CN101617040B

CN101617040B - △17去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

Info

Publication number: CN101617040B
Application number: CN2007800394209A
Authority: CN
Inventors: 薛志雄; N·S·亚达夫; 朱群
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2006-10-30
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2027-07-19
Also published as: JP2010508019A; CA2663807A1; US20090280996A1; EP2087105A1; US8241884B2; US7556949B2; US20130011846A1; AU2007314481A1; DK2087105T3; WO2008054565A1; AU2007314481B2; CA2663807C; EP2087105B1; US20080125326A1; JP5193216B2; CN101617040A

Abstract

本发明涉及Δ17去饱和酶，所述去饱和酶具有将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物(即，将花生四烯酸[20∶4，ARA]转化成二十碳五烯酸[20∶5，EPA])的能力。本发明公开了分离的核酸片段和包含这种编码Δ17去饱和酶的片段的重组构建体，以及用这些Δ17去饱和酶在含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法。

Description

△17去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

本申请要求于2006年10月30日提交的美国临时专利申请60/855177的优先权。

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ17脂肪酸去饱和酶的核酸片段的鉴定以及这种去饱和酶在制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)中的用途。

发明背景

PUFA的重要性无可争议。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生物成分并被公认为是：在哺乳动物内不能从头合成、相反必须从膳食获得或由亚油酸(LA；18:2ω-6)或α-亚麻酸(ALA；18:3ω-3)通过进一步去饱和和延伸而衍生得到的“必需”脂肪酸；细胞质膜的组分，在质膜中它们可以以诸如磷脂或三酰基甘油之类的形式存在；正确发育(尤其是在发育中的婴儿脑中)和组织形成及修复的必需物质；以及哺乳动物中几种重要的具有生物活性的类二十烷酸(如前列环素、类花生酸、白三烯和前列腺素)的前体。而且，摄入大量长链ω-3PUFA产生心血管保护效果(Dyerberg，J.等人，Amer.J.Clin.Nutr.，28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等人，Lancet，2(8081)：117-119(July 15，1978)；Shimokawa，H.，World Rev.Nutr.Diet，88：100-108(2001)；von Schacky，C.和Dyerberg，J.，World Rev.Nutr.Diet，88：90-99(2001))。大量的其它研究证明，针对多种症状和疾病(如哮喘、牛皮癣、湿疹、糖尿病、癌)施用ω-3和/或ω-6PUFA赋予了广泛的健康益处。

目前正在研究包括植物、藻类、真菌和酵母在内的多种不同宿主作为商业化PUFA生产的手段。基因工程已经证明，一些宿主(即便是天然受限于LA和ALA脂肪酸生产的那些宿主)的天然能力可以得到大幅提高，以产生高水平的(例如)γ-亚麻酸(GLA；18:3ω-6)、二高-γ-亚麻酸(DGLA；20:3ω-6)、花生四烯酸(ARA；20:4ω-6)、二十碳五烯酸(EPA；20:5ω-3)、二十二碳五烯酸(DPA；22:5ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；22:6ω-3)。

无论ω-3/ω-6PUFA生产是天然能力的结果还是重组技术的结果，这两种策略都可能需要将ω-6PUFA转化成它们的ω-3对应物。具体地讲，Δ15去饱和酶负责将LA转化成ALA，而Δ17去饱和酶负责将ARA转化成EPA(尽管一些Δ17去饱和酶也可利用DGLA)作为底物来产生二十碳四烯酸(ETA；20:4ω-3))。这两种酶在Δ6去饱和酶/Δ6延长酶(elongase)途径(其主要存在于藻类、藓类、真菌、线虫和人中并且其特征在于产生GLA和/或十八碳四烯酸(STA；18:4ω-3))和Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径(其在一些生物如类眼虫物种中起作用并且其特征在于产生二十碳二烯酸(EDA；20:2ω-6)和/或二十碳三烯酸(ETrA；20:3ω-3))中都起作用(图1)。

由于Δ17去饱和酶起到能使ω-3脂肪酸被合成的作用，已经付出了相当大的努力来鉴定和表征来自多种来源的这些酶。然而，目前只有少数Δ17去饱和酶是已知的并且这些酶仅分离自两种不同分类的属。具体地讲，专利公布No.US 2003/0190733描述了来自异丝水霉(Saprolegniadiclina)的Δ17去饱和酶(还可参见GenBank登陆号AY373823)。PCT公开No.WO 2005/083053描述了致病疫霉菌(Phytophthora infestans)“ω3去饱和酶”(还可参见GenBank登陆号CAJ30870)，而PCT公开No.WO 2006/100241描述了大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)“ω3去饱和酶”，这两种酶似乎都起到Δ17去饱和酶的作用。另外，共同拥有的共同未决的专利申请美国专利申请11/787772(提交于2007年4月18日)公开了来自大豆疫霉菌和栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)的Δ17去饱和酶的核酸和氨基酸序列。因此，需要鉴定和分离另外的编码Δ17去饱和酶的基因，该基因将适于在多种宿主生物体中异源表达以用于产生ω-3脂肪酸。

申请人已经通过从卵菌(oomycete)，瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)分离编码Δ17去饱和酶的基因解决了上述问题。

发明概述

本发明涉及编码具有Δ17去饱和酶活性的多肽的新遗传构建体以及它们在植物、细菌、藻类、真菌和酵母中用于产生PUFA并且尤其是ω-3脂肪酸的用途。

因此，本发明提供了选自下列的分离的核酸分子：

a.)编码选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的Δ17去饱和酶的分离的核苷酸分子；

b.)在如下杂交条件下与(a)杂交的分离的核苷酸分子：0.1×SSC，0.1％SDS，65℃以及用2×SSC、0.1％SDS洗涤，之后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤；或者，

与(a)或(b)完全互补的分离的核苷酸分子。

在另一个实施方案中，本发明提供了编码选自由SEQ ID NO：1和4的Δ17去饱和酶的分离的核酸分子或编码如SEQ ID NO：2中示出的Δ17去饱和酶的分离的核酸分子，其中至少175个密码子是经密码子最优化以用于在耶氏酵母属(Yarrowia)中表达。另外，本发明提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含编码至少359个氨基酸的Δ17去饱和酶的第一核苷酸序列，其中基于Clustal W算法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的序列的多肽进行比较时，该去饱和酶具有至少75.3％的同一性；

或包含第一核苷酸序列的互补序列的第二核苷酸序列。

在其它实施方案中，本发明提供了包含本发明的分离的核酸分子的嵌合基因以及包含该嵌合基因的转化宿主。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生二十碳五烯酸的方法，该方法包括：

a.)提供宿主细胞，其包含：

(i)编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ IDNO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少75.3％的同一性；和

(ii)花生四烯酸源；

b.)使步骤(a)的宿主细胞在其中编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的核酸分子得以表达并且将花生四烯酸转化成二十碳五烯酸的条件下生长；以及

c.)任选回收步骤(b)的二十碳五烯酸。

类似地，本发明提供了用于产生二十碳四烯酸的方法，该方法包括：

a.)提供宿主细胞，其包含：

(i)编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少75.3％的同一性；和

(ii)二高-γ-亚麻酸源；

b.)使步骤(a)的宿主细胞在使编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的核酸分子表达并且将二高-γ-亚麻酸转化成二十碳四烯酸的条件下生长；以及

c.)任选回收步骤(c)的二十碳四烯酸。

作为另外一种选择，本发明提供了用于产生多不饱和脂肪酸的方法，该方法包括：

a)提供宿主细胞，其包含：

i)编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少75.3％的同一性；和

ii)脂肪酸源，所述脂肪酸选自亚油酸和二十碳二烯酸；

b)使步骤(a)的宿主细胞在其中编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的核酸分子得以表达并且将亚油酸转化成α-亚麻酸且将二十碳二烯酸转化成二十碳三烯酸的条件下生长；以及

c)任选回收步骤(b)的脂肪酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码Δ17去饱和酶多肽的核酸序列的分离的核酸片段，该去饱和酶多肽包含至少一个选自下列的氨基酸序列基序：

a)F T X G H D X G H(SEQ ID NO：96)；

b)H R H H H K N T G(SEQ ID NO：97)；和，

c)I G T H Q X H H L F P(SEQ ID NO：98)；

其中X可以是任何氨基酸，并且

其中Δ17去饱和酶多肽不具有如SEQ ID NO：43和95中示出的氨基酸序列。

作为另外一种选择，本发明提供了Δ17去饱和酶多肽，该多肽包含至少一个选自SEQ ID NO：96-98的氨基酸基序。

在其它实施方案中，本发明提供了用于鉴定和分离Δ17去饱和酶多肽的方法，该方法包括：

a)用如下核酸片段探测基因组文库：

i)编码选自SEQ ID NO：96-98的氨基酸序列的分离的核酸片段；或

ii)与(i)互补的分离的核酸片段；

b)鉴定与步骤(a)的核酸片段杂交的DNA克隆；以及，

c)对包含步骤(b)中鉴定的克隆的基因组片段进行测序；

其中经测序的基因组片段编码Δ17去饱和酶多肽，或者作为另外一种选择，

a)合成至少一种寡核苷酸引物，该引物对应编码选自SEQ ID NO96-98的氨基酸基序的分离的核酸序列的一部分；以及

b)用步骤(a)的寡核苷酸引物扩增存在于克隆载体中的插入序列；

其中，扩增的插入序列编码编码Δ17去饱和酶的氨基酸序列的一部分。

生物保藏

下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

生物材料	保藏号	保藏日期
			解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y2047	ATCC PTA-7186	2005年10月26日

上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

附图和序列表的简要说明

图1示出了ω-3/ω-6脂肪酸的生物合成途径。

图2示出了采用Vector

的AlignX程序(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)的默认参数产生的、大豆疫霉菌Δ17去饱和酶(SEQID NO：45)和栎树猝死病菌Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：47)的氨基酸序列的成对比对。

图3提供了下列质粒的质粒图谱：(A)pKUNFmkF2；(B)pDMW287F；(C)pDMW214；和(D)pFmD8S.

图4A以图形式示出了解脂耶氏酵母菌株Y2047的发展，其产生占总脂质组分11％的ARA。图4B提供了pKUNF12T6E的质粒图谱，而图4C提供了pDMW271的质粒图谱。

图5A和5B示出了Phytophthora aphanidermatumΔ17去饱和酶基因的DNA序列(称为“PaD17”；SEQ ID NO：1)和经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成基因的DNA序列(称为“PaD17S”；SEQ IDNO：4)的比较。

图6A以图形式示出了解脂耶氏酵母菌株Y4070的发展，其产生占总脂质组分12％的ARA。图6B提供了pZKLeuN-29E3的质粒图谱，而图6C提供了pY116的质粒图谱。

图7提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pKO2UF8289和(B)pZKSL-555R。

图8提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pFBAIN-MOD-1和(B)pY6.GPD.Leu2。

图9示出了大豆疫霉菌Δ17去饱和酶基因的DNA序列(称为“PsD17”；SEQ ID NO：44)和经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)中表达的合成基因的DNA序列(称为“PsD17S”；SEQ IDNO：81)的比较。

图10示出了栎树猝死病菌Δ17去饱和酶基因的DNA序列(称为“PrD17”；SEQ ID NO：46)和经密码优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成基因的DNA序列(称为“PrD17S”；SEQ ID NO：84)的比较。

图11提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY130；(B)pY138；(C)pY139；和(D)pY140。

图12提供了如下质粒的质粒图谱：(A)pY137和(B)pY117。

图13是示出了如下ω-3去饱和酶的ω-6脂肪酸底物特异性的图：串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ15去饱和酶(FmD15；SEQ IDNO：86和87)；经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于栎树猝死病菌(Phytopthora ramorum)的合成的Δ17去饱和酶(PrD17S；SEQ ID NO：84和47)；经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于大豆疫霉菌(Phytopthora sojae)的合成的Δ17去饱和酶(PsD17S；SEQ ID NO：81和82)；以及经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于瓜果腐霉菌的合成的Δ17去饱和酶(PaD17S；SEQ ID NO：4和2)。

图14示出了下列ω-3去饱和酶的Clustal V比对(采用默认参数)：致病疫霉菌Δ17去饱和酶(PiD17；SEQ ID NO：43)；栎树猝死病菌Δ17去饱和酶(PrD17；SEQ ID NO：47)；经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于大豆疫霉菌的合成的Δ17去饱和酶(PsD17S；SEQ ID NO：82)；异丝水霉Δ17去饱和酶(SdD17；SEQ ID NO：95)；以及本发明的瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(PaD17S；SEQ ID NO：2)。在框内显示的序列区(Sequence region)分别对应Δ-17基序#1、#2和#3。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵照37C.F.R.1.8211.825(“Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”(对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则))，并且符合WorldIntellectual Property Organization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(abis)以及Administrative Instructions(行政指令)的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的规则。

SEQ ID NO：1-8、42-53、56-95和102是编码基因或蛋白质的ORF或质粒，如表1中所示。

表1

基因和蛋白质SEQ ID号汇总

描述和缩写	核酸SEQ ID NO.	蛋白质SEQ ID NO.
			瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(“PaD17”)	1(1080bp)	2(359AA)
瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(“PaD17^*”)	--	3(359AA)
			经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于瓜果腐霉菌的合成的Δ17去饱和酶(“PaD17S”)	4(1080bp)	2(359AA)
瓜果腐霉菌PaD17-内部cDNA片段	5(614bp)	--
			瓜果腐霉菌PaD17-5’基因组片段	6(739bp)	--
瓜果腐霉菌PaD17-3’cDNA片段	7(512bp)	--
			瓜果腐霉菌PaD17重叠群-对应核苷酸388-1467的编码序列	8(1533bp)	--
致病疫霉菌Δ17去饱和酶(“PiD17”)(GenBank登陆号CAJ30870)	42(1085bp)	43(361AA)
			大豆疫霉菌Δ17去饱和酶(“PsD17”)(美国专利申请11/787772)	44(1092bp)	45(363AA)
栎树猝死病菌Δ17去饱和酶(“PrD17”)(美国专利申请11/787772)	46(1086bp)	47(361AA)
			质粒pKUNFmkF2	48(7145bp)	--
质粒pDMW287F	49(5473bp)	--
			质粒pDMW214	50(9513bp)	--

质粒pFmD8S	51(8910bp)	--
			经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于小眼虫(Euglenagracilis)的合成的Δ8去饱和酶(“EgD8S”)(等同于PCT公开No.WO 2006/012326中的SEQ ID NO：112和113)	52(1272bp)	53(422AA)
质粒pKUNF12T6E	56(12,649bp)	--
			经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)(美国专利6,677,145)的合成的C_18/20延长酶(“EL2S”)	57(819bp)	58(272AA)
质粒pDMW271	59(13,034bp)	--
			经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于人类(Homosapiens)的合成的Δ5去饱和酶(GenBank登陆号NP 037534)	60(1335bp)	61(444AA)
质粒pPaD17S	62(3800bp)	--
			质粒pZKLeuN-29E3	63(14,655bp)	--
经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于小眼虫(美国专利申请11/601563和No.11/601564)的合成的Δ9延长酶(“EgD9eS”)	64(777bp)	65(258AA)
			被Cre重组酶识别的大肠杆菌(Escherichia coli)LoxP重组位点	66(34bp)	--

经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)ELO3(美国专利申请11/253882)的合成的C_16/18延长酶(“ME3S”)	67(828bp)	68(275AA)
			质粒pY116	69(8739bp)	--
质粒pKO2UF8289	70(15,304bp)	--
			来源于小眼虫(“EgD8S”；PCT公开No.WO 2006/012326)的合成的突变型Δ8去饱和酶(“EgD8S-23”；美国专利申请11/635258)	71(1272bp)	72(422AA)
小眼虫Δ9延长酶(美国专利申请11/601563和11/601564)(“EgD9e”)	73(777bp)	65(258AA)
			质粒pZKSL-555R	74(13,707bp)	--
经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于小眼虫(美国专利申请11/748629)的合成的Δ5去饱和酶(“EgD5S”)	75(1350bp)	76(449AA)
			经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于多甲藻属物种(Peridinium sp.)CCMP626(美国专利申请11/748637)的合成的Δ5去饱和酶(“RD5S”)	77(1392bp)	78(463AA)
小眼虫Δ5去饱和酶(美国专利申请11/748629)(“EgD5”)	79(1350bp)	76(449AA)
			质粒pFBAIN-MOD-1	80(7222bp)	--
经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于大豆疫霉菌的合成的Δ17去饱和酶(美国专利申请11/787772)(“PsD17S”)	81(1086bp)	82(361AA)

质粒pPsD17S	83(3806bp)	--
			经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于栎树猝死病菌的合成的Δ17去饱和酶(美国专利申请11/787772)(“PrD17S”)	84(1086bp)	47(361AA)
质粒pPrD17S	85(3806bp)	--
			串珠镰刀菌(藤仓赤霉(Gibberellafujikuroi))Δ15去饱和酶(PCT公开No.WO 2005/047480；GenBank登陆号DQ272516.1)	86(1209bp)	87(402AA)
质粒pY6.GPD.Leu2	88(7668bp)	--
			质粒pY130	89(9048bp)	--
质粒pY138	90(8925bp)	--
			质粒pY139	91(8925bp)	--
质粒pY140	92(8919bp)	--
			质粒pY137	93(6267bp)	--
质粒pY117	94(9570bp)	--
			异丝水霉Δ17去饱和酶(GenBank登陆号AAR20444)	--	95(358AA)
质粒pFBAINPaD17S	102(8067bp)	--

