CN103282474A - 从微生物生物质中获得包含多不饱和脂肪酸的组合物的方法 - Google Patents

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CN103282474A CN2011800202385A CN201180020238A CN103282474A CN 103282474 A CN103282474 A CN 103282474A CN 2011800202385 A CN2011800202385 A CN 2011800202385A CN 201180020238 A CN201180020238 A CN 201180020238A CN 103282474 A CN103282474 A CN 103282474A
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K.W.哈钦森
R.E.博克拉思
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Abstract

本发明公开了从微生物生物质中获得包含至少一种多不饱和脂肪酸的精制的脂质组合物的方法，其中所述精制的脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸且相对于所述微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。

Description

从微生物生物质中获得包含多不饱和脂肪酸的组合物的方法
本申请要求提交于2010年4月22日的美国临时专利申请61/326,793的优先权，将该专利的全文以引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及用包含二氧化碳的溶剂提取破碎的微生物生物质并分级来获得精制的脂质组合物的方法，所述精制的脂质组合物包含至少一种多不饱和脂肪酸且富含三酰基甘油。
发明背景
对在药物和膳食产品中包括多不饱和脂肪酸(PUFA)如二十碳五烯酸(EPA；ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；ω-3)的兴趣一直在持续地增长。可例如从天然微生物来源、从重组微生物、或从鱼油和海洋浮游生物中获得包含PUFA的脂质组合物。认为包含PUFA的脂质组合物在某些条件下是氧化不稳定的，这需要消耗可观的精力以获得未氧化的组合物。
美国专利公开4,675,132公开了浓缩鱼油中的PUFA部分的方法，所述鱼油包含相对低比例的饱和和单不饱和脂肪酸部分，其链长与拟浓缩的PUFA部分相同，包含具有低级链烷醇的酯交换鱼油甘油酯以形成低级烷基脂肪酸酯的混合物，并在超临界条件下用二氧化碳(CO2)提取所述酯。
开发用于产生高浓度EPA的连续逆流超临界CO2分级方法的工艺流程图由V.J.Krukonis等人(Adv.Seafood Biochem.，Pap.Am.Chem.Soc.Annu.Meet.(1992)，召开年份：1987，169-179)公开。该方法的原料是鲱油的尿素结晶乙酯，并且该设计的基础是在90％的产量下产物浓度为90％EPA(乙酯)。
美国专利公开6,727,373公开了包含PUFA的微生物油，其具有高甘油三酯含量和高氧化稳定性。此外，描述了一种从来源于经巴氏消毒的发酵液的微生物生物质中回收此类油的方法，其中所述微生物生物质经挤出形成颗粒、干燥、然后使用合适溶剂从干燥颗粒中提取所述油。
寻找其中可在包含PUFA的脂质组合物中调节三酰基甘油、二酰基甘油、单酰基甘油和游离脂肪酸的分配的方法。期望获得包含PUFA的脂质组合物的方法，所述组合物具有改善的氧化稳定性。也期望获得富含三酰基甘油的包含PUFA的脂质组合物的方法，该方法是用于获得此类组合物的经济型方法。
发明概述
在第一实施方案中，本发明提出了方法，所述方法包括以下步骤：
a)用包含液体或超临界流体二氧化碳的溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质，所述未处理的破碎的微生物生物质具有包含至少一种多不饱和脂肪酸的油组合物，以获得：
(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和，
(ii)包含磷脂的残余生物质；以及，
b)分级在步骤(a)的部分(i)中获得的提取物至少一次以获得包含至少一种多不饱和脂肪酸的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
在第二实施方案中，所述富含三酰基甘油的精制的脂质组合物包含至少一种脂质组分，所述脂质组分选自：二酰基甘油、单酰基甘油、游离脂肪酸、以及它们的组合。
在第三实施方案中，所述富含三酰基甘油的精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质富含至少一种多不饱和脂肪酸。
在第四实施方案中，本发明的方法还包括选自以下的步骤：
a)分级在步骤(a)的部分(i)中获得的提取物以获得包含至少一种多不饱和脂肪酸的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含脂质组分，所述脂质组分选自：二酰基甘油、单酰基甘油、游离脂肪酸、以及它们的组合；以及，
b)用提取剂加工步骤(a)的部分(ii)的包含磷脂的残余生物质以获得基本上由磷脂组成的残余生物质提取物。
在第五实施方案中，步骤(a)的加工在约20℃至约100℃的温度下和在约60巴至约800巴的压力下进行。步骤(b)的分级通过改变所述分级条件的温度、压力、或温度和压力执行。
在第六实施方案中，步骤(a)的加工溶剂包含超临界流体二氧化碳，并且步骤(b)的分级在约35℃至约100℃的温度下和在约80巴至约600巴的压力下进行。
在第七实施方案中，所述未处理的破碎的微生物生物质包含含油微生物细胞。
在第八实施方案中，所述至少一种多不饱和脂肪酸选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、以及它们的混合物。
在第九实施方案中，所述包含磷脂的残余生物质或所述基本上由磷脂组成的残余生物质提取物适于用作水产养殖饲料中的组分
在第十实施方案中，所述未处理的破碎的微生物生物质包含按所述未处理的破碎的微生物生物质中的总脂肪酸的重量％计至少25重量％的二十碳五烯酸。
在第十一实施方案中，本发明提出的方法包括用包含液体或超临界流体二氧化碳的溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质，所述未处理的破碎的微生物生物质具有包含至少一种多不饱和脂肪酸的油组合物，以获得：
(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和，
(ii)包含磷脂的残余生物质；
其中所述未处理的破碎的微生物生物质得自耶氏酵母属(Yarrowia)的含油微生物，所述耶氏酵母属的含油微生物积聚的油超过其干细胞重量的25％；并且
其中所述包含至少一种多不饱和脂肪酸的油组合物包含按总脂肪酸的重量％计至少25重量％的多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸具有至少二十个碳原子和四个或更多个碳-碳双键。
所述未处理的破碎的微生物生物质优选得自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，并且所述至少一种多不饱和脂肪酸包括二十碳五烯酸。
在第十二实施方案中，用提取剂加工所述包含磷脂的残余生物质以获得基本上由磷脂组成的残余生物质提取物。
生物保藏
下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，并具有下列名称、保藏号和保藏日期。
生物材料   保藏号   保藏日期
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4128   ATCC PTA-8614   2007年8月23日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8412   ATCC PTA-10026   2009年5月14日
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8259   ATCC PTA-10027   2009年5月14日
上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。
根据如美国专利申请公布2009-0093543-A1所述的方法，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y4305来源于解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Y4128。根据如美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y9502来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8412。类似地，根据如美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8672来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)Y8259。
附图概述
图1A和图1B以流程图的形式提供了本发明方法的概述，并且当考虑下文说明书时将它们视为一体。给每个文本框分配从A至L的一个字母标记。具体地讲，微生物发酵(图1A，I)产生未处理的微生物生物质(图1A，B)。然后机械或化学加工产生未处理的破碎的微生物生物质(图1A，C)。未处理的破碎的微生物生物质的油提取(图1A，D)产生包含磷脂的残余生物质(图1A，E)和基本上不含磷脂的提取油(图1A，I)，可将它们任选分级(图1B，I)以产生包含至少一种PUFA的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含TAG(图1B，L)。
图2图示了本发明方法的一个实施方案，其中微生物生物质接触CO2以获得随后分级的提取物。
图3图示了本发明方法的一个实施方案，其中微生物生物质接触CO2以获得提取物。
图4图示了实施例1中获得的提取曲线。
发明详述
本文引用的所有专利和非专利文献的公开全文以引用方式并入本文。
当数量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或优选上限值和优选下限值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。当本文描述数值范围时，除非另外指明，所述范围旨在包括其端点，以及所述范围内的所有整数和分数。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”，或者其任何其他变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另有相反的说明，“或”是指包含性的或而不是指排他性的或。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。
如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施方案，并无意于局限于任一具体实施方案或方面。
在该公开中使用以下定义：
“超临界流体”缩写为“SCF”。
“二氧化碳”缩写为“CO2”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“磷脂”缩写为“PL”。
“单酰基甘油”缩写为“MAG”。
“二酰基甘油”缩写为“DAG”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。本文术语“三酰基甘油”(TAG)与术语“甘油三酯”同义并且指由三个脂肪酰残基酯化的甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。
“脂肪酸”缩写为“FFA”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“干细胞重量”缩写为“DCW”。
“重量百分比”缩写为“重量％”。
如本文所用，术语“微生物生物质”指来自含油微生物的微生物发酵“的微生物细胞物质，所述含油微生物产生包含PUFA的微生物油。微生物生物质可为全细胞、全细胞裂解产物、匀化细胞、部分水解的细胞物质、和/或破碎细胞(因此术语微生物生物质一般可指未处理的微生物生物质或未处理的破碎的微生物生物质，见下文)。
术语“未处理的微生物生物质”指在用溶剂提取前的微生物生物质。微生物生物质任选地可为例如脱水的、干燥的、成粒状的和/或颗粒化的。术语“未处理的微生物生物质”和“未精制的微生物生物质”本文互换使用。
术语“未处理的破碎的微生物生物质”指已经经受破碎处理并且尚未经受溶剂提取的微生物生物质。本领域的技术人员将会知道这一点：可利用多种细胞破碎方法，包括例如用于细胞裂解的化学方法或经由物理装置如珠粒打浆机、螺杆式挤出机等进行机械破碎。
术语“残余生物质”指得自含油微生物的发酵的微生物细胞物质，所述微生物已经用溶剂提取至少一次。因此，残余生物质是消耗过的微生物生物质，从中已经通过提取除去了包含PUFA的微生物油。
