注意一些延伸酶具有广泛的特异性并因而单种延伸酶可能能够催化若干种延伸酶反应,从而既可作为C16/18延伸酶又可作为C18/20延伸酶)。可能理想的是,通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布特征的作用,从而经验性地测定脂肪酸延伸酶的特异性。
术语“含油的”指那些倾向于以油脂形式贮存它们的能源的生物(Weete,Fungal Lipid Biochemistry,第2版,Plenum,1980)。通常,含油微生物的细胞油脂含量符合S形曲线,其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度,随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward,Appl.Environ.Microbiol.,57:419-25(1991))。含油微生物积累油脂超过它们的干细胞重量的约25%的情形是常见的。
术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。含油酵母的实例包括但不限于如下属:耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。或者,被分类为酵母并被改造为生产超过其干细胞重量25%的油脂的生物也是“含油的”。
术语“氨基酸”将指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。按照在Nucleic Acids Research,13:3021-3030(1985)和Biochemical Journal,219(2):345-373(1984)中描述的IUPAC-IYUB标准,用氨基酸的单字母代码或三字母代码来表示氨基酸。
术语“保守氨基酸置换”指将给定蛋白质中的氨基酸残基用另一种氨基酸置换,而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如,在本领域中熟知,导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码、折叠蛋白质的结构和功能特性)的基因改变是常见的。出于本文的目的,将“保守氨基酸取代”定义为下列五组中的一组内的互换:
1.小的脂族、非极性残基或稍微极性的残基:Ala[A]、Ser[S]、Thr[T](Pro[P]、Gly[G]);
2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺:Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q];
3.极性的、带正电荷的残基:His[H]、Arg[R]、Lys[K];
4.大的脂族、非极性残基:Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V](Cys[C]);并且
5.大的芳族残基:Phe[F]、Tyr[Y]、Trp[W]。
因此如Ala这样的弱疏水性氨基酸可以由另一种疏水性更弱的残基(例如Gly)取代。同样的,也期望由一种带负电的残基取代另一种带负电的残基(例如Asp取代Glu)或一种带正电的残基取代另一种带正电的残基(例如Lys取代Arg)所引发的改变能产生功能上等同的产物。同样的,保守氨基酸取代一般保持:置换区内多肽主链的结构;分子在靶位点处的电荷或疏水性;或侧链的堆积体积。此外,在许多情形中,改变蛋白质分子的N末端和C末端部分也将预计不会改变蛋白质的活性。
术语“非保守氨基酸取代”指通常预期会使蛋白质性质发生最大变化的氨基酸置换。因此,例如,在非保守氨基酸取代中可以是:1)亲水性残基取代疏水性残基/被疏水性残基取代(例如,Ser或Thr取代Leu、Ile、Val/被Leu、Ile、Val取代);2)Cys或Pro取代任何其他残基/被任何其他残基取代;3)具有带正电的侧链的残基取代带负电的残基/被带负电的残基取代(例如,Lys、Arg或His取代Asp或Glu/被Asp或Glu取代);或4)具有大侧链的残基取代无侧链的残基/被无侧链的残基取代(如Phe取代Gly/被Gly取代)。有时,这五组中的两组之间的非保守氨基酸置换将不会影响所编码的蛋白质的活性。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物,它们可以是单链或双链,任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)通过单字母命名指代如下:“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA),“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸,“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸,“U”指尿苷酸,“T”指脱氧胸苷酸,“R”指嘌呤(A或G),“Y”指嘧啶(C或T),“K”指G或T,“H”指A或C或T,“I”指肌苷,“N”指任何核苷酸。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时,核酸片段“可杂交”至另一核酸片段,例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的,并例示于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989)中,该文献尤其是第11章和表11.1以引用方式并入本文。温度和离子强度条件决定杂交的“严格度”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列),到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤,开始是6X SSC,0.5%SDS在室温洗涤15分钟,然后用2X SSC,0.5%SDS在45℃重复30分钟,然后用0.2X SSC,0.5%SDS在50℃重复洗涤两次,每次30分钟。一组较优选的严格性条件使用较高温度,其中洗涤步骤与上述那些步骤相同,不同的是最后两次用0.2X SSC,0.5%SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1%SDS进行。例如,另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1%SDS中于65℃下杂交,并用2X SSC、0.1%SDS洗涤,随后用0.1X SSC、0.1%SDS洗涤。
杂交需要两种核酸含有互补序列,但是取决于杂交的严格性,碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度,所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高,具有那些序列的核酸的杂交体的[“Tm”]值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低:RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言,已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人,同上,9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交,错配的位置变得更重要,而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人,同上,11.7-11.8)。在一个实施方案中,可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地,可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸;更优选至少约20个核苷酸;最优选长度为至少约30个核苷酸。此外,技术人员将认识到,可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分,该部分包含的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定鉴定所述多肽或基因,所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过对所述序列的人工评估进行,或者可以利用诸如[“BLAST”](Basic Local Alignment Search Tool;Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.,215:403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲,为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源,需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外,对于核苷酸序列,包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外,12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物,以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此,核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本公开讲授了编码特定微生物蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的有益效果,技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此,如所附序列表中报道的完整序列,以及那些序列的如上文所定义的基本部分,均包括在本公开之内。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如,对于DNA,腺嘌呤与胸腺嘧啶互补而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此,与如所附序列表中报道的完整序列以及那些基本相似的核酸序列互补的分离的核酸片段,均包括在本公开之内。
术语“同源性”或“同源”可互换使用。它们指这样的核酸片段,即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指核酸片段的修饰,例如缺失或插入一个或多个核苷酸,相对于初始的未经修饰的核酸片段,所述修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此,正如本领域的技术人员应当理解的,本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。
此外,技术人员认识到,同源核酸序列也通过它们在中等严格条件(如0.5X SSC,0.1%SDS,60℃)下,与本文所例示的序列杂交的能力,或杂交至本文公开的核苷酸序列和与其功能相当的序列的任何部分的能力而被限定。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列),到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下,核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少两倍于背景)杂交,并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80%的序列同一性,或90%的序列同一性,最多并包括100%的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将会选择性杂交至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性,可鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择,可调节严格条件以允许序列中的一些错配,以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常,探针的长度少于约1000个核苷酸,任选长度少于500个核苷酸。