SEQ ID NO：9-11分别对应SMART^TM IV寡核苷酸引物、CDSIII/3’PCR引物和5’-PCR引物，用于瓜果腐霉菌cDNA合成。

SEQ ID NO：12对应简并寡核苷酸引物PD17-F1，其编码SEQ IDNO：13中示出的肽。

SEQ ID NO：14和15分别对应简并寡核苷酸引物PD17-F2和PD17-F3，这两种引物都编码SEQ ID NO：16中示出的肽。

SEQ ID NO：17和18分别对应简并寡核苷酸引物PD17-F4和PD17-F5，这两种引物都编码SEQ ID NO：19中示出的肽。

SEQ ID NO：20和21分别对应简并寡核苷酸引物PD17-F6和PD17-F7，这两种引物都编码SEQ ID NO：22中示出的肽。

SEQ ID NO：23和24分别对应简并寡核苷酸引物PD17-R1和PD17-R2，这两种引物都编码SEQ ID NO：25中示出的肽。

SEQ ID NO：26和27分别对应简并寡核苷酸引物PD17-R3和PD17-R4，这两种引物都编码SEQ ID NO：28中示出的肽。

SEQ ID NO：29和30分别对应简并寡核苷酸引物PD17-R5和PD17-R6，这两种引物都编码SEQ ID NO：31中示出的肽。

SEQ ID NO：32对应简并寡核苷酸引物PD17-R7，其编码SEQ IDNO：33中示出的肽。

SEQ ID NO：34和35对应Universal GenomeWalker^TM衔接头。

SEQ ID NO：36、37、38和39分别对应引物PUD17-5-1、UniversalGenomeWalker^TM引物AP1、PUD 17-5-3和Universal GenomeWalker^TM引物AP2，用于PCR扩增编码瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶的基因组DNA的5’-端。

SEQ ID NO：40和41分别对应引物PUD17-3-1和PUD17-3-2，用于PCR扩增编码瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶的cDNA的3’-端。

SEQ ID NO：54和55分别对应引物PUD17-F和PUD17-R，用于扩增编码瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶的的全长cDNA。

SEQ ID NO：96-98分别对应Δ17去饱和酶基序#1、Δ17去饱和酶基序#2和Δ17去饱和酶基序#3。

SEQ ID NO：99-101分别对应富含His的基序，该富含His的基序是属于双铁膜蛋白超家族的膜结合脂肪酸去饱和酶的特征。

发明详述

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用的方式将其全文并入本文。这具体包括如下申请人的受让人共同未决的申请：美国专利7,125,672、美国专利7,189,559、美国专利7,192,762、美国专利7,198,937、美国专利7,202,356、美国专利申请10/840579和No.10/840325(提交于2004年5月6日)、美国专利申请10/869630(提交于2004年6月16日)、美国专利申请10/882760(提交于2004年7月1日)、美国专利申请10/985254和10/985691(提交于2004年11月10日)、美国专利申请11/024544(提交于2004年12月29日)、美国专利申请11/166993(提交于2005年6月24日)、美国专利申请11/183664(提交于2005年7月18日)、美国专利申请11/185301(提交于2005年7月20日)、美国专利申请11/190750(提交于2005年7月27日)、美国专利申请11/198975(提交于2005年8月8日)、美国专利申请11/225354(提交于2005年9月13日)、美国专利申请11/253882(提交于2005年10月19日)、美国专利申请11/264784和11/264737(提交于2005年11月1日)、美国专利申请11/265761(提交于2005年11月2日)、美国专利申请60/853563(提交于2006年10月23日)、美国专利申请60/855177(提交于2006年10月30日)、美国专利申请11/601563和11/601564(提交于2006年11月16日)、美国专利申请11/635258(提交于2006年12月7日)、美国专利申请11/613420(提交于2006年12月20日)、美国专利申请60/909790(提交于2007年4月3日)、美国专利申请60/910831(提交于2007年4月10日)、美国专利申请60/911925(提交于2007年4月16日)、美国专利申请11/787772(提交于2007年4月18日)、美国专利申请11/737772(提交于2007年4月20日)、美国专利申请11/740298(提交于2007年4月26日)、美国专利申请60/915733(提交于2007年5月3日)以及美国专利申请11/748629和11/748637(提交于2007年5月15日)。

本发明提供了新的卵菌(Oomycota)Δ17去饱和酶和编码该去饱和酶的基因，该酶和编码该酶的基因可用于操纵产生有益于健康的PUFA的生化途径。

通过本文所公开的方法学制备的PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，可用于接受静脉内营养法的病人或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。

给人或动物补充以重组手段产生的PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸(即前列腺素、白三烯和血栓素)的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。

定义

在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。

“可读框”缩写为ORF。

“聚合酶链反应”缩写为PCR。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。

“多不饱和脂肪酸”缩写为PUFA。

“三酰基甘油”缩写为TAG。

如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施方案，并无意于局限于任一具体实施方案或方面。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂至C₂₂(尽管更长和更短链长的酸两者都是已知的)。主要的链长在C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(C)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”(或“PUFA”)以及ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在PCT公布WO 2004/101757中有提供。

在本公开内容中用于描述PUFA的命名在下面的表2中示出。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。

表2

多不饱和脂肪酸及其前体的命名

俗名	缩写	化学名称	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	Palmitate	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八碳烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9，12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ-亚麻酸	GLA	顺式-6，9，12-十八碳三烯酸	18:3ω-6
附子脂酸	EDA	顺式-11，14-二十碳二烯酸	20:2ω-6
				二高-γ-亚麻酸	DGLA	顺式-8，11，14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
花生四烯酸	ARA	顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
				α-亚麻酸	ALA	顺式-9，12，15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
十八碳四烯酸	STA	顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
				二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11，14，17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
二十碳四烯酸	ETA	顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸	20:4ω-3
				二十碳五烯酸	EPA	顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸	20:5ω-3
二十二碳五烯酸	DPA	顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
				二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

术语“三酰基甘油”、“油”和“TAG”指由与甘油分子酯化的三个脂肪酰残基组成的中性脂质(并且这些术语在本公开内容中将可以互换使用)。这些油可含有长链PUFA以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。因此，“油的生物合成”一般指细胞中TAG的合成。“微生物油”或“单细胞油”指微生物在它们的生命周期中天然产生的那些油。

“总脂质和油组分中的PUFA百分比(％)”指PUFA相对于在那些组分中的总脂肪酸的百分比。术语“总脂质组分”或“脂质组分”两者均指含油生物内所有脂质(即中性和极性脂质)的总和，因此包括位于磷脂酰胆碱(PC)组分、磷脂酰乙醇胺(PE)组分和三酰基甘油(TAG或油)组分中的那些脂质。然而，术语“脂质”和“油”将可在整个说明书中互换使用。

代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可以认为是发生于细胞内由酶催化的一系列化学反应，用以实现待细胞使用的或待细胞贮存的代谢产物的形成，或启动另一代谢途径(因而称作流量产生步骤)。很多此类途径都很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有期望的精确化学结构的产物。

术语“PUFA生物合成途径”指将油酸转化成LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的代谢过程。该过程在文献中已有很好的描述(如参见PCT公开No.WO 2006/052870)。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延长酶(即“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延长酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、C_18/20延长酶和/或C_20/22延长酶。

术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指在合适条件下表达时编码催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。图1示出了一条代表性途径，提供了从肉豆蔻酸经过多种中间产物向DHA的转化，演示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源产生。该途径自然分成两部分，其中一部分将产生ω-3脂肪酸而另一部分只产生ω-6脂肪酸。只产生ω-3脂肪酸的部分在本文中将称作ω-3脂肪酸生物合成途径，而只产生ω-6脂肪酸的部分在本文中将称作ω-6脂肪酸生物合成途径。

如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性的”指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应该了解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着上面段落中列出的所有基因都是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅需要表达该途径中的一亚组基因。

术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别关注的是：1.)催化EDA转化成DGLA和/或催化ETrA转化成ETA的Δ8去饱和酶；2.)催化DGLA转化成ARA和/或催化ETA转化成EPA的Δ5去饱和酶；3.)催化LA转化成GLA和/或催化ALA转化成STA的Δ6去饱和酶；4.)催化DPA转化成DHA的Δ4去饱和酶；5.)催化油酸转化成LA的Δ12去饱和酶；6.)催化LA转化成ALA和/或催化GLA转化成STA的Δ15去饱和酶；以及7.)催化棕榈酸转化成棕榈油酸(16∶1)和/或催化硬脂酸转化成油酸(18∶1)的Δ9去饱和酶。

本文尤其关注的是使脂肪酸在从该分子的羧基末端计数的第17和第18个碳原子之间去饱和并且例如催化ARA转化成EPA(并且任选催化DGLA转化成ETA)的Δ17去饱和酶。在本领域中，基于Δ17去饱和酶(以及Δ15去饱和酶)将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA或将DGLA转化成ETA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。

一些去饱和酶对两种或多种底物有活性。基于这种能力，这些酶可以根据它们的去饱和酶活性来进一步分为“单功能的”或“双功能的”。在一些实施方案中，最理想的是，通过用脂肪酸去饱和酶的基因转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸概况的作用来经验性地测定脂肪酸去饱和酶的特异性。

更具体地讲，在本文中将Δ17去饱和酶定义为具有单功能或双功能Δ17去饱和酶活性的那些脂肪酸去饱和酶，其中Δ17去饱和酶活性是将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA。术语“单功能Δ17去饱和酶”、“单功能Δ17去饱和酶活性”或“专一的Δ17去饱和酶活性”指能够将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA但不能将LA转化成ALA的Δ17去饱和酶。相比之下，“双功能Δ17去饱和酶”、“双功能Δ17去饱和酶活性”或“主要的Δ17去饱和酶活性”指优先将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA但是另外还具有将LA转化成ALA的有限能力(因而展示出主要的Δ17去饱和酶活性和有限的Δ15去饱和酶活性)的Δ17去饱和酶。

应该指出的是，除了Δ17和Δ15去饱和作用之外，Δ17去饱和酶可具有与该类别不相关的特异性。

为本文目的，术语“PaD17”指分离自瓜果腐霉菌的由SEQ ID NO：1编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：2)。类似地，术语“PaD17^*”是指相对于SEQ ID NO：2包含最多(并且包括)两个保守氨基酸突变(即155位的S突变成P和351位的A突变成T)的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：3)。相比之下，术语“PaD17S”指经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于瓜果腐霉菌的合成的Δ17去饱和酶(即SEQ ID NO：4和2)。基于本文所述的分析，PaD17和PaD17S可进一步归类为双功能Δ17去饱和酶。

为本文目的，术语“PsD17”指分离自大豆疫霉菌的由SEQ ID NO：44编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：45)。相比之下，术语“PsD17S”指经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于大豆疫霉菌的合成的Δ17去饱和酶(即SEQ ID NO：81和82)。基于本文所述的分析，PsD17和PsD17S可进一步归类为双功能Δ17去饱和酶。

类似地，术语“PrD17”指分离自栎树猝死病菌的由SEQ ID NO：46编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：47)。相比之下，术语“PrD17S”指经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的来源于栎树猝死病菌的合成的Δ17去饱和酶(即SEQ ID NO：84和47)。先前在美国专利申请11/787772中描述的分析将PrD17和PrD17S归类为单功能Δ17去饱和酶；然而，基于本文所述的分析，现在将PrD17和PrD17S确定为双功能Δ17去饱和酶。

相关地，术语“PiD17”指分离自致病疫霉菌的由SEQ ID NO：42编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：43)。

术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。

术语“延长酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延长酶作用在其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合成酶相关的多步骤机制中发生，如PCT公开No.WO 2004/101757中所描述。由延长酶体系催化的反应的实例是将GLA转化成DGLA、将STA转化成ETA和将EPA转化成DPA。通常，延长酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如：C_14/16延长酶将会利用C₁₄底物(如肉豆蔻酸)；C_16/18延长酶将会利用C₁₆底物(如棕榈酸)；C_18/20延长酶(又称为Δ6延长酶，两个术语可以互换使用)将利用C₁₈底物(如GLA、STA)；而C_20/22延长酶将利用C₂₀底物(如EPA)。以类似方式，Δ9延长酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。重要的是，须注意一些延长酶具有广泛的特异性并因而单个延长酶可能能催化几种延长酶反应(如，从而可作为C_16/18延长酶和C_18/20延长酶起作用)。

术语“卵菌”指一类通常被称为水霉和霜霉的异养生物。它们是必须从周围的水或土壤中吸收它们的食物或者可以侵入另一种生物体寄养的丝状原生生物。这样，卵菌在腐烂物质的分解和循环利用方面起重要作用。尽管卵菌通过趋同进化与真菌具有相似性，但它们不是真菌(先前认为是真菌)；相反，卵菌是茸鞭生物界(Stramenopiles)的成员并由此与植物、真菌和动物区分开来。硅藻和金褐藻及褐藻(如海藻)也包括在茸鞭生物界内。

腐霉属(Pythium)是卵菌的一个属，包括约85个物种。腐霉属物种是导致植物和鱼类疾病的常见病原体。该属的物种属于最具破坏性的植物病原体，通过破坏种子、贮藏器官、根和其他植物组织而造成作物严重的经济损失。已经将腐霉属的成员描述为“水生真菌”。

术语“含油的”指那些趋于以脂质形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。FungalLipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在晚对数生长期或早稳定生长期时它达到最高浓度，随后在晚稳定生长期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

术语“氨基酸”将指蛋白质或多肽的基本化学结构单位。遵照在Nucleic Acids Research，13：3021-3030(1985)和Biochemical Journal，219(2)：345-373(1984)(将其以引用方式并入本文)中描述的IUPAC-IYUB标准，通过氨基酸的单字母密码或三字母密码来表示氨基酸。

术语“保守氨基酸置换”指将给定蛋白质中的氨基酸残基用另一种氨基酸置换，而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸(但不影响所编码、折叠蛋白质的结构和功能特性)的基因改变是常见的。为了本发明目的，将“保守氨基酸置换”定义为如下五组中的一组内的互换：

1.小的脂族非极性残基或稍微极性的残基：Ala[A]、Ser[S]、Thr[T](Pro[P]、Gly[G])；

2.极性的、带负电荷的残基和它们的酰胺：Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q]；

3.极性的、带正电荷的残基：His[H]、Arg[R]、Lys[K]；

4.大的脂族非极性残基：Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V](Cys[C])；和

5.大的芳族残基：Phe[F]、Tyr[Y]、Trp[W]。

保守氨基酸置换通常保持：1.)置换区内多肽主链的结构；2.)分子在靶位点处的电荷或疏水性；或3.)侧链体积。此外，在许多情形中，改变蛋白质分子的N-末端和C-末端部分也将预计不会改变蛋白质的活性。

术语“非保守氨基酸置换”指通常预期会使蛋白质性质发生最大变化的氨基酸置换。因此，例如非保守氨基酸置换应该是这样的置换，由此1.)亲水性残基置换疏水性残基/被疏水性残基置换(如Ser或Thr置换Leu、Ile、Val/被Leu、Ile、Val置换)2.)Cys或Pro置换任何其它残基/被任何其它残基置换；3.)具有带正电荷的侧链的残基置换带负电荷的残基/被带负电荷的残基置换(如Lys、Arg或His置换Asp或Glu/被Asp或Glu置换)；或4.)具有大侧链的残基置换无侧链的残基/被无侧链的残基置换(如Phe置换Gly/被Gly置换)。有时，这5组中的两组之间的非保守氨基酸置换将不会影响所编码的蛋白质的活性。

如本文所用，“分离的核酸片段”或“分离的核酸分子”将可互换使用，并且指为单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)中有举例说明，尤其是其中的第11章和表11.1(将其全部内容以引用的方式并入本文)。温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤决定严格性条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤：开始采用6×SSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2×SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，最后使用0.2×SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2×SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1×SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1×SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2×SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1×SSC、0.1％SDS洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算Tm的公式(请参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；并且最优选地，长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包含的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))之类的算法通过计算机自动化序列比较和鉴定来完成。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多邻接氨基酸或者30个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定卵菌蛋白质的完整的氨基酸和核苷酸序列。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，以用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如随附的序列表中所示的完整序列，以及如上文定义的这些序列的基本部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括与所附序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段，以及那些基本相似的核酸序列。

术语“同源”和“同源的”可以互换使用，并且指其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应该理解的，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。

此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的同源核苷酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5×SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本发明核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。

“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时特定宿主细胞显示出的“密码子偏好性”。因此，在合成基因以改善其在宿主细胞中的表达时，希望设计基因以使得其密码子使用频率接近宿主细胞中优选的密码子使用频率。

与DNA序列有关的“化学合成”指在体外对组分核苷酸进行装配。可以采用完善建立的方法来完成DNA的手工化学合成，或者可使用许多种可商业获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些构件进行连接并退火以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏倚，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。

“基因”指表达特定蛋白质的核酸片段，并且该核酸片段可以指单独的编码区或可以包含位于编码序列之前的调节序列(5′非编码区)和之后的调节序列(3′非编码区)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调节序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含在天然情况下不是一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包含源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调节序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可以整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可以是源自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称作成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并源于mRNA的双链DNA。“有义”RNA指包含mRNA并因而能由细胞翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补并且可阻断靶基因的表达的RNA转录物(美国专利5,107,065；PCT公开No.WO99/28508)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其它不能翻译可是对细胞过程有影响作用的RNA。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

如本文所用的，术语“表达”指源于本发明的核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽，即已经去除了存在于初始翻译产物中的任何前肽或肽原的多肽。“前体”蛋白质指mRNA的初级翻译产物，即前肽和肽原仍然存在。前肽和肽原可以是(但不限于)细胞内定位信号。

“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

术语“质粒”、“载体”和“盒”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3′末端非翻译序列一起引入细胞中。“表达盒”指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。

如本领域所熟知，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffiun，A.M.，and Griffin，H.G.，Eds.)Humania：NJ(1994)；4.)SequenceAnalysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，Ed.)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.and Devereux，J.，Eds.)Stockton：NY(1991)。

设计确定同一性的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“Clustal V比对方法”，该方法相当于称为Clustal V(在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlign^TM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于缺口罚分(GAP PENALTY)＝10和缺口长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，缺口罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相当于称为Clustal W(在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlign^TM v6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数对应于缺口罚分＝10、缺口长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay DivergenSeqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNAWeight Matrix)＝IUB。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