术语“富含”指具有较大的量，例如仅略多于初始量的量，或者例如指数大于初始量的量，并且包括上述两者之间的所有量。
术语“减少的”或“耗尽的”指具有较小的量，例如仅略少于初始量的量，或者例如在指定物质中完全缺失的量，并且包括上述两者之间的所有量。
术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的不同组，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。表1显示了对脂质的综述，它基于Lipid Metabolitesand Pathways Strategy(LIPID MAP S)分类系统(National Institute ofGeneral Medical Sciences，Bethesda，MD)。
表1：脂质类别综述
Figure BDA00002287142200071
术语“油”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油构成总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油(TAG)组成，但是也可包含其他中性脂质、磷脂(PL)和游离脂肪酸(FFA)。油中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的升高或降低将对应于油中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
“中性脂质”指那些一般作为贮存脂肪存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们之所以被称为“中性脂质”，是因为在细胞的pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油(MAG)、二酰基甘油(DAG)或TAG，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放FFA，必须发生水解反应。
术语“提取”指通过溶剂从底物中除去一个或多个组分的物理或化学方法。
术语“分级”指将分子的复杂混合物组分选择性地分离成级份，所述级份使这些组分具有与原料不同并且彼此不同的分配。
术语“提取油”指已经从细胞材料中分离的油，例如其能够合成微生物油的微生物。提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如，使用多种挤压构造(例如，螺杆、螺旋压榨机、活塞、珠粒打浆机等)的机械压碎能够从细胞材料分离油。作为另外一种选择，可通过用多种有机溶剂处理(例如己烷、异己烷)、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取(例如CO2提取)、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。任选地进一步纯化或浓缩提取的油。
术语“精制的脂质组合物”指微生物油组合物，它是本文所公开的提取和分级方法的产物。因此，所述精制的脂质组合物是基本上不含磷脂的提取油。虽然本领域的技术人员将会知道可在分级方法中分离不同级份，分级产生的至少一种精制的脂质组合物将相对于微生物生物质的油组合物富含TAG。所述富含TAG的精制的脂质组合物可包含DAG、MAG、FFA、以及它们的组合。可分离附加的精制的脂质组合物，其包含中性脂质、FFA、以及它们的组合的多种级份，例如富含脂质组分的精制的脂质组合物，所述脂质组分选自DAG、MAG、FFA、以及它们的组合。精制的脂质组合物可进行进一步纯化以产生“纯化油”。
术语“基本上不含磷脂(PL)”指包含不超过约0.1重量％的磷脂。因此，当PL的浓度按总脂质的重量％计不超过约0.1重量％时，包含脂质级份的提取物基本上不含PL。类似地，当PL的浓度按总脂质的重量％计不超过约0.1重量％时，精制的脂质组合物基本上不含PL。
术语“总脂肪酸”(TFA)本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯(FAME)，例如它可以是微生物生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级份(包括DAG、MAG和TAG)和来自极性脂质级份(包括磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级份)的脂肪酸，但不包括FFA。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以占干细胞重量(DCW)的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比(FAME％DCW)量度。因此，总脂质含量(TFA％DCW)等于，例如，脂肪酸毫克数每100毫克DCW。
总脂质中的脂肪酸浓度在本文中表示为占TFA的重量百分比(％TFA)，例如，给定脂肪酸的毫克数每100毫克TFA。在本公开中，除非另有特别说明，所提及的给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于所述脂肪酸以％TFA表示的浓度(例如％EPA对总脂质等同于EPA％TFA)。
在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占干细胞重量的重量％(％DCW)是有用的。因此例如EPA％DCW将根据下式测定：(EPA％TFA)*(TFA％DCW)]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量％表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：(EPA％TFA)*(FAME％DCW)]/100。
术语“脂质谱”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级份中，例如在总脂质或油中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以占TFA的重量百分比形式表示混合物中存在的各单个脂肪酸的总量应当是100。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C12至C22(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主要的链长介于C22和C16之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸(PUFA)”、以及“ω-6脂肪酸(ω-6或n-6)”对“ω-3脂肪酸(ω-3或n-3)”之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。
表2提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。
表2：多不饱和脂肪酸及其前体的命名
Figure BDA00002287142200101
术语“高水平PUFA生产”是指生产占微生物宿主总脂质至少约25％的PUFA，优选地占微生物宿主总脂质至少约30％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约35％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约40％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约40-45％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约45-50％的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约50-60％，并且最优选地占微生物宿主总脂质至少约60-70％的PUFA。PUFA的结构形式不受限制；因此例如PUFA可在总脂质中以FFA形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。
术语“含油微生物”指能够产生微生物油的微生物。因此，含油微生物可为酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、或它们的组合。在优选的实施方案中，含油微生物是含油的。
术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。通常，含油微生物的细胞油符合S形曲线，其中脂质浓度提高直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油生物的实例包括但不限于选自以下属的生物：被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)和多种含油酵母。
术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。含油酵母的实例包括但不限于以下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
术语“动物饲料”指旨在专用于动物消耗的饲料，动物包括家畜如宠物、农场动物等，或用于为了生产食品而喂养的动物，如养鱼场。术语“水产养殖饲料”、“水产饲料”和“饲料营养物质”如美国专利申请公布2006-0115881-A1中所提出的。
通常，含油微生物的脂质蓄积响应存在于生长培养基中的总的碳氮比率而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成。
可将多种脂肪酸(包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸)掺入TAG，它是脂肪酸的主要贮藏单位。在本文所述的方法中，向TAG中掺入长链PUFA是最合乎期望的，尽管PUFA的结构形式是不受限制的(因此，例如，在总脂质中可以作为FFA或以酯化形式如酰基甘油、PL、硫脂或糖脂存在)。更具体地讲，在本发明方法的一个实施方案中，含油微生物将产生至少一种PUFA，其选自LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、AlA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。更优选地，所述至少一种PUFA具有至少C20的链长，例如PUFA选自EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在另一个实施方案中，所述至少一种PUFA具有至少C20的链长和四个或更多个碳-碳双键，即，PUFA选自ARA、EPA、DPAn-6、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在另一个优选的实施方案中，所述至少一种PUFA选自EPA和DHA。
虽然大多数PUFA以中性脂类的形式掺入TAG并贮存于脂质体中，但是重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应至少包括那些位于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和TAG级份中的PUFA。
在本文的一个实施方案中，本发明涉及获得包含至少一种PUFA的精制的脂质组合物的方法，其中所述精制的脂质组合物相对于未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含TAG。所述富含TAG的精制的脂质组合物还可包含DAG、MAG、FFA、以及它们的组合。可获得附加的精制的脂质组合物级份，其包含至少一种PUFA并富含DAG、MAG、FFA、以及它们的组合。优选地，所述富含TAG的至少一种精制的脂质组合物相对于微生物生物质的油组合物消耗了游离FFA且相对于未处理的破碎的微生物生物质富含至少一种PUFA。最优选地，富含的至少一种PUFA具有至少20个或更多个碳原子。
在本文另一个实施方案中，本发明涉及其中用包含液体或超临界流体二氧化碳的溶剂处理未处理的破碎的微生物生物质的方法。(a)所述未处理的破碎的微生物生物质得自耶氏酵母属(Yarrowia)的含油微生物，所述耶氏酵母属的含油微生物积聚的油超过其干细胞重量的25％；并且，(b)其中所述包含至少一种PUFA的油组合物包含按总脂肪酸的重量％计至少25重量％的PUFA，所述PUFA具有至少二十个碳原子和四个或更多个碳-碳双键。这产生：(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和，(ii)包含磷脂的残余生物质。
虽然本发明大体上提出了本文所公开的方法，人们将会知道可用于获得含油微生物的相关方法的概况，从所述含油微生物本身获得未处理的破碎的微生物生物质(参见图1A和图1B，并参见其中的文本框)。大多数方法将从微生物发酵开始(图1A，A)，其中在允许微生物生长并产生包含至少一种PUFA的微生物油的条件下培养特定微生物。在一个合适的时间，从发酵罐中收获所述微生物细胞。这种未处理的微生物生物质(图1A，B)任选地可使用多种装置进行加工，例如脱水、干燥、制粒、成粒等，随后进行破碎(图1A，C)。然后进行未处理破碎的微生物生物质的油提取(图1A，D)，产生包含磷脂[“PL”]的残余生物质(例如细胞碎片)(图1A，E)和基本上不含PL的提取油(图1A，I)，任选地可将它们分级(图1B，J)以产生精制的脂质组合物，其包含至少一种PUFA，其中所述精制的脂质组合物相对于未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含TAG(图1B，L)。包含PL的残余生物质(图1A，E)可进行进一步提取(图1B，F)。图1A和图1B的这些方面中的每一个将在下文中进行进一步的详细讨论。
