CN103379946A - 使用短程蒸馏纯化来自微生物来源的甘油三酯油 - Google Patents
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- B01D3/12—Molecular distillation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
本发明公开了减少含甾醇微生物油组合物中甾醇量的方法，所述方法包括在短程蒸馏条件下蒸馏含甾醇微生物油，其中所述蒸馏产生馏出液级份，其包含所述甾醇和含三酰基甘油级份，所述含三酰基甘油级份在与尚未经受短程蒸馏的含甾醇微生物油组合物中甾醇量进行比较时具有减少的甾醇量。
Description
本专利申请要求2011年2月11日提交的美国临时申请61/441,842的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及包含多不饱和脂肪酸（PUFA）的脂质的纯化。具体地，提供了使用短程蒸馏（SPD）从富含三酰基甘油并包含至少一种PUFA的微生物油组合物中减少非期望的甾醇（例如麦角固醇）量的方法。
背景技术
微生物如丝状真菌、酵母和藻类产生多种脂质，包括脂肪酰、甘油脂、磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇脂和孕烯醇酮脂类。从其中产生这些脂质、因此已经实施多种方法的微生物细胞中提取这些脂质中的一些是有利的。
通常从微生物中提取的一类脂质是甘油脂，其包括脂肪酸甘油酯（“三酰基甘油”或“TAG”）。TAG是主要的脂肪酸储存单元，因此可含有长链多不饱和脂肪酸（PUFA），以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸与较长链的饱和脂肪酸。对在药物和膳食产品中包括PUFA如二十碳五烯酸[“EPA”；ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”；ω-3]的兴趣一直在持续地增长。有效地并高性价比地提取、精制和纯化包含PUFA的脂质组合物的方法因此是尤其期望的。
多种典型的脂质分离方法涉及破坏微生物细胞（例如经由机械、酶促或化学手段），随后使用有机或绿色溶剂进行油提取。破坏方法从微生物细胞中释放细胞内脂质，这使得它们在提取期间容易触及溶剂。在提取后，通常除去溶剂（例如通过蒸发如施加真空、温度或压力变化等除去）。
所得的提取油富含亲脂组分，其在脂质体中积聚。一般来讲，脂质体的主要组分由TAG、麦角固醇酯、其它甾醇酯、游离麦角固醇和磷脂组成。存在于脂质体中的PUFA主要是TAG、二酰基甘油、单酰基甘油和磷脂组分，但是也能够是游离脂肪酸的形式。可随后精制提取油以产生高度纯化的富含PUFA的TAG级份。关于纯化的TAG级份的最终规格可为用途依赖性的，例如，根椐油是否用作化妆品或药物组合物等中的添加剂或补充剂（例如在食物组合物、婴儿代乳品、动物饲料等中）。可接受的污染物标准是自己制定的（其中特定污染物导致不可取的特性，例如模糊/浑浊、气味）或由外部营养委员会确定的（例如A Voluntary Monograph OfThe Council for Responsible Nutrition（Washington，D.C.），2006年3月，指定了ω-3EPA、ω-3DHA以及它们的混合物的酸、过氧化物、茴香胺、TOTOX、多氯代二苯并-对-二氧杂环己烯和多氯代二苯并呋喃的最大值）。
美国专利6,166,230（GIST-Brocades）描述了用极性溶剂处理包含PUFA的微生物油（例如来自高山被孢霉（Mortierella alpina）的微生物油）以提取至少一种溶解在溶剂中的甾醇（例如链甾醇），并且随后从油中分离至少一些包含该甾醇的溶剂的方法，其中油具有小于1.5%的甾醇含量。
美国专利7,695,626（Martek）描述了从微生物生物质（例如裂殖壶菌属（Schizochytrium））中回收包含PUFA的中性脂质的方法，所述方法包括以下步骤：在提取过程中使生物质接触非极性溶剂以回收脂质，精制和/或漂白和/或除臭脂质组合物，将极性溶剂加到脂质组合物中，冷却混合物以选择性地沉淀至少一种其它化合物（例如饱和甘油三酯、含磷材料、蜡酯、包含甾醇酯的饱和脂肪酸、甾醇、角鲨烯、烃类）并且随后减少来自脂质组合物的这种不可取化合物的量。
以前的方法尚未利用短程蒸馏技术作为有效手段以避免将PUFA（具体地讲高度不饱和的脂肪酸）暴露于高温并减少来自微生物油的麦角固醇（麦角-5,7,22-三烯-3β-醇；CAS登记号57-87-4）污染物的量。
发明内容
在第一实施例中，本发明涉及减少含甾醇微生物油组合物中甾醇量的方法，所述方法包括：
a)在短程蒸馏条件下蒸馏含甾醇微生物油至少一次，其中所述油包含：
(i)包含一种或多种多不饱和脂肪酸的三酰基甘油；和
(ii)至少300mg/100g油的甾醇级份；
其中所述蒸馏产生包含甾醇的馏出液级份和含三酰基甘油级份，所述含三酰基甘油级份在与尚未经受短程蒸馏的含甾醇微生物油组合物中甾醇量进行比较时具有减少的甾醇量；以及
b)任选地，回收含三酰基甘油级份。
在第二实施例中，短程蒸馏条件包括使含甾醇微生物油在不超过30mTorr的真空水平和不超过300℃的温度下通过至少一次。
在第三实施例中，甾醇级份包括一种或多种甾醇，所述甾醇选自：豆甾醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和链甾醇。
在第四实施例中，含三酰基甘油级份中甾醇量在与含甾醇微生物油组合物中甾醇量进行比较时减少至少40%。优选地，含三酰基甘油级份中甾醇量在与含甾醇微生物油组合物中甾醇量进行比较时减少至少70%，并且更优选地减少至少80%。