“BLASTN比对方法”是由国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)提供的用以采用默认参数比较核苷酸序列的算法。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的核酸片段(本发明的分离的多核苷酸)编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约70％同一性，优选至少约75％同一性，并且更优选至少约80％同一性的多肽。优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。最优选的是编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核酸片段。实际上，从70％至100％的任何整数氨基酸同一性都可用于描述本发明，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不仅具有以上同源性，而且通常还可编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，还更优选至少200个氨基酸，并且最优选至少250个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序包(Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR有限公司，Madison，WI)；4.)Sequencher(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5.)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，11120.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本专利申请案的上下文中应当理解，使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。在此所用的“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表示对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同源物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标记或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。为本文目的，下表描述了本发明的基序，其表示具有Δ17去饱和酶活性的蛋白质。

表3

Δ17去饱和酶基序汇总

描述	序列	蛋白质SEQ ID NO.
			Δ17去饱和酶基序#1	F T X G H D X G H	96
Δ17去饱和酶基序#2	H R H H H K N T G	97
			Δ17去饱和酶基序#3	I G T H Q X H H L F P	98

术语“His Box”指组氨酸盒，该组氨酸盒具有选自H(X)₃H(SEQ IDNO：99)、H(X)₂HH(SEQ ID NO：100)和H/Q(X)₂HH(SEQ ID NO：101)的基序。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambroo k，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)。

综述：脂肪酸和三酰基甘油的微生物生物合成

通常，含油微生物的脂质蓄积响应存在于生长培养基中的总的碳氮比率而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在PCT公布开No.WO 2004/101757中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延长酶和去饱和酶的作用形成(图1)。

TAG(脂肪酸的主要贮存单位)通过包括如下反应在内的一系列反应形成：1.)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化而生成溶血磷脂酸；2.)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3.)通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸而生成1，2-二酰基甘油(DAG)；和4.)在酰基转移酶作用下加入第三个脂肪酸以形成TAG。广谱的脂肪酸可被整合进TAG中，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。

ω-脂肪酸的生物合成

其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延长酶。然而，如在图1中看到的和如下所述的，通常存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。

具体地讲，所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成LA(第一个ω-6脂肪酸)。然后，利用“Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径”，如下形成ω-6脂肪酸：(1)通过Δ6去饱和酶将LA转化成GLA；(2)通过C_18/20延长酶将GLA转化成DGLA；和(3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成ARA。作为另一种选择，“Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径”可用于如下形成ω-3脂肪酸：(1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；(2)通过Δ6去饱和酶将ALA转化成STA；(3)通过C_18/20延长酶将STA转化成ETA；(4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成EPA；(5)通过C_20/22延长酶将EPA转化成DPA；和(6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成DHA。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。

用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径使用了Δ9延长酶/Δ8去饱和酶生物合成途径。更具体地讲，LA和ALA可通过D9延长酶分别转化成EDA和ETrA；然后，D8去饱和酶将EDA转化成DGLA和/或将ETrA转化成ETA。

预期需要在特定宿主生物中表达用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延长酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。本领域技术人员将能够鉴定多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。可用的去饱和酶和延长酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源(来自细菌、藻类、真菌、植物、动物等)、经由半合成途径产生或从头合成。尽管导入宿主的去饱和酶和延长酶基因的具体来源不是关键的，但选择具有去饱和酶或延长酶活性的特定多肽的考虑事项包括：1.)多肽的底物特异性；2.)多肽或其组分是否为限速酶；3.)去饱和酶或延长酶是否是合成期望的PUFA所必需的；4.)多肽所需的辅因子；和/或5.)多肽在产生后是否经过修饰(例如，通过激酶修饰)。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数(其它详细信息参见PCT公开No.WO 2004/101757)。

在另外的实施方案中，考虑每种具体的去饱和酶和/或延长酶的转化效率也将是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质概况将通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当最优化所需的脂肪酸的生物合成时，每种酶的转化效率也是一个要考虑的变量。

考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延长酶活性(如Δ6去饱和酶、C_18/20延长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C_20/22延长酶)的候选基因可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主生物中，以使该生物能合成PUFA或增强生物合成PUFA。

新的Δ17去饱和酶的鉴定

在本发明中，已经从瓜果腐霉菌中分离出一种编码Δ17去饱和酶(在本文中称为“PaD17”)的核苷酸序列。

PaD17的核苷酸碱基和推导的氨基酸序列与公共数据库的比较揭示，用Clustal W比对算法，最相似的已知序列与本文所报道的PaD17氨基酸序列在359个氨基酸的长度上具有约75.3％的同一性。更优选的氨基酸片段与本文中的序列具有至少约70％-85％的同一性，其中具有至少约85％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。类似地，优选的对应本发明Δ17去饱和酶ORF的编码PaD17的核酸序列是编码活性蛋白质的那些并且其与本文所报道的PaD17核酸序列具有至少约70％-85％同一性，其中具有至少约85％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。

在备选的实施方案中，本发明的PaD17序列可经密码子最优化以用于在特定的宿主生物中表达。如本领域所熟知，这可以是进一步优化该酶在替代宿主中表达的有用手段，因为使用宿主优选的密码子能够大幅增强编码该多肽的外来基因的表达。通常，宿主优选的密码子可在所关注的具体宿主物种中通过检查蛋白质(优选那些最大量表达的蛋白质)中的密码子使用以及确定哪些密码子的使用频率最高来测定。然后，可利用宿主物种优选的密码子整个或部分地合成具有例如去饱和酶活性的所关注的多肽的编码序列。

在本发明的一个优选实施方案中，PaD17经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达。这可能通过这样来实现：首先测定解脂耶氏酵母的密码子使用概况(参见PCT公开No.WO 04/101757；美国专利7,125,672)并鉴定那些优选的密码子。通过测定‘ATG’起始密码子周围的共有序列来实现对解脂耶氏酵母中的基因表达的进一步优化。这种优化导致修饰了1080bp的编码区中的188bp(17.4％)以及优化了175个密码子(48.6％)。经密码子最优化的基因(“PaD17S”；SEQ ID NO：4)中的修饰都不改变所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。如实施例10中所描述，当在解脂耶氏酵母中表达时，经密码子最优化的基因对ARA去饱和形成EPA的效率比野生型基因高。

基于野生型PaD17序列(即SEQ ID NO：2)或如SEQ ID NO：3所示的它的变体，本领域技术人员将能够利用本文的教导产生适用于在替代宿主(即解脂耶氏酵母以外的宿主)中优化表达的多种其它经密码子最优化的Δ17去饱和酶蛋白。因此，本发明涉及任何来源于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的经密码子最优化的Δ17去饱和酶蛋白。这包括但不限于在SEQ ID NO：4中示出的核苷酸序列，该核苷酸序列编码经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成的Δ17去饱和酶蛋白(即PaD17S)。

一旦鉴定了上述卵菌多肽，野生型脂肪酸去饱和酶和经密码子最优化的脂肪酸去饱和酶的活性就可以通过这样测定：将其转化进合适的宿主(即解脂耶氏酵母)中并测定它对宿主脂肪酸概况的影响(实施例7、10和17)。可以预知，PaD17和PaD17S两者都具有Δ17去饱和酶活性，这样该酶能够催化ARA转化成EPA。具体地讲，PaD17将ARA转化成EPA的效率的范围是18.4-19.5％，而PaD17S将ARA转化成EPA的效率的范围是54.1-55.8％(基于在两种不同的解脂耶氏酵母菌株中和在不同的生长条件下的测定)。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。

然而，出乎意料的是，PaD17S还具有有限的Δ15去饱和酶活性(即将LA转化成ALA的效率是34.6％)(实施例17)。因此，瓜果腐霉菌去饱和酶在本文中定义为双功能Δ17去饱和酶。

基于使用ω-6脂肪酸底物EDA和DGLA时大于25％的转化效率(实施例17)，对PaD17S的进一步分析揭示该酶表现出广的催化混杂性。因此，PaD17S的ω-6脂肪酸底物特异性与来源于大豆疫霉菌且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成的Δ17去饱和酶(即PsD17S；美国专利申请11/787772和本文中的实施例17)以及来源于栎树猝死病菌且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成的Δ17去饱和酶(即PrD17S；美国专利申请11/787772和本文中的实施例17)相似。这些结果与相关的异丝水霉的ω-3去饱和酶所表现的结果相反，已经报道该酶作为单功能Δ7去饱和酶专一地作用于C20ω-6脂肪酸底物(Pereira，S.L.等人，Biochem.J.，378：665(2004))。

在另一方面，本发明涉及包含编码Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：43(即“PiD17”，来自致病疫霉菌的ω-3去饱和酶(GenBank登陆号CAJ30870))和SEQ ID NO：95(即“SdD17”，来自异丝水霉的Δ17去饱和酶(GenBank登陆号AAR20444))除外)的核酸序列的分离的核酸片段，其中包含所述Δ17去饱和酶的氨基酸序列含有至少一个下列氨基酸序列基序，该氨基酸序列基序选自：

a)F T X G H D X G H(Δ17去饱和酶基序#1；SEQ ID NO：96)；

b)H R H H H K N T G(Δ17去饱和酶基序#2；SEQ ID NO：97)；和

c)I G T H Q X H H L F P(Δ17去饱和酶基序#3；SEQ ID NO：98)；

其中X可以是任何氨基酸。

加下划线的氨基酸表示作为去饱和酶His Box基序的部分的组氨酸残基。His Box基序可描述为：H(X)₃H(SEQ ID NO：99)、H(X)₂HH(SEQID NO：100)和H/Q(X)₂HH(SEQ ID NO：101)。图14示出了用Clustal V比对(采用默认参数)对本发明的Δ17去饱和酶与其它公开的Δ17去饱和酶进行的比较。具体地讲，比较了SEQ ID NO：2(PaD17)、SEQ IDNO：43(PiD17)、SEQ ID NO：47(PrD17)、SEQ ID NO：82(PsD17S)和SEQ ID NO：95(SdD17)。包含本发明基序(即分别为Δ17去饱和酶基序#1、Δ17去饱和酶基序#2和Δ17去饱和酶基序#3)的区在框中示出。

同源物的鉴定和分离

任何本发明的去饱和酶序列(即PaD17、PaD17^*、PaD17S)或其部分(即Δ17去饱和酶基序#1、Δ17去饱和酶基序#2和/或Δ17去饱和酶基序#3)都可用于利用序列分析软件来搜索相同或其它细菌、藻类、真菌、卵菌或植物物种中的Δ17去饱和酶同源物。通常，这种计算机软件通过将同源的程度分配给多种置换、缺失和其它修饰来匹配相似的序列。

作为另外一种选择，任何本发明的去饱和酶序列或其部分也可以用作杂交试剂用以鉴定Δ17同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样品及特定的杂交方法。本发明的探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的某些碱基没有与正确的互补碱基配对。

杂交方法是非常确实的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或靶标的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯)。如果需要，人们可以加入甲酰胺至杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。

可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(约300-500千道尔顿(kdal))、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其它添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。

核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的方法形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。

在另外的实施方案中，本文描述的任何Δ17去饱和酶核酸片段(或其鉴定的任何同源物)都可用于从相同的或其它细菌、藻类、真菌、卵菌或植物物种中分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1.)核酸杂交方法；2.)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法例证[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3.)文库构建和互补筛选方法。

例如，编码与本文描述的Δ17去饱和酶相似的蛋白质或多肽的基因可以用本领域技术人员熟知的方法，通过将本发明的核酸片段的全部或部分用作DNA杂交探针来筛选来自任何期望的酵母、真菌或卵菌(其中那些产生EPA[或其衍生物]的酵母或真菌将是优选的)的文库而得以直接分离。基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法(如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分(或全长)的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。

通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以便提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotide as specific hybridizationprobes in the Diagnosis of Genetic Disorders”，in Human Genetic Diseases：A Practical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)pp 33-50，IRL：Herndon，VA；以及Rychlik，W.，In Methods in Molecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)Vol.15，pp 31-39，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。

通常，可以将本发明序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。PCR也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，而另一个引物的序列利用编码真核基因的mRNA前体的3′端的多腺苷酸片的存在。

作为另外一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用本发明的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。

在其它实施例中，任何本文所述的Δ17去饱和酶核酸片段(或其鉴定的任何同源物)都可用于产生新的和改良的脂肪酸去饱和酶。如本领域所熟知的，体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组(gene shuffling)”法或其它手段可用于获得天然存在的去饱和酶基因的突变。作为另外一种选择，改良的脂肪酸可以通过结构域交换合成，其中将本文所述的任何Δ17去饱和酶核酸片段的功能结构域与备选的去饱和酶基因的功能结构域交换，从而产生新的蛋白质。

用于产生多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法

期望在合适的启动子控制下编码本文所描述的Δ17去饱和酶(即PaD17、PaD17^*、PaD17S或其它突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)的嵌合基因的导入将导致ARA和/或EPA分别在转化的宿主生物内的产生增加。同样，本发明涵盖了用于直接产生PUFA的方法，其包括将脂肪酸底物(即ARA)暴露给本文所描述的去饱和酶(例如PaD17、PaD17^*、PaD17S)，以便该底物转化成期望的脂肪酸产物(即EPA)。

更具体地讲，本发明的目的是提供用于在宿主细胞(例如含油酵母)中产生EPA的方法，其中宿主细胞包含：

a.)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于ClustalW比对方法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少75.3％的同一性；和

b.)ARA源；

c.)使步骤(a)的宿主细胞在使编码Δ17去饱和酶多肽的核酸分子表达并且将ARA转化成EPA的条件下生长；以及

d.)任选回收步骤(c)的EPA。

本领域中的技术人员将认识到，Δ17去饱和酶的广的底物范围将允许利用该酶将DGLA转化成ETA。因此，本发明提供用于在宿主细胞中产生ETA的方法，其中宿主细胞包含：

b.)DGLA源；

c.)使步骤(a)的宿主细胞在使编码Δ17去饱和酶多肽的核酸分子表达并且将DGLA转化成ETA的条件下生长；以及

d.)任选回收步骤(c)的ETA。

在替代实施方案中，基于瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶的双功能性，本发明的目的是提供用于在宿主(如含油酵母)中产生多不饱和脂肪酸的方法，其中该宿主细胞包含：

a.)编码双功能Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少75.3％的同一性；和

b.)脂肪酸源，该脂肪酸选自：亚油酸和二十碳二烯酸；

其中使宿主细胞在使编码双功能Δ17去饱和酶多肽的核酸分子表达并且将亚油酸转化成α-亚麻酸以及将二十碳二烯酸转化成二十碳三烯酸的条件下生长；然后任选回收所述脂肪酸。

在上述方法中的任一种都需要底物供给(Substrate feeding)。

作为另一种选择，本文描述的Δ17去饱和酶基因及其相应的酶产物可间接用于产生ω-3脂肪酸(参见PCT公开No.WO 2004/101757和No.WO 2006/052870)。发生了间接产生ω-3/ω-6 PUFA，其中脂肪酸底物经由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期可以将本文描述的Δ17去饱和酶(如PaD17、PaD17^*、PaD17S或其它突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)与另外的编码PUFA生物合成途径的酶(如Δ6去饱和酶、C_18/20延长酶、Δ5去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶、C_20/22延长酶)的基因结合表达以导致更高水平地产生长链ω-3脂肪酸(如EPA、DPA和DHA)。包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞(和它的PFUA概况和/或去饱和酶/延长酶概况)、底物的可利用性和期望的终产物。

在备选的实施方案中，基于本文描述的完整序列、那些完整序列的互补序列、那些序列的基本部分、源于那些序列的经密码子最优化的去饱和酶以及那些与其基本同源的序列，破坏宿主生物内的天然Δ17去饱和酶可能是有用的。例如，靶向破坏宿主生物内的Δ17去饱和酶(以及任选Δ15去饱和酶)可产生具有减弱的合成ω-3脂肪酸能力的突变株。这种突变株可用于产生“纯”的ω-6脂肪酸(没有伴随合成ω-3脂肪酸)。

表达系统、盒和载体

本文描述的本发明序列的基因和基因产物可以在异源宿主细胞中表达。在重组宿主中的表达可用于产生多种PUFA途径中间产物，或者可用于调节宿主中已经存在的PUFA途径，用以合成迄今为止用该宿主不能合成的新产物。

含有引导外来蛋白质高水平表达的调节序列的表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。这些表达系统和表达载体的任一种均可用于构建用于产生本发明序列的任何基因产物的嵌合基因。然后可以将这些嵌合基因通过转化导入合适的宿主细胞中以提供所编码的酶的高水平表达。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或DNA盒是本领域熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及建议的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含控制转录起始的基因5′区(如启动子)和控制转录终止的DNA片段3′区(即终止子)。最优选的是，这两个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管应该了解这种控制区不必源自选作生产宿主的特定物种的天然基因。

可用于驱动本发明Δ17去饱和酶ORF在期望宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有许多并且是本领域技术人员所熟悉的。实际上任何能引导这些基因在所选择的宿主细胞中表达的启动子都适用于本发明。在宿主细胞中的表达可以瞬时或稳定的方式完成。瞬时表达可通过诱导可操作地连接至目的基因的可调节启动子的活性完成。稳定表达可通过利用可操作地连接至目的基因的组成型启动子实现。举例来说，当宿主细胞为酵母时，提供在酵母细胞中起作用的转录和翻译区，尤其是来自宿主物种的转录和翻译区(例如，对于在解脂耶氏酵母中使用的优选的转录起始调控区，参见PCT公开No.WO 2006/052870[专利公开US2006-0115881-A1])。可以使用许多调节序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建容易性等。

终止区可源于起始区从其获得的基因的3′区或来自不同的基因。大量的终止区是已知的并且(在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时)在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。终止控制区也可以源于优选宿主天然的多种基因。任选地，终止位点可以是非必需的。然而，如果包括则是最优选的。