含油微生物经由微生物发酵产生微生物生物质。微生物生物质可来自任何微生物，无论是天然存在的微生物或重组微生物(“遗传工程的”)，它们能够产生包含至少一种PUFA的微生物油。因此，例如含油微生物可选自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、以及它们的混合物。优选地，所述微生物将能够具有在微生物油中的高水平PUFA产量。
例如商业来源的ARA油通常从被孢霉属(Mortierella，丝状真菌)、虫霉属(Entomophthora)、草腐霉枯萎属(Pythium)和紫球藻属(Porphyridium，红藻)微生物中产生。最需要注意的是，MartekBiosciences Corporation(Columbia，MD)生产包含ARA的真菌油(ARASCO
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；美国专利公开5,658,767)，其基本上不含EPA并且来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)或腐皮病诱发腐霉(Pythiuminsidiuosum)。
类似地，EPA可基于利用的特定微生物的天然能力经由多个不同方法由微生物产生[例如异养生物硅藻小环藻属(Cyclotella sp.)和菱形藻属(Nitzschia sp.)(美国专利公开5,244,921)；假单胞菌属(Pseudomonas)、交替单胞菌属(Alteromonas)或希瓦氏菌属(Shewanella)菌种(美国专利公开5,246,841)；草腐霉枯萎属(Pythium)的丝状真菌(美国专利公开5,246,842)；或长被孢霉属(Mortierellaelongata)、微小被孢霉(M. exigua)、或喜湿被孢霉(M.hygrophila)(美国专利公开5,401,646)]。描述天然产生EPA的微生物的有用参考文献为Z.Wen和F.Chen，In Single Cell Oils；C.Ratledge和Z.Cohen编辑；AOCS Publishing，2005；第10章，题目为“Prospects for EPAproduction using microorganisms”。
DHA也可使用基于天然微生物的天然能力的方法产生。参见例如开发用于裂殖壶菌属(Schizochytrium)菌种的方法(美国专利公开5,340,742；美国专利公开6,582,941)；吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(美国专利公开6,509,178)；假单胞菌属(Pseudomonas sp.)YS-180(美国专利公开6,207,441)；破囊壶菌属(Thraustochytrium)菌株LFF1(美国专利公开申请公布2004/0161831A1)；寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)(美国专利公开申请公布2004/0072330A1；de Swaaf，M.E.等人，Biotechnol Bioeng.，81(6)：666-72(2003)和Appl MicrobiolBiotechnol.，61(1)：40-3(2003))；Emiliania sp.(日本专利公布(Kokai)5-308978(1993))；和Japonochytrium sp.(ATCC#28207；日本专利公布(Kokai)199588/1989)]。此外，已知以下微生物具有产生DHA的能力：海产弧菌(Vibrio marinus)(从深海中分离出的细菌；ATCC#15381)；微藻类隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)和绿光等鞭金藻(Isochrysis galbana)；以及鞭毛虫真菌如金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)(ATCC#34304；Kendrick，Lipids，27：15(1992))和破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)，它们称为ATCC#28211、ATCC#20890和ATCC#20891。目前有至少三种不同的发酵方法用于DHA的商业生产：发酵寇氏隐甲藻(C.cohnii)以生产DHASCOTM(Martek Biosciences Corporation，Columbia，MD)；发酵裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)以生产以前已知为DHAGold的油(MartekBiosciences Corporation)；以及发酵吾肯氏壶菌属(Ulkenia sp.)以生产DHActiveTM(Nutrinova，Frankfurt，Germany)。
期望使用重组方法，用微生物生产微生物油中的PUFA，该方法与从天然微生物来源的生产相比具有多个优点。例如，可使用具有优选的油生产特性的重组微生物，因为可通过将新的生物合成途径导入宿主和/或通过抑制非期望的途径改变宿主天然存在的微生物脂肪酸特征，从而导致期望PUFA(或其共轭形式)的产量提高并降低非期望PUFA的产量。第二，重组微生物能够提供特殊形式的PUFA，该PUFA可具有特别的用途。此外，可通过控制培养条件操纵微生物油生产，要注意的是通过向微生物表达的酶提供特定的底物源，或通过加入化合物/基因工程以抑制不可取的生物化学途径。因此例如改变由此生产的ω-3对ω-6脂肪酸的比率，或工程化生产不显著积聚其它下游或上游PUFA产物的特殊PUFA(例如EPA)是可能的。
因此，例如通过导入合适的PUFA生物合成途径基因，例如Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ-12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶和C18/20延伸酶的特定组合，可将缺乏制造EPA的天然能力的微生物工程化以表达PUFA生物合成途径，但是应当认识到导入的特定酶(以及编码那些酶的基因)绝不受本发明的限制。
例如，已经将多个类型的酵母进行了重组工程化以产生至少一种PUFA。参见例如对啤酒糖酵母的研究(Dyer，J.M.等人，Appl.Environ.Microbiol.，59：224-230(2002)；Domergue，F.等人，Eur.J.Biochem.，269：4105-4113(2002)；美国专利公开6,136,574；美国专利申请公布2006-0051847-A1)和含油酵母、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(美国专利公开7,238,482；美国专利公开7,465,564；美国专利公开7,588,931；美国专利申请公布2006-0115881-A1；美国专利公开7,550,286；美国专利申请公布2009-0093543-A1；美国专利申请公布2010-0317072-A1)。
在一些实施方案中，如果微生物宿主是含油的，注意到其具有优点。含油微生物宿主细胞可为例如选自下组的属的成员：被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)和含油酵母(oleaginous yeast)。含油酵母天然能够合成并积聚油，其中总油含量可占细胞干重的超过约25％，更优选占细胞干重的超过约30％，而最优选占细胞干重的超过约40％。在其他实施方案中，非含油酵母可经基因修饰变成含油酵母，使得它能够产生占细胞干重超过25％的油，例如酵母如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)(国际专利申请公布WO 2006/102342)。
通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、禾木科红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；并且，在又一个实施方案中，最优选的是命名为ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944、ATCC#76982和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)：43-9(2002))。
在一些实施方案中，期望含油酵母能够“产生高水平的PUFA”，其中所述生物能够产生总脂质中至少约5-10％的期望PUFA(即，LA、AlA、EDA、GLA、STA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、DPA n-6、EPA、DPA n-3和/或DHA)。更优选地，含油酵母将产生总脂质中至少约10-25％的期望PUFA，更优选地产生总脂质中至少约25-35％的期望PUFA，更优选地产生总脂质中至少约35-50％的期望PUFA，并且最优选地产生总脂质中至少约50-70％的期望PUFA。PUFA的结构形式不受限制；因此例如，EPA可在总脂质中以FFA或酯化形式存在。优选地，所述至少一种PUFA为TAG形式。
因此，本文所述的PUFA生物合成途径基因和基因产物可在异源性微生物宿主细胞、尤其是在含油酵母(例如耶氏酵母属)细胞中产生。在重组微生物宿主中的表达可用于产生多种PUFA途径中间产物，或者可用于调节宿主中已经存在的PUFA途径，用以合成迄今为止用该宿主不能合成的新产物。
虽然基于上文提供的引用文献多种含油酵母能够经工程化以产生优选的ω-3/ω-6PUFA，在表3中描述了含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的代表性的PUFA生产菌株。这些菌株具有以下PUFA生物合成途径基因的多种组合：Δ-4去饱和酶、Δ-5去饱和酶、Δ-6去饱和酶、Δ_12去饱和酶、Δ-15去饱和酶、Δ-17去饱和酶、Δ-9去饱和酶、Δ-8去饱和酶、Δ-9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶，但是应当认识到导入的特定酶(以及编码那些酶的基因)和产生的特定PUFA绝不受本发明的限制。
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本领域的技术人员将会知道本发明的方法不限于使用得自上述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株的微生物生物质，也不限于使用其中本发明已经展示的菌种(即，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))或属(即，耶氏酵母属(Yarrowia))，因为将PUFA生物合成途径导入含油酵母的方法是熟知的。相反地，能够产生包含至少一种PUFA的微生物油的任何含油酵母或任何其他适用微生物将同样适用于本发明方法。
可培养产生包含至少一种期望PUFA的脂质的微生物菌种并在使所述微生物产生脂质的条件下，在发酵培养基中培养所述微生物(图1A，A)。通常向所述微生物提供碳源和氮源、以及许多附加的化学物质或底物，它们允许所述微生物生长和/或产生包含至少一种PUFA的微生物油。如上文引文所述，发酵条件将取决于使用的微生物，并且可经优化以在所得微生物生物质中得到高含量的至少一种PUFA。
通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)通常在复合培养基，例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基(YPD)，或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择生产PUFA所需重组表达盒的最低限定培养基(例如，YeastNitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，IM))中生长。
当期望量的包含至少一种PUFA的微生物油已经由微生物产生时，可通过例如干燥、脱水、制粒和/或成粒来加工发酵培养基以获得包含所述微生物油的未处理微生物生物质(图1A，B)。
更具体地讲，例如发酵培养基可经过滤或换句话讲经处理以除去至少部分的含水组分(例如通过干燥)。本领域的技术人员将认识到这一点，未经处理的微生物生物质通常包括水。优选地，在微生物发酵后从未处理的微生物生物质中除去一部分水以提供具有小于10重量％的水分含量，更优选地小于5重量％的水分含量，以及最优选地3重量％或更少的水分含量的微生物生物质。微生物生物质水分含量可通过干燥进行控制。优选地，微生物生物质具有的水分含量在约1重量％至10重量％的范围内。