通常,严格条件将是如下那些条件:在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子,通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其它盐),并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃,而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含30至35%甲酰胺、1M NaCl、1%十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液中杂交,以及在50至55℃下用1X至2X SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中杂交,以及在55至60℃下用0.5X至1X SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下于50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中杂交,以及在60至65℃下用0.1X SSC洗涤。例如,另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1%SDS中于65℃下杂交,并用2X SSC、0.1%SDS洗涤,随后用0.1X SSC、0.1%SDS洗涤。
特异性通常取决于杂交后洗涤,最终洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。对于DNA-DNA杂交体,Tm可以用Meinkoth等人,Anal.Biochem.,138:267-284(1984)中的等式估算:Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度,%GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比,%form是杂交溶液中甲酰胺的百分比,而L是以碱基对表示的杂交体的长度。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50%的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1%的错配,Tm降低约1℃;因此,可调节Tm杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如,如果要寻求具有≥90%同一性的序列,则可将Tm降低10℃。通常,在确定的离子强度和pH下,严格条件选择为比特定序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而,极严格条件可采用在比Tm低1、2、3或4℃的温度下杂交和/或洗涤;中等严格条件可采用在比Tm低6、7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤;而低严格条件可采用在比Tm低11、12、13、14、15或20℃的温度下杂交和/或洗涤。利用所述等式、杂交和洗涤组合物以及所期望的Tm,本领域的技术人员将会理解,杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上进行了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液),则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的详尽指导可在见于下列文献:Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”,Elsevier,New York(1993);以及Current Protocols in Molecular Biology,第2章,Ausubel等人编辑,Greene Publishing和Wiley-Interscience,New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。
在核酸序列或多肽序列中的上下文中的“序列同一性”或“同一性”指在特定比较窗口上进行比对以寻求最大对应时两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。
因此,“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列而测得的值,其中在与参考序列(其不包含添加或缺失)进行比较时,比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即缺口)以实现两个序列的最佳比对。该百分比通过如下计算:测定相同核酸碱基或氨基酸残基在两个序列中出现的位置的数目,以获得匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数目并将所得结果乘以100而获得序列同一性百分比。
用于测定“同一性百分比”和“相似性百分比”的方法在被编码于可公开获得的计算机程序中。同一性百分比和相似性百分比可通过已知的方法容易地计算,所述方法包括但不限于下列中所述的那些:1)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,编辑)Oxford University:NY(1988);2)Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,编辑)Academic:NY(1993);3)Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编辑)Humania:NJ(1994);4)Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje,G.,编辑)Academic(1987);以及5)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑)Stockton:NY(1991)。
序列比对和同一性或相似性百分比可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定,这些方法包括但不限于LASARGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.,Madison,WI)的Megalign程序。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行,包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”(描述于Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989);Higgins,D.G.等人,Comput.Appl.Biosci.,8:189-191(1992))并可见于MegAlignTM(版本8.0.2)程序(参见上文)。用Clustal程序比对序列后,可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
就多重比对而言,采用Clustal V方法,默认值对应于空位罚分=10和空位长度罚分=10。使用Clustal V方法进行的成对比对和蛋白序列同一性百分比计算,默认参数为KTUPLE=1,空位罚分=3,窗口=5,DIAGONALS SAVED=5。就核酸而言,这些参数为KTUPLE=2,空位罚分=5,窗口=4,DIAGONALS SAVED=4。
使用Clustal W比对方法进行的多重比对的默认参数是:空位罚分=10,空位长度罚分=0.2,延迟分歧序列(Delay Divergent Seqs)(%)=30,DNA转换权重(Transition Weight)=0.5,蛋白质权重矩阵=Gonnet系列,DNA权重矩阵=IUB。
“BLASTN比对方法”是由美国国立生物技术信息中心[“NCBI”]提供的算法,采用默认参数比较核苷酸序列,而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法,采用默认参数比较蛋白质序列。
本领域的技术人员非常清楚,多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽,其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。适合的核酸片段,即根据本公开的分离的多核苷酸,编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约70-85%同一性的多肽,而更优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约85-95%同一性的氨基酸序列。尽管上文已描述了优选的范围,同一性百分比的可用的实例包括从50%至100%的任何整数百分比,例如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。此分离的核苷酸片段的任何全长或部分的互补序列也是受关注的。
合适的核酸片段不但具有上述同源性,而且通常编码具有至少50个氨基酸,优选至少100个氨基酸,更优选至少150个氨基酸,更优选至少200个氨基酸,最优选至少250个氨基酸的多肽。
“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此,本文描述了编码氨基酸序列全部或基本部分的任何核酸片段,其中所述氨基酸序列编码如SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:97、和SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:179所示的多肽。技术人员熟知特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定的氨基酸中表现出的“密码子偏好性”。因此,当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时,希望对基因进行设计,使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些寡核苷酸基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段,该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此,基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚性,可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子,则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如,在美国专利7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用谱。
术语“基因”是指表达特异性蛋白质的核酸片段,并且可以指单独的编码区或者可以包括在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因,包括在天然中不一起存在的调控序列和编码序列。因此,嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列,或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因,或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”是指位于编码序列上游(5’非编码序列)、中间、或下游(3’非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于:启动子、增强子、沉默子、5’非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译起始密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲,编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因,或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成,或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解,不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中,或者在不同的发育阶段,或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。导致基因在几乎所有发育阶段中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当认识到,由于在大多数情况下调控序列的确切边界(特别是它们的5’端)尚未完全确定,因此一些改变形式的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“3′非编码序列”、“转录终止子”和“终止序列”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时,它指初级转录物。当RNA转录物是来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列时,RNA转录物是指成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指不含内含子的、能被细胞翻译为蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补,并且是利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的,或者利用DNA聚合酶I的Klenow片段转换为双链形式的。“有义”RNA是指包括mRNA的能在细胞内或在体外被翻译为蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补的和阻碍靶基因的表达(美国专利5,107,065)的RNA转录物。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联,使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如,当启动子能够影响编码序列的表达时,即,该编码序列处于该启动子的转录控制下时,该启动子可操作地连接至该编码序列。编码序列可以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。