如本领域技术人员所意识到，仅仅将基因插入到克隆载体中不能保证它将被成功地以所需要的水平表达。响应于对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、翻译、蛋白质稳定性、氧限制和从宿主细胞分泌方面的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。更具体地讲，已经进行操作来控制基因表达的一些分子特征包括：1.)相关转录启动子和终止子序列的性质；2.)所克隆基因的拷贝数目以及该基因是质粒携带的还是整合到了宿主细胞的基因组中；3.)所合成的外来蛋白质的最终细胞定位；4.)蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率；5.)所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性；和6.)所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些类型的修饰的每一种都包含于本发明中，作为进一步优化本文所描述的Δ17去饱和酶的表达的手段。

宿主细胞的转化

一旦已经获得适于在合适的宿主细胞中表达的编码多肽的DNA，则将其置于能在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定调控区、选择手段和导入的构建体的增殖方法的明智选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

包含目的基因的构建体可以通过任何标准技术导入到宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射或任何将目的基因导入宿主细胞中的其它方法。

为方便起见，已经通过任何方法操纵来摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合到基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞可通过多种选择技术鉴定，如在PCT公开No.WO 2004/101757、No.WO 2005/003310和No.WO 2006/052870中描述。

转化后，适合于本发明Δ17去饱和酶(以及任选在宿主细胞中共表达的其它PUFA酶)的底物可以由宿主自然产生或转基因产生，或者它们可以从外源提供。

ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程改造

有关本发明的Δ17去饱和酶序列的知识将可用于操纵多种宿主细胞中的ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造或需要另外对为PUFA生物合成途径贡献碳的途径进行操纵。可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的方法是本领域技术人员熟知的。例如，与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶可以通过基因破坏来去除或通过其它手段(如反义mRNA和锌指靶向技术(zinc-finger targeting technologies))来下调。

在PUFA生物合成途径中作为增加ARA、EPA或DHA的手段的操纵(及其相关技术)的详细讨论分别在PCT公开No.WO 2006/055322[专利公开No.US 2006-0094092-A1]、PCT公开No.WO 2006/052870[专利公开No.US 2006-0115881-A1]和PCT公开No.WO 2006/052871[专利公开No.US 2006-0110806-A1]中给出，在TAG生物合成途径和TAG降解途径中的所需的操纵(及其相关技术)也在其中给出。

用于Δ17去饱和酶的重组表达的优选宿主

用于表达本发明基因和核酸片段的宿主细胞可以包括在多种原料(包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油和醇类和/或碳氢化合物)上于广泛的温度和pH值范围内生长的宿主。基于申请人的受让人的需要，最初分离本发明描述的基因用于在含油酵母(并且尤其是解脂耶氏酵母)中表达；但是预期，由于转录、翻译和蛋白质生物合成装置是高度保守的，任何植物、细菌、酵母、藻类、卵菌和/或丝状真菌都将是用于表达本发明的核酸片段的合适宿主。

优选的宿主是含油生物，例如含油酵母。这些含油生物天然能够合成并积聚油，其中油可占细胞干重的超过约25％，更优选占细胞干重的超过约30％，而最优选占细胞干重的超过约40％。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、禾木科红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。

最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母。而且，在其它实施方案中，最优选的是命名为ATCC #76982、ATCC #20362、ATCC #8862、ATCC#18944和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。

适用于在解脂耶氏酵母中工程化EPA和DHA的具体教导分别在美国专利申请11/265761(PCT公开No.WO 2006/052870；专利申请US2006-0115881-A1)和No.11/264737(PCT公开No.WO 2006/052871；专利申请US 2006-0110806-A1)中提供。用于在含油酵母(即解脂耶氏酵母)中合成和转化含有Δ17去饱和酶的表达载体的详细方法在PCT公开No.WO 2004/101757和No.WO 2006/052870中提供。在这种酵母中表达基因的优选方法是将线性DNA整合到宿主的基因组中；而且，当期望基因高水平表达时，整合到基因组中的多个位置可以是尤其有用的[如在Ura3基因座(GenBank登陆号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登陆号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登陆号M34929)、Aco2基因座(GenBank登陆号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登陆号XP_503244或Aco3：GenBank登陆号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(PCT公开No.WO 2004/104167)、Lip1基因座(GenBank登陆号Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank登陆号AJ012632)]。

优选的用于解脂耶氏酵母的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在备选的实施方案中，将5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)用于选择酵母Ura-突变体。该化合物对具有编码乳清苷5′-单磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3基因的酵母细胞有毒性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura-突变酵母菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，Oxford University：New York，第7卷，第109-147页，1997)。

其它优选的微生物宿主包括含油细菌、藻类、卵菌和其它真菌；而且，在该广的微生物宿主的组中，特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物(或那些能被基因工程化而达到该目的的微生物[如其它酵母例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)])。因此，例如，用处于诱导型或调节型启动子控制下的任何本发明的Δ17去饱和酶基因转化高山被孢霉(在商业上用于生产ARA)可以产生能合成EPA的转化体生物。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。类似地，美国专利7,001,772公开了转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物的方法。

不论选择哪种具体宿主来表达本文描述的Δ17去饱和酶，如果筛选多个转化体以便获得显示期望表达水平和模式的株系则是优选的。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产品的表型分析或GC分析完成。

ω脂肪酸产生的发酵工艺

将转化的宿主细胞在优化去饱和酶嵌合基因的表达并且产生最大且最经济产量的期望PUFA的条件下生长。通常，可以被优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法。解脂耶氏酵母通常生长在复合培养基(如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基(YPD))或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的极限培养基中(如YeastNitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。

本发明的发酵培养基必须含有合适的碳源。PCT公开No.WO2004/101757中教导了合适的碳源。尽管预期本发明中利用的碳源可以涵盖许多种含碳源，但优选的碳源是糖类、甘油和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或含有10-22个碳的脂肪酸。

氮可以由无机来源(如(NH₄)₂SO₄)或有机来源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其它组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²、Mg⁺²)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin(编辑).pp 61-97(1992))。

本发明中优选的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，且适于转化体宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常在约pH 4.0至pH 8.0之间，其中优选将pH 5.5至pH 7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微好氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要两个阶段的过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，两个阶段的发酵过程是在解脂耶氏酵母中产生PUFA所必需的。这种方法在PCT公开No.WO 2004/101757中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。

油在食物、保健食品、药物和动物饲料中的用途

市场目前支持许多种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。预期含有长链PUFA的本发明的油将在食物和饲料产品中起作用以赋予当前制剂的健康益处。更具体地讲，本发明的含有ω-3和/或ω-6脂肪酸的油将适用于多种食物和饲料产品，包括但不限于：食物模拟物、饮料、肉产品、谷类产品、烘烤食物、小吃和乳制品(对于详细内容，参见美国专利No.US2006/0094092)。

此外，本发明的油可用于制剂中以在医疗食物(包括医疗营养品、膳食补充剂、婴儿代乳品以及药物产品)中赋予健康益处。食物加工和食物配制领域的技术人员将了解存在的油的量和组成是如何加入食物或饲料产品中的。该量在本文中将称为“有效”量并将取决于食物或饲料产品、期望补充该产品的膳食或医疗食物或医疗营养品打算纠正或治疗的医学状况。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步限定。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。

一般方法

实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有描述：1.)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。除非另外说明，否则用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)。通常使大肠杆菌(E.coli)菌株于37℃下在Luria Bertani(LB)平板上生长。

一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生的。基因序列的比较是使用DNASTAR软件(DNA Star，Inc.)完成。

除非另外指明，进行BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)；Altschul，S.F.，等人，J.Mol.Biol.，215：403410(1993)和Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))研究以确定与BLAST“nr”数据库(包含所有非丰余GenBank CDS的翻译序列，来源于三维结构Brookhaven Protein Data Bank、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库的序列)中含有的序列具有相似性的分离的序列。采用由国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法，分析查询序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。将序列在所有可读框内翻译并采用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W.和States，D.J.，Nature Genetics，3：266-272(1993))，比较该序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列的相似性。根据百分比同一性、百分比相似性和期望值(expectation value)，报告了BLASTX比较的结果，该结果总结了与查询序列具有最大相似性的序列。“百分比同一性”定义为两种蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。“百分比相似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。

缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔浓度，“mM”表示毫摩尔浓度，“M”表示摩尔浓度，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对而“kB”表示千碱基对。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。通常使解脂耶氏酵母菌株于28℃下在YPD琼脂(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上生长。

除非另外说明，否则解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))的方法完成。简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并使其在30℃下生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的1mL转化缓冲液中：2.25mL 50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；以及0.125mL 2M DTT。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μl重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺在选择培养基平板上并在30℃下维持2至3天。

为了选择转化体，一般使用极限培养基(“MM”)；MM的组分如下：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮基质(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸，pH 6.1。视需要加入亮氨酸、赖氨酸和/或尿嘧啶补充剂至终浓度0.01％(由此产生分别用20g/L琼脂制备的“MMLeu”、“MMLys”和“MMU”选择培养基)。

作为另外一种选择，将转化体在5-氟乳清酸(“FOA”；也称为5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物)选择培养基上进行选择，该培养基包含：不含硫酸铵或氨基酸的0.17％酵母氮基质(DIFCO Laboratories)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷酸、900mg/L FOA(ZymoResearch Corp.，Orange，CA)和20g/L琼脂。

最后，如下制备高葡萄糖培养基(“HGM”)作为促进含油(oleaginy)条件的手段：6.3g/L KH₂PO₄、27g/L K₂HPO₄和80g/L葡萄糖(pH7.5)。

用于产生在本文中确定为Y4001U1、Y4036U和L38的菌株的方法依赖于位点特异性重组酶系统。简而言之，位点特异性重组系统由两个元件组成：(1)具有特征性DNA序列的重组位点[如LoxP]；和(2)重组酶[如Cre]，当两个或多个重组位点在同一DNA分子上以给定间隔以同一方向取向时，该重组酶与DNA序列特异性结合并催化DNA序列之间的重组(即切除)。为本文目的，产生整合构建体，该整合构建体包含期望插入宿主基因组中的的靶基因(即第一选择标记[即Ura3或Leu2])，该靶序列的旁侧为重组位点。在转化和选择转化体后，通过引入携带第二选择标记(即Leu2或磺酰脲抗性[AHAS])的复制型质粒和适用于识别引入基因组中的位点特异性重组位点的重组酶(即Cre)来将第一选择标记从染色体切除。选择了那些携带第二标记的转化体后，则在没有选择时从宿主除去该复制型质粒，并根据Ura或Leu原养型的丧失来确认第一选择标记从质粒去除了的菌株的宿主基因组中的切除。这产生了既不具有第一选择标记又不具有第二选择标记的转化体，因而该去除了质粒的菌株可用于使用第一选择标记的另一轮转化。有关用于解脂耶氏酵母的基于位点特异性重组酶的方法的另外的详细在PCT公开No.WO 2006/052870中有所描述。

用于pY117的第二选择标记基因(实施例16)是天然的解脂耶氏酵母乙酰羟酸合酶(AHAS或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18；GenBank登陆号XM_501277)，该酶含有赋予磺酰脲类除草剂抗性的单个氨基酸改变(W497L)(SU^R；在PCT公开No.WO 2006/052870中描述)。AHAS是支链氨基酸生物合成途径中最常见的酶并且它是磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的靶。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

为了进行脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))中所述提取脂质。脂肪酸甲酯通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备(Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46(1990))，并随后将其用配有30-m×0.25mm(i.d.)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μl，1％)加入样品中，然后将样品涡旋并摇动20分钟。加入3滴1M NaCl和400μl己烷后，将样品涡旋并离心。移出上层并如上所述的用GC进行分析。

实施例1

瓜果腐霉菌的脂质概况、总RNA分离和基因组DNA分离

瓜果腐霉菌菌株从Lisa Hoffman(E.I.duPont de Nemours，Inc.，Wlimington，DE)获得。

使菌株在室温下于麦芽浸出液琼脂培养基(Difco Laboratories，Detroit，MI)上生长3天。将细胞从平板上刮下并再悬浮于600μl溶解于甲醇中的甲醇钠中。将样品摇动20分钟，并加入50μl 1M的NaCl。混合后，加入600μl庚烷。将样品在Eppendorf微量离心管中涡旋和离心1分钟。小心地将上层与下层分离，并将其置于玻璃小瓶中用于GC分析。分析结果在下面的表4中示出。脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2、GLA、20:1、20:2、DGLA、ARA、EPA和DHA；并且每种组分用占总脂肪酸的百分比表示。

表4

瓜果腐霉菌细胞的脂质概况

脂肪酸	16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	GLA
							占总脂肪酸的百分比	15.8	7.1	0	30.0	11.2	0.5

脂肪酸	20:1	20:2	DGLA	ARA	EPA	DHA
							占总脂肪酸的百分比	1.3	0.5	0.7	7.8	13.4	0.3

基于ARA和EPA的存在，可以得出的结论是，瓜果腐霉菌菌株似乎既具有Δ5去饱和酶(能够将DGLA转化成ARA)又具有Δ17去饱和酶(能够将ARA转化成EPA)。

用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)将总的RNA和基因组DNA从麦芽浸出液琼脂平板刮下的细胞中分离出来。具体地讲，将刮下的细胞再悬浮于1mL水中并在Eppendorf微量离心管中离心30秒。将细胞沉淀物再悬浮于0.75mL Trizol试剂中，与0.75mL 0.5mm的玻璃珠混合，并在最高设置下的Biospec微型珠粒打浆机(mini beadbeater)(Bartlesville，OK)中均化3分钟。将混合物在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心30秒以移除碎屑和玻璃珠。用150μl 24∶1的氯仿∶异戊醇(Invitrogen)萃取上清液。将上面的水相用于RNA分离并且将下面的有机相用于DNA分离。

对于RNA分离，将水相与0.375mL异丙醇混合并让其在室温下孵育5分钟。通过在8000rpm和4℃下离心5分钟收集沉淀的RNA。将沉淀物用0.7mL 80％的乙醇洗涤一次并风干。获得总RNA(59μg)(即200μl样品，29.5μg/μl)。

对于基因组DNA分离，将样品下层有机相与225μl乙醇混合并将其在室温下孵育5分钟。然后将样品在Eppendorf离心机中以5000rpm离心2分钟。将沉淀物用0.75mL 0.1M的柠檬酸钠/10％乙醇洗涤两次。每次将样品在室温下于洗涤溶液中孵育15分钟，之后在4℃下于Eppendorf离心机中以5000rpm离心5分钟。将沉淀物风干并再溶解于300μl 8mM的NaOH中。用1M HEPES将样品的pH调节至7.5，随后完全如生产商的规程所描述的用Qiagen PCR纯化试剂盒将其进一步纯化。获得总共7.2μg瓜果腐霉菌基因组DNA。

实施例2

瓜果腐霉菌的cDNA合成

用BD-Clontech Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒(Mississauga，ON，Canada)直接从瓜果腐霉菌的总RNA合成双链cDNA。具体地讲，将3μl总RNA样品(0.9μg)与1μl SMART^TM IV寡核苷酸(SEQ ID NO：9)和1μl CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10)混合。将混合物加热至75℃并在此温度加热5分钟，并在冰上冷却5分钟。将2μl 5×第一链缓冲液、1μl 20mM的DTT、1μl dNTP混合物(10mM dATP、10mM dCTP、10mM dGTP和10mM dTTP)和1μl PowerScript逆转录酶加入该混合物中。将样品在42℃下孵育1小时。

随后将所得第一链cDNA合成混合物用作用于PCR扩增的模板。该反应混合物含有2μl上述第一链cDNA样品、80μl水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物(10mM dATP、10mMdCTP、10mM dGTP和10mM dTTP)、2μl 5’PCR引物(SEQ ID NO：11)、2μl CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10)和2μl 50×Advantage 2聚合酶混合物。热循环仪的条件设定为：95℃1分钟，然后是20个循环的95℃10秒和68℃6分钟。

将扩增产物用Qiagen PCR纯化试剂盒完全按照生产商的规程进行纯化。将经纯化的cDNA产物用50μl水洗脱。

实施例3

瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶基因编码区的部分的分离

本实施例描述了通过利用源于其它已知Δ17去饱和酶序列的保守区的引物，鉴定编码Δ17去饱和酶(下文中称作“PaD17”(SEQ ID NO：1和2))的一部分瓜果腐霉菌基因。

基于大豆疫霉菌的Δ17脂肪酸去饱和酶序列(SEQ ID NO：45；美国专利申请11/787772，提交于2007年4月18日；也可参见下文中的实施例11)和栎树猝死病菌的Δ17脂肪酸去饱和酶序列(SEQ ID NO：47；美国专利申请11/787772，提交于2007年4月18日；也可参见下文中的实施例13)，将来自实施例2的瓜果腐霉菌的cDNA样品用作PCR的模板，该PCR采用简并引物，该简并引物被设计用以扩增可能的Δ17去饱和酶基因的部分。基于本文提供的比对(如图2)，如表5中所示设计简并引物(有关SEQ ID NO：45和47的引物位置在图2中用虚线框显示)。

表5

用于扩增来自瓜果腐霉菌的Δ17去饱和酶基因的简并寡核苷酸

引物	核苷酸序列	氨基酸序列
			PD17-F1	TTYTGGGGNTTYTTYACNGT(SEQ ID NO：12)	FWGFFTY(SEQ ID NO：13)
PD17-F2	TTCTTYACNGTNGGNCAYGA(SEQ ID NO：14)	FFTVGHD(SEQ ID NO：16)
			PD17-F3	TTTTTYACNGTNGGNCAYGA(SEQ ID NO：15)	FFTVGHD(SEQ ID NO：16)
PD17-F4	ACNCAYCGNCAYCAYCAYAA(SEQ ID NO：17)	THRHHHK(SEQ ID NO：19)
			PD17-F5	ACNCAYAGRCAYCAYCAYAA(SEQ ID NO：18)	THRHHHK(SEQ ID NO：19)
PD17-F6	AARAAYACNGGNAAYATYGA(SEQ ID NO：20)	KNTGNID(SEQ ID NO：22)
			PD17-F7	AARAAYACNGGNAAYATAGA(SEQ ID NO：21)	KNTGNID(SEQ ID NO：22)
PD17-R1	TCRTCRTTRTGRTGNAGRAA(SEQ ID NO：23)	FLHHNDE(SEQ ID NO：25)

PD17-R2	TCRTCRTTRTGRTGYAARAA(SEQ ID NO：24)	FLHHNDE(SEQ ID NO：25)
			PD17-R3	AARAARGCYTTDATDATNGG(SEQ ID NO：26)	PIIKAFF(SEQ ID NO：28)
PD17-R4	AARAAYGCYTTDATDATNGG(SEQ ID NO：27)	PIIKAFF(SEQ ID NO：28)
			PD17-R5	TTRTGNGTNCCDATRTTATG(SEQ ID NO：29)	HNIGTHQ(SEQ ID NO：31)
PD17-R6	TTRTGNGTNCCDATRTTGTG(SEQ ID NO：30)	HNIGTHQ(SEQ ID NO：31)
			PD17-R7	CCYTTNACRTANGTCCAYTC(SEQ ID NO：32)	EWTYVKG(SEQ ID NO：33)

[注意：用于SEQ ID NO：12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30和32的核酸简并密码如下：R＝A/G；Y＝C/T；D＝A/G/T；并且N＝A/C/T/G.]