可经由其他装置巴氏消毒或处理发酵培养基和/或微生物生物质以降低能够损害微生物油和/或PUFA产量的内源性微生物酶的活性。
然后未处理的微生物生物质在用溶剂提取之前经过至少一个破碎步骤以产生“未处理的破碎的微生物生物质”(图1A，C)。破碎可通过机械/物理装置(例如经由珠粒打浆机、螺杆式挤出机等)或化学方法(例如经由酶处理剂或渗透处理以促进细胞裂解)进行。这种破碎使微生物细胞内容物较易于得到。
然后例如用溶剂提取来加工未处理的破碎的微生物生物质(图1A，D)，从而获得提取油和残余生物质。提取油包含基本上不含PL的脂质级份(图1A，I)，而残余生物质包含PL(图1A，E)。
虽然油提取能够经由用多种有机溶剂(例如己烷、异己烷)处理、经由酶提取、经由渗透休克、经由超声波提取、经由超临界流体提取(例如CO2提取)、经由皂化以及经由这些方法的组合而发生，在本文优选的实施方案中，所述溶剂包含液体或超临界流体CO2。
超临界流体(SCF)表现出介于那些气体和液体之间的中间体特性。SCF的一个关键特征是通过改变温度或压力、或它们的组合能够持续改变流体密度，从液体样密度变为气体样密度。多个密度依赖性的物理特性同样表现出在此范围内类似的连续改变。这些特性中的一些包括但不限于溶剂强度(这一点通过不同物质在SCF介质中的溶解度得到证明)、极性、粘度、扩散性、热容、热导率、等温压缩率、膨胀性、收缩性、流动性、和分子堆积。SCF中的密度变化也影响溶质的化学势并因此影响反应速率和平衡常数。因此，在SCF介质中的溶剂环境可通过调节多个密度依赖性流体特性进行优化以供特定用途。
当体系温度和压力超过由临界温度(Tc)和压力(Pc)限定的相应临界点值时，流体处于SCF状态。对于纯物质，气相和液相能够共存时Tc和Pc是最高的。高于Tc时，无论施加多大压力，液体不会形成纯物质。相似地，在对应于气相和液相共存状态的这一Tc，限定了Pc和临界摩尔体积。虽然多组分混合物更为复杂，但混合物临界状态类似地进行鉴定，因为气相和液相共存时的条件变得不能区别。为了讨论超临界流体，参见Kirk-Othmer Encycl.of Chem.Technology，第4版，第23卷，第452-477页。
任何适用的SCF或液体溶剂可用于最初的提取步骤，例如用溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质以从微生物生物质中分离包含PUFA的微生物油，所述溶剂包括但不限于CO2、四氟甲烷、乙烷、乙烯、丙烷、丙烯、丁烷、异丁烷、异丁烯、戊烷、己烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯、以及它们的混合物，前提条件是它对所有试剂和产物是惰性的。优选的溶剂包括CO2或C3-C6烷烃。较优选的溶剂是CO2、戊烷、丁烷和丙烷。最优选的溶剂是包含CO2的SCF溶剂。包含CO2的SCF还可包含至少一种附加溶剂(即，共溶剂)，例如一种或多种上述溶剂，只要存在的附加溶剂或者附加溶剂的量对所述方法无害，例如在最初的提取步骤期间不增溶微生物生物质中包含的PL。然而，可加入一种极性共溶剂如乙醇、甲醇、丙酮等以有意地赋予溶剂相极性，使得能够从残余微生物生物质中提取PL(即，在任选的二次提取期间)以分离PL。
根据至少两种方法，具有包含至少一种PUFA的微生物油的未处理破碎的微生物生物质可用液体或超临界CO2在合适的提取条件下进行加工(图1A，D)以提供提取油和残余生物质。根据第一种方法，用CO2加工未处理的破碎的微生物生物质在提取/分级条件下进行多次，所述条件对应于提高的溶剂密度，例如在提高的压力和/或降低的温度下进行，从而获得至少一种提取物，其包含具有至少一种PUFA的精制的脂质组合物。虽然提取物的精制的脂质组合物根据它们的相对溶解度在FFA、MAG、DAG和TAG的分配上不同，所述相对溶解度取决于对应于多个提取中每一个所选提取条件的溶剂密度，但至少一种精制的脂质组合物将相对于未处理的破碎的微生物生物质富含TAG(图1B，L)。
作为另外一种选择并且根据本发明方法，在第二种方法中用溶剂例如CO2在提取条件下加工未处理的破碎的微生物生物质(图1A，D)，选择所述加工条件以提供包含基本上不含PL的脂质级份的提取油(图1A，I)，其随后经一系列多段降压分级步骤以提供精制的脂质组合物。这些分段降压步骤中的每一个在分隔体容器中进行，进行的压力和温度条件对应于降低的溶剂密度以分离液相精制的脂质组合物，其能够通过例如简单的滗析从提取相中分离出来。提供的精制的脂质组合物根据它们的相对溶解度在FFA、MAG、DAG和TAG的分配上不同，所述相对溶解度取决于对应于分段分隔体容器所选条件的溶剂密度。至少一种精制的脂质组合物将相对于未处理破碎的微生物生物质的油组合物富含TAG(图1B，L)。
当提取条件适当匹配时，通过第二种方法获得的精制的脂质组合物可相当于在第一种方法中获得的提取物。因此据信通过实施第一种方法例示本发明方法可获得的精制的脂质组合物是可能的。
根据本发明方法，可用溶剂如液体或SCF CO2在某一温度和压力加工未处理的破碎的微生物生物质足够的时间以获得提取物(即，提取油)，其包含基本上不含PL的脂质级份(图1A，I)。脂质级份可包含中性脂质(例如TAG、DAG和MAG)以及FFA。足够的加工时间以及合适的CO2对生物质的比率可通过生成特定微生物生物质样品的提取曲线进行测定，例如如实施例1所述。这些提取曲线取决于温度、压力、CO2流量的提取条件，以及变量如细胞破碎程度和生物质形式。在本发明方法的一个实施方案中，所述溶剂包含液体或超临界流体CO2并且CO2对微生物生物质的质量比为约20∶1至约70∶1，例如约20∶1至约50∶1。
包含基本上不含PL的脂质级份的提取物(图1A，I)然后可任选地分级至少一次以获得精制的脂质组合物。所述分级通过改变所述分级条件的温度、压力、或温度和压力进行。可在多个分离过程的其中一个中完成分级，包括例如富含SCF提取物的连续减压、在一系列混合澄清槽塔板或提取塔中的液体或SCF溶剂提取、短程蒸馏、真空汽提、或熔融结晶。可重复分级所述提取物的步骤一次或多次以提供附加的精制的脂质组合物。
降低例如所述提取物的压力降低溶解溶质的溶解度，在每个分离容器中形成分离的液相。可例如通过使用换热器调节给料于每个分离容器的提取物的温度，从而在每个分离容器中提供期望的溶剂密度和相应的溶质溶解度。初始的提取物由多个类型的脂质组分(例如FFA、MAG、DAG和TAG)的络合混合物组成，所述脂质组分表现出相似的溶解度参数，因此将不会很好地分离不同的组分，而是在分级步骤中获得的每个精制的脂质组合物将包含分配的产物。然而，一般来讲，溶解度较低的化合物在最高压力下运行的第一分离容器中冷凝，而溶解度最高的化合物在最低压力下运行的最终分离容器中冷凝。最终分离容器将提取物相的压力降至足以基本上除去提取物相中剩余的大量溶质，并且向来自这一容器顶部的相对纯的CO2流可再循环到初始的提取容器中。
包含至少一种PUFA的精制的脂质组合物基本上不含PL。至少其中一种精制的脂质组合物将相对于微生物生物质的油组合物富含TAG(图1B，L)并且还可包含DAG、MAG、或它们的组合。富含TAG的精制的脂质组合物还可包含FFA。在分级步骤中可分开或组合获得的其他精制的脂质组合物包括消耗了FFA的富含TAG的产物、消耗了TAG的富含FFA的产物、富含MAG和/或DAG的富含FFA的产物、消耗了MAG和/或DAG的富含FFA的产物、富含MAG和/或DAG的富含TAG的产物、以及消耗了MAG和/或DAG的富含TAG的产物(图1B，K)。根据使用的分级条件，在本发明方法的一个实施方案中，所述至少一种富含TAG的精制的脂质组合物可相对于微生物生物质的油组合物消耗FFA。在一个实施方案中，所述至少一种富含TAG的精制的脂质组合物可相对于微生物生物质的油组合物富含至少一种PUFA。
在一个实施方案中，所述至少一种富含TAG的精制的脂质组合物可相对于所述生物质的油组合物富含至少一种PUFA，其具有20个或更多个碳原子，其中所述至少一种PUFA具有20个或更多个碳原子，其可优选地包含至少四个碳-碳双键。
可选择加工和分级温度以提供液体或SCF CO2、以在至少一种PUFA的热稳定范围内、以及提供足够的CO2密度以增溶TAG、DAG、MAG和FFA。一般来讲，加工和分级温度可为约20℃至约100℃，例如约35℃至约100℃；压力可为约60巴至约800巴，例如约80巴至约600巴。
图2图示了本发明方法的一个实施方案。在图2中，包含未处理的破碎的微生物生物质的物流10和包含CO2的物流38显示进入容器14。包含未处理的破碎微生物生物质的物流12和包含平衡CO2和提取物的物流16显示进入容器18。用CO2加工包含具有至少一种PUFA的微生物油的未处理破碎的微生物生物质发生在初始温度T14和压力P14的容器14与温度T18和压力P18的容器18中。T14可与T18相同或不同；P14可与P18相同或不同。平衡CO2和提取物的所得混合物以物流16的形式离开容器14，进入容器18，在其中进一步加工微生物生物质和CO2以提供包含基本上不含PL的脂质级份的提取物，它显示为物流20。残余生物质(未示出)保留在容器14和16中。如果需要，所述方法可包括附加的提取容器(未示出)。作为另外一种选择，如果需要，所述方法可仅使用一个提取容器(未示出)。使用多于一个提取容器可为有利的，因为这能够通过改变加到提取容器(未示出)中的溶剂的相对顺序使连续的CO2流过，并且同时一个或多个提取容器离线(未示出)以例如用于充满微生物生物质或用于除去残余生物质。
提取容器的下游显示具有两个串联的分离容器，容器22和28，其中通过分段降压，任选地通过调节温度如通过使用换热器(未示出)进行提取物的分级。如果需要，所述方法可包括附加的分离容器(未示出)。包含CO2和基本上不含PL的脂质级份的提取物显示以物流20的形式进入容器22。在容器22中，压力P22低于P18并且温度T22可与T18相同或不同；在所述方法的运行条件下，形成包含较少可溶脂质组分的分离液相。得自所述提取物分级的分离液相显示以物流24的形式离开容器22，它提供通过本发明方法获得的第一精制的脂质组合物。将显示为物流26的剩余提取物导入下一个分离容器28，其中所述压力P28与P22相比降低，并且温度T28可与T22相同或不同。所述方法的运行条件能够在容器28中形成分离的液相，其显示以物流30的形式离开分离容器28。物流30提供通过本发明方法获得的第二精制的脂质组合物。
容器28中的包含相对纯CO2的剩余提取物显示为物流32，它可再循环到提取容器14和/或另一个提取容器(未示出)中。CO2的回收利用通常提供比一次性使用CO2更大的经济有益效果。可使用显示为物流34的吹扫物流除去挥发性组分，所述挥发性组分可因为方法连续回收利用的CO2而积聚起来。可加入补偿CO2以抵消清洗导致的CO2损失。可加入补偿CO2到再循环CO2流中，如图2所示，通过加入物流36的补偿CO2流8提供混合CO2流38。作为另外一种选择，可将附加的CO2加到容器14和/或容器18中作为分离的进料流(未示出)。
图3图示了本发明方法的提取步骤的一个实施方案。在图3中，将包含CO2的物流70导入提取容器76中，其包含未处理的破碎微生物生物质(未示出)。任选地，用泵(未示出)将共溶剂(显示为物流72)加到CO2流中以提供包含CO2和共溶剂的混合物流74。在其中不使用共溶剂的情况下，物流70和物流74是相同的并且仅包含CO2。在容器76中用CO2加工包含至少一种PUFA的未处理破碎的微生物生物质，并且以物流78的形式从容器中除去包含基本上不含PL的脂质级份的提取物以及CO2溶剂和任选的共溶剂。残余生物质(未示出)保留在提取容器中。然后可如上所述在至少一个分离容器中分级包含基本上不含PL的脂质级份的提取物，参见图2，或者任选地，可通过排出CO2和任选的共溶剂(未示出)从提取物中分离基本上不含PL的脂质级份。
来自上文初始提取的残余生物质包含PL(图1A，E)。这种残余生物质可用极性提取溶剂第二次提取(图1B，F)，例如极性有机溶剂如二氯甲烷或包含CO2和极性共溶剂如醇的混合溶剂，从而获得基本上不含中性脂质的PL级份(即，“基本上由PL组成的残余生物质提取物”；图1B，H)。极性共溶剂可包括例如甲醇、乙醇、1-丙醇、和/或2-丙醇。包含PL的残余生物质(图1A，E)或提取的PL级份(图1B，H)可适于用作例如水产养殖饲料。
本文所述的基于CO2的提取/分级方法提供了相对于常规的基于有机溶剂的方法的多个优点。例如，CO2是无毒的、不易燃的、环保的、易得的和廉价的。CO2(Tc＝31.1℃)能够在相对低的温度下从微生物生物质中提取热不稳定的脂质以最小化微生物油中的脂质降解。提取的脂质可从通过简单地从加压提取物中排出CO2，而不是通过热处理反萃取有机溶剂，从CO2溶剂中分离出来。提取物中的脂质级份基本上不含PL并且可从微生物生物质中分离出来。包含PL的残余微生物生物质(图1A，E)可为可销售的副产物，例如水产养殖饲料。可从残余微生物生物质中提取PL，它是消耗了中性脂质的相对纯的副产物(图1B，H)。基本上不含PL的提取的脂质级份(图1A，I)可被分级(图1B，J)以产生例如相对于破碎的微生物生物质富含FFA和DAG(并消耗了TAG)的精制的脂质组合物(图1B，K)和相对于破碎的微生物生物质富含TAG(并消耗了FFA和DAG)的精制的脂质组合物(图1B，L)。
因此，本发明提供了获得包含至少一种PUFA的精制的脂质组合物的方法，其中：
a)用包含液体或SCF CO2的溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质，所述未处理的破碎的微生物生物质具有包含至少一种PUFA的油组合物，以获得：
(i)包含基本上不含PL的脂质级份的提取物；和，