在第五实施例中，具有减少甾醇级份的含三酰基甘油级份在与尚未经受短程蒸馏的含甾醇微生物油组合物进行比较时具有改善的透明度。
在第六实施例中，含甾醇微生物油组合物获取自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、或它们的混合物。优选地，含甾醇微生物油组合物获取自含油微生物，所述含油微生物来自选自下列的属：被孢霉属（Mortierella）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）；更优选地，含甾醇微生物油组合物获取自经工程化以产生多不饱和脂肪酸的重组耶氏酵母属细胞的微生物生物质。
在第七实施例中，蒸馏步骤可包括对微生物油组合物的两个或更多个连续的短程蒸馏。每个连续的短程蒸馏的温度可高于之前刚进行的短程蒸馏的温度。
生物保藏
下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection）（ATCC）（10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209），并具有下列名称、保藏号和保藏日期。
| 生物材料 | 保藏号 | 保藏日期 |
| 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y8412 | ATCC PTA-10026 | 2009年5月14日 |
| 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y8259 | ATCC PTA-10027 | 2009年5月14日 |
上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。
根据美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。类似地，根据美国专利申请公布2010-0317072-A1所述的方法，解脂耶氏酵母Y8672来源于解脂耶氏酵母Y8259。
附图说明和序列表
图1以流程图形式提供了本发明方法的概观。具体地，微生物发酵产生未处理的微生物生物质，其可任选地经机械加工。未处理的微生物生物质的油提取产生残余生物质和提取油。使用短程蒸馏（SPD）条件蒸馏提取油随后减少纯化三酰基甘油（TAG）-级份（即，SPD-纯化的微生物油）中的甾醇量。
图2提供了下列质粒的质粒图谱：（A）pZKUM；和（B）pZKL3-9DP9N。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825（“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”（“Requirements for PatentApplications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino Acid SequenceDisclosures-the Sequence Rules”）），并且符合世界知识产权组织（WorldIntellectual Property Organization）（WIPO）ST.25标准（1998）以及EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis）以及行政指令（Administrative Instructions）的208节和附录C）。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。
SEQ ID NO:1-8是编码基因、蛋白（或它们的片段）、或质粒的开放阅读框，如表1所述。
表1：核酸和蛋白质的序列号概述
具体实施方式
本文引用的所有专利和非专利文献的公开全文以引用方式并入本文。
当数量、浓度或其它值或参数以范围、优选范围或优选上限值和优选下限值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选值和任何范围下限或优选值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围都意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其它变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一个均表示满足条件A或B：A是真的（或存在的）且B是假的（或不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或存在的）。
同样，涉及元素或组分实例（即次数）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施例，并无意于局限于任一具体实施例或方面。
在该公开中使用以下定义：
“二氧化碳”缩写为“CO2”。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“磷脂”缩写为“PL”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。本文术语“三酰基甘油”（TAG）与术语“甘油三酯”同义并且指由三个脂肪酰残基酯化的甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。
“脂肪酸”缩写为“FFA”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“干细胞重量”缩写为“DCW”。
“毫托”缩写为“mTorr”。