术语“重组体”是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段而实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。
如本文所用,术语“表达”是指有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指mRNA翻译成蛋白质(其为前体蛋白或成熟蛋白)。
“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中,导致在遗传上稳定遗传。例如,核酸分子可以是自主复制的质粒,例如,或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因的”、“重组的”、“转化的”或“转化体”生物。
术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件,并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状),其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体,该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。
术语“表达盒”是指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的DNA片段。一般而言,“表达盒”将包含所选基因的编码序列和所选基因产物的表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此,表达盒通常由下列组成:1)启动子序列;2)编码序列[“ORF”];和3)3′非翻译区(即终止子),所述非翻译区在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中,只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合,例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。因此,重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列,或源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体,则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将要用于转化宿主细胞的方法。例如可以使用质粒载体。
技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包含本文所述的任何分离的核酸片段的宿主细胞,必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到,不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人,EMBO J.,4:2411-2418(1985);DeAlmeida等人,Mol.Gen.Genetics 218:78-86(1989)),因此为了获得表现出所需表达水平和模式的菌株,必须对多个事件进行筛选。这样的筛选可以通过DNA的Southern印迹分析、mRNA表达的Northern印迹分析、蛋白表达的Western分析或表型分析等完成。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于:1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,WI);2)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-410,1990);3)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,WI);4)Sequencher(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI);和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.Methods Genome Res.,[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20。编辑:Suhai,Sandor.Plenum:New York,NY)。在这一描述中,除非另外指明,只要序列分析软件用于分析,分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989);Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984);以及Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience,Hoboken,NJ(1987)。
通常,含油微生物的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体。
油酸在其中转化为ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程涉及通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊延伸酶和去饱和酶。然而,如在图1中可见的和如下所述的,就特定ω-3/ω-6脂肪酸的生产而言,存在多种替代途径。
具体地讲,图1描述了下文所述的途径。所有途径都需要首先通过Δ12去饱和酶将油酸转化为亚油酸[“LA”]第一个ω-6脂肪酸。然后,利用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并以LA作为底物,形成长链ω-6脂肪酸如下:1)LA被Δ9延伸酶转化为二十碳二烯酸[“EDA”];2)EDA被Δ8去饱和酶转化为二高-γ-亚麻酸[“DGLA”];3)DGLA被Δ5去饱和酶转化为花生四烯酸[“ARA”];4)ARA被C20/22延伸酶转化为二十二碳四烯酸[“DTA”];和,5)DTA被Δ4去饱和酶转化为二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。
“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”还可使用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物生产长链ω-3脂肪酸如下:1)LA被Δ15去饱和酶转化为ALA第一个ω-3脂肪酸;2)ALA被Δ9延伸酶转化为二十碳三烯酸[“ETrA”];3)ETrA被Δ8去饱和酶转化为二十碳四烯酸[“ETA”];4)ETA被Δ5去饱和酶转化为二十碳五烯酸[“EPA”];5)EPA被C20/22延伸酶转化为二十二碳五烯酸[“DPA”];以及6)DPA被Δ4去饱和酶转化为二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地,ω-6脂肪酸可被转化为ω-3脂肪酸。例如,ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。
ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ6去饱和酶和C18/20延伸酶,即,“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲,LA和ALA可被Δ6去饱和酶分别转化为GLA和十八碳四烯酸[“STA”]。然后,C18/20延伸酶将GLA转化为DGLA和/或将STA转化为ETA。随后如上所述形成下游PUFA。
预期需要在特定宿主生物中导入用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA谱和/或去饱和酶/延伸酶谱)、底物的可利用性和所需的终产物。例如,在一些实施方案中优选的是Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径的表达,而不是Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径的表达,因为通过前面的途径产生的PUFA缺少GLA和/或STA。
本领域的技术人员将能够鉴定编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的多种候选基因。可用的去饱和酶和延长酶序列可源自任何来源,例如,分离自天然来源(来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等)、经由半合成途径产生或从头合成。尽管对引入宿主的特定来源的去饱和酶和延伸酶要求并不严格,选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特异性多肽需考虑的事项包括:1)所述多肽的底物特异性;2)所述多肽或其组分是否为限速酶;3)所述去饱和酶或延伸酶是否对所期望的PUFA的合成是必不可少的;4)所述多肽所需的辅因子;和/或5)所述多肽在其产生后是否被修饰(例如,通过激酶或异戊烯转移酶修饰)。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(更多细节参见美国专利7,238,482)。
考虑每种特定的去饱和酶和/或延长酶的转化效率也将是有用的。更具体地讲,由于每种酶极少能以100%的效率将底物转化成产物,宿主细胞所产生的未纯化的油脂的最终脂质谱将通常是由所期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此,当使所期望的脂肪酸的生物合成最优化时,每种酶的转化效率也是要考虑的变量。
考虑到上述各个需考虑的事项,具有适合的去饱和酶和延伸酶活性(如Δ6去饱和酶、C18/20延长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C14/16延长酶、C16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C20/22延长酶)的候选基因可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA的能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主生物中,以使该生物能合成PUFA或增强该生物的PUFA合成。