(ii)包含PL的残余生物质；以及，
b)分级在步骤(a)的部分(i)中获得的提取物至少一次以获得包含至少一种PUFA的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含TAG。
优选地，步骤(a)的加工在约20℃至约100℃的温度下和在约60巴至约800巴的压力下进行，并且步骤(b)的分级在约35℃至约100℃的温度下和在约80巴至约600巴的压力下进行。本文所公开的方法通过改变所述分级条件的温度、压力、或温度和压力执行。
在另一方面，本文所公开的方法还包括选自以下的步骤：
(1)分级在步骤(a)的部分(i)中获得的提取物以获得包含至少一种PUFA的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含脂质组分，所述脂质组分选自：DAG、MAG、FFA、以及它们的组合；以及，
(2)用提取剂加工步骤(a)的部分(ii)的包含PL的残余生物质以获得基本上由PL组成的残余生物质提取物。
在另一个实施方案中，本文所公开的方法利用未处理的破碎的微生物生物质，其包含含油的微生物细胞。这些含油的微生物细胞优选地选自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、以及它们的混合物。更优选地，所述细胞是选自下组的属的成员：被孢霉属(Mortierella)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)，其中所述耶氏酵母属(Yarrowia)是尤其优选的。
微生物生物质将包含至少一种PUFA，其选自：LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、AlA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。优选地，所述至少一种PUFA选自：EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物(即，对应于具有至少二十个碳原子的PUFA)。如本发明实例所示，未处理的破碎微生物生物质将按TFA的重量％计优选地包含至少25重量％的EPA，但是这在本发明中不应理解为限制性的。
在其他实施方案中，本文提供的方法包括用包含液体或SCF CO2的溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质，所述未处理的破碎的微生物生物质具有包含至少一种PUFA的油组合物，以获得：
(i)包含基本上不含PL的脂质级份的提取物；和
(ii)包含PL的残余生物质；
其中所述未处理的破碎的微生物生物质得自耶氏酵母属(Yarrowia)的含油微生物，所述耶氏酵母属的含油微生物积聚的油超过其干细胞重量的25％；并且
其中所述包含至少一种PUFA的油组合物包含按TFA的重量％计至少25重量％的PUFA，所述PUFA具有至少二十个碳原子和四个或更多个碳-碳双键。
所述未处理的破碎的微生物生物质优选地得自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，并且所述至少一种PUFA优选地包括EPA。
包含至少一种PUFA如EPA(或其衍生物)的提取油组合物和/或精制的脂质组合物将具有熟知的临床和药物价值。参见例如美国专利申请公布2009-0093543A1。例如包含PUFA的脂质组合物可被用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA(或其衍生物)掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。
给人或动物补充PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸(即前列腺素、白三烯和血栓素)、DPAn-3和DHA的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。
作为另外一种选择，PUFA或其衍生物能应用于动物或水产饲料的合成中，如干饲料、半湿饲料和湿饲料，因为这些制剂一般需要至少1-2％的营养物质组合物是ω-3和/或ω-6PUFA(美国专利申请公布2006-0115881-A1)。具体地讲，本文预期包含PL的残余生物质可适于用作水产养殖饲料或其组分。作为另外一种选择，可用提取剂提取残余生物质以获得基本上由PL组成的残余生物质提取物，它可用于制备水产养殖饲料。
实施例
本发明将在下面的实施例中得到进一步阐述。应该理解，这些实施例尽管说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论和这些实施例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。应参考指明本发明范围的所附权利要求书而不是上述说明书。
使用以下缩写：
“HPLC”是高效液相色谱法，“C”是摄氏，“kPa”是千帕斯卡，“mm”是毫米，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔每升，“cm”是厘米，“g”是克，“wt”是重量，“hr”是小时，“temp”或“T”是温度，“SS”是不锈钢，“in”是英寸，“i.d.”是内径，“o.d.”是外径，并且“％”是百分比。
材料
以下材料用于实施例中。所有商购试剂均按原样使用。所有使用的溶剂是HPLC级。乙酰氯是99+％。TLC板和溶剂得自VWR(WestChester，PA)。HPLC或SCF级二氧化碳得自MG Industries(Malvern，PA)。
微生物生物质制备
下文描述了解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的多个酵母菌株，它们生产不同量的包含至少一种PUFA的微生物油。微生物生物质在2-阶段分批补料发酵方法中获得，然后经如下所述的下游加工。
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株：本文比较实施例和实施例1、2、3、4、7、8和9利用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672生物质。菌株Y8672的产生在美国专利申请公布2010-0317072-A1中进行了描述[该文献以引用方式并入本文]。菌株Y8672来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362，能够经由表达Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径产生相对于总脂质约61.8％的EPA。
针对野生型解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362的菌株Y8672的最终基因型为Ura+，Pex3-，unknown 1-，unknown 2-，unknown 3-，unknown 4-，unknown 5-，unknown 6-，unknown 7-，unknown8-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，GPD::FmD 12::Pex20，YAT1::FmD 12::Oct，EXP1::FmD12S::ACO，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::EaD8S::Pex16(2个拷贝)，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9ES/EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco和YAT1::MCS::Lip1。上述表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。缩写如下：FmD12是串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)Δ-12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ-12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫(Euglena gracilis)Δ-9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ-9延伸酶基因，来源于小眼虫(Euglena gracilis)[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成突变型Δ-8去饱和酶基因[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫(Euglena gracilis)[美国专利7,256,033]；EaD8S是经密码子优化的Δ-8去饱和酶基因，来源于Euglena anabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是通过连接密码子优化的Δ-9延伸酶基因(“E389D9eS”)产生的DGLA合酶，来源于小型绿藻属(Eutreptiellasp)。CCMP389Δ-9延伸酶(美国专利7,645,604)对Δ-8去饱和酶“EgD8M”(同上)[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD9ES/EgD8M是通过连接Δ-9延伸酶“EgD9eS”(同上)与Δ-8去饱和酶“EgD8M”产生的DGLA合酶(同上)[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD5M和EgD5SM是合成的突变型Δ-5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，来源于小眼虫(Euglenagracilis)[美国专利7,678,560]；EaD5SM是合成突变型Δ-5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，来源于Euglenaanabaena[美国专利申请公布2008-0274521-A1]；PaD17是瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)Δ-17去饱和酶基因[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ-17去饱和酶基因，来源于瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)[美国专利7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[国际专利申请公布WO 2006/052870]；以及，MCS是密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因，来源于豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum bv.viciae)3841[美国专利申请公布2010-0159558-A1]。
为了详细分析菌株Y8672中的总脂质含量和组合物，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段生长总计7天。根据分析，菌株Y8672产生3.3g/L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为26.5[“TFA％DCW”]，以干细胞重量％[“EPA％DCW”]表示的EPA含量为16.4，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量％TFA[“％TFA”]：16:0(棕榈酸)-2.3，16:1(棕榈油酸)--0.4，18:0(硬脂酸)--2.0，18:1(油酸)--4.0，18:2(LA)--16.1，AlA--1.4，EDA--1.8，DGLA--1.6，ARA--0.7，ETrA--0.4，ETA--1.1，EPA--61.8，其他--6.4。
本文实施例6利用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y9502生物质。菌株Y9502的产生在美国专利申请公布2010-0317072-A1中所述进行，该文献以引用方式并入本文。菌株Y9502来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362，能够经由表达Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0％的EPA。