术语“减少的”指具有较小的量，例如仅略少于初始量的量，或者例如在指定物质中完全缺失的量，并且包括上述两者之间的所有量。
如本文所用，术语“微生物生物质”是指来自包含具有PUFA的TAG的微生物发酵的微生物细胞材料。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和/或破碎细胞。
术语“未处理的微生物生物质”指在用溶剂提取前的微生物生物质。任选地，未处理的微生物生物质在用溶剂提取之前可经受至少一种机械处理（例如干燥生物质、破坏生物质、或这些方法的组合）。
如本文所用，术语“残余生物质”是指来自具有PUFA的TAG的微生物发酵的微生物细胞材料，其已经用溶剂提取过至少一次。
术语“脂质”指任何脂溶性的（即，亲脂的）、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的不同组，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。表2显示了对脂质的综述，它基于Lipid Metabolites and PathwaysStrategy（LIPID MAPS）分类体系（National Institute of General MedicalSciences，Bethesda，MD）。
表2：脂质类别综述
术语“含甾醇微生物油组合物”是指在25℃下是液体的脂质物质，并且其包含（i）至少一种甾醇；和（ii）包含一种或多种PUFA的三酰基甘油酯（TAG）。更具体地，来源于微生物生物质的含甾醇微生物油组合物具有至少300mg/100g油的甾醇级份，所述甾醇级份包含一种或多种甾醇。
已经从所有大类的存活生物中分离出在细胞膜渗透性中行使功能的甾醇，然而分离出的主要甾醇多种多样。在高等动物中的主要甾醇是胆固醇，而β-谷甾醇是高等植物中常见的主要甾醇（但是它很多情况下附随有菜油甾醇和豆甾醇）。关于存在于微生物中的主要甾醇的概述是较困难的，因为组合物取决于特定的微生物菌种。例如，含油酵母解脂耶氏酵母主要包含麦角固醇，真菌菌属被孢霉属主要包含胆固醇和链甾醇，并且原生藻菌菌属裂殖壶菌属主要包含芸苔甾醇和豆甾醇。常存在于含甾醇微生物油中的甾醇概述在下表3中示出；与之相反，这些甾醇通常不存在于鱼油中。当存在于含甾醇微生物油中时，表3的甾醇趋于沉淀到微生物油外面，这是由于其高熔点和在较低储存温度下减少的溶解度，这导致油浑浊。非常期望通过降低这些甾醇的浓度来最小化微生物油中不可取的浑浊。
表3：含甾醇微生物油中的甾醇
| 通用名 | 化学名称 | CAS登记号 |
| 豆甾醇 | 豆甾-5,22-二烯-3-醇 | 83-48-7 |
| 麦角固醇 | 麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇 | 474-67-9 |
| 芸苔甾醇 | 麦角甾-5,22-二烯-3β-醇 | 57-87-4 |
| 菜油甾醇 | （24R）-麦角甾-5-烯-3β-醇 | 474-62-4 |
| β-谷甾醇 | 豆甾-5-烯-3-醇 | 83-46-5 |
| 链甾醇 | 胆甾-5,24-二烯-3β-醇 | 313-04-2 |
优选的含甾醇微生物油具有至少300mg/100g油的甾醇级份，所述甾醇级份包含一种或多种甾醇。
含甾醇微生物油组合物也优选地包含占总脂质约25%的PUFA，优选地占总脂质至少约30%的PUFA，更优选地占总脂质至少约35%的PUFA，更优选地占总脂质至少约40%的PUFA，更优选地占总脂质至少约40-45%的PUFA，更优选地占总脂质至少约45-50%的PUFA，更优选地占总脂质至少约50-60%的PUFA，并且最优选地占总脂质至少约60-70%或更高的PUFA。
含甾醇微生物油组合物来源于通常通过微生物发酵提供的微生物生物质。从而，本发明中使用的含甾醇微生物油组合物可包括水。优选地油具有小于10重量%的含水量，更优选地具有小于5重量%的含水量，并且最优选地具有3重量%或更小的含水量。
在含油的生物中，油构成了总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油（TAG）组成，但是也可包含其它中性脂质、磷脂（PL）和游离脂肪酸（FFA）。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的升高或降低将对应于油脂中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
“中性脂质”是指那些通常以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们如此地命名是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯、和/或三酯，也分别称为单酰基甘油、二酰基甘油或三酰基甘油（TAG），或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放FFA，必须发生水解反应。
术语“提取油”指已经从细胞材料中分离的油，例如其能够合成油的微生物。提取油通过多种方法获得，其中最简单的方法仅涉及物理方法。例如，使用多种挤压构造（例如，螺杆、螺旋压榨机、活塞、珠磨器等）的机械压碎能够从细胞材料分离油。作为另外一种选择，可通过用多种有机溶剂处理（例如己烷、异己烷）、酶提取、渗透压冲击破碎、超声波提取、超临界流体提取（例如CO2提取）、皂化、以及这些方法的组合进行油提取。任选地进一步纯化或浓缩提取油。