一旦脂肪酸在生物体内生成(包括饱和的和不饱和的以及短链的和长链的),它们即可被整合到三酰基甘油[“TAG”]中。TAG是脂肪酸的主要贮藏单位,它们通过一系列的反应形成,这些反应包括:1)在酰基转移酶介导下,一分子的酰基-辅酶A通过酯化反应被加至甘油-3-磷酸,从而产生溶血磷脂酸;2)在酰基转移酶介导下,通过第二个酰基-辅酶A分子的酯化反应生成1,2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸);3)通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸,从而生成1,2-二酰基甘油;4)在酰基转移酶作用下加入第三个脂肪酸以形成TAG。
尽管Δ5去饱和酶包含若干保守序列(即,三个组氨酸框[H(X)3-4H(SEQ ID NO:1和2),H(X)2-3HH(SEQ ID NO:3和4)和H/Q(X)2-3HH(SEQ ID NO:5和6)]以及细胞色素b5结构域),但只有血红素结合基序(即,His-Pro-Gly-Gly或者HPGG[SEQ ID NO:180])在序列内没有变异。首先被选作诱变靶标的正是这一基序。文献表明,HPGG基序内的组氨酸残基对功能是重要的(Sayanova,O.等人,Plant Physiol.,121:641(1999);Guillou,H.,等人,J.Lipid Res.,45:32-40(2004);Hongsthong,A.等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.,72:1192-1201(2006))。因此,避免了对组氨酸残基的取代,而代之以对脯氨酸和甘氨酸残基的取代。
在若干种Δ5去饱和酶的HPGG基序中,对脯氨酸和第二个甘氨酸各自进行了定点诱变,然后表达了所得到的突变多肽,并测定了它们相对于野生型酶的活性。出人意料地,产生了包括HXGG(SEQ ID NO:181)和HPGX(SEQ ID NO:182)的包含氨基酸突变基序的多种突变Δ5去饱和酶,其中突变Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性与对应的野生型Δ5去饱和酶的Δ5去饱和酶活性功能上等同。
寡核苷酸介导的定点诱变被用于在多种靶标Δ5去饱和酶的HPGG基序中产生特定的点突变。存在多种定点诱变规程(例如,Ishii,T.M.,等人,Methods Enzymol.,293:53-71(1998);Ling M.M.和B.H.Robinson,Anal.Biochem.,254:157-178(1997);Braman J.(编辑)In Vitro Mutagenesis Protocols.2nd Ed.,Humania:Totowa,NJ(2002);Kunkel T.A.,等人,Methods Enzymol.,154:367-382(1987);Sawano A.和Miyawaki,A.Nucleic Acids Res.,28:e78(2000));但是,选择了QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)使用,这是基于该试剂盒的易操作和高效率。基本程序利用了超螺旋双链DNA载体以及所需的插入序列和两个包含所需突变的合成低聚核苷酸引物。每个低聚核苷酸引物与载体的反链互补,在温度循环过程中被DNA聚合酶延伸。结合低聚核苷酸引物产生包含交错切口的突变质粒。在温度循环后用Dpn I核酸内切酶(甲基化和半甲基化DNA特异性的)处理产物,以此作为消化亲本DNA模板并选择新合成的突变DNA的方法。然后用包含所需突变的带切口的载体DNA转化大肠杆菌宿主并在其中增殖。
利用上述技术,所有可能的氨基酸取代均通过定点诱变被引入合成的Δ5去饱和酶,所述合成的Δ5去饱和酶来源于小眼虫,并且其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即,EgD5S;SEQ ID NO:10;美国专利申请公布2007-0277266-A1),所述合成的Δ5去饱和酶被编码于包含嵌合基因FBAIN::EgD5S::Pex20的质粒构建体内。突变体被转入大肠杆菌、测序,然后被转入事先被改造为产生~18%DGLA的适合的解脂耶氏酵母菌株中。如此使得能够基于GC分析和ARA的产量对Δ5去饱和酶活性进行筛选。
许多突变被发现导致完全不具备功能的突变Δ5去饱和酶(即不具有可检测到的Δ5去饱和酶活性)或相对于非突变的野生型酶具有基本上降低的Δ5去饱和酶活性的突变Δ5去饱和酶。然而,出人意料地,初步筛选鉴定到了三种能取代HPGG基序中的脯氨酸,并且在突变体中导致与对应的野生型酶(即EgD5S)的Δ5去饱和酶活性相比大约等同的或者提高的Δ5去饱和酶活性的氨基酸残基。因此,该初步实验表明,HPGG基序内的脯氨酸残基能够被几种氨基酸取代而不会显著地影响EgD5S的Δ5去饱和酶活性。
在定点诱变反应中用EgD5S作为模板进行了类似的实验,其中HPGG基序的第二个甘氨酸被突变。如上所述,对突变酶的分析确认,有2种氨基酸残基能够取代野生型氨基酸(即甘氨酸)并产生具有等同的或提高的Δ5去饱和酶活性的突变EgD5S酶。
对EgD5S的HPGG基序中的氨基酸取代的初步分析如上文所述完成之后,即通过将每一包含突变EgD5S的质粒再转化进解脂耶氏酵母宿主菌株,对以等于或高于野生型EgD5S的转化率进行生产的那些突变体进行了定量分析。对产生的脂肪酸甲酯[“FAME”]的GC分析证实,最初的五种突变体中的三种与对应的野生型EgD5S对照相比表现出提高的Δ5去饱和酶活性。
利用来自Euglena anabaena且针对在解脂耶氏酵母中的表达进行过密码子优化的合成的Δ5去饱和酶(即,EaD5S;SEQ ID NO:14;美国专利申请公布2008-0274521-A1)和来自多甲藻属未定名种CCMP626且针对在解脂耶氏酵母中的表达进行过密码子优化的合成的Δ5去饱和酶(即,RD5S;SEQ ID NO:18;美国专利申请公布2007-0271632-A1),重复应用了上述实验规程。在突变体中导致与对应的野生型酶(即EgD5S、EaD5S或RD5S)相比等同的或提高的Δ5去饱和酶活性的全部定点诱变的结果总结在下面的表3中(更多细节参见实施例)。突变体利用下列命名法命名,具体为:1)野生型酶;2)连字符(-);3)突变HPGG基序。因此,例如,从密码子优化的合成的EgD5S(即,SEQ ID NO:10)产生的、在HPGG基序的氨基酸2具有组氨酸对脯氨酸的取代(即,P2至H的取代)的突变酶,被标识为EgD5S-HHGG。
表3:导致提高的Δ5去饱和酶活性的HPGG基序突变体
*所报告的突变酶相对于对应的非突变的野生型酶Δ5去饱和酶活性升高的%是基于最初的分析结果而非定量分析。
关于哪种特定的氨基酸取代足以产生具有升高的Δ5去饱和酶活性的突变多肽,从上述数据中并不能得出共识。但是,与上文曾提及的本领域中的报道相反,上述数据出人意料地证明,对脯氨酸或甘氨酸残基的取代可产生具有比其野生型亲本更高的Δ5去饱和酶活性的酶。因此,提供具有Δ5去饱和酶活性的多肽属于本发明的范围内,其中所述多肽包含选自下列的氨基酸基序:SEQ ID NO:183(HGGG),SEQ ID NO:184(HHGG),SEQ ID NO:186(HCGG),SEQ ID NO:187(HWGG)和SEQ ID NO:185(HPGS)。优选地,所述多肽具有选自下列的氨基酸序列:SEQ ID NO:58(EgD5S-HGGG和EgD5S-HHGG),SEQ ID NO:97(EgD5S-HPGS),SEQ ID NO:139(EaD5S-HCGG)和SEQ ID NO:179(RD5S-HCGG和RD5S-HWGG)。更优选,所述突变Δ5去饱和酶:1)包含选自下列的突变氨基酸基序:SEQ ID NO:183(HGGG),SEQ ID NO:184(HHGG),SEQ ID NO:186(HCGG),SEQ ID NO:187(HWGG)和SEQ ID NO:185(HPGS);并且2)突变Δ5去饱和酶相对于具有HPGG(SEQ ID NO:180)氨基酸基序的对应的野生型Δ5去饱和酶活性升高。
本领域的技术人员将认识到,有用的Δ5去饱和酶不限于以上所述的突变。相反,上述结果表明,利用在细胞色素b5结构域内具有HPGG(SEQ ID NO:180)基序的任何Δ5野生型去饱和酶,能够进行类似的实验,从而构建具有升高的Δ5去饱和酶活性的突变Δ5去饱和酶,其中突变将产生突变的HXGG基序(SEQ ID NO:181)或HPGX(SEQ ID NO:182)基序。对于使ω-3/ω-6脂肪酸的生产的提高成为可能,具有升高的Δ5去饱和酶活性的突变酶能够是有用的。
例如,体外诱变和选择或者易错PCR(Leung等人,Techniques,1:11-15(1989);Zhou等人,Nucleic Acids Res.,19:6052-6052(1991);Spee等人,Nucleic Acids Res.,21:777-778(1993);Melnikov等人,Nucleic Acids Res.,27(4):1056-1062(February 15,1999))也能被用作获得天然存在的Δ5去饱和酶基因(例如EgD5S、EaD5S或RD5S)的突变的方法,其中所述突变可包括删除、插入和点突变,或它们的组合。易错PCR的主要优点是,通过该方法引入的所有突变都将位于所期望的去饱和酶基因内,并且任何改变均可容易地通过改变PCR条件加以控制。作为另外一种选择,利用可商购获得的材料,可以采用体内诱变,所述材料例如来自Stratagene(La Jolla,CA;Greener和Callahan,Strategies,7:32-34(1994))的大肠杆菌XL1-Red菌株和Epicurian coli XL1-Red增变菌株。该菌株缺少了三条主要的DNA修复途径(mutS,mutD和mutT),导致比野生型高5000倍的突变率。体内诱变不依赖连接效率(如采用易错PCR那样);但是,突变可发生在载体的任何区域,并且突变率总体上要低得多。
同样预期,具有改变的或增强的Δ5去饱和酶活性的突变Δ5去饱和酶可使用“基因改组”方法(美国专利5,605,793;美国专利5,811,238;美国专利5,830,721;美国专利5,837,458)构建。基因改组方法尤其具有吸引力,因为它易于实施并且具有高诱变率。基因改组的过程涉及将所关注的基因限制性酶切为特定大小的片段,酶切在另外的DNA区域的群体存在下进行,与所关注的基因相似的(或不同的)DNA区域均包括在所述群体中。上述片段的集合将变性,然后退火,以产生突变的基因。然后就改变的活性对突变的基因进行筛选。任何的这些方法可被用于产生具有取代的HXGG(SEQ ID NO:181)和HPGX(SEQ ID NO:182)基序的突变Δ5去饱和酶,然后可以利用本文所述的方法,就升高的活性对所述突变Δ5去饱和酶进行筛选。
预期在适合的启动子控制下,编码本文所述的突变Δ5去饱和酶(即,其中所述突变Δ5去饱和酶在编码HPGG氨基酸基序的区域包含至少一个突变,并且其中所述突变Δ5去饱和酶相对于对应的野生型Δ5去饱和酶具有升高的Δ5去饱和酶活性)的嵌合基因的引入,将在转化的宿主生物内分别导致ARA和/或EPA的提高的生产。如此,本文公开了用于直接生产PUFA的方法,所述方法包括将脂肪酸底物(即,DGLA和/或ETA)暴露给本文所述的突变去饱和酶(例如,SEQ ID NO:58[EgD5S-HGGG和EgD5S-HHGG],SEQ ID NO:97[EgD5S-HPGS],SEQ ID NO:139[EaD5S-HCGG],SEQ ID NO:179[RD5S-HCGG和RD5S-HWGG]),使得所述底物被转化为所期望的脂肪酸产物(即,分别为ARA和/或EPA)。
更具体地讲,本文描述了用于在微生物宿主细胞(例如,细菌、酵母、藻类、眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌)中生产ARA的方法,其中所述微生物宿主细胞包含:
a)具有Δ5去饱和酶活性的多肽,所述多肽包含选自下列的氨基酸基序:SEQ ID NO:183(HGGG),SEQ ID NO:184(HHGG),SEQ ID NO:186(HCGG),SEQ ID NO:187(HWGG)和SEQ ID NO:185(HPGS);和,
b)DGLA源;
其中所述宿主细胞在使得所述突变Δ5去饱和酶被表达并且DGLA被转化为ARA的条件下生长,并且其中ARA任选地被回收。
在本文所述的另一方法中,突变Δ5去饱和酶可被用于ETA向EPA的转化。相应地,给出了用于生产EPA的方法,其中所述宿主细胞包含:
a)具有Δ5去饱和酶活性的多肽,所述多肽包含选自下列的氨基酸基序:SEQ ID NO:183(HGGG),SEQ ID NO:184(HHGG),SEQ ID NO:186(HCGG),SEQ ID NO:187(HWGG)和SEQ ID NO:185(HPGS);并且,
b)ETA源;
其中所述宿主细胞在使得所述突变Δ5去饱和酶被表达并且ETA被转化为EPA的条件下生长,并且其中EPA任选地被回收。