针对野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y9502的最终基因型为Ura+，Pex3-，unknown 1-，unknown 2-，unknown 3-，unknown 4-，unknown 5-，unknown 6-，unknown 7-，unknown 8-，unknown 9-，unknown10-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT 1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16(2个拷贝)，YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。上文未定义的缩写如下：EaD9eS/EgD8M是通过将来源于Euglena anabaenaΔ-9延伸酶的密码子优化的Δ-9延伸酶基因(“EaD9eS”)[美国专利7,794,701]连接到Δ-8去饱和酶“EgD8M”(同上)[美国专利申请公布2008-0254191-A1]上产生的DGLA合酶；以及，MaLPAAT1S是密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,879,591]。
为了详细分析菌株Y9502中的总脂质含量和组合物，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段生长总计7天。根据分析，菌株Y9502产生3.8g/L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为37.1[“TFA％DCW”]，以干细胞重量％[“EPA％DCW”]表示的EPA含量为21.3，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量％TFA[“％TFA”]：16:0(棕榈酸)-2.5，16:1(棕榈油酸)--0.5，18:0(硬脂酸)--2.9，18:1(油酸)--5.0，18:2(LA)-12.7，AlA-0.9，EDA-3.5，DGLA-3.3，ARA--0.8，ETrA--0.7，ETA-2.4，EPA-57.0，其他-7.5。
本文实施例5利用解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4305F1B1生物质。下文示出经由表达Δ-9延伸酶/Δ-8去饱和酶途径产生来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362并能够产生相对于总脂质约50-52％的EPA并具有28-32％的总脂质含量[“TFA％DCW”]的菌株Y4305F1B1。具体地讲，菌株Y4305F1B1来源于解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4305，其以前已经在美国专利申请公布2008-0254191中的一般方法中进行了描述，该专利申请公布于2009年4月9日，其公开内容全文并入本文。针对野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4305的最终基因型是SCP2-(YALI0E01298g)，YALI0C18711g-，Pex10-，YALI0F24167g-，unknown1-，unknown 3-，unknown 8-，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::OCT，GPM/FBAIN::FmD12S::OCT，EXP1::FmD12S::Aco，YAT1::FmD12S::Lip2，YAT1::ME3S::Pex16，EXP1::ME3S::Pex20(3个拷贝)，GPAT::EgD9e::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，FBA::EgD9eS::Pex20，GPD::EgD9eS::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT1::E389D9eS::OCT，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1(2个拷贝)，EXP1::EgD8M::Pex16，GPDIN::EgD8M::Lip1，YAT1::EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5::Aco，EXP1::EgD5S::Pex20，YAT1::EgD5S::Aco，EXP1::EgD5S::ACO，YAT1::RD5S::OCT，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，YAT1::YlCPT1::ACO，GPD::YlCPT 1::ACO。上文未定义的缩写如下：E389D9eS是经密码子优化的Δ-9延伸酶基因，来源于小型绿藻属(Eutreptiella sp.)CCMP389[美国专利7,645,604]；EgD5是小眼虫(Euglena gracilis)Δ-5去饱和酶[美国专利7,678,560]；EgD5S是经密码子优化的Δ-5去饱和酶基因，来源于小眼虫(Euglena gracilis)[美国专利7,678,560]；以及；RD5S是经密码子优化的Δ-5去饱和酶，来源于多甲藻属(Peridiniumsp.)CCMP626[美国专利7,695,950]。
Y4305细胞的总脂质含量为27.5[“TFA％DCW”]，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量％TFA[“％TFA”]：16:0(棕榈酸)-2.8，16:1(棕榈油酸)--0.7，18:0(硬脂酸)-1.3，18:1(油酸)-4.9，18:2(LA)-17.6，AlA-2.3，EDA-3.4，DGLA-2.0，ARA--0.6，ETA-1.7和EPA-53.2。
基于磺酰脲类[“SUR”]抗性，菌株Y4305用解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的显性非抗生素标记转化。更具体地讲，该标记基因是具有单个氨基酸改变(即W497L)的天然乙酰羟酸合酶(“AHAS”或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，其赋予磺酰基脲抗除草剂性(SEQ ID NO：292，国际专利申请公布WO 2006/052870)。
将SUR遗传标记随机整合进耶氏酵母属菌株Y4305中，所述整合用于鉴定当在含油条件下生长时相对于亲本Y4305菌株具有提高的脂质含量的那些细胞，如美国专利申请公布2011-0059204-A1所述。
当在2升发酵条件下评估时，菌株Y4305的平均EPA产量[“EPA％DCW”]是50-56，与之相比突变体SUR菌株Y4305-F1B1是50-52。菌株Y4305的平均脂质含量[“TFA％DCW”]是20-25，与之相比菌株Y4305-F1B1是28-32。因此，菌株Y4503-F1B1中的脂质含量提高了29-38％，对EPA产量具有最小的影响。
发酵：在摇瓶中从解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的冷冻培养物制备菌剂。在孵育期后，使用培养物接种种子发酵罐。当种子培养物达到合适的目标细胞密度时，用它接种较大的发酵罐。发酵是2-阶段分批补料方法。在第一阶段，在促进酵母快速生长至高细胞密度的条件下培养酵母；培养基包含葡萄糖、多种氮源、微量金属和维生素。在第二阶段，限制酵母的氮源并连续给料葡萄糖以促进脂质和PUFA积聚。方法变量包括温度(控制在30-32℃之间)、pH(控制在5-7之间)、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。
发酵领域的技术人员将了解特定耶氏酵母属菌株的油特征将取决于发酵运行自身、培养条件、方法参数、规模大小等、以及特定的培养物取样时间点而发生变化(参见例如美国专利申请公布2009-0093543-A1)。
下游加工：任选地在加工之前将抗氧化剂加到发酵液中以确保微生物油的氧化稳定性。酵母微生物生物质进行脱水和洗涤以除去盐和残余培养基、以及最小化脂肪酶活性。然后进行滚筒干燥(通常用80psig的蒸汽)或喷雾干燥以将含水量降低至小于5％，从而确保短期贮藏和运输期间的油稳定性。使用双螺杆挤出机机械破碎滚筒干燥的薄片或喷雾干燥的粉末，使得微生物油较易于暴露并从而有利于提取。
一般方法
测定微生物生物质、提取油和残余生物质样品内脂质分布的方法：酵母微生物生物质和残余生物质(即，在用CO2提取后)的样品用Bligh&Dyer(based on procedures outlined in Lipid Analysis，第3版，W.W.Christie编辑，Oily Press：Bridgwater，2003)方法的变型进行提取，用薄层色谱法(TLC)分离并用氯化氢的甲醇溶液直接酯化/酯交换。油样品溶解在氯仿/甲醇中，然后用TLC分离并直接酯化/酯交换。通过气相色谱法分析酯化/酯交换的样品。
酵母微生物生物质和残余生物质的样品通常为干粉形式。预设部分(100-200mg或更少，取决于PUFA浓度)的样品称重后置于具有TeflonTM顶盖的13×100mm玻璃测试管中，其中加入3mL体积的2∶1(体积∶体积)甲醇/氯仿溶液。充分地涡旋处理样品并在室温下孵育一小时，同时进行轻柔的搅拌和翻转。在孵育规定的时间后，加入1mL氯仿和1.8mL去离子水，搅拌混合物，然后离心以分离形成的两层。使用巴氏吸管将底层移入第二个配衡的13mm玻璃小瓶中，并用第二个1mL氯仿部分再提取含水顶层30分钟。混合两种提取物并认为它是“第一提取物”。使用TurboVapTM在50℃下用干燥氮气除去溶剂并将剩余的油重悬在适量的6∶1(体积∶体积)氯仿/甲醇中以获得100mg/mL的溶液。
通过薄层色谱法(TLC)分析如上所述获得的提取油(酵母微生物生物质和残余生物质样品)以及通过CO2提取微生物生物质所得的油样品。TLC通常使用一个槽完成，但是当将鉴定单个PL时也可使用两个槽的方法。在一个槽的TLC方法中，5×20cm的硅胶60平板(EMD#5724-3，得自VWR)通过从底部画一条轻铅笔线一直越过平板2cm进行制备。将适量样品(～60μL)点在铅笔线顶部完全越过平板的位置，在点之间不留任何空隙。将已知标准物点在第二平板上，并且样品用量为1-2μL。平板风干5-10分钟并用己烷-乙醚-乙酸混合物(体积比70∶30∶1)显影，所述混合物在用于平板之前已经用一张吸墨纸在槽中平衡至少30分钟。
在平板已经显影至顶部1/4英寸范围内之后，它们在N2环境中干燥15分钟。具有标准物和小样品点的第二平板然后在槽中显影，所述槽已经用碘晶体饱和过，用作制备性平板的基准。在制备性平板上的条带通过用碘给条带的边缘非常轻微地染色并使用铅笔勾勒出每个级份(即，分别为PL、FFA、TAG和DAG级份)的条带进行鉴定。DAG条带能够显示出在1，2-DAG、1，3-DAG和MAG条带之间的一些分离，并且通常将这个完整区域切出作为DAG条带。将条带切出凝胶并转移到13mm的玻璃小瓶中。平板的剩余部分在碘槽中显影以确认完全移除了受关注的条带。
将适量甘油三酯内标加到包含每个条带的玻璃小瓶中。取决于每个条带的可见浓度，通常使用100μL的0.1mg/mL至5mg/mL的内标。共溶剂(在这种情况下为甲苯)与内标一起加入。如果不使用内标，加入附加的共溶剂以完成较长链脂质的酯化/反式酯化。加入1mL 1％氯化氢的甲醇溶液(通过缓慢加入5mL乙酰氯到50mL冷却干燥的甲醇中进行制备)，样品盖上封盖，轻柔混合，并置于80℃的加热区中。在一小时后，移出样品并冷却。加入1mL 1N的氯化钠溶液和400μL己烷，然后涡旋处理样品至少12秒并离心分离两个层。然后仔细地除去顶层，避免它受到任何含水(底)层的污染。将顶层置于GC小瓶中，小瓶配有插入件并盖上封盖。
使用Agilent Model 6890气相色谱仪(Agilent Technologies，SantaClara，CA)分析样品，该仪器配有火焰离子化检测器(FID)和Omegawax320柱(30m×0.32mm ID×25μm薄膜厚度，由Supelco(Bellfonte，PA)制造)。氦气载气恒定地保持在1-3mL/min范围内，分流比为20∶1或30∶1。炉内条件如下：初始温度为160℃，初始时间为0分钟并且平衡时间为0.5分钟。温度以5度/分钟的速度升至200℃，最终保持时间为0分钟，然后以10度/分钟的速度升至240℃，保持时间为四分钟，总计16分钟。将入口设为260℃。也将FID检测器设为260℃。运行Nu-Chek Prep GLC参考标准品(#461)以确认保留时间。
使用Agilent’s Custom Reports收集GC结果并将每个脂肪酸的面积转化成Excel电子表格以计算它们的百分比。然后可使用校正因子以转化脂质类物质中的脂肪酸总量。各个组分的总百分比与TLC之前的固定化初始提取物相比较。
提取方法：一般将干燥并机械破碎的酵母细胞(“微生物生物质”)充入包在玻璃棉塞之间的提取容器中，用CO2冲洗，然后在CO2流下加热并加压到期望的运行条件。从配有排放管的商业滚筒中直接进料CO2，并且用高压泵定量。使用限定器在容器的流出侧保持对提取容器的压力，并且在样品容器中收集微生物油样品，同时将CO2溶剂排放到大气。可使用共溶剂泵(Isco Model 100D注射器泵)将共溶剂(例如乙醇)任选地加到进料于提取容器的提取溶剂中。据报道通过测量残余生物质并测定提取期间的总质量损失来进行重量分析，测定从微生物生物质得到的提取产量。