使用7种正向引物和7种反向引物的所有可能的组合，进行总共49个不同的PCR扩增反应。每种反应混合物都含有1μl 1∶10稀释的瓜果腐霉菌cDNA、5μl的每种正向引物和反向引物(20μM)、14μl水和25μlTaKaRa ExTaq 2×预混物(TaKaRa Bio，Mountain View，CA)。将热循环仪的条件设定为94℃ 1分钟，然后为30个循环的94℃ 20秒、55℃ 20秒和72℃ 1分钟，之后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。通过在标准琼脂糖凝胶上进行电泳来分析PCR产物，并检测推定的Δ17去饱和酶片段，如下表6中所示。

表6

检测到的推定的Δ17去饱和酶片段

产物	正向引物	反向引物
			约460bp片段	PD17-F1	PD17-R5
约400bp片段	PD17-F4	PD17-R2
			约350bp片段	PD17-F6	PD17-R2

将上面表6中描述的片段的每一个用Qiagen PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化，克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并测序。

BLAST序列分析显示，每个片段都来自显示与来自其他生物的已知Δ17去饱和酶具有广泛同源性的单个基因。将这些序列装配成614bp的重叠群(SEQ ID NO：5)，假定其编码推定的来自瓜果腐霉菌的Δ17去饱和酶。

实施例4

来自瓜果腐霉菌的全长Δ17去饱和酶的分离

基于在SEQ ID NO：5中示出并且在实施例3中描述的部分序列，设计引物用以从瓜果腐霉菌的cDNA和基因组DNA样品分离推定的Δ17去饱和酶基因的5’端和3’端。

采用Universal GenomeWalker^TM试剂盒(BD Biosciences Clonetech，Palo Alto，CA)，根据生产商的规程通过基因步移分离来自瓜果腐霉菌的推定的Δ17去饱和酶的5’区。首先，将来自瓜果腐霉菌的基因组DNA分别用DraI、EcoRV、PvuII和StuI消化(每次消化1μg)。将消化的DNA样品根据生产商的规程用Qiagen酶反应纯化试剂盒纯化并将每种样品用20μl水洗脱。

将消化的基因组DNA样品与Universal GenomeWalker^TM衔接头(SEQ ID NO：34[上链]和SEQ ID NO：35[下链])连接，如下面所示：

5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’

3’-H2N-CCCGACCA-5’

具体地讲，将4μl每种消化的DNA与1.9μl 25μM Genome Walker^TM衔接头、1.6μl 10×连接缓冲液和0.5μl T4 DNA连接酶混合。该反应在16℃下过夜进行。在70℃下加热5分钟后，将72μl 10mM Tris、1mMEDTA(pH7.4)缓冲液加入每种反应混合物中。然后将这些反应混合物用作PCR扩增的模板。

对于第一轮PCR，使用引物PUD17-5-1(SEQ ID NO：36)和来自试剂盒的Universal GenomeWalker^TM引物AP1(SEQ ID NO：37)。反应混合物含有1μl 10μM的各种引物、2μl作为模板的纯的连接产物、21μl水和25μl TaKaRa ExTaq 2×预混物。将热循环仪的条件设定为94℃ 90秒，然后30个循环的94℃ 20秒、55℃ 20秒和72℃ 2分钟，之后在72℃进行5分钟最后的延伸反应。

将PCR产物进行1∶20稀释，并将1μl稀释的PCR产物用作第二轮PCR的模板，第二轮PCR使用引物PUD17-5-3(SEQ ID NO：38)和Universal GenomeWalker^TM引物AP2(SEQ ID NO：39)。PCR组分和扩增条件是如上所述的。

第二轮PCR产生了一条约750bp的DNA片段。将该片段用QiagenPCR纯化试剂盒纯化，克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并测序。随后的序列分析显示，该片段含有推定的Δ17去饱和酶基因的5’端，包括翻译起始密码子和387bp另外的未翻译的5’序列。5’片段(SEQ IDNO：6)与异丝水霉Δ17去饱和酶(GenBank登陆号AAR20444；SEQ IDNO：95)具有显著的同源性。

采用瓜果腐霉菌cDNA作为模板，通过PCR扩增分离推定的Δ17去饱和酶的3’区。将引物PUD17-3-1(SEQ ID NO：40)和CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10；来自BD-Clontech Creator^TM Smart^TM cDNA文库构建试剂盒，参见实施例1)用于第一轮扩增。反应混合物含有1μl各种引物(10μM)、1μl瓜果腐霉菌cDNA、22μl水和25μl TaKaRa ExTaq 2×预混物。将热循环仪的条件设定为94℃ 90秒，然后30次循环的94℃ 30秒、55℃ 30秒和72℃ 30秒，之后在72℃进行5分钟最后的延伸反应。

将PCR产物进行1∶20稀释，并将1μl稀释的产物用作第二轮PCR的模板，第二轮PCR采用PUD17-3-2(SEQ ID NO：41)和CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：10)，采用如上所述的组成和扩增条件。第二轮PCR产生了一条约550bp的DNA片段。将该片段用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，克隆进pCR2.1-TOPO中并测序。序列分析显示，该片段含有推定的Δ17去饱和酶cDNA的3’区，包括聚腺苷酸尾。该3’片段(SEQ IDNO：7)与异丝水霉Δ17去饱和酶(GenBank登陆号AAR20444；SEQ IDNO：95)具有显著的同源性。

装配5’基因组区(SEQ ID NO：6)、最初的部分cDNA序列(SEQ IDNO：5)和3’cDNA序列(SEQ ID NO：7)产生了1533bp的重叠群(SEQID NO：8)，包含推定的来自瓜果腐霉菌的Δ17去饱和酶完整序列和另外的未翻译的5’端和3’端。SEQ ID NO：8的编码区(其如SEQ ID NO：1中所示)为1080bp长(对应SEQ ID NO：8的碱基388-1467)并编码359个氨基酸的肽(SEQ ID NO：2)。瓜果腐霉菌的编码序列在这里称为“PaD17”。

用全长PaD17基因(即SEQ ID NO：1)作为查询序列进行BLASTP搜索，结果表明它与异丝水霉的Δ17去饱和酶的氨基酸序列(GenBank登陆号AAR20444)具有58％的同一性和71％的相似性，期望值为e-121；此外，它与其它ω-3去饱和酶也具有同一性和相似性。

相似地，使用Clustal W分析(DNASTAR软件中的MegAlign^TM程序)对来自致病疫霉菌的Δ17去饱和酶蛋白(“PiD17”；SEQ ID NO：43)、来自大豆疫霉菌的Δ17去饱和酶蛋白(“PsD17”；SEQ ID NO：45)、来自栎树猝死病菌的Δ17去饱和酶蛋白(“PrD17”；SEQ ID NO：47)和来自瓜果腐霉菌的Δ17去饱和酶蛋白(“PaD17”；SEQ ID NO：2)之间和之中进行的成对比对得到了如下百分比相似性：PiD17和PaD17之间为74.5％；PrD17和PaD17之间为75.0％；而PsD17和PaD17之间为75.3％。

实施例5

包含瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(“PaD17”)的解脂耶氏酵母表达载体的产生

本实施例描述了质粒pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4的构建，每个质粒都包含FBAINm::PaD17^*::XPR嵌合基因，其中PaD17^*(SEQ ID NO：3)相对于SEQ ID NO：2包含最多(且包括)2个氨基酸突变。质粒pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4用于测试PaD17^*的功能性表达，如下文实施例7所描述。

用来自质粒pFmD8S的片段、PaD17的5’部分和PaD17的3’部分通过三合一连接(three-way ligation)来构建质粒pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4。用来自质粒pKUNFmkF2、pDMW287F和pDMW214的片段通过三合一连接构建质粒pFmD8S(SEQ ID NO：51；图3D)。

质粒pKUNFmkF2

pKUNFmkF2(SEQ ID NO：48；图3A；PCT公开No.WO 2006/012326)是包含FBAINm::F.D12::Lip2嵌合基因(其中“FBAINmK”是解脂耶氏酵母FBAINm启动子[PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356]，“F.D12”是串珠镰刀菌Δ12去饱和酶[PCT公开No.WO2005/047485]而“Lip2”是解脂耶氏酵母Lip2终止子序列(GenBank登陆号AJ012632))的构建体。

质粒pDMW287F

pDMW287F(SEQ ID NO：49；图3B；PCT公开No.WO 2006/012326)是包含合成的Δ8去饱和酶(“EgD8S”；本文中的SEQ ID NO：52)的构建体(其中EgD8S在图中标定为“D8SF”)，该合成的去饱和酶来源于野生型小眼虫，并且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达。去饱和酶基因的旁侧为解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No.WO2005/049805；美国专利7,202,356；在图中标定为“FBA1+内含子”)和耶氏酵母Pex16基因(GenBank登陆号U75433)的Pex16终止子序列。

质粒pDMW214

pDMW214(SEQ ID NO：50；图3C；PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)是既在大肠杆菌中又在解脂耶氏酵母中复制的穿梭质粒。它含有如下组分：

表7

质粒pDMW214(SEQ ID NO：50)的描述

SEQ ID NO：50中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		1150-270	ColE1质粒复制起点
2080-1220	用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
		2979-4256	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登陆号A17608)
PmeI/SphI6501-4256	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)
		6501-1	FBA1+内含子::GUS::XPR，包含：·FBA1+内含子：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)；·GUS：编码β-葡糖苷酸酶的大肠杆菌基因(Jefferson，R.A.，Nature，342：837-838(1989))；·XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号M17741)的约100bp的3’区

质粒pFmD8S

质粒pKUNFmkF2的PmeI/NcoI片段(图3A；包含FBAINm启动子)和质粒pDMW287F的NcoI/NotI片段(图3B；包含合成的Δ8去饱和酶基因“EgD8S”)用于定向地置换pDMW214(图3C)的PmeI/Not I片段。这导致产生了pFmD8S(SEQ ID NO：51；图3D)，其包含FBAINm::EgD8S::XPR嵌合基因。因此，pFmD8S的组分是如下面的表8中所述的。

表8

质粒pFmD8S(SEQ ID NO：51)的组分

SEQ ID NO：51中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		Swa I/Sac II(7988-1461)	FBAINm::EgD8S::XPR，包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)；·EgD8S：经密码子最优化的Δ8去饱和酶基因(SEQ ID NO：52，在图3D中标定为“校正的D8”)，来源于小眼虫(PCT公开No.WO 2006/012326)；·XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号M17741)的约100bp的3’区
2601-1721	ColE1质粒复制起点
		3531-2671	用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
4430-5734	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
		7942-5741	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)

质粒pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4的产生

通过包含下列成分的反应混合物从cDNA扩增瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶：1μl 20μM正向引物PUD17-F(SEQ ID NO：54)、1μl 20μM的反向引物PUD17-R(SEQ ID NO：55)、1μl瓜果腐霉菌cDNA、10μl 5×PCR缓冲液、1μl dNTP混合物(每种都为10μM)、35μl水和1μl Phusion聚合酶(New England Biolabs)。将热循环仪的条件设定为98℃1分钟，然后是30个循环的98℃10秒、55℃10秒和72℃30秒，之后在72℃进行5分钟最后的延伸反应。

将PCR产物克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并对8个单独的克隆进行测序。基于测序结果，将2个克隆(即克隆2和克隆4)用于构建最终的表达质粒。克隆2相对于SEQ ID NO：2含有351位的A至T的突变，而克隆4相对于SEQ ID NO：2含有155位的S至P的突变；因此它们因两个保守氨基酸置换而彼此不同并且它们各自与SEQ ID NO：2中示出的野生型cDNA PaD17序列因一个保守氨基酸置换而不同。

将每个克隆用NcoI和BglII消化以产生约370bp的含Δ17去饱和酶cDNA的5′区的片段；并且，还将每个克隆用BglII和NotI消化以产生710bp的含cDNA的3′区的片段。将约370bp的含Δ17去饱和酶5’区的片段和710bp的含Δ17去饱和酶3’区的片段在三合一连接反应中连接成pFmD8S，其经NcoI和NotI预消化(这样经密码子最优化的Δ8去饱和酶基因[“EgD8S”]被从该质粒切除)。反应混合物含有10μl 2×连接缓冲液和1μl T4DNA连接酶(Promega)、4μl的每个5’和3’Δ17去饱和酶片段(每个为约300ng)和1μl pFmD8S(约150ng)。

使用上述方法，除了pFmD17载体具有FBAINm::PaD17^*::XPR嵌合基因而不是pFmD8S中的FBAINm::EgD8S::XPR嵌合基因以外，新产生的表达质粒pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4的组分与表8中描述的pFmD8S(SEQ ID NO：51)的组分相同。“PaD17^*”的符号对应相对于SEQ ID NO：2(即如实施例4中所述的PaD17的氨基酸)的下列突变。无效突变、155位的S至P的突变、351位的A至T的突变和155位的S至P的突变以及351位的A至T的突变的每种都包含在SEQID NO：3(在下文中称为PaD17^*)中。基于两个克隆的组合，四个不同的表达质粒含有如下面的表9中所示的如下突变。

表9

包含FBAINm::PaD17 ^* ::XPR嵌合基因的变体pFmD17解脂耶氏酵母表达载体

质粒	5’片段	3’片段	相对于SEQ ID NO：2的突变
				pFmD17-1	克隆2	克隆2	351号位的A至T
pFmD17-2	克隆4	克隆4	155位的S至P
				pFmD17-3	克隆2	克隆4	无
pFmD17-4	克隆4	克隆2	155位的S至P，351位的A至T

将每种反应混合物在室温下孵育2小时并用于转化大肠杆菌Top10感受态细胞。用Qiagen Miniprep试剂盒回收来自转化体的质粒DNA。

实施例6

产生解脂耶氏酵母菌株Y2047以通过Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径生产占总脂质约11％的ARA

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y2047的构建，该菌株Y2047能够通过Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径的表达产生相对总脂质而言为11％的ARA(图4A)。该菌株可用于在下面的实施例7中测试PaD17^*的功能性表达。

解脂耶氏酵母菌株Y2047已经按照布达佩斯条约的有关条款保存并具有ATCC号PTA-7186。另外，Y2047的构建已经在共同未决的美国专利申请11/265761(专利公开No.US 2006-0115881A1和PCT公开No.WO 2006/052870)中有所描述。

菌株Y2047的产生首先需要构建菌株M4(产生8％的DGLA)。

产生M4菌株以生产占总脂质约8％的DGLA

产生构建体pKUNF12T6E(图4B；SEQ ID NO：56)用以将四种嵌合基因(包含Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶和两种C_18/20延长酶)整合进野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因座内，由此使得能产生DGLA。pKUNF12T6E质粒含有下列组分：

表10

质粒pKUNF12T6E(SEQ ID NO：56)的描述

SEQ ID NO：56中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/B siWI(9420-8629)	784bp的耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)的5′部分
SphI/PacI(12128-1)	516bp的耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)的3′部分

SwaI/BsiWI(6380-8629)	FBAIN::EL1S::Pex20，包含·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)；·EL1S：来源于高山被孢霉(GenBank登陆号AX464731)的经密码子最优化的延长酶1基因(PCT公开No.WO 2004/101753)；·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号AF054613)的Pex20终止子序列
		BglII/SwaI(4221-6380)	TEF::Δ6S::Lip1，包含：·TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登陆号AF054508)；·Δ6S：来源于高山被孢霉(GenBank登陆号AF465281)的经密码子最优化的Δ6去饱和酶基因(PCT公开No.WO 2004/101753；美国专利7,125,672)；·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登陆号Z50020)的Lip1终止子序列
PmeI/ClaI(4207-1459)	FBA::F.Δ12::Lip2，包含：·FBA：解脂耶氏酵母FBA启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)；·F.Δ12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(PCT公开No.WO 2005/047485)；·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank登陆号AJ012632)的Lip2终止子序列
		ClaI/PacI(1459-1)	TEF::EL2S::XPR，包含：·TEF：TEF启动子(GenBank登陆号AF054508)；·EL2S：来源于金黄色破囊壶菌的经密码子最优化的延长酶基因(SEQ ID NO：57)(美国专利6,677,145)；·XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号M17741)的约100bp的3’区

将pKUNF12T6E质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362。将转化细胞铺在FOA选择培养基平板上并在30℃下维持2至3天。挑取FOA抗性菌落并划线到MM和MMU选择平板上。将在MMU平板上生长但不在MM平板上生长的菌落选作Ura-菌株。然后将Ura-菌株的单菌落在30℃下接种到液体MMU中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。