作为另外一种选择,本文所述的每种突变Δ5去饱和酶基因及其对应的酶产物能被直接用于各种ω-6和ω-3PUFA的生产(参见图1;美国专利7,238,482;国际申请公布WO 2007/136671和国际申请公布WO 2007/136646)。当其中脂肪酸底物通过中间步骤或通过途径的中间产物间接转化为所期望的脂肪酸产物,发生了ω-3/ω-6PUFA的间接生产。因此,预期本文所述的突变Δ5去饱和酶可与编码PUFA生物合成途径的酶(例如,Δ6去饱和酶,C18/20延伸酶,Δ17去饱和酶,Δ8去饱和酶,Δ15去饱和酶,Δ9去饱和酶,Δ12去饱和酶,C14/16延伸酶,C16/18延伸酶,Δ9延伸酶,Δ5去饱和酶,Δ4去饱和酶,C20/22延伸酶)的另外的基因结合表达,以导致更高水平的长链ω-3/ω-6脂肪酸生产,所述长链ω-3/ω-6脂肪酸例如ARA、EPA、DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA。
优选地,本文所述的Δ5去饱和酶将最低限度地与Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶结合表达。所述Δ5去饱和酶也可最低限度地与Δ6去饱和酶和Δ6延伸酶结合表达。然而,包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞(及其PUFA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。
有必要构建包含编码突变Δ5去饱和酶(即,其中所述突变体包含选自下列的氨基酸基序:SEQ ID NO:183(HGGG),SEQ ID NO:184(HHGG),SEQ ID NO:186(HCGG),SEQ ID NO:187(HWGG)和SEQ ID NO:185(HPGS))的ORF的重组构建体并将其引入适当的宿主细胞。本领域的技术人员知道标准的来源材料,所述材料描述:1)用于构建、操作和分离高分子,例如DNA分子、质粒等,的具体条件和规程;2)重组DNA片段和重组表达构建体的产生;以及3)克隆的筛选和分离。参见:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989)(下文称为“Maniatis”);Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984);以及Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版,Hoboken,NJ(1987)。
一般来讲,存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。技术人员知道必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞的遗传因子。然而,通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。适合的载体包含控制转录启动的基因的5′区域(即启动子)、基因编码序列和控制转录终止的DNA片段的3′区域(即终止子)。最优选地,两个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因,尽管它们无需来源于对生产宿主是天然的基因。
对驱动本发明的Δ5去饱和酶ORF在所期望的微生物宿主细胞中的表达有用的转录启动控制区(启动控制区或启动子也一样)是为人们所熟知的。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3’UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的长度和特异性可以不同。事实上,能够指导这些基因在所选择的宿主细胞中的表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)都是适合的,但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。在宿主细胞中的表达可以以诱导型或组成型的方式实现。诱导型表达通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调控启动子的活性而发生,而组成型表达通过使用组成型启动子而发生。
当宿主细胞是酵母时,提供了酵母细胞中的功能性转录和翻译区域,尤其是从宿主菌种提供。参见,例如,美国专利申请公布2006-0115881-A1,对应于针对用于解脂耶氏酵母中的优选的转录起始调节区的国际申请公布WO 2006/052870。可以使用许多调控序列的任意一种,这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等。
已经发现围绕翻译起始密码子‘ATG’的核苷酸序列影响酵母细胞的表达。如果所需多肽在酵母中表达差,则可以修饰外源基因的核苷酸序列以包括有效的酵母翻译起始序列来获得最佳的基因表达。对酵母中的表达而言,这可以通过使无效表达基因框内融合至内源酵母基因(优选高度表达的基因)而使其定点诱变来完成。作为另外一种选择,可以测定宿主中的共有翻译起始序列并将该序列引入异源基因中,以便它们在所关注宿主中最优化表达。
编码转录终止区域的3′非编码序列可以在重组构建体中提供,并且可以来自所述起始区域所来自的基因的3′区域或者来自不同的基因。大量的终止区是已知的,并且在用于与它们所源自的属和物种相同的和不同的属和物种时,在多种宿主中令人满意地起作用。终止区也可以源于优选宿主的多种天然基因。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。3′-区也可以是合成的,因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止位点可以是非必需的,但是是高度优选的。
仅仅将基因插入克隆载体并不能保证它以所期望的速度、浓度、量等表达。作为对高表达速度的需求的响应,通过调节控制着转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和定位、氧气限制和从微生物宿主细胞的分泌的特定性质,构建了许多专门的表达载体。这些性质包括:相关转录启动子和终止子序列的性质;所克隆基因的拷贝数目(其中可以在单个表达构建体中克隆另外的拷贝和/或将另外的拷贝通过增加质粒拷贝数或通过将克隆基因多次整合进基因组中来引入宿主细胞中);基因是质粒携带的还是整合进了宿主细胞的基因组中;所合成的外来蛋白质的最终细胞定位;蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率;所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性;以及所克隆基因中的密码子使用,使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些性质每种均可被用于本文所述的方法和宿主细胞中,以进一步优化所述突变Δ5去饱和酶的表达。
构建了包含至少一种包含启动子、Δ5去饱和酶ORF和终止子的嵌合基因的重组构建体之后,将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中,或者使其直接整合进宿主细胞的基因组。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向,即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座,则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达,则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其他构建体的同源性以便保持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择,以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
包含所关注的基因的构建体可以通过任何标准技术导入微生物宿主细胞中。这些技术包括转化如醋酸锂转化(Methods in Enzymology,194:186-187(1991))、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射或将所关注的基因导入宿主细胞中的任何其他方法。
为方便起见,已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞,在本文中将称为“转化的”、“转化体”或“重组体”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体,并且可以具有两个或更多个拷贝,这取决于该表达盒是整合到基因组内的、被扩增的、还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞能通过就所导入的构建体上包含的标记进行的选择得到鉴定。作为另外一种选择,单独的标记构建体可与所期望的构建体进行共转化,该方法与将多种DNA分子导入宿主细胞的多种转化技术一样。
典型地,就转化的宿主在选择性培养基上生长的能力对它们进行选择,所述选择性培养基可掺入了抗生素或缺少未被转化的宿主生长所必需的因子,例如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性,或编码必需的生长因子或酶,从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。更多的选择技术描述于美国专利7,238,482、美国专利7,259,255和国际申请公布WO 2006/052870中。
转化后,适合本发明的突变Δ5去饱和酶(以及任选地,在宿主细胞中共表达的其他PUFA酶)的底物可以由宿主天然地产生或通过转基因产生,或者它们可以由外部来源提供。
多种真核生物,包括细菌、酵母、藻类、原生藻菌、卵菌、眼虫和/或真菌,适合作为宿主,从而产生包含如本文所述的突变Δ5去饱和酶的转化体。这种预期是因为转录、翻译和蛋白质生物合成的装置是高度保守的。因此,适合的宿主可包括在包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油脂、甘油和醇类和/或碳氢化合物的多种原料上于广泛的温度和pH值范围内生长的那些宿主。
优选的微生物宿主是含油生物。这些含油生物天然能够合成并积聚油脂,其中总油脂含量可占干细胞重量的超过约25%,更优选占干细胞重量的超过约30%,最优选占干细胞重量的超过约40%。多种细菌、藻类、眼虫、苔藓、真菌、酵母和原生藻菌被天然地分类为含油的。在替代实施方案中,能对非含油生物进行基因修饰,使之变成含油的,例如酵母如啤酒糖酵母。
在更优选的实施方案中,微生物宿主细胞是含油酵母。通常被鉴定为含油酵母的属包括但不限于:耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲,示例性的油合成酵母包括:圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(Lipomyces lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、牧草红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(以前被分类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。作为另外一种选择,可以通过基因工程进行油脂的生物合成,使得微生物宿主细胞(例如酵母)产生多于25%细胞干重的油脂,从而被认为是含油的。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母。在另一个实施方案中,最优选的是命名为ATCC #20362、ATCC #8862、ATCC #18944、ATCC #76982和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.,Bioresour.Technol.,82(1):43-9(2002))。
可用于转化含油酵母(即解脂耶氏酵母)的具体教导内容包括美国专利4,880,741和美国专利5,071,764,以及Chen,D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.,48(2):232-235(1997))。美国专利申请11/264784(国际申请公布WO 2006/055322)、美国专利申请11/265761(国际申请公布WO 2006/052870)和美国专利申请11/264737(国际申请公布WO 2006/052871)中分别提供了用于在解脂耶氏酵母中建立ARA、EPA和DHA生产的具体教导。