使用可商购获得的自动化SCF提取仪器(Isco Model SFX3560)实施实施例5。这个仪器利用10mL的塑料提取容器，该容器在提取容器的每个端部配有2-微米的烧结金属过滤器。这个容器充入了拟提取的底物，然后将其载入高压提取室，所述提取室平衡了提取容器内侧和外侧的压力。用注射器泵(ISCO Model 260D)测量CO2溶剂，将其预热到特定的提取温度，然后通过提取容器。用电阻加热器加热提取室，达到期望的提取温度。用自动化的可变限定器保持对容器的压力，该限定器是所述仪器的整体部分。
在定制的高压提取设备中实施实施例1-4和6-9。用316SS管材加工成提取容器，并且所述容器在容器的流出端配有2-微米的烧结金属过滤器。用配有冷冻头部组件(Jasco Model PU-1580-CO2)的正位移泵测量CO2。提取容器安装在定制的机器铝块内部，其配有四个calrod加热元件，所述元件受自动化温度控制器的控制。用自动化的背压调节器(Jasco Model BP-1580-81)保持提取压力。
如实施例中所报道的那样，微生物生物质、残余生物质和提取油中的多种脂质组分的分析使用如上所述的薄层和气相色谱方法进行测定。这一概述反映了使用分析程序对从微生物生物质中提取的脂质的分析；然而，在与微生物生物质和提取油样品中的脂质的量(通常在初始微生物生物质中＜3％的提取油)进行比较时，通过该程序分析的残余生物质样品中脂质的量是相对少的。
在概述表中报道的结果显示了微生物生物质、残余生物质和提取油样品中的脂质组分的相对分配。对于在横跨表顶部横排中的每个鉴定的脂肪酸，磷脂(PL)、二酰基甘油(DAG)、游离脂肪酸(FFA)和三酰基甘油(TAG)组分的相对分配沿着表的列垂直显示。每个样品的第一排显示TLC之前对固定化的初始提取物的分析，而随后的排提供了通过TLC和GC对每个组分的分析，同时每个组分的总百分比存在于该样品的最右边的列上。
报道的微生物油的提取产量通过提取前的微生物生物质和提取后的残余生物质之间的重量差异进行计算，将其表达为百分比。假定重量差异是由于通过用CO2加工提取的微生物油量而引起。一般发现获得的油的实际重量基于质量差异在约85％的期望重量范围内。
实施例1
在311巴和40℃下的提取曲线
这个实施例的目的是展示提取曲线的生成。用316SS管材(0.95cmo.d.×0.62cm i.d.×26.7cm长度)加工成的8mL提取容器反复充满标定2.7g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(即，微生物生物质)，进行一系列提取以测定这种微生物生物质在40℃和311巴下的提取曲线。对于每次提取，用CO2冲洗提取容器和微生物生物质并且随后用CO2在40℃加压至311巴。在这些条件下并在1.5g/分钟的CO2流量下提取微生物生物质不同的时间以提供产生相应的提取产量的溶剂-进料比范围，如表4所示。
表4：在311巴和40℃下的溶剂-进料比率和提取产量数据
Figure BDA00002287142200381
图4在提取曲线上图示了这些数据。在曲线约40g CO2/g酵母的溶剂-进料比率处的转折点指示至少这个溶剂比率是在选定温度和压力下有效提取这一特定微生物生物质中的可用微生物油所需的。
可在不同温度和/或压力条件下重复进行系列提取以产生特定微生物生物质样品的一系列提取曲线，使得人们能够基于例如经济性、期望的提取产量、或者使用的CO2总量选择最佳的提取条件。
比较实施例
在不分级提取油的情况下提取酵母细胞
这个比较实施例的目的是为了展示在不分级提取物或不连续提取残余生物质的情况下用CO2提取微生物生物质，并且提供获得提取物的脂质组合物。
用316SS管材(1.27cm o.d.×0.94cm i.d.×26.0cm长度)加工成的18mL的提取容器充满4.99g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(即，微生物生物质)。用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至222巴。在这些条件下，以2.3g/分钟的CO2流量提取微生物生物质5.5小时，提供149gCO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物的产量为18.2重量％。
下表概述了对微生物生物质、残余生物质和提取油的脂质分析。
Figure BDA00002287142200401
对于酵母微生物生物质，发现50重量％[wt％”]的FFA和59.8重量％的TAG包含EPA。具体地讲，将FFA内的EPA重量％计算为微生物生物质中包含EPA的FFA重量％(即，3)除以微生物生物质中的FFA总重量％(即，6)，以百分比形式表示并且具有取自TLC分析的两个百分比值，如上表5所示。类似地，将TAG内的EPA重量％计算为微生物生物质中包含EPA的TAG重量％(即，49)除以微生物生物质中的TAG总重量％(即，82)，以百分比形式表示并且具有取自TLC分析的两个百分比值，同上。
在提取油中缺乏PL(即，0重量％)表明初始微生物生物质中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质(43重量％PL)中并且不与CO2一起分配到提取油中。此外，在与微生物生物质的TAG含量(即，82重量％)进行比较时，提取油富含TAG(即，90重量％)。因此，所述提取油是精制的脂质组合物。
更具体地讲，所述结果显示提取油的精制的脂质组合物包含90重量％的TAG，4重量％的FFA和6重量％的DAG，其中发现50％的FFA和58.9％的TAG包含EPA。更具体地讲，将FFA内的EPA重量％计算为提取油中包含EPA的FFA重量％(即，2)除以提取油中的FFA总重量％(即，4)；并且将TAG内的EPA重量％计算为提取油中包含EPA的TAG重量％(即，53)除以提取油中的TAG总重量％(即，90)；精制的脂质组合物相对于微生物生物质不富含EPA。
实施例2-4
通过连续加压提取分级脂质
实施例2、3和4的目的是为了展示在不同提取条件下连续加压提取微生物生物质，以及为了提供获得的提取油的脂质组合物。
实施例2、3和4共同示出了提取油的脂质组分分配可能受到多步骤提取中所选提取条件的影响。此类分配将同样地由通过如图3所示方法获得的提取油的连续减压导致。
期望在实施例2、3和4中获得的这些结果与通过SCF CO2-提取微生物生物质能够获得的结果类似，其中所述提取油随后经由逐步减压分级。
实施例2：125巴至222巴
用316 SS管材(1.27cm o.d.×0.94cm i.d.×26.0cm长度)加工成的18mL的提取容器充满3.50g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(微生物生物质)。
提取物A：用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至125巴。在这些条件下，以2.3g/分钟的CO2流量提取微生物生物质5小时，在此时压力提高到150巴。继续提取附加的1.2小时，提供238gCO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物A的产量为11.7重量％。
提取物B：通过升压至222巴并继续保持2.3g/分钟的CO2流量4.0小时，继续用相同的部分提取微生物生物质进行提取，提供该级份153gCO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物B的产量为6.2重量％的初始微生物生物质，所述初始微生物生物质被充入提取容器中。
下表概述了对微生物生物质和两个提取油级份(即，提取物A和提取物B)的脂质分析。
Figure BDA00002287142200431
在使用的提取条件下，提取油的一些TAG(即，82重量％)和大多数FFA和DAG选择性地分配到提取物A(其包含9重量％的各种物质)中。初始微生物生物质中存在的脂质的PL级份不与CO2一起分配到提取物A中。因此，提取物A是精制的脂质组合物。
在使用的提取条件下，提取物B富含TAG(并且仅包含1重量％的DAG以及未测量到的FFA)并且基本上不含PL。因此，提取物B的提取油是富含TAG的精制的脂质组合物。更具体地讲，提取物B包含99％的TAG，其中包含62.6％的EPA(即，计算为提取物B中包含EPA的TAG重量％[即，62]除以提取物B中的TAG总重量％[即，99]，以百分比形式表示，并且具有取自TLC分析的两个百分比值)。与之相反，EPA存在于微生物生物质中约59.8％的TAG中(即，计算为微生物生物质中包含EPA的TAG重量％[即，49]除以微生物生物质中的TAG总重量％[即，82])。提取物B的精制的脂质组合物因此相对于微生物生物质富含EPA，它是一种C20PUFA。
实施例3：125巴至141巴至222巴
用316SS管材(2.54cm o.d.×1.93cm i.d.×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器充满15.0g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(微生物生物质)。
提取物A：用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至125巴。在这些条件下，以2.3g/分钟的CO2流量提取微生物生物质3.9小时，在此时将流量提高到4.7g/分钟CO2并继续提取附加的2.3小时。然后加压至141巴。在4.7g/分钟的CO2流量下继续提取附加的4.1小时，提供154g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物A的产量为8.7重量％。
提取物B：通过升压至222巴并继续保持4.7g/分钟的CO2流量8.0小时，继续用相同的部分提取微生物生物质进行提取，提供该提取物150g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物B的产量为15.4重量％的初始微生物生物质，所述初始微生物生物质被充入提取容器中。
下表概述了对微生物生物质、在最后提取后的残余生物质和两个提取油级份(即，提取物A和提取物B)的脂质分析。
Figure BDA00002287142200451
结果显示微生物生物质中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质(即，残余生物质中37重量％的PL对提取物A中的0重量％和提取物B中的1重量％)中。
在使用的提取条件下，微生物生物质的FFA和DAG选择性地分配到提取物A的精制的脂质组合物中，而所述精制的脂质组合物提取物B富含TAG。更具体地讲，提取物B为约97％的TAG，不含测量到的FFA，并且发现约61.9％的TAG包含EPA。与之相反，EPA存在于微生物生物质中约59.8％的TAG中(即，计算为微生物生物质中包含EPA的TAG重量％[即，49]除以微生物生物质中的TAG总重量％[即，82])。因此，提取物B的精制的脂质组合物因此相对于微生物生物质富含EPA，它是一种C20PUFA。
实施例4：110巴至222巴
用316SS管材(2.54cm o.d.×1.93cm i.d.×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器充满20.0g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(微生物生物质)。
提取物A：用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至110巴。在这些条件下，以4.7g/分钟的CO2流量提取微生物生物质7.1小时，提供100g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物A的产量为4.1重量％。
提取物B：通过升压至222巴并继续保持4.7g/分钟的CO2流量15.0小时，继续用相同的部分提取微生物生物质进行提取，提供该提取物212g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取物B的产量为14.6重量％的初始微生物生物质，所述初始微生物生物质被充入提取容器中。
下表概述了对原料酵母、在最后提取后的残余生物质和两个提取油级份(即，提取物A和提取物B)的脂质分析。
结果显示微生物生物质中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质(即，残余生物质中41重量％的PL对提取物A和提取物B中的0重量％)中。
在使用的提取条件下，微生物生物质的FFA和DAG选择性地分配到提取物A的精制的脂质组合物中，而所述精制的脂质组合物提取物B富含TAG。更具体地讲，提取物B为约95％的TAG，不含测量到的FFA，并且发现约58.9％的TAG包含EPA。提取物B的精制的脂质组合物相对于微生物生物质不富含EPA。
实施例5-7
在不同压力下的超临界流体CO 2 提取
实施例5、6和7的目的是为了展示用CO2作为超临界流体(SCF)在不同压力下(即，分别在500巴、310巴和222巴下)提取微生物生物质，并且提供获得的提取油的脂质组合物。可在方法的第一步骤中使用此类提取条件，所述方法用于获得包含至少一种PUFA的精制组合物，其中所述方法包括用CO2在合适的提取条件下加工包含至少一种PUFA的微生物生物质，并且随后例如通过连续减压分级所述提取物。
实施例5：在500巴下的SCF CO 2 提取