术语“精制的脂质组合物”是指如美国专利公布2011-0263709-A1所公开的超临界二氧化碳（CO2）提取产物的微生物油组合物。精制的脂质组合物可包含中性脂质和/或游离脂肪酸，但是基本上不含磷脂。精制的脂质组合物优选地具有小于30ppm的磷，并且更优选地小于20ppm的磷，其通过名称为“Analysis for Phosphorus in Oil by Inductively Coupled PlasmaOptical Emission Spectroscopy”的American Oil Chemists’Society（AOCS）Official Method Ca20-99（Official Methods and Recommended Practices of theAOCS，第6版，Urbana，IL，AOCS Press，2009，其以引用的方式并入本文）来测定。精制的脂质组合物可相对于微生物生物质的油组合物富含TAG。精制的脂质组合物可进行进一步纯化，例如经由如本文所述的短程蒸馏进行纯化以产生“纯化油”。
因此，本文所述方法的优选的含甾醇微生物油组合物是一种精制的脂质组合物，其来源于超临界CO2提取，精制的脂质组合物包含具有至少一种PUFA和至少一种甾醇的TAG。
术语“蒸馏”是指基于混合物在沸腾液体混合物中的挥发性差异来分离混合物的方法。蒸馏是单元操作或物理分离过程，并且不是化学反应。
术语“短程蒸馏”（缩写为“SPD”）是指在极高真空度下的分离方法操作，其中SPD装置在接近蒸发器处配有内部冷凝器，使得来自材料的挥发性化合物在蒸发后仅行进短距离到达冷凝表面。因此，这种分离方法有最小的热降解。
术语“SPD-纯化油”是指包含具有一种或多种PUFA的三酰基甘油级份的微生物油，所述油已经在短程蒸馏条件下经受至少一次蒸馏处理。与短程蒸馏之前油中的甾醇含量相比，蒸馏方法减少SPD纯化油中的甾醇量。
术语“总脂肪酸”（TFA）本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法（本领域已知的方法）被衍生化成脂肪酸甲酯（FAME），例如它可以是生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级份（包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG）和来自极性脂质级份（包括磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级份）的脂肪酸，但不包括FFA。
术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以占干细胞重量（DCW）的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比（FAME%DCW）量度。因此，总脂质含量（TFA%DCW）等于，例如，脂肪酸毫克数每100毫克DCW。
总脂质中的脂肪酸浓度本文表示为TFA的重量百分比（%TFA），例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于按%TFA计的脂肪酸浓度（例如总脂质的%EPA等同于EPA%TFA）。
在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占干细胞重量的重量%（%DCW）是有用的。因此例如二十碳五烯酸%DCW将根据下式测定：（二十碳五烯酸%TFA）*（TFA%DCW）]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量%表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：（二十碳五烯酸%TFA）*（FAME%DCW）]/100。
术语“脂质特征”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级份中，例如在总脂质或油脂中，包含的各种脂肪酸分别的量，其中所述量以占TFA的重量百分比形式表示混合物中存在的脂肪酸的总量应当是100。
术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸（链烷酸），链长为约C12-C22（尽管更长和更短链长的酸均是已知的）。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳[“C”]原子的总数，并且Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸（ PUFA ） 、以及 ω-6脂肪酸（ω-6或n-6） 对 “ω-3脂肪酸（ω-3或n-3）”之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。
表4提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始（为此ω碳的编号为1）。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸以及它们的前体的通用名、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。
表4：多不饱和脂肪酸及其前体的命名
| 通用名 | 缩写 | 化学名称 | 简化符号 |
| 肉豆蔻酸 | -- | 十四酸 | 14:0 |
| 棕榈酸 | 棕榈酸酯 | 十六酸 | 16:0 |
| 棕榈油酸 | -- | 9-十六碳烯酸 | 16:1 |
| 硬脂酸 | -- | 十八酸 | 18:0 |
| 油酸 | -- | 顺式-9-十八碳烯酸 | 18:1 |
| 亚油酸 | LA | 顺式-9,12-十八碳二烯酸 | 18:2ω-6 |
| γ-亚麻酸 | GLA | 顺式-6,9,12-十八碳三烯酸 | 18:3ω-6 |
| 二十碳二烯酸 | EDA | 顺式-11,14-二十碳二烯酸 | 20:2ω-6 |