在这种酵母中表达基因的优选方法是将线性DNA整合到宿主的基因组中。当期望基因高水平表达时,整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的,例如整合到Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3:GenBank登录号XP_503244;或,Aco3:GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(美国专利7,214,491)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)、Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)、SCP2基因座(GenBank登录号AJ431362)、Pex3基因座(GenBank登录号CAG78565)、Pex16基因座(GenBank登录号CAG79622)和/或Pex10基因座(GenBank登录号CAG81606)。
用于解脂耶氏酵母中的优选的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性,以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。5-氟乳清酸(一水5-氟尿嘧啶-6-羧酸;“5-FOA”)对于酵母Ura-突变体(美国专利申请公布2009-0093543-A1)也可以是特别有用的,或者可利用赋予磺酰尿类除草剂抗性的天然乙酰羟酸合酶(或乙酰乳酸合酶;E.C.4.1.3.18)(国际申请公布WO 2006/052870)进行对转化体的选择。美国专利申请公布2009-0093543-A1中还教导了一种独特的方法,该方法通过使用位点特异性重组酶体系,“循环利用”一对优选的选择标记,用于连续进行的多重转化中。
基于以上所述,本文公开了分别生产ARA或EPA的方法,所述方法包括:
(a)提供一种含油酵母(例如解脂耶氏酵母),其包含:
(i)编码突变Δ5去饱和酶多肽的第一重组核苷酸分子,该核苷酸分子可操作地连接至至少一种调控序列;并且,
(ii)分别由DGLA和/或ETA组成的去饱和酶底物源;并且,
(b)在适合的可发酵碳源的存在下使步骤(a)的酵母生长,其中编码所述突变Δ5去饱和酶多肽的基因得到表达而且分别将DGLA转化为ARA和/或将ETA转化成EPA;并且,
(c)任选地,分别回收步骤(b)中的ARA和/或EPA。
可能需要供给底物。在优选的实施方案中,所述突变Δ5去饱和酶多肽选自SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:179。因此,例如,编码所述突变Δ5去饱和酶多肽的基因的核苷酸序列可以,例如,选自SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:195。
由于含油酵母中天然产生的PUFA仅限于18:2脂肪酸(即LA)和通常较少的18:3脂肪酸(即ALA),除了本文所述的突变Δ5去饱和酶之外,还可对含油酵母进行基因工程改造以表达多种长链PUFA生物合成所必需的酶(从而使得例如DPAn-6、DPA和DHA的生产成为可能)。
具体而言,本文设想了一种含油酵母,其中所述酵母包含:
a)包含编码突变Δ5去饱和酶多肽的分离的多核苷酸的第一重组DNA构建体,其中所述多核苷酸可操作地连接至至少一种调控序列;和
b)包含分离的多核苷酸的至少一种附加的重组DNA构建体,其中所述多核苷酸可操作地连接至至少一种调控序列,并且编码选自下列的多肽:Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶。
其他适合的微生物宿主包括含油的细菌、藻类、眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。在该宽泛的微生物宿主群体中,特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物,或者那些能经过基因工程改造而达到该目的的微生物(例如,其它酵母如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae))。因此,例如,用处于诱导型或调节型启动子控制下的任何本发明的Δ5去饱和酶基因转化高山被孢霉(Mortierella alpina)(其在商业上被用于生产ARA),能够产生能合成增加量的ARA的转化生物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.,66:4655(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。类似地,美国专利7,001,772中公开了用于转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物(例如,破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法。
无论选择用什么宿主表达本文所述的突变Δ5去饱和酶,为了获得表现出所需表达水平和模式的菌株,必须筛选多个转化子。例如,Juretzek等人(Yeast,18:97-113(2001)提出,整合的DNA片段在解脂耶氏酵母中的稳定性取决于具体的转化体、受体菌株和所用的靶向平台。此类筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern,J.Mol.Biol.,98:503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek,J.Chromatogr.Biomed.Appl.,618(12):133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。
对于在多种宿主细胞中操纵ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成,有关本发明的突变Δ5去饱和酶序列的知识将是有用的。操纵生化途径的方法是本领域的技术人员所熟知的;并且,预期可能进行多项操纵以最大化在含油酵母尤其是解脂耶氏酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造,或者需要另外对为PUFA生物合成途径提供碳的途径进行操纵。可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的方法是本领域技术人员熟知的。
例如,与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物生产的天然PUFA生物合成途径中的酶,可以通过基因破坏被去除或通过其他手段(例如反义mRNA)被下调。
对于作为提高ARA、EPA或DHA生产的方法的对PUFA生物合成途径的操纵及其相关技术的详细讨论,分别存在于国际申请公布WO 2006/055322[美国专利申请公布2006-0094092-A1]、国际申请公布WO 2006/052870[美国专利申请公布2006-0115881-A1]和国际申请公布WO 2006/052871[美国专利申请公布2006-0110806-A1]中,所期望的对TAG生物合成途径和TAG降解途径的操纵(及其相关技术)同样见于上述文献。
通过任何一种上述策略调节脂肪酸生物合成途径的表达都可能是有用的。例如,本文提供了方法,根据所述方法,编码Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶生物合成途径和Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶生物合成途径的关键酶的基因被导入含油酵母以生产ω-3和/或ω-6脂肪酸。利用对宿主生物进行代谢工程改造的多种方法,使本发明的突变Δ5去饱和酶基因在天然地不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径的含油酵母中表达并协调这些基因的表达,以使优选的PUFA产物的生产最大化,将是特别有用的。
使转化的微生物宿主细胞在使嵌合基因(例如,去饱和酶、延伸酶)的表达最优化并且产生的所期望的PUFA的产率最大且最经济的条件下生长。通常,可以被优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油脂积聚期的时长以及收获细胞的时间和方法。通常使所关注的微生物,例如含油酵母(如解脂耶氏酵母),在复合培养基,例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基[“YPD”],或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择所需表达盒的最低限定培养基(例如,Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories,Detroit,MI))中生长。
用于本文所述的方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含适当的碳源,例如美国专利7,238,482中所教导的。尽管预期本文的方法利用的碳源可包括广泛种类的含碳源,优选的碳源是糖类(例如葡萄糖)、甘油和/或脂肪酸。
氮可以由无机源(例如(NH4)4SO2)或有机源(例如尿素或谷氨酸盐)提供。除了合适的碳源和氮源,发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其他组分。特别注意的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子,例如Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2和Mg+2(Nakahara,T.等人,Ind.Appl.Single Cell Oils,D.J.Kyle和R.Colin,编辑第61-97页(1992))。
用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基,如酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base,DIFCO Laboratories,Detroit,MI)。也可以使用其他确定成分的生长培养基或合成的生长培养基,适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间,其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行,其中优选为微氧条件。
通常,在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程,由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此,最优选地,两阶段发酵过程是在含油酵母(例如解脂耶氏酵母)中产生PUFA所必需的。这种方法,以及多种适合的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项,描述于美国专利7,238,482中。
PUFA可以游离脂肪酸或以酯化的形式(例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂)存在于宿主微生物中,并且可以通过本领域熟知的多种手段从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology,12(5/6):463-491(1992))的综述。A.Singh和O.Ward提供了关于下游加工过程的简要综述(Adv.Appl.Microbiol.,45:271-312(1997))。
一般而言,用于纯化PUFA的方法可包括用有机溶剂萃取(例如,美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(例如使用二氧化碳)、皂化和物理方法如挤压,或它们的组合。更多细节参见美国专利7,238,482。
存在众多的掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸,尤其例如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA,的食物和饲料产品。预期包含长链PUFA的微生物量、部分纯化的包含PUFA的微生物量、纯化的包含PUFA的微生物油和/或纯化的PUFA将在食物和饲料产品中起作用以赋予该制剂健康益处。更具体地讲,包含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油脂将适合在多种食物和饲料产品中使用,所述产品包括但不限于:食物类似物、肉制品、谷类制品、烘焙食品、快餐食品和乳制品(详见美国专利申请公布2006-0094092)。