10mL的提取容器充满2.01g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y4305-F1B1的酵母细胞(作为微生物生物质)，并且将该容器安装在Isco Model SFX3560提取器中。用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至500巴。在这些条件下，以0.86g/分钟的CO2流量提取微生物生物质5.8小时，提供150g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取油的产量为32.8重量％。下表概述了对微生物生物质、残余生物质和提取油的脂质分析。
Figure BDA00002287142200491
表9的结果显示微生物生物质中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取的油中(即，残余生物质中48重量％的PL对提取油中的0重量％)。因为提取油也相对于微生物生物质富含TAG，这种油是精制的脂质组合物。精制的脂质组合物包含5重量％FFA，7重量％DAG和88重量％TAG。
实施例6：在310巴下的SCF CO 2 提取
用316SS管材(2.54cm o.d.×1.93cm i.d.×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器充满25.1g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y9502的酵母细胞(微生物生物质)。用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至310巴。在这些条件下，以5.0g/分钟的CO2流量提取微生物生物质4.4小时，提供50g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取油的产量为28.8重量％。下表概述了对微生物生物质、残余生物质和提取油的脂质分析。
Figure BDA00002287142200511
表10的结果显示微生物生物质中存在的脂质的大部分PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取的油中(即，残余生物质中40重量％的PL对提取油中的1重量％)。因为提取油基本上不含PL并且相对于微生物生物质富含TAG，这种油是精制的脂质组合物。精制的脂质组合物包含16重量％FFA，6重量％DAG和77重量％TAG。
实施例7：在222巴下的SCF CO 2 提取
用316SS管材(2.54cm o.d.×1.93cm i.d.×30.5cm长度)加工成的89mL的提取容器充满25.1g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(微生物生物质)。用CO2冲洗微生物生物质，然后加热至40℃并加压至222巴。在这些条件下，以4.7g/分钟的CO2流量提取微生物生物质13.7小时，提供154g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取油的产量为18.1重量％。
同上的这种提取再重复四次，每次使用新的微生物生物质样品。合并并混合五个残余生物质样品和五个提取油样品以提供来自五次提取的复合样品。
下表概述了对微生物生物质、合并残余生物质和合并提取油的脂质分析。
Figure BDA00002287142200531
下表概述了对微生物生物质、合并残余生物质和合并提取油的脂质分析。表11的结果显示微生物生物质中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取的油中(即，残余生物质中59重量％的PL对提取油中的0重量％)。因为提取油也相对于微生物生物质富含TAG，这种油是精制的脂质组合物。精制的脂质组合物包含7重量％FFA，7重量％DAG和86重量％TAG。
实施例8
在85巴下的液体CO 2 提取
这个实施例的目的是为了展示用CO2作为液体在85巴下提取微生物生物质，并且提供获得的提取油的组合物。可在方法的第一步骤中使用此类提取条件，所述方法用于获得包含至少一种PUFA的精制组合物，其中所述方法包括用CO2在合适的提取条件下加工包含至少一种PUFA的微生物生物质，并且随后例如通过连续减压分级所述提取物。
用316SS管材(0.95cm o.d.×0.62cm i.d.×26.7cm长度)加工成的8mL的提取容器充满0.966g的干燥并机械破碎的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672的酵母细胞(微生物生物质)。微生物生物质用CO2冲洗，然后用液体CO2在22℃加压至85巴。在这些条件下，以0.69g/分钟的CO2流量提取微生物生物质8.5小时，得到361g CO2/g酵母的最终溶剂-进料比率。提取油的产量为21.4重量％。
下表概述了对微生物生物质、残余生物质和提取油的脂质分析。
Figure BDA00002287142200551
表12的结果显示微生物生物质中存在的脂质的PL级份保留在残余生物质中并且不分配到CO2-提取的油中(即，残余生物质中28重量％的PL对提取油中的0.7重量％)。因为提取油基本上不含PL并且相对于微生物生物质富含TAG，这种油是精制的脂质组合物。
精制的脂质组合物包含8重量％FFA，5重量％DAG和86重量％TAG。
实施例9
用SCF CO 2 /EtOH提取残余磷脂
这个实施例的目的是为了展示用SCF CO2和乙醇的混合物作为提取剂提取第一残余生物质样品以获得PL级份和第二残余生物质样品。
用316SS管材(1.27cm o.d.×0.94cm i.d.×26.0cm长度)加工成的18mL的提取容器充满6.39g来自实施例3的残余生物质(即，在125巴和222巴下的CO2提取后的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株Y8672生物质)，本文将其称为“第一残余生物质”。所述材料用CO2冲洗，然后用CO2/乙醇混合物(提取剂)在40℃下加压至222巴。所述CO2流量为2.3g/分钟并且所述乙醇流量为0.12g/分钟，提供在进料于提取容器的溶剂中5.0重量％的乙醇浓度。在这些条件下提取第一残余生物质5.3小时，提供120g CO2/乙醇每g残余生物质的最终溶剂-进料比率。油的提取产量为之前提取的这种材料的2.4重量％。
下表概述了对第一残余生物质(这个实施例的初始样品)、第二残余生物质(在这个实施例中提取后的第一残余生物质)和通过提取第一残余生物质获得的提取油的脂质分析。
表13的结果显示发现提取油包含基本上纯的PL。以前在实施例3中进行的提取已经从微生物生物质中除去了中性脂质(即，TAG、DAG和MAG)和FFA。
实施例10
这个实施例的目的是为了提供在本文所述的提取和分级方法中可供选择的微生物生物质，其包含至少一种可被利用的PUFA，从而产生相对于微生物生物质的油组合物富含TAG的精制的脂质组合物。
虽然根据本文公开，多个经遗传工程化以生产ω-3/ω-6 PUFA的含油酵母是合适的微生物生物质，含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的代表性菌株在表3中进行了描述。这些包括以下菌株，它们已经被保藏为ATCC：解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y2047(生产ARA；ATCC保藏号PTA-7186)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y2096(生产EPA；ATCC保藏号PTA-7184)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y2201(生产EPA；ATCC保藏号PTA-7185)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y3000(生产DHA；ATCC保藏号PTA-7187)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y4128(生产EPA；ATCC保藏号PTA-8614)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y4127(生产EPA；ATCC保藏号PTA-8802)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y8406(生产EPA；ATCC保藏号PTA-10025)；解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y8412(生产EPA；ATCC保藏号PTA-10026)；和解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)菌株Y8259(生产EPA；ATCC保藏号PTA-10027)。
因此例如表3显示了产生占总脂肪酸25.9％至34％的GLA，占总脂肪酸10.9％至14％的ARA，占总脂肪酸9％至53.2％的EPA和占总脂肪酸5.6％的DHA的微生物宿主。
本领域的技术人员将会知道本发明的方法不限于展示高EPA生产水平的微生物生物质，而是同样适用于展示高替代ω-3/ω-6PUFA或组合或它们的PUFA生产水平的微生物生物质。

Claims (14)

1.方法，包括以下步骤：
a)用包含液体或超临界流体二氧化碳的溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质，所述未处理的破碎的微生物生物质具有包含至少一种多不饱和脂肪酸的油组合物，以获得：
(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和，
(ii)包含磷脂的残余生物质；以及，
b)分级在步骤(a)的部分(i)中获得的提取物至少一次以获得包含至少一种多不饱和脂肪酸的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含三酰基甘油。
2.权利要求1的方法，其中所述富含三酰基甘油的精制的脂质组合物包含至少一种脂质组分，所述脂质组分选自：
a)二酰基甘油；
b)单酰基甘油；
c)游离脂肪酸；以及，
d)它们的组合。
3.权利要求1的方法，其中所述富含三酰基甘油的精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质富含至少一种多不饱和脂肪酸。
4.权利要求1的方法，还包括选自以下的步骤：
(1)分级在步骤(a)的部分(i)中获得的提取物以获得包含至少一种多不饱和脂肪酸的精制的脂质组合物，其中所述精制的脂质组合物相对于所述未处理的破碎的微生物生物质的油组合物富含脂质组分，所述脂质组分选自：二酰基甘油、单酰基甘油、游离脂肪酸、以及它们的组合；以及，
(2)用提取剂加工步骤(a)的部分(ii)的包含磷脂的残余生物质以获得基本上由磷脂组成的残余生物质提取物。
5.权利要求1的方法，其中步骤(a)的加工在约20℃至约100℃的温度下和在约60巴至约800巴的压力下进行。
6.权利要求1的方法，其中步骤(b)的分级通过改变所述分级条件的温度、压力、或温度和压力执行。
7.权利要求1的方法，其中：
a)步骤(a)的加工溶剂包含超临界流体二氧化碳；并且，
b)步骤(b)的分级在约35℃至约100℃的温度下和在约80巴
至约600巴的压力下进行。
8.权利要求1的方法，其中所述未处理的破碎的微生物生物质包含含油微生物细胞。
9.权利要求1或3中任一项的方法，其中所述至少一种多不饱和脂肪酸选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、以及它们的混合物。
10.权利要求1或4中任一项的方法，其中所述包含磷脂的残余生物质或所述基本上由磷脂组成的残余生物质提取物适于用作水产养殖饲料中的组分。
11.权利要求1的方法，其中所述未处理的破碎的微生物生物质包含按所述未处理的破碎的微生物生物质中的总脂肪酸的重量％计至少25重量％的二十碳五烯酸。
12.方法，包括用包含液体或超临界流体二氧化碳的溶剂加工未处理的破碎的微生物生物质，所述未处理的破碎的微生物生物质具有包含至少一种多不饱和脂肪酸的油组合物，以获得：
(i)包含基本上不含磷脂的脂质级份的提取物；和，
(ii)包含磷脂的残余生物质；
其中所述未处理的破碎的微生物生物质得自耶氏酵母属(Yarrowia)的含油微生物，所述耶氏酵母属的含油微生物积聚的油超过其干细胞重量的25％；并且，
其中所述包含至少一种多不饱和脂肪酸的油组合物包含按总脂肪酸的重量％计至少25重量％的多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸具有至少二十个碳原子和四个或更多个碳-碳双键。
13.权利要求12的方法，其中所述未处理的破碎的微生物生物质得自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，并且其中所述至少一种多不饱和脂肪酸包括二十碳五烯酸。
14.权利要求12的方法，其中用提取剂加工所述包含磷脂的残余生物质以获得基本上由磷脂组成的残余生物质提取物。
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