GC分析显示，DGLA存在于含有pKUNF12T6E的四种嵌合基因的转化体中，但不存在于野生型耶氏酵母对照株中。所选的32个Ura-菌株中大部分产生占总脂质约6％的DGLA。有两个菌株(即菌株M4和13-8)产生了占总脂质约8％的DGLA。

产生Y2047菌株以生产占总脂质约11％的ARA

产生构建体pDMW271(图4C；SEQ ID NO：59)以将三种Δ5嵌合基因整合进耶氏酵母菌株M4的Leu2基因中。如表11中所述，质粒pDMW271含有如下组分：

表11

质粒pDMW271(SEQ ID NO：59)的描述

SEQ ID NO：59中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(5520-6315)	耶氏酵母Leu2基因的788bp的5′部分(GenBank登陆号AF260230)
SphI/PacI(2820-2109)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)的703bp的3′部分

SwaI/BsiWI(8960-6315)	FBAIN::MAΔ5::Pex20，包含：·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)；·MAΔ5：高山被孢霉Δ5去饱和酶基因(GenBank登陆号AF067654)；·Pex20：耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号AF054613)的Pex20终止子序列
		SwaI/ClaI(8960-11055)	TEF::MAΔ5::Lip1，包含：·TEF：TEF启动子(GenBank登陆号AF054508)；·MAΔ5：高山被孢霉Δ5去饱和酶基因(GenBank登陆号AF067654)；·Lip1：耶氏酵母Lip1基因(GenBank登陆号Z50020)的Lip1终止子序列
PmeI/ClaI(12690-11055)	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)
		ClaI/PacI(1-2109)	TEF::HΔ5S::Pex16，包含：·TEF：TEF启动子(GenBank登陆号AF054508)；·HΔ5S：来源于人类的经密码子最优化的Δ5去饱和酶基因(SEQ ID NO：60)(GenBank登陆号NP 037534)；·Pex16：耶氏酵母Pex16基因(GenBank登陆号U75433)的Pex16终止子序列

将质粒pDMW271用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株M4。转化后，将细胞铺在MMLeu平板上并在30℃下维持2至3天。挑取在MMLeu平板上生长的单菌落并将其划线到MM和MMLeu平板上。将那些在MMLeu平板上生长但不在MM平板上生长的菌落选作Leu2-菌株。然后将Leu2-菌株的单菌落在30℃下接种到液体MMLeu培养基中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。

GC分析显示，ARA存在于pDMW271转化体中，但不存在亲本M4菌株中。具体地讲，在所选的48个Leu2-pDMW271转化体中，有35个菌株产生了少于总脂质5％的ARA，12个菌株产生了占总脂质6-8％的ARA，并且1个菌株产生了占工程化耶氏酵母中的总脂质约11％的ARA。将产生11％ARA的菌株命名为“Y2047”。

实施例7

解脂耶氏酵母菌株Y2047中瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(“PaD17 ^* ”)的功能分析

本实施例描述了对解脂耶氏酵母菌株Y2047(实施例6)中的PaD17^*的功能分析。因此，在转化包含PaD17^*的不同pFmD17质粒(来自实施例5)之后，比较转化生物内的脂质概况。

解脂耶氏酵母的转化

将质粒pFmD17-1、pFmD17-2、pFm17-3和pFmD17-4(包含FBAINm::PaD17^*::XPR嵌合基因)如“一般方法”中所述转化进解脂耶氏酵母菌株Y2047中。将转化细胞铺在无尿嘧啶的MM平板上并在30℃下维持2至3天。然后将转化体解脂耶氏酵母的单菌落贴在无尿嘧啶的新鲜MM平板上并让其在30℃下生长1天。然后将菌斑用于接种3mL的MM液体培养基。使细胞在MM培养基中生长2天，然后在HGM培养基中生长4天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析，如“一般方法”中所述。

如表12中所示，GC分析表明在分别包含pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4的克隆的每一个中ARA转化成了EPA。ARA和EPA的组分用占总脂肪酸的百分比表示。转化效率(“Conv.Effic.”)根据如下公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。

表12

用pFmD17-1、pFmD17-2、pFmD17-3和pFmD17-4转化的耶氏酵母菌株 Y2047中的脂肪酸组成的比较

克隆	质粒	相对于SEQ IDNO：2的突变	ARA的百分比	EPA的百分比	转化效率
						1	pFmD17-1	351号位的A至T	3.99	1.09	21.46
2	pFmD17-1	351号位的A至T	3.98	1.2	23.17
						3	pFmD17-2	155位的S至P	4.22	1.06	20.08
4	pFmD17-2	155位的S至P	4.22	1.07	20.23
						5	pFmD17-2	155位的S至P	4.22	1.07	20.23
6	pFmD17-3	无	4.17	0.94	18.40
						7	pFmD17-3	无	4.04	0.98	19.52
8	pFmD17-3	无	4.04	0.92	18.55
						9	pFmD17-4	155位的S至P，351位的A至T	4.01	1.22	23.33
10	pFmD17-4	155位的S至P，351位的A至T	4.01	1.31	24.62
						11	pFmD17-4	155位的S至P，351位的A至T	3.99	1.09	21.46

由PaD17^*将ARA转化成EPA的转化效率的范围是18.4至24.6％。更具体地讲，实验数据表明，存在于载体pFmD17-3中起Δ17去饱和酶作用的来自瓜果腐霉菌的克隆cDNA(SEQ ID NO：2；PaD17)有效地使ARA去饱和成EPA(转化效率的范围是18.4％至19.52％)；然而，SEQID NO：2的第155位氨基酸Ser和SEQ ID NO：2的第351位氨基酸Ala两者都不是酶活性所需要的。包含第155位S至P的突变、第351位A至T的突变或这两种突变的由SEQ ID NO：3编码的PaD17^*变体(分别在pFmD17-2、pFmD17-1和pFmD17-4中表达)都具有比pFmD17-3中的PaD17(SEQ ID NO：2)更高的转化效率。表现出最高Δ17去饱和酶转化效率的转化细胞是表达载体pFmD17-4的那些细胞，所述载体pFmD17-4包含具有第155位S至P的突变和第351位A至T的突变的PaD17^*变体(SEQ ID NO：3)。

实施例8

用于解脂耶氏酵母的经密码子最优化的瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶基因 (“PaD17S”)的合成

将瓜果腐霉菌的Δ7去饱和酶基因(SEQ ID NO：1和2)的密码子使用以与PCT公开No.WO 2004/101753和美国专利7,125,672中描述相似的方式优化，以便在解脂耶氏酵母中表达。具体地讲，基于PaD17的编码序列，根据耶氏酵母密码子使用模式(PCT公开No.WO 2004/101753)、‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计经密码子最优化的瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶基因(称作“PaD17S”，SEQID NO：4)。除了修饰翻译起始位点，还对1080bp编码区中的188bp进行了修饰(17.4％；图5A和5B)并且优化了175个密码子(48.6％)。GC含量从野生型基因(即PaD17)中的61.8％减少到合成基因(即PaD17S)中的54.5％。分别将NcoI位点和NotI位点整合到PaD17S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。在经密码子最优化的基因中所有修饰均不改变所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。设计的PaD17S基因(SEQ ID NO：4)由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并将其克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中而产生pPaD17S(SEQ ID NO：62)。

实施例9

产生解脂耶氏酵母菌株Y4070以通过Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径生产占总脂质约12％的ARA

本实施例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的解脂耶氏酵母菌株Y4070，该菌株Y4070能通过Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质而言约12％的ARA(图6A)。将菌株Y4070用于在下面的实施例10中测试PaD17S的功能性表达。

菌株Y4070的产生需要构建菌株Y2224(由野生型耶氏酵母菌株ATCC #20362的Ura3基因的自主突变而产生的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U(产生17％EDA，具有Leu-和Ura-表型)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)和菌株Y4036U(产生18％DGLA，具有Leu-和Ura-表型)。

菌株Y2224的产生

以如下方式分离菌株Y2224：将来自YPD琼脂平板(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)的解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞划线至含有250mg/L 5-FOA(Zymo Research)的MM平板(75mg/L的尿嘧啶和75mg/L的尿苷、6.7g/L具有硫酸铵且无氨基酸的YNB，以及20g/L葡萄糖)上。将平板在28℃下孵育并将四个得到的菌落分别贴在含有200mg/mL 5-FOA的MM平板上和无尿嘧啶和尿苷的MM平板上以确定尿嘧啶Ura3营养缺陷型。

产生菌株Y4001以生产占总脂质约17％的EDA

通过整合构建体pZKLeuN-29E3(图6B)产生菌株Y4001。将含有四种嵌合基因(即Δ12去饱和酶、C_16/18延长酶和两种Δ9延长酶)的该构建体整合进菌株Y2224的Leu2基因座，由此使得能产生EDA。

构建体pZKLeuN-29E3包含表13中显示的组分。

表13

质粒pZKLeuN-29E3(SEQ ID NO：63)的描述

SEQ ID NO：63中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		BsiW I/Asc I(7797-7002)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)的788bp的3′部分
Sph I/Pac I(4302-3591)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)的703bp的5′部分
		Swa I/BsiW I(10500-7797)	GPD::F.D12::Pex20，包含：·GPD：解脂耶氏酵母GPD启动子(PCT公开No.WO 2005/003310)；·F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(PCT公开No.WO 2005/047485)；·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号AF054613)的Pex20终止子序列

BglII/Swa I(12526-10500)	Exp pro::EgD9E::Lip1，包含：·Exp pro：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(PCT公开No.WO 2006/052870和美国专利申请11/265761)；·EgD9E：来源于小眼虫的经密码子最优化的Δ9延长酶(SEQ ID NO：64)(“EgD9eS”；美国专利申请11/601563和No.11/601564)；·Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登陆号Z50020)的Lip1终止子序列
		Pme I/Cla I(12544-1)	FBAINm::EgD9S::Lip2，包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO 2005/049805)；·EgD9S：来源于小眼虫的经密码子最优化的Δ9延长酶基因(SEQ ID NO：64)(“EgD9eS”；美国专利申请11/601563和No.11/601564)；·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank登陆号AJ012632)的Lip2终止子序列
Cla I/EcoR I(1-1736)	LoxP::Ura3::LoxP，包含：·LoxP序列(SEQ ID NO：66)；·耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)；·LoxP序列(SEQ ID NO：66)
		EcoR I/Pac I(1736-3591)	YAT::ME3S::Pex16，包含：·NT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公开No.US 2006/0094102-A1)；·ME3S：来源于高山被孢霉的经密码子最优化的C_16/18延长酶基因(SEQ ID NO：67)(美国专利申请11/253882以及PCT公开No.WO2006/052870)；·Pex16：耶氏酵母Pex 16基因(GenBank登陆号U75433)的Pex16终止子序列

将质粒pZKLeuN-29E3用Asc I/Sph I消化，然后根据“一般方法”将其用于转化解脂耶氏酵母菌株Y2224(即ATCC#20362Ura3-)。将转化细胞铺在MMLeu培养基平板上并在30℃下维持2至3天。挑取菌落并划线到MM和MMLeu选择平板上。将在MMLeu平板上生长但不在MM平板上生长的菌落选作Leu-菌株。然后将Leu-菌株的单菌落在30℃下接种到液体MMLeu中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析显示，EDA存在于含有pZKLeuN-29E3的4种嵌合基因的转化体中，但不存在于耶氏酵母Y2224对照株中。所选的36个Leu-菌株中大部分产生占总脂质约12至16.9％的EDA。有3个菌株(即菌株#11、#30和#34)产生占总脂质约17.4％、17％和17.5％的EDA；这三个菌株分别称为菌株Y4001、Y4002和Y4003。

产生菌株Y4001U(Leu-、Ura-)以产生占总脂质约17％的EDA

通过在菌株Y4001中的质粒pY116(图6C)中暂时表达Cre重组酶以产生Leu-和Ura-表型来产生菌株Y4001U。构建体pY116含有如下组分：

表14

质粒pY116(SEQ ID NO：69)的描述

SEQ ID NO：69中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		1328-448	ColE1质粒复制起点
2258-1398	用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
		3157-4461	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
PacI/SawI6667-4504	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)

Swa I/Pme I(6667-218

GPAT::Cre::XPR2，包含：·GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(PCT公开No.WO 2006/031937)；·Cre：重组酶蛋白的肠杆菌噬菌体P1 Cre基因(GenBank登陆号X03453)；·XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号M17741)的约100bp的3′部分

根据“一般方法”将质粒pY116用于转化新鲜生长的Y4001细胞。将转化体铺在含有280μg/mL磺酰脲的MMLeu+Ura平板(MMU加上亮氨酸)上并在30℃下维持3至4天。挑取四个菌落，将其在30℃下接种至3mL液体YPD培养基中并以250rpm/min摇动1天。将培养物用液体MMLeu+Ura培养基稀释至1∶50,000，将100μL铺至新的YPD平板上并在30℃下维持2天。挑取菌落并划线至MMLeu和MMLeu+Ura选择平板上。选择在MMLeu+Ura平板上生长但不在MMLeu平板上生长的菌落并通过GC分析来确定C20:2(EDA)的存在。一种具有Leu-和Ura-表型的菌株产生了占总脂质约17％的EDA，并被称为Y4001U。

产生Y4036菌株以生产占总脂质约18％的DGLA

产生构建体pKO2UF8289(图7A；SEQ ID NO：70)以将四种嵌合基因(包含Δ12去饱和酶、一种Δ9延长酶和两种突变型Δ8去饱和酶)整合进菌株Y4001U1的Δ12基因座，由此使得能产生DGLA。构建体pKO2UF8289含有如下组分：

表15

质粒pKO2UF8289(SEQ ID NO：70)的描述

SEQ ID NO：70中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(10304-9567)	耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(PCT公开No.WO2004/104167)的5’部分
EcoRI/SphI(13568-13012)	耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(PCT公开No.WO2004/104167)的3’部分

SwaI/BsiWI(7055-9567)	FBAINm::EgD8M::Pex20，包含：·FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)；·EgD8M：来源于小眼虫(“EgD8S”；PCT公开No.WO 2006/012326)的合成的突变型Δ8去饱和酶(“EgD8S-23”；SEQ ID NO：71；美国专利申请11/635258)；·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号AF054613)的Pex20终止子序列
		SwaI/PmeI(7055-4581)	YAT::F.D12::OCT，包含：·YAT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公开No.US 2006/0094102-A1)；·F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(PCT公开No.WO 2005/047485)；·耶氏酵母OCT基因(GenBank登陆号X69988)的OCT终止子序列
PmeI/PacI(4581-2124)	EXP::EgD8M::Pex16，包含：·EXP：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(PCT公开No.WO 2006/052870和美国专利申请11/265761)；·EgD8M：来源于小眼虫(“EgD8S”；PCT公开No.WO 2006/012326)的合成的突变型Δ8去饱和酶(“EgD8S-23”；SEQ ID NO：71；美国专利申请11/635258)；·Pex16：耶氏酵母Pex16基因(GenBank登陆号U75433)的Pex16终止子

PmeI/ClaI(2038-1)	GPAT::EgD9e::Lip2，包含：·GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(PCT公开No.WO 2006/031937)；·EgD9e：小眼虫Δ9延长酶基因(SEQ ID NO：73)(美国专利申请11/601563和No.11/601564)；·Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因(GenBank登陆号AJ012632)的Lip2终止子序列
		ClaI/EcoRI(13568-1)	LoxP::Ura3::LoxP，包含：·LoxP序列(SEQ ID NO：66)；·耶氏酵母Ura3基因(GenBank登陆号AJ306421)；·LoxP序列(SEQ ID NO：66)

将pKO2UF8289质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4001U1。将转化体铺在MMLeu平板上并在30℃下维持2至3天。挑取菌落并将其在30℃下划线至MMLeu选择平板上2天。然后将这些细胞在30℃下接种至液体MMLeu中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。

GC分析显示，DGLA存在于含有pKO2UF8289的4种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y4001U1菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质7％至13％的DGLA。有6个菌株(即#32、#42、#60、#68、#72和#94)产生了占总脂质约15％、13.8％、18.2％、13.1％、15.6％和13.9％的DGLA。分别将这六个菌株称为Y4034、Y4035、Y4036、Y4037、Y4038和Y4039。

产生菌株Y4036U(Leu-，Ura3-)以生产占总脂质约18％的DGLA

将构建体pY116(图6C；SEQ ID NO：69)用于在菌株Y4036中暂时表达Cre重组酶。这从基因组释放出LoxP夹着的Ura3基因。

根据“一般方法”将质粒pY116用于转化菌株Y4036。转化后，将细胞铺至MMLeu+Ura平板上(MMU加亮氨酸)并在30℃下维持2至3天。挑取在MMLeu+Ura平板上生长的单菌落，将其在30℃下划线至YPD液体培养基中并以250rpm/min摇动1天以清除pY116质粒。将生长的培养物划线至MMLeu+Ura u平板上。在30℃下两天后，将单菌落再次划线至MMLeu+Ura、MMU和MMLeu平板上。选择可以在MMLeu+Ura平板上生长但不在MMU或MMLeu平板上生长的那些菌落。将这些具有Leu-和Ura-表型的菌株中的一种称为Y4036U(Ura-、Leu-)。

产生Y4070菌株以生产占总脂质约12％的ARA

产生构建体pZKSL-555R(图7B；SEQ ID NO：74)以将三种Δ5去饱和酶基因整合进菌株Y4036U的Lys基因座，由此使得能产生ARA。pZKSL-555R质粒含有如下组分：

表16

质粒pZKSL-555R(SEQ ID NO：74)的描述

SEQ ID NO：74中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/B siWI(3321-2601)	耶氏酵母Lys5基因(GenBank登陆号M34929)的720bp的5’部分
PacI/SphI(6716-6029)	耶氏酵母Lys5基因(GenBank登陆号M34929)的687bp的3’部分
		BglII/B siWI(15-2601)	EXP::EgD5S::Pex20，包含：·EXP：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(PCT公开No.WO 2006/052870和美国专利申请11/265761)；·EgD5S：来源于小眼虫(美国专利申请11/748629)的经密码子最优化的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：75)；·Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号AF054613)的Pex20终止子序列