| 二高-γ-亚麻酸 | DGLA | 顺式-8,11,14-二十碳三烯酸 | 20:3ω-6 |
| 花生四烯酸 | ARA | 顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸 | 20:4ω-6 |
| α-亚麻酸 | ALA | 顺式-9,12,15-十八碳三烯酸 | 18:3ω-3 |
| 十八碳四烯酸 | STA | 顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸 | 18:4ω-3 |
| 二十碳三烯酸 | ETrA | 顺式-11,14,17-二十碳三烯酸 | 20:3ω-3 |
| 二十碳四烯酸 | ETA | 顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸 | 20:4ω-3 |
| 二十碳五烯酸 | EPA | 顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸 | 20:5ω-3 |
| 二十二碳四烯酸 | DTA | 顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸 | 22:4ω-3 |
| 二十二碳五烯酸 | DPAn-6 | 顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸 | 22:5ω-6 |
| 二十二碳五烯酸 | DPAn-3 | 顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸 | 22:5ω-3 |
| 二十二碳六烯酸 | DHA | 顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸 | 22:6ω-3 |
术语“高水平PUFA生产”是指生产占微生物宿主总脂质至少约25%的PUFA，优选地占微生物宿主总脂质至少约30%的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约35%的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约40%的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约40-45%的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约45-50%的PUFA，更优选地占微生物宿主总脂质至少约50-60%，并且最优选地占微生物宿主总脂质至少约60-70%的PUFA。PUFA的结构形式不受限制；因此例如PUFA可在总脂质中以FFA形式或酯化形式存在，例如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂。
术语“含油的”指那些倾向于以油形式贮存它们的能源的生物（Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980）。通常，含油微生物的细胞油脂符合S形曲线，其中脂质浓度提高直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降（Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57:419-25（1991））。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25%的情形并不鲜见。
含甾醇微生物油组合物可来源于微生物宿主细胞，其选自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、以及它们的混合物。优选地，微生物宿主细胞是含油的并且可为选自下组的属的成员：被孢霉属、破囊壶菌属、裂殖壶菌属、耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。术语“含油酵母”是指归类为能够产油的酵母的那些微生物。含油酵母的例子包括但不限于以下属：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。
通常，含油微生物的脂质蓄积响应存在于生长培养基中的总的碳氮比率而触发。该过程（导致含油微生物中游离棕榈酸（16:0）的从头合成）在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和的脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成。
可将多种脂肪酸（包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸）掺入TAG，它是脂肪酸的主要贮藏单位。在本文所述的方法和宿主细胞中，向TAG中掺入长链PUFA是最合乎期望的，尽管PUFA的结构形式是不受限制的（因此，例如，EPA在总脂质中可以作为FFA或以酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂存在）。更具体地讲，在本发明方法的一个实施例中，至少一种PUFA选自LA、GLA、EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、AlA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。更优选地，所述至少一种PUFA具有至少C20的链长，例如选自EDA、DGLA、ARA、DTA、DPAn-6、ETrA、ETA、EPA、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物的PUFA。在一个实施例中，至少一种PUFA选自ARA、EPA、DPAn-6、DPAn-3、DHA、以及它们的混合物。在另一个优选的实施例中，所述至少一种PUFA选自EPA和DHA。