本发明的组合物可用于医疗食物的配方中以使其具有健康有益效果,所述医疗食物包括医疗营养品、膳食补充剂、婴儿代乳品以及药物。食物加工和食物配制领域的技术人员将了解所述各种油的量和组成如何加入到食物或饲料产品中。该量在本文中将称为“有效”量并将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品旨在纠正或治疗的医学状况。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明,所述实施例示出了实施本发明的简要方法,但不完全限定其所有可能变型。
一般方法
实施例中使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述于:1)Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1989)(Maniatis);2)T.J.Silhavy,M.L.Bennan,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions;Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY(1984);和3)Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版,Hoboken,NJ(1987)。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下述实施例的技术可在Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt,R.G.E.Murray,Ralph N.Costilow,Eugene W.Nester,Willis A.Wood,Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips,编辑),American Society for Microbiology:Washington,D.C.(1994));或者Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版,Sinauer Associates:Sunderland,MA(1989)的描述中找到。用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、DIFCO Laboratories(Detroit,MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg,MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis,MO),除非另外指明。大肠杆菌菌株通常于37℃下在Luria Bertani[“LB”]平板上生长。
一般的分子克隆按照标准方法(Sambrook等人,同上)进行。使用载体和插入-特异性引物,利用末端标记技术(美国专利5,366,860;EP 272,007),在ABI自动测序仪上获得DNA序列。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。基因序列的比较是使用DNASTAR软件(DNAStar Inc.,Madison,WI)来完成。
缩写的含义如下:“sec”表示秒,“min”表示分钟,“h”或“hr”表示小时,“d”表示天,“μL”表示微升,“mL”表示毫升,“L”表示升,“μM”表示微摩尔每升,“mM”表示毫摩尔每升,“M”表示摩尔每升,“mmol”表示毫摩尔,“μmole”表示微摩尔,“g”表示克,“μg”表示微克,“ng”表示纳克,“U”表示单位,“bp”表示碱基对以及“kB”表示千碱基。
表达盒的命名:
表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示,其中X描述启动子片段,Y描述基因片段而Z描述终止子片段,它们均彼此可操作地连接。
解脂耶氏酵母的转化和培养:
具有ATCC保藏号#20362、#76982和#90812的解脂耶氏酵母菌株购自美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)。根据下文所述方法,解脂耶氏酵母菌株通常于28℃至30℃下在几种培养基中生长。根据标准方法,按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。
YPD琼脂培养基(每升):10g酵母提取物[Difco],20g蛋白胨(Bacto)[Difco];以及20g葡萄糖。
基本培养基(MM)(每升):20g葡萄糖;1.7g不含氨基酸的酵母氮源;1.0g脯氨酸;并且pH为6.1(未调节)。
基本培养基+亮氨酸(MM+亮氨酸或MMLeu)(每升):如上制备MM培养基并添加0.1g亮氨酸。
高葡萄糖培养基(HGM)(每升):80glucose、2.58g KH2PO4和5.36gK2HPO4,pH 7.5(不需要调节)。
解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公布2009-0093543-A1所述进行,该专利以引用方式并入本文。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析:
对于脂肪酸分析,通过离心收集细胞并如Bligh,E.G.& Dyer,W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-917(1959))所述提取脂质。脂肪酸甲基酯[“FAMES”]通过脂质提取物和甲醇钠之间的酯交换反应制备(Roughan,G.和Nishida I.,Arch Biochem Biophys.,276(1):38-46(1990)),然后用配备30m×0.25mm(i.d.)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890GC进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应,收获耶氏酵母培养物(3mL),在蒸馏水中洗涤一次,并在Speed-Vac中真空干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μL,1%)加入样本中,然后将样本涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后,涡旋振荡并离心样本。移出上层并如上所述用GC进行分析。
解脂耶氏酵母菌株Y4036U的构建
描述于国际申请公布WO 2008/073367中的解脂耶氏酵母菌株Y4036U(Leu-,Ura-)在下文的实施例2-4、6-7和9中被用作宿主。
菌株Y4036U的开发需要菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17%EDA,具有Leu-表型)、菌株Y4001U1(产生17%EDA,具有Leu-和Ura-表型)和菌株Y4036(产生18%DGLA,具有Leu-表型)的构建。
菌株Y4036U相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终基因型如下:GPD::FmD12::Pex20,YAT1::FmD12::Oct,YAT1::ME3S::Pex16,GPAT::EgD9e::Lip2,EXP1::EgD9eS::Lip,FBAINm::EgD9eS::Lip2,FBAINm::EgD8M::Pex20(其中FmD12为串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶基因[国际申请公布WO 2005/047485];ME3S是密码子优化的C16/18延伸酶基因,来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[国际申请公布WO 2007/046817];EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[国际申请公布WO 2007/061742];EgD9eS是密码子优化的Δ9延伸酶基因,来源于小眼虫[国际申请公布WO 2007/061742];EgD8M是合成的突变Δ8去饱和酶[国际申请公布WO 2008/073271],来源于小眼虫[美国专利7,256,033])。
实施例1
包含EgD5S的构建体pDMW369
本实施例描述了质粒pDMW369,该质粒包含嵌合基因FBAIN::EgD5S::Pex20(质粒的构建描述于国际申请公布WO 2007/136671中)。质粒pDMW369(图2A;SEQ ID NO:19)包含下列组分:
表7:质粒pDMW369(SEQ ID NO:19)的组分
实施例2
导致EgD5S中升高的Δ5去饱和酶活性的HXGG突变的鉴定
以pDMW369(实施例1)作为模板,使用19对寡核苷酸(SEQ ID NO:20-57;表8)作为引物,通过定点诱变(QuickChange Kit,Stratagene,CA)单独地使EgD5S(SEQ ID NO:10)的HPGG基序的脯氨酸残基突变,进行了单氨基酸突变,从而产生全部可能的氨基酸取代(即,His-Xaa-Gly-Gly[HXGG]突变体,其中Xaa可以为任何氨基酸)。包含每一突变的质粒被转入大肠杆菌XL2Blue细胞(Stratagene)中。从19个转化中的每一个挑出四个菌落,并使其在液体培养基中于37℃单独生长过夜。从这些培养物中分离质粒(即,总计76种)并单独测序,以确定突变。
野生型pDMW369质粒和上述分离的突变质粒被单独地转入菌株Y4036U,如一般方法部分所述。在MMLeu平板上选择转化株。于30℃生长2天之后,来自每一转化反应的两个转化子被划线至新的MMLeu平板上,并于30℃再孵育2天。然后将菌落接种至24孔Qiagen板中的3mL MMLeu。上述板被置于30℃培养箱中孵育,以200rpm摇动。将上述培养物孵育2天后,离心上述板,移除上清液并加入3mL HGM。上述板被放回30℃培养箱中,以200rpm再摇动5天。通过离心收集细胞,提取脂质,并通过酯交换制备了FAME,然后用Hewlett-Packard 6890GC进行了分析。
归因于HPGG基序内每一突变的Δ5去饱和酶活性总结于下文的表8中。EgD5S突变体根据突变HXGG基序的序列命名(即,突变体EgD5S-HAGG的HPGG基序具有P2至A的取代,从而产生His-Ala-Gly-Gly[HAGG]基序,而突变体EgD5S-HRGG具有P2至R的取代,等等)。转化效率按照下列公式测定:([产物]/[底物+产物])*100。结果被用于与质粒pDMW369内的野生型EgD5S(SEQ ID NO:10)的结果比较,其中GC分析测得转化体产生了占总脂质8.8%的DGLA和4.5%的ARA(即,平均转化效率为33.8%)。
表8:EgD5S和HXGG基序突变体中的Δ5去饱和酶活性
*每一EgD5S基因(突变或野生型)在pDMW369内表达。
**ND:该实验中未获得突变体。
基于以上所述,显然HPGG基序内的脯氨酸残基能被若干种氨基酸取代而基本不会影响EgD5S的Δ5去饱和酶活性。优选的脯氨酸取代存在于EgD5S-HGGG(33.6%转化效率)和EgD5S-HYGG(34.6%转化效率)中,其中相对于EgD5S,Δ5去饱和酶活性是相等的或升高的。EgD5S-HHGG(32.8%转化效率)以EgD5S 97%的Δ5去饱和酶活性发挥作用。
实施例3
导致EgD5S中升高的Δ5去饱和酶活性的HPGX突变的鉴定
以pDMW369(实施例1)作为模板,使用19对寡核苷酸(SEQ ID NO:59-96;表9)作为引物,通过定点诱变(QuickChange Kit,Stratagene,CA)单独地使EgD5S(SEQ ID NO:10)的HPGG基序的第二个甘氨酸残基突变,进行了单氨基酸突变,从而产生全部可能的氨基酸取代(即His-Pro-Gly-Xaa[HPGX]突变体)。诱变之后,质粒被转入Y4036U,选择转化体并生长于MMLeu和HGM中,制备了FAME并通过GC进行了分析,如实施例2中所述。
归因于HPGG基序内每一突变的Δ5去饱和酶活性总结于下文的表9中。EgD5S突变体根据突变HPGX基序的序列命名(即,突变体EgD5S-HPGA的HPGG基序具有G4至A的取代,从而产生His-Pro-Gly-Ala[HPGA]基序,而突变体EgD5S-HPGR具有G4至R的取代,等等)。转化效率按照实施例2中所述的公式测定。结果被用于与质粒pDMW369内的野生型EgD5S(SEQ ID NO:10)的结果比较,其中GC分析测得转化体产生了占总脂质8.8%的DGLA和4.5%的ARA(即,平均转化效率为33.8%)。
表9:EgD5S和HPGX基序突变体中的Δ5去饱和酶活性
*每一EgD5S基因(突变或野生型)在pDMW369内表达。