ClaI/PmeI(11243-1)	YAT::RD5S::OCT，包含：·YAT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公开No.US 2006/0094102-A1)；·RD5S：来源于多甲藻属物种CCMP626(美国专利申请11/748637)的经密码子最优化的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：77)；·OCT：耶氏酵母OCT基因(GenBank登陆号X69988)的OCT终止子序列
		EcoRI/PacI(9500-6716)	FBAIN::EgD5WT::Aco，包含：·FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公开No.WO 2005/049805)；·EgD5WT：除去了内部的BglII、HindIII和NcoI限制性内切酶位点的小眼虫Δ5去饱和酶(SEQID NO：79；美国专利申请11/748629)；·Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank登陆号AJ001300)的Aco终止子
EcoRI/ClaI(9500-11243)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号M37309)

将pZKSL-555R质粒用AscI/SphI消化，然后根据“一般方法”将其用于转化菌株Y4036U。将转化细胞铺在MMLeuLys平板上(MMLeu加赖氨酸)并在30℃下维持2至3天。然后将单菌落再次划线至MMLeuLys平板上，随后将其在30℃下接种至液体MMLeuLys中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。

GC分析显示，ARA存在于含有pZKSL-555R的3种嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y4036U菌株中。所选的96个菌株中大部分产生占总脂质约10％的ARA。有4个菌株(即#57、#58、#69和#75)产生了占总脂质约11.7％、11.8％、11.9％和11.7％的ARA。分别将这四个菌株称为Y4068、Y4069、Y4070和Y4071。进一步的分析显示，pZKSL-555R的三种嵌合基因没有整合进Y4068、Y4069、Y4070和Y4071菌株中的Lys5位点。所有菌株都具有Lys+表型。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y4070的最终表型是Ura3-、Leu+、Lys+、GPD::F.D12::Pex20、YAT::F.D12::OCT、YAT::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、Exp::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD5WT::Aco、EXP::EgD5S::Pex20、YAT::RD5S::OCT。

实施例10

构建体pFBAINPaD17S(包含经密码子最优化的Δ7去饱和酶基因 “PaD17S”)的产生和在解脂耶氏酵母中的表达

本实施例描述了PaD17S在解脂耶氏酵母菌株Y4070(实施例9)中的功能分析。因此，在构建包含FBAINm::PaD17S::Pex20嵌合基因的质粒pFBAINPaD17S(SEQ ID NO：102)并将其转化之后，比较转化生物内的脂质概况。

具体地讲，使用来自质粒pPaD17S的5’PaD17S和3’PaD17S片段(实施例8；其中5’PaD17S片段通过NcoI和BglII消化产生并且其中3’PaD17S片段通过BglII和NotI消化产生，如实施例5中所述)和预先用NcoI和NotI消化的质粒pFBAIN-MOD-1(SEQ ID NO：80；图8A)，通过三合一连接构建质粒pFBAINPaD17S。因此，将PaD17S与解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公开No.WO 2005/049805；美国专利7,202,356)和耶氏酵母Pex20基因(GenBank登陆号AF054613)的PEX20-3’终止子区可操作地连接。

将质粒pFBAINPaD17S(SEQ ID NO：102)转化到解脂耶氏酵母菌株Y4070内，并在SD-Ura平板(含有：20g/L琼脂；6.7g/L无氨基酸但具有硫酸铵的YNB；20g/L葡萄糖；20mg/L硫酸腺嘌呤、20mg/L L-色氨酸、20mg/L L-组氨酸-HCl、20mg/L L-精氨酸-HCl、20mg/L L-甲硫氨酸；30mg/L L-酪氨酸、30mg/L L-亮氨酸、30mg/L L-异亮氨酸、30mg/L L-赖氨酸-HCl；50mg/L L-苯基丙氨酸；100mg/mL L-谷氨酸、100mg/mL L-天冬氨酸；150mg/L L-缬氨酸；200mg/L L-苏氨酸；和400mg/L L-丝氨酸)上选择转化体。

如实施例7中所述测定四个转化体的脂肪酸概况和转化效率。GC分析结果在表17中示出；将ARA和EPA组成用总脂肪酸的百分比表示。

表17

用pFBAINPaD17S转化的包含PaD17S的耶氏酵母菌株Y4070中的脂肪酸组成的比较

克隆	质粒	ARA的百分比	EPA的百分比	转化效率(％)
					1	pFBAIN-MOD-1	13.23	0	0
2	pFBAIN-MOD-1	13.20	0	0
					3	pFBAINPaD17S	6.22	7.34	54.1
4	pFBAINPaD17S	6.15	7.73	54.7
					5	pFBAINPaD17S	6.04	7.34	54.9
6	pFBAINPaD17S	6.02	7.53	55.6

GC结果表明，在携带有pFBAINPaD17S的转化体中产生了ARA和EPA，但是在携带有对照质粒pFBAIN-MOD-1(图8A，只有载体)的转化体中只产生了ARA。与野生型PaD17(SEQ ID NO：2)的18.4至19.5％的转化效率相比，经密码子最优化的瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶(PaD17S；SEQ ID NO：4)的转化效率的范围是54.1％至55.6％。

实施例11

编码Δ17去饱和酶的大豆疫霉菌基因的鉴定

在美国专利申请11/787772中公开过的本实施例描述了对来自大豆疫霉菌的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：44和45)的鉴定。

美国能源部联合基因研究所(U.S.Department of Energy’s JointGenome Institute)(“JGI”；Walnut Creek，CA)产生了1.0版本的大豆疫霉菌基因组(估计的基因组大小为95Mbp)。该基因组序列用全基因组鸟枪策略(whole genome shotgun strategy)产生并总共包含19,276个基因模型。

将致病疫霉菌的Δ17去饱和酶(GenBank登陆号CAJ30870；本文中称为“PiD17”并对应SEQ ID NO：43)的氨基酸序列用作查询序列，对JGI的大豆疫霉菌数据库进行TBLASTN(BLAST蛋白质对翻译的核苷酸)搜索(采用可得自JGI的默认参数)。发现位于scaffold17：338148-339167上的一个大豆异霉菌ORF与PiD17具有广泛的同源性(即91.8％的同一性和95.6％的相似性，期望值为0)。基于该同源性，将该大豆异霉菌ORF假定为Δ17去饱和酶并称为“PsD17”。当从数据库检索到1092bp的PsD17的DNA序列(SEQ ID NO：44)时，发现它能编码363个氨基酸长的多肽(SEQ ID NO：45)。采用Clustal W分析(DNASTAR软件的MegAlign^TM程序)进行氨基酸比对显示，PiD17和PsD17之间具有90.9％的同一性；相比之下，核苷酸序列仅具有86.6％的同一性。

而且通过将PsD17(SEQ ID NO：45)用作查询序列进行蛋白质-蛋白质BLAST搜索来测定PsD17与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列的序列同源性(参见一般方法)。基于这一分析，发现PsD17与异丝水霉的ω-3脂肪酸去饱和酶(GenBank登陆号AAR20444)具有最大同源性；具体地讲，PsD17与GenBank登陆号AAR20444的氨基酸序列具有60％的同一性和74％的相似性，期望值为7E-117。另外，PsD17与鱼腥藻(Anabaena variabilis)ATCC#29413的脂肪酸去饱和酶(GenBank登陆号ABA23809)的氨基酸序列具有39％的同一性和57％的相似性，期望值为4E-57。

实施例12

用于解脂耶氏酵母的经密码子最优化的Δ17去饱和酶基因(“PsD17S”) 的合成

在美国专利申请11/787772中公开过的本实施例描述了来源于大豆疫霉菌(SEQ ID NO：44和45)且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：81和82)的产生。

将大豆疫霉菌的Δ17去饱和酶基因的密码子使用以与美国专利7,125,672中描述相似的方式优化，以便在解脂耶氏酵母中表达。具体地讲，基于PsD17(SEQ ID NO：44和45)的编码序列，根据耶氏酵母密码子使用模式(PCT公开No.WO 2004/101753)、′ATG′翻译起始密码子周围的共有序列以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计经密码子最优化的Δ17去饱和酶基因(称为“PsD17S”，SEQ ID NO：81和82)。除了修饰翻译起始位点，还对1092bp编码区中的175bp进行了修饰(16.0％)并优化了168个密码子(46.2％)。GC含量从野生型基因(即PsD17)中的65.1％减少到合成基因(即PsD17S)中的54.5％。分别将NcoI位点和NotI位点整合到PsD17S(SEQ ID NO：81)的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。图9示出了PsD17和PsD17S的核苷酸序列的比较。在氨基酸水平上，与野生型PsD17比较，PsD17S缺少第三个和第四个氨基酸；因此，PsD17S的总长度是361个氨基酸(SEQ ID NO：82)。由GenScript公司(Piscataway，NJ)合成经设计的PsD17S基因并将其克隆进pUC57(GenBank登陆号Y14837)中以产生pPsD17S(SEQ ID NO：83)。

实施例13

编码Δ17去饱和酶的栎树猝死病菌基因的鉴定

在美国专利申请11/787772中公开过的本实施例描述了对来自栎树猝死病菌的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：46和47)的鉴定。

美国能源部联合基因研究所(“JGI”；Walnut Creek，CA)产生了1.0版本的栎树猝死病菌基因组(评估该基因组大小为65Mbp)。该基因组序列用全基因组鸟枪策略产生并总共包含16,066个基因模型。

以与实施例11中描述相似的方式，将PiD17(SEQ ID NO：43)的氨基酸序列用作查询序列以对JGI的栎树猝死病菌数据库进行TBLASTN搜索(采用可得自JGI的默认参数)。

发现在栎树猝死病菌的基因组序列中有两个ORF与PiD17具有广泛的同源性。具体地讲，ORF 80222与SEQ ID NO：43具有89％的同一性和94％的相似性，期望值为0。类似地，ORF48790与SEQ ID NO：43具有高达40％的同一性和61％的相似性，期望值为6E-44。基于这些结果，将ORF 80222假定为Δ17去饱和酶并称为“PrD17”。

当从数据库检索出PrD17的1086bp的DNA序列(SEQ ID NO：46)时，发现它能编码长度为361个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：47)。用Clustal W分析(DNASTAR软件的MegAlign^TM程序)进行氨基酸序列比对显示，PiD17和PrD17之间存在89.5％的同一性；相比之下，核苷酸序列仅具有85.7％的同一性。

通过将PrD17(SEQ ID NO：47)用作查询序列进行蛋白质-蛋白质BLAST搜索来依次比较PrD17与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列的序列同源性(参见“一般方法”)。显示出最高水平的相似性的序列是异丝水霉的ω-3脂肪酸去饱和酶(GenBank登陆号AAR20444)的序列，具有59％的同一性和74％的相似性，期望值为E-124。另外，PrD17与鱼腥藻ATCC#29413的脂肪酸去饱和酶(GenBank登陆号ABA23809)的氨基酸序列具有38％的同一性和57％的相似性，期望值为6E-61。

实施例14

用于解脂耶氏酵母的经密码子最优化的Δ17去饱和酶基因(“PrD17S”) 的合成

在美国专利申请11/787772中公开过的本实施例描述了来源于栎树猝死病菌(SEQ ID NO：46和47)且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：84和47)的产生。

将栎树猝死病菌的Δ17去饱和酶基因的密码子使用以与美国专利7,125,672中描述相似的方式优化，以便在解脂耶氏酵母表达。具体地讲，基于PrD17的编码序列(SEQ ID NO：46和47)，根据耶氏酵母密码子使用模式(PCT公开No.WO 2004/101753)、′ATG′翻译起始密码子周围的共有序列以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计经密码子最优化的Δ17去饱和酶基因(称作“PrD17S”，SEQ ID NO：84)。除了修饰翻译起始位点，还对1086bp编码区中的168bp进行了修饰(15.5％)并优化了160个密码子(44.2％)。GC含量从野生型基因(即PrD17)中的64.4％减少到合成基因(即PrD17S)中的54.5％。分别将NcoI位点和NotI位点整合到PrD17S(SEQ ID NO：84)的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。图10示出了PrD17和PrD17S的核苷酸序列的比较。在经密码子最优化的基因中所有修饰均不改变所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO：47)。设计的PrD 17S基因由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并将其克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中而产生pPrD17S(SEQ ID NO：85)。

实施例15

产生构建体pY130、pY138、pY139和pY140(包含串珠镰刀菌Δ15去饱和酶、PrD17S、PsD17S和PaD17S)用于比较ω-6脂肪酸底物特异性

本实施例和相关实施例16和17(下文)描述了解脂耶氏酵母中串珠镰刀菌Δ15去饱和酶(FmD15；SEQ ID NO：86和87)的底物特异性与PaD17S(SEQ ID NO：4和2)、PrD17S(SEQ ID NO：84和47)和PsD17S(SEQ ID NO：81和82)的底物特异性的比较。

这项工作包括如下步骤：(1)如本文实施15中所述，构建耶氏酵母表达载体pY130(包含FmD15)、pY138(包含PrD17S)、pY139(包含PsD17S)和pY140(包含PaD17S)；(2)如实施例16中所述，构建Δ12去饱和酶被打断的菌株解脂耶氏酵母ATCC#76982(标定为菌株L38)；3.)如实施例17中所述，将pY130、pY138、pY139和pY140转化进野生型耶氏酵母和耶氏酵母菌株L38中；和4)如实施例17所述，在提供脂肪酸底物后比较包含pY130、pY138、pY139或pY140的转化体生物内的脂质概况。

试验基础

ω-3去饱和酶(其既包括作用于C18脂肪酸底物的Δ15去饱和酶又包括作用于C20脂肪酸底物的Δ17去饱和酶)通过将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物(图1)而在长链PUFA的生物合成中起重要作用。众所周知，某些真菌ω-3去饱和酶显示出广泛的催化混杂性。例如，串珠镰刀菌的Δ15去饱和酶(GenBank登陆号DQ272516.1)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的Δ15去饱和酶(GenBank登陆号XP 362963)两者都另外具有有限的Δ17去饱和酶活性(PCT公开No.WO2005/047485和No.WO 2005/047480；美国专利申请11/740298)。

类似地，源自大豆疫霉菌且经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ17去饱和酶(即PsD17S)先前在美国专利申请11/787772中被证实既具有Δ17去饱和酶活性又具有Δ15去饱和酶活性。更具体地讲，PsD17S显示出“双功能Δ17去饱和酶活性”或“主要的Δ17去饱和酶活性”，其中去饱和酶优先将ARA转化成EPA和/或将DGLA转化成ETA，但另外具有有限的能力将LA转化成ALA(因此显示具有主要的Δ17去饱和酶活性和有限的Δ15去饱和酶活性)。

尽管上面描述了广泛的催化混杂性，但并不是所有的ω-3去饱和酶都具有双功能活性。例如，异丝水霉Δ17去饱和酶专一地作用于C20ω-6脂肪酸底物(Pereira，S.L.等人，Biochem.J.，378：665(2004))。

下面的实施例的目的是比较来自大豆疫霉菌(PsD17S；SEQ IDNO：81和82)、栎树猝死病菌(PrD17S；SEQ ID NO：84和47)和瓜果腐霉菌(PaD17S；SEQ ID NO：4和2)的Δ17去饱和酶与以前表征的串珠镰刀菌Δ15去饱和酶(FmD15；SEQ ID NO：86和87)的相对ω-6脂肪酸底物特异性。与以前美国专利申请11/787772中用PsD17S和PrD17S进行的工作形成对比，本文的ω-3去饱和酶在缺少参与将LA转化成EPA的去饱和酶和延长酶的解脂耶氏酵母菌株中表达，因为它们的存在使得能产生长链PUFA生物合成的替代途径(图1)。因此，有关PrD17S、PsD17S和PaD17S中的ω-6底物特异性的解释比以前的工作要清楚得多。

构建包含FmD15的耶氏酵母表达载体pY130

质粒pY6.GPD.Leu2(SEQ ID NO：88)是既能在大肠杆菌中复制又能在解脂耶氏酵母中复制的穿梭质粒，其含有如下元件：耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号M91600)；ColE1质粒复制起点；大肠杆菌f1复制起点；用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)；用于在耶氏酵母中选择的耶氏酵母Leu2基因(GenBank登陆号AF260230)；和嵌合的GPD::NcoI/NotI::XPR盒。耶氏酵母“GPD启动子”指位于由解脂耶氏酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因编码的蛋白质的翻译起始密码子‘ATG’之前的5′上游未翻译区并且是表达所必需的(PCT公开No.WO 2005/003310)。“XPR”指耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741)约100bp的3′区。尽管质粒pY6.GPD.Leu2的构建在本文中没有详细描述，但它来源于pY28GPD.YlD12d(以前在提交于2007年4月26日的美国专利申请11/740298中有所描述，其包含嵌合的GPD::解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶(Yld12d)::Lip1基因盒)。

通过首先在FmD15去饱和酶ORF的位置180处进行单个bp的置换，从先前在PCT公开No.WO 2005/047485(其内容引入本文以供参考)中描述过的质粒pY34衍生串珠镰刀菌Δ15去饱和酶。这种C180T“沉默”突变导致ORF中丧失NcoI位点以方便克隆。然后，用具有NcoI和NotI限制位点的5’和3’PCR引物将该修饰过的序列用于对ORF进行PCR，并且利用NcoI和NotI位点将得到的含有FmD15去饱和酶ORF(SEQ ID NO：86)的NcoI-NotI片段用于置换上面描述的质粒pY28中的Yld12d ORF以产生pY130(SEQ ID NO：89；图11A[在图中标记为“pY130.GPD.Fmd15”])。