大多数PUFA以中性脂质形式掺入TAG中并储存在脂质体中。然而，重要的是认识到在含油生物中测量总PUFA应至少包括那些位于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和TAG级份中的PUFA。
包含至少一种PUFA如EPA（或其衍生物）并具有减少量甾醇（相对于不经受如本文所述的蒸馏的组合物）的SPD-纯化油将具有熟知的临床和药用价值。参见例如美国专利申请公布2009-0093543A1。例如包含PUFA的脂质组合物可被用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，可以将纯化的PUFA（或其衍生物）掺入食用油、脂肪或调配的人造黄油中，以便食用者在正常使用中将获得所需量的膳食补充。PUFA还可以掺入婴儿代乳品、营养补充剂或其它食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用（人药或兽药）。
给人或动物补充PUFA可导致加入的PUFA以及它们的代谢物的水平升高。例如，用EPA处理不但可以导致EPA的水平升高，而且还可以导致EPA的下游产物如类二十烷酸（即前列腺素、白三烯和血栓素）、DPAn-3和DHA的水平升高。复杂的调节机制使得期望组合多种PUFA或者添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这种机制来在个体中实现所需水平的特定PUFA。
作为另外一种选择，PUFA或其衍生物能应用于动物或水产饲料的合成中，如干饲料、半湿饲料和湿饲料，因为这些制剂一般需要至少1-2%的营养物质组合物是ω-3和/或ω-6PUFA。
虽然本发明涉及经由使用短程蒸馏条件来蒸馏含甾醇微生物油组合物以生产包含含TAG级份（其具有减量的甾醇）的SPD-纯化油的方法，人们将会知道可用于获取含甾醇微生物油组合物自身的相关方法的概述。如流程图形式的图1所示，大多数方法将起始于微生物发酵，其中在允许生长和PUFA生产的条件下培养特定微生物。在一个合适的时间，从发酵罐中收获所述微生物细胞。可使用多种手段机械加工这种未处理的微生物生物质，例如干燥、破坏、制粒等。然后进行未处理生物质的油提取，产生残余的生物质（例如细胞碎片）和提取油。使用短程蒸馏条件蒸馏提取油（其包含甾醇和包含PUFA的三酰基甘油[TAG]）随后减少纯化TAG-级份（即，SPD-纯化微生物油）中的甾醇量。图1的这些方面中的每一个将在下文中进行进一步的详细讨论。
用于本发明的含甾醇微生物油来源于通常通过微生物发酵提供的微生物生物质。微生物生物质可来自任何微生物，或者是天然存在的或者是重组的，能够产生包含期望PUFA的脂质。优选地，所述微生物将能够具有高水平的PUFA产量。
例如商业来源的ARA油通常从被孢霉属（丝状真菌）、虫霉属（Entomophthora）、草腐霉枯萎属（Pythium）和紫球藻属（Porphyridium，红藻）微生物中产生。最需要注意的是，MartekBiosciences Corporation（Columbia，MD）生产包含ARA的真菌油（
美国专利5,658,767），其基本上不含EPA并且来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）或腐皮病诱发腐霉（Pythium insidiuosum）。
类似地，EPA可基于利用的特定微生物的天然能力经由多个不同方法由微生物产生[例如异养生物硅藻小环藻属（Cyclotella sp.）和菱形藻属（Nitzschia sp.）（美国专利5,244,921）；假单胞菌属（Pseudomonas）、交替单胞菌属（Alteromonas）或希瓦氏菌属（Shewanella）菌种（美国专利5,246,841）；草腐霉枯萎属（Pythium）的丝状真菌（美国专利5,246,842）；或长被孢霉属（Mortierella elongata）、微小被孢霉（M.exigua）、或喜湿被孢霉（M.hygrophila）（美国专利5,401,646）；和微拟球藻（Nannochloropsis）属的微绿球藻（eustigmatophycean alga）（Krienitz，L.和M.Wirth，Limnologica，36:204-210（2006））]。
DHA也可使用基于天然微生物的天然能力的方法产生。参见例如开发用于裂殖壶菌属（Schizochytrium）菌种的方法（美国专利5,340,742；美国专利6,582,941）；吾肯氏壶菌属（Ulkenia）（美国专利6,509,178）；假单胞菌属（Pseudomonas sp.）YS-180（美国专利6,207,441）；破囊壶菌属（Thraustochytrium）菌株LFF1（U.S.2004/0161831A1）；寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii）（美国专利申请公布2004/0072330A1；deSwaaf，M.E.等人，Biotechnol Bioeng.，81（6）:666-72（2003）和Appl.Microbiol.Biotechnol.，61（1）:40-3（2003））；Emiliania sp.（日本专利公布（Kokai）5-308978（1993））；和Japonochytrium sp.（ATCC28207