**ND:该实验中未获得突变体。
上述结果表明,HPGG基序内的第二个甘氨酸残基能被若干种氨基酸取代而基本不会影响EgD5S的Δ5去饱和酶活性。优选的甘氨酸取代存在于EgD5S-HPGS(37.3%转化效率)和EgD5S-HPGT(35.5%转化效率)中,其中相对于EgD5S,Δ5去饱和酶活性是相等的或升高的。
实施例4
表现出等于或高于野生型EgD5S水平的EgD5突变体的定量分析
对氨基酸取代的初步分析(实施例2和3)完成之后,即对表现出大约等于或高于野生型EgD5S的转化率的那些突变进行了定量分析(即,EgD5S-HGGG、EgD5S-HHGG、EgD5S-HYGG、EgD5S-HPGS和EgD5S-HPGT)。包含上述突变的质粒分别被命名为pDMW369-HGGG、pDMW369-HHGG、pDMW369-HYGG、pDMW369-HPGS和pDMW369-HPGT。这些质粒与pDMW369一起被再转化进Y4036U(一般方法)并铺板于MMLeu上。在30℃孵育平板约4天。来自每一平板的十二个转化子被再划线至新鲜的MMLeu平板上,并再次于30℃孵育。转化子被接种至24孔板中的3mL MMLeu中。上述板于30℃以200rpm摇动孵育2天。2天的生长之后,将上述板离心,移除上清液,将沉淀重悬于HGM中。将所述板于30℃再孵育5天。离心收集细胞,提取脂质,通过酯交换反应来制备FAME,并随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。
12份样品平均的DGLA向ARA的转化率总结于下面的表10中:
表10:EgD5S HXGX基序突变体中的Δ5去饱和酶活性
*每一EgD5S基因(突变或野生型)在pDMW369内表达。
该实验证明,EgD5S-HGGG和EgD5S-HHGG(SEQ ID NO:58)和EgD5S-HPGS(SEQ ID NO:97)突变体的Δ5去饱和酶活性相对于野生型EgD5S对照是升高的。编码EgD5S-HGGG的一段适合的核苷酸序列如SEQ ID NO:190所示,编码EgD5S-HHGG的一段适合的核苷酸序列如SEQ ID NO:191所示,而编码EgD5S-HPGS的一段适合的核苷酸序列如SEQ ID NO:192所示。
实施例5
包含EaD5S的构建体pZUFmEaD5S的产生
本实施例描述了包含嵌合基因FBAINm::EaD5S::Pex20的质粒pZUFmEaD5S的构建。通过用来自pEaD5S(SEQ ID NO:100)[其中当EaD5S基因(SEQ ID NO:13)被克隆进pUC57(GenBank登录号Y14837)即产生了质粒pEaD5S(SEQ ID NO:100)]的Nco I/NotI EaD5S片段替代pZUF17(图2B;SEQ ID NO:99)的Nco I/Not I片段,构建了质粒pZUFmEaD5S(SEQ ID NO:98)。这一连接反应的产物是pZUFmEaD5S,其由此包含下列组分:
表11:质粒pZuFmEaD5S(SEQ ID NO:98)的组分
实施例6
导致EaD5S中升高的Δ5去饱和酶活性的HXGG突变的鉴定
以pZUFmEaD5S(实施例5)作为模板,使用19对寡核苷酸(SEQ ID NO:101至138;表12)作为引物,通过定点诱变(QuickChange Kit,Stratagene,CA)单独地使EaD5S(SEQ ID NO:14)的HPGG基序的脯氨酸残基突变,进行了单氨基酸突变,从而产生全部可能的氨基酸取代(即,His-Xaa-Gly-Gly[HXGG]突变体)。来自每一突变的质粒被转入大肠杆菌XL2Blue细胞中。从19个转化体中的每一个挑出四个菌落,并使其在液体培养基中于37℃单独生长过夜。从这些培养物中分离质粒(即,总计76种)并单独测序,以确定突变。
野生型质粒pZUFmEaD5S和上述分离的突变质粒被单独地转入菌株Y4036U,如一般方法部分所述。在MMLeu平板上对转化体进行选择,然后使它们在液体MMLeu和HGM培养基中生长,如实施例2中所述(除培养箱的速度从200升高至250rpm之外)。离心收集细胞,提取脂质,通过酯交换反应来制备FAME,并随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。
归因于HPGG基序内每一突变的Δ5去饱和酶活性总结于下文的表12中。EaD5S突变体根据突变HXGG基序的序列命名(即,突变体EaD5S-HAGG的HPGG基序具有P2至A的取代,从而产生His-Ala-Gly-Gly[HAGG]基序,而突变体EaD5S-HRGG具有P2至R的取代,等等)。转化效率按照下列公式测定:([产物]/[底物+产物])*100。结果被用于与质粒pZUFmEaD5S内的野生型EaD5S(SEQ ID NO:14)的结果比较,其中GC分析测得2转化体平均的DGLA向ARA的转化效率为25%。
表12:EaD5S和HXGG基序突变体中的Δ5去饱和酶活性
*每一EaD5S基因(突变或野生型)在pZuFmEaD5S内表达。
**ND:该实验中未获得突变体。
基于以上所述,显然HPGG基序内的脯氨酸残基能被若干种氨基酸取代而基本不会影响EaD5S的Δ5去饱和酶活性。优选的脯氨酸取代存在于EaD5S-HAGG(26.3%转化效率)、EaD5S-HCGG(26.2%转化效率)、EaD5S-HKGG(25.2%转化效率)和EaD5S-HTGG(25.8%转化效率)中,其中相对于EaD5S,Δ5去饱和酶活性是升高的。
表现出等于或高于野生型EaD5S水平的EaD5突变体的定量分析
对相对于野生型EaD5S的转化率表现出大约相等的或升高的活性的那些突变进行了更加定量的分析(即,EaD5S-HAGG、EaD5S-HRGG、EaD5S-HNGG、EaD5S-HCGG、EaD5S-HHGG、EaD5S-HLGG、EaD5S-HKGG、EaD5S-HMGG、EaD5S-HFGG、EaD5S-HSGG和EaD5S-HTGG)。包含上述突变的质粒分别被命名为pZuFmEaD5S-HAGG、pZuFmEaD5S-HRGG、pZuFmEaD5S-HNGG、pZuFmEaD5S-HCGG、pZuFmEaD5S-HHGG、pZuFmEaD5S-HLGG、pZuFmEaD5S-HKGG、pZuFmEaD5S-HMGG、pZuFmEaD5S-HFGG、pZuFmEaD5S-HSGG、和pZuFmEaD5S-HTGG。这些质粒与pZuFmEaD5S一起被再转化进Y4036U(一般方法)并铺板于MMLeu上。在30℃孵育平板约4天。来自每一平板的六个转化子被再划线至新鲜的MMLeu平板上,并再次于30℃孵育。转化子被接种至24孔板中的3mL MMLeu中。上述板于30℃以200rpm摇动孵育2天。在2天的生长之后,将上述板离心,移除上清液,并将沉淀重悬于HGM中。将所述板于30℃再孵育5天。离心收集细胞,提取脂质,通过酯交换反应来制备FAME,并随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。
6份样品平均的DGLA向ARA的转化率总结于下面的表13中:
表13:EaD5S HXGG基序突变体中的Δ5去饱和酶活性
*每一EaD5S基因(突变或野生型)在pZuFmEaD5S内表达。
该实验证明,突变EaD5S-HCGG(SEQ ID NO:139)的Δ5去饱和酶活性相对于野生型EaD5S对照是升高的。编码EaD5S-HCGG的一段适合的核苷酸序列如SEQ ID NO:193所示。
实施例7
包含RD5S的构建体pZUFmRD5S的产生
本实施例描述了质粒pZURD5S,该质粒包含嵌合基因FBAIN::RD5S::Pex20(质粒的构建描述于国际申请公布WO 2007/136646中)。除了RD5S(SEQ ID NO:17)代替EgD5S(SEQ ID NO:9)被取代之外,质粒pZURD5S(SEQ ID NO:140)在构建上与pDMW369(实施例1;SEQ ID NO:19)相同。
实施例8
导致RD5S中升高的Δ5去饱和酶活性的HXGG突变的鉴定
以pZURD5S(实施例7)作为模板,使用19对寡核苷酸(SEQ ID NO:141至178;表14)作为引物,通过定点诱变(QuickChange Kit,Stratagene,CA)单独地使RD5S(SEQ ID NO:17)的HPGG基序的脯氨酸残基突变,进行了单氨基酸突变,从而产生全部可能的氨基酸取代(即,His-Xaa-Gly-Gly[HXGG]突变体)。来自每一突变的质粒被转入大肠杆菌XL2Blue细胞中。从19个转化体中的每一个挑出四个菌落,并使其在液体培养基中于37℃单独生长过夜。从这些培养物中分离质粒(即,总计76种)并单独测序,以确定突变。
野生型质粒pZURD5S和上述分离的突变质粒被单独地转入菌株Y4036U,如一般方法部分所述。在MMLeu平板上对转化体进行选择,然后使它们在液体MMLeu和HGM培养基中生长,如实施例2中所述(除培养箱的速度从200升高至250rpm之外)。离心收集细胞,提取脂质,通过酯交换反应来制备FAME,并随后用Hewlett-Packard 6890GC进行分析。
归因于HPGG基序内每一突变的Δ5去饱和酶活性总结于下文的表14中。RD5S突变体根据突变HXGG基序的序列命名(即,突变体RD5S-HAGG的HPGG基序具有P2至A的取代,从而产生His-Ala-Gly-Gly[HAGG]基序,而突变体RD5S-HRGG具有P2至R的取代,等等)。转化效率按照下列公式测定:([产物]/[底物+产物])*100。结果被用于与质粒pZURD5S内的野生型RD5S(SEQ ID NO:18)的结果比较,其中GC分析测得2转化体平均的DGLA向ARA的转化效率为25.1%。
表14:RD5S和HXGG基序突变体中的Δ5去饱和酶活性
*每一RD5S基因(突变或野生型)在pZURD5S内表达。
**ND:该实验中未获得突变体。
基于以上所述,显然HPGG基序内的脯氨酸残基能被若干种氨基酸取代而基本不会影响RD5S的Δ5去饱和酶活性。优选的脯氨酸取代存在于RD5S-HCGG(34.8%转化效率)和RD5S-HWGG(28.5%转化效率)中,其中相对于RD5S,Δ5去饱和酶活性是升高的。
对表现出等于或高于野生型RD5S的转化率的那些突变体(即,RD5S-HCGG和RD5S-HWGG(SEQ ID NO:179))将进行定量分析,如上文就EgD5S和EaD5S突变体所述。编码RD5S-HCGG的一段适合的核苷酸序列如SEQ ID NO:194所示,而编码RD5S-HWGG的一段适合的核苷酸序列如SEQ ID NO:195所示。
Claims (12)
1.具有Δ5去饱和酶活性的突变多肽,所述多肽包含选自下列的氨基酸基序:SEQ ID NO:183(HGGG)、SEQ ID NO:184(HHGG)、SEQ ID NO:186(HCGG)、SEQ ID NO:187(HWGG)和SEQ ID NO:185(HPGS)。
2.权利要求1的突变多肽,所述多肽具有选自下列的氨基酸序列:SEQ ID NO:58(EgD5S-HGGG和EgD5S-HHGG)、SEQ ID NO:97(EgD5S-HPGS)、SEQ ID NO:139(EaD5S-HCGG)和SEQ ID NO:179(RD5S-HCGG和RD5S-HWGG)。
3.权利要求1的突变多肽,其中所述突变多肽具有比亲本多肽的二高-γ-亚麻酸向花生四烯酸的转化效率更高的二高-γ-亚麻酸向花生四烯酸的转化效率。
4.基本上编码权利要求1的多肽的分离的核酸分子。
5.权利要求4的分离的核酸,所述核酸选自SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:195。
6.表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞。
7.权利要求6的微生物宿主细胞,所述微生物宿主细胞选自:细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。
8.权利要求7的微生物宿主细胞,其中所述微生物宿主细胞是含油酵母。
9.权利要求8的微生物宿主细胞,其中所述含油酵母选自:耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。
10.生产花生四烯酸的方法,所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二高-γ-亚麻酸的存在下生长,其中所述二高-γ-亚麻酸被转化为花生四烯酸。
11.生产二十碳五烯酸的方法,所述方法包括使表达权利要求1的多肽的微生物宿主细胞在二十碳四烯酸的存在下生长,其中所述二十碳四烯酸被转化为二十碳五烯酸。
12.权利要求6的微生物宿主细胞,其中所述宿主细胞生产多不饱和脂肪酸,所述多不饱和脂肪酸选自ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸。
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