含有GPD::FmD15::Lip1嵌合基因的表达载体pY130的9048bp序列在SEQ ID NO：89中公开并在下表中描述。

表18

质粒pY130(SEQ ID NO：89)的描述

SEQ ID NO：89中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		BsiWI-SphI	包含：·ColE1质粒复制起点(157-1037bp)；·用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)(1107-1967bp)；·大肠杆菌f1复制起点(2147-2537bp)；·耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登陆号A17608)(2866-4143bp)
SphI-NcoI	包含：·耶氏酵母LEU2基因(GenBank登陆号AF260230)(4152-6379bp)；·耶氏酵母GPD启动子(对应于GenBank登陆号CR382129中的825835-826763bp，除了产生用以破坏NcoI而方便克隆的单个bp的改变(C826238T)和两个非预期的改变：在位置826161处插入了一个A和核苷酸825884-825922的37bp的正向重复)(6382-7346bp)
		NcoI-NotI	包含串珠镰刀菌(藤仓赤霉)Δ15去饱和酶ORF(SEQ ID NO：86)(GenBank登陆号DQ272516.1；PCT公开No.WO 2005/047480；除了用以破坏NcoI位点以方便克隆的单个bp的沉默改变(C180A))(7350-8558bp)
NotI-BsiWI	包含Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因(GenBank登陆号Z50020)的Lip1终止子序列(8567-8888bp)

耶氏酵母表达载体pY138(包含PrD17S)、pY139(包含PsD17S)和 pY140(包含PaD17S)的构建

将pY130中包含FmD15的NcoI-NotI片段用经类似消化的片段置换，该片段包含来自来源质粒pPrD17S(SEQ ID NO：85；实施例14，同上)和pPsD17S(SEQ ID NO：83；实施例12，同上)的、已经经密码子最优化以用于在耶氏酵母属中表达的栎树猝死病菌和大豆疫霉菌的合成的Δ17去饱和酶ORF(即分别为PrD17S和PsD17S)。这分别产生了质粒pY138(SEQ ID NO：90；图11B[在图中标记为“pY138GPD-PrD17”])和pY139(SEQ ID NO：91；图11C[在图中标记为“pY139GPD PsD17”])。

使用类似的策略将pY130中的FmD15ORF用来自来源质粒pPaD17S(SEQ ID NO：62；实施例8，同上)的瓜果腐霉菌的合成Δ17去饱和酶ORF置换；然而，由于PaD17S含有内部NcoI位点，所以这通过将PaD17S的NcoI-BglII和BglII-NotI片段三合一连接进pY130载体主链中来实现。这导致形成质粒pY140(SEQ ID NO：92)，如图11D中所示(在图中标记为“pY140GPD-PaD17”)。

实施例16

敲除了解脂耶氏酵母Δ12的菌株L38的产生

在美国专利申请11/740298中公开过的本实施例描述了Δ12去饱和酶受破坏[Δ12敲除(KO)]的解脂耶氏酵母ATCC#76982菌株的产生，该菌株被标定为菌株L38并通常称为“d12KO”菌株。该菌株唯一的天然Δ12去饱和酶基因通过利用同源重组用被破坏的Δ12去饱和酶基因进行置换而被破坏。

用于产生在本文中标定为L38的d12KO菌株的方法取决于位点特异性重组酶系统，如在“一般方法”中所述的。

试验方法

用SphI和AscI线性化的质粒pY137转化解脂耶氏酵母ATCC#76982。质粒pY137(在图12A中标记为pY137.YlD12ko.Leu2)的序列公开为SEQ ID NO：93并且pY137在下表中有描述。

表19

pY137(SEQ ID NO：93)的描述

SEQ ID NO：93中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		PacI-BglII[用PacI-SalI消化释放LoxP::Leu2]	含有LoxP::Leu2::LoxP，其包含：·LoxP序列(SEQ ID NO：66)(28-61bp)；·耶氏酵母LEU2基因(GenBank登陆号AF260230)(68-2228bp)；·LoxP序列(SEQ ID NO：66)(2308-2341)
BglII-AscI	包含解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的3’部分(2357-2950bp)，其对应GenBank登陆号XM 500707的661-1254bp
		AscI-SphI	包含：·ColE1质粒复制起点(3003-3883)；·用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)(3941-4801)；·大肠杆菌f1的复制起点(5009-5409)
SphI-PacI	包含解脂耶氏酵母Δ12去饱和酶基因的5’部分(5662-6262bp)，其对应GenBank登陆号XM_500707的1-601bp

通过GC分析十一个LEU原养型pY137转化体并且根据GC分析时可检测的18:2(LA)的缺失确定四个转化体为Δ12敲除(d12KO)菌株。将这些转化体中的一个命名为菌株L37。

通过在耶氏酵母甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)启动子的控制下瞬时表达Cre重组酶来切除d12KO菌株L37中的LEU2基因。具体地讲，用质粒pY117转化菌株L37。质粒pY117中的突变型耶氏酵母AHAS酶赋予了SU^R，其可用作阳性筛选标记。

质粒pY117通过如下操作而源自质粒pY116(在本文中的表14和美国专利申请11/635258中有描述)：将旁侧有PacI-SwaI位点的突变AHAS基因插入用PacI-SwaI消化的pY116中，由此用磺酰脲标记置换了LEU选择标记。质粒pY117(SEQ ID NO：94)在图12B(在图中标记为pY117.Cre.AHASw497L)中示出并且在下面的表20中描述。

表20

pY117(SEQ ID NO：94)的描述

SEQ ID NO：94中的RE位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		BsiWI-Eco RI	包含：·ColE1质粒复制起点(448-1328)；·用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)(1328-2258，互补)；·大肠杆菌f1复制起点(2438-2838)
Eco RI-PacI	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登陆号A17608)(3157-4461bp)
		PacI-SwaI	解脂耶氏酵母AHAS基因(对应GenBank登陆号CR382129中的27040-30026bp[互补])，包含W497L突变(3157-4461bp)
SwaI/BsiWI[用SwaI-NotI消化释放GPAT::Cre]	包含GPAT::Cre::XPR2，包含：·GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(PCT公开No.WO 2006/031937)(7498-8535bp)；·Cre：重组酶蛋白的肠杆菌噬菌体P1Cre基因(GenBank登陆号X03453)(8537-9570bp)，除了一个碱基变化(T4G)，其导致一个氨基酸改变(S2A)而产生了NcoI位点以方便克隆；·XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登陆号M17741)的约170bp的3’区

将由pY117转化的L37置于含有Leu和280μg/mL磺酰脲(氯嘧磺隆，E.I.duPont de Nemours & Co.，Inc.，Wilmington，DE)的小型平板上。为了去除pY117的菌株，将两个SU^R菌落用于接种3mL的YPD。在30℃下生长过夜后，将100μl 1∶250,000稀释的培养物放置在YPD平板上。在30℃下生长过夜后，将6个菌落划线至YPD和MM平板上。所有菌落都在YPD上生长但不在MM平板上生长，证实了它们为Leu营养缺陷型。将这些菌株中的一种称作菌株L38。

实施例17

在解脂耶氏酵母菌株中表达构建体pY130、pY138、pY139和pY140(包含FmD15、PrD17S、PsD17S和PaD17S)用于比较ω-6脂肪酸底物特异性

本实施例描述了将表达质粒pY130、pY138、pY139和pY140转化进解脂耶氏酵母ATCC#76982中，之后比较转化生物内的脂质概况。

转化

如“一般方法”所述，将下列表达质粒转化进野生型(WT)解脂耶氏酵母ATCC#76982和它的Δ12去饱和酶受破坏的衍生(Δ12KO)菌株L38(实施例16)中：1.)质粒pY130(包含FmD15)；2.)质粒pY138(包含PrD17S)；3.)质粒pY139(包含PsD17S)；4.)质粒pY140(包含PaD17S)；和5.)质粒pY6.GPD.Leu2(无任何去饱和酶ORF的空的载体对照；也称为质粒“pY6”)。

在没有底物供给的情况下比较脂质概况

将来自每种转化的三个独立的转化体划线至MM平板上。将新鲜的培养物用于单独接种3mL的MM，一式三份。在30℃下摇动生长2天后，通过离心收集来自2ml等份试样的每种培养物的细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯，并随后用Hewlett-Packard 6890GC分析。

表达pY6(SEQ ID NO：88)、pY130(SEQ ID NO：89)、pY138(SEQID NO：90)、pY139(SEQ ID NO：91)和pY140(SEQ ID NO：92)的解脂耶氏酵母的脂肪酸概况在下面的表21中显示。在表21中，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、18:2(LA)和ALA。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。转化效率(“CE”)根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括源于它的途径中的中间产物和所有产物。因此，Δ12活性(即“d12d CE”)根据如下公式计算：([LA]/[油酸+LA])×100，并且其表示底物转化成LA的百分比。“Δ15活性”(即“d15d CE”)根据如下公式计算：([ALA]/[LA+ALA])×100，并且其表示底物转化成ALA的百分比。标准偏差缩写为“SD”，而“nd”表示未检测到。

表21

用pY130、pY138、pY139和pY140(包含FmD15、PrD17S、PsD17S 和PaD17S)转化的野生型耶氏酵母和Δ12敲除的耶氏酵母中的脂肪酸组成的比较

菌株	质粒	16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	ALA	d12dCE	d15dCE
										WT	pY6(载体ctrl)	9.2	12.2	1.5	28.9	39.6	未检测到	57.8	未检测到
	SD	0.3	0.2	0.1	0.3	0.6	0.0	0.6	未检测到
										WT	pY130(FmD15)	8.5	12.3	2.1	33.7	6.5	29.1	51.4	81.7
	SD	0.3	0.3	0.3	1.1	0.2	0.8	1.5	0.1
										WT	pY138(PrD17S)	9.2	13.8	1.6	30.4	29.1	9.5	56.0	24.6
	SD	0.3	0.3	0.2	0.7	0.4	0.2	0.9	0.2
										WT	pY139(PsD17S)	9.2	14.1	1.5	30.8	26.5	11.8	55.4	30.8
	SD	0.2	0.3	0.1	0.1	0.5	0.0	0.3	0.5
										WT	pY140(PaD17S)	9.0	13.3	1.7	33.6	23.1	12.2	51.2	34.6
	SD	0.2	0.3	0.2	0.3	0.3	0.3	0.5	0.7
										d12KO	pY6(载体ctrl)	6.7	10.8	2.1	71.4	未检测到	未检测到	未检测到	未检测到
	SD	0.3	0.3	0.3	1.2	0.0	0.0	未检测到	未检测到

d12KO	pY130(FmD15)	7.1	10.6	2.5	55.0	0.6	15.7	22.8	96.6
										SD	0.1	0.1	0.2	0.2	0.0	0.3	0.4	0.0
d12KO	pY138(PrD17S)	6.8	11.7	2.2	69.5	未检测到	未检测到	未检测到	未检测到
										SD	0.0	0.1	0.0	0.2	0.0	0.0	未检测到	未检测到
d12KO	pY139(PsD17S)	7.0	11.9	2.1	70.2	未检测到	未检测到	未检测到	未检测到
										SD	0.3	0.1	0.2	0.1	0.0	0.0	未检测到	未检测到
d12KO	pY140(PaD17S)	7.7	11.4	2.6	69.5	未检测到	未检测到	未检测到	未检测到
										SD	0.1	0.1	0.0	0.3	0.0	0.0	未检测到	未检测到

有底物供给的情况下的脂质概况的比较

为了研究不同ω-3去饱和酶对ω6底物而不是LA的相对底物特异性，为用不同质粒(即pY6、pY130、pY138、pY139和pY140)转化的d12KO菌株提供不同FA的混合物，为此，将菌株划线至MM平板上并将新鲜的培养物用于接种3mL的MM。在30℃下生长过夜后，将所有培养物稀释成0.5的OD₆₀₀，然后将它们等分成三份3mL的培养物。另外生长6小时后，收获培养物并将其再悬浮于含有1％Tergitol和0.5mMGLA、0.5mM EDA和0.5mM ARA的3mL MM中，让其生长了24小时时收获它们，用12mL 0.5％的Triton X-100洗涤一次，并用12mL蒸馏水洗涤一次。如上所述分析沉淀物的脂肪酸组成。

表达pY6(SEQ ID NO：88)、pY130(SEQ ID NO：89)、pY138(SEQID NO：90)、pY139(SEQ ID NO：91)和pY140(SEQ ID NO：92)的d12KO解脂耶氏酵母的脂肪酸概况在下面的表22中示出。在该表中，脂肪酸被鉴定为GLA(ω-6)、EDA(ω-6)、DGLA(ω-6)、ARA(ω-6)、ALA(ω-3)、STA(ω-3)、ETrA(ω-3)、ETA(ω-3)和EPA(ω-3)。脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)。ω-3去饱和酶将ω-6底物GLA、EDA、DGLA和ARA分别转化成它们的ω-3产物STA、ETrA、ETA和EPA的转化效率(“Conv.Effic.”)根据如下公式计算：[产物/(底物+产物)]×100。标准偏差缩写成“SD”，而“nd”表示未检测到。

有关FmD15、PsD17S、PrD17S和PaD17S的ω-6脂肪酸底物特异性的结果直观地汇总于图13中。具体地讲，与LA相关的数据来自野生型解脂耶氏酵母转化体，如表21中所示；所有其他数据都来自供给了不同ω-6脂肪酸底物的Δ12-去饱和酶受破坏的(d12KO)解脂耶氏酵母菌株，如表22中所示。脂肪酸DGLA在图中缩写成“HGLA”。

基于本文中提供的数据，与PsD17S、PrD17S和PaD17S比较，FmD15具有最高Δ15去饱和酶活性(表21，图13)。然而，不同于FmD15(其具有双功能Δ12/Δ15去饱和酶活性)，所测试的三种Δ17去饱和酶对油酸都不具有任何可检测的Δ12去饱和酶活性(表21)。在存在ω-6脂肪酸底物的情况下生长表明，所有的Δ17去饱和酶都对ARA具有最强的偏好性，对EDA和DGLA具有相对较低的活性，而对GLA具有最小的活性。PaD17S对ARA具有最强的活性。Δ17去饱和酶对C18底物LA具有显著的Δ15去饱和酶活性，其中该活性与对C20底物EDA和DGLA的Δ17去饱和酶活性相差不大(PsD17S和PrD17S也显示对LA具有显著的Δ15去饱和酶活性，但是该活性稍微弱于对C20底物的Δ17去饱和酶活性)。这三种Δ17去饱和酶的广泛催化混杂性将它们与专一地作用于C20ω-6脂肪酸底物的异丝水霉Δ17去饱和酶区分开来。

Claims

1.分离的核酸分子，所述核酸分子选自：

a.)编码选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的Δ17去饱和酶的分离的核苷酸分子；或，

b.)与(a)完全互补的分离的核苷酸分子。

2.编码Δ17去饱和酶的分离的核酸分子，所述核酸分子选自SEQID NO：1或SEQ ID NO：4。

3.多肽，所述多肽编码Δ17去饱和酶，所述去饱和酶由根据权利要求1所述的分离的核酸分子编码。

4.多肽，所述多肽编码Δ17去饱和酶，所述去饱和酶选自SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3。

5.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码如SEQ ID NO：2中示出的Δ17去饱和酶，其中至少175个密码子是经密码子最优化以用于在耶氏酵母属中表达。

6.嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作地连接至合适的调节序列的根据权利要求1所述的分离的核酸分子。

7.转化的宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1所述的分离的核酸分子。

8.权利要求7的转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自藻类、细菌、酵母、卵菌和真菌。

9.权利要求8的转化的宿主细胞，其中所述酵母是含油酵母。

10.权利要求9的转化的宿主细胞，其中所述含油酵母选自：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。

11.一种用于产生二十碳五烯酸的方法，所述方法包括：

a.)提供宿主细胞，其包含：

(i)编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述去饱和酶多肽选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3；和

(ii)花生四烯酸源；

b.)使步骤(a)的所述宿主细胞在使编码所述双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的所述核酸分子表达并使所述花生四烯酸转化成二十碳五烯酸的条件下生长；以及

c.)任选回收步骤(b)的所述二十碳五烯酸。

12.一种用于产生二十碳四烯酸的方法，所述方法包括：

a.)提供宿主细胞，其包含：

(i)编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述去饱和酶多肽示于SEQ ID NO：2；和

(ii)二高-γ-亚麻酸源；

b.)使步骤(a)的所述宿主细胞在使编码所述双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的所述核酸分子表达并使所述二高-γ-亚麻酸转化成二十碳四烯酸的条件下生长；以及，

c.)任选回收步骤(b)的所述二十碳四烯酸。

13.一种用于产生多不饱和脂肪酸的方法，包括：

a)提供宿主细胞，其包含：

i)编码双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述去饱和酶多肽示于SEQ ID NO：2；和

ii)脂肪酸源，所述脂肪酸选自亚油酸和二十碳二烯酸；

b)使步骤(a)的所述宿主细胞在使编码所述双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽的所述核酸分子表达并使所述亚油酸转化成α-亚麻酸和使所述二十碳二烯酸转化成二十碳三烯酸的条件下生长；以及，

c)任选回收步骤(b)的α-亚麻酸和二十碳三烯酸。

14.根据权利要求11、12或13任一项的方法，其中所述分离的核苷酸分子编码SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列所示的双功能Δ17/Δ15去饱和酶多肽，其中至少175个密码子经密码子最优化以用于在耶氏酵母属中表达。

15.根据权利要求11、12或13任一项的方法，其中：

a.)所述分离的核苷酸分子如选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的核酸序列所示；并且

b.)所述宿主细胞是解脂耶氏酵母。

16.根据权利要求11、12或13任一项的方法，其中所述宿主细胞选自藻类、细菌、酵母、卵菌和真菌。

17.根据权利要求16的方法，其中所述宿主细胞是选自下列的真菌：破囊壶菌属物种、裂殖壶菌属物种和被孢霉属物种。

18.根据权利要求16的方法，其中所述酵母是含油酵母。

19.根据权利要求18的方法，其中所述含油酵母选自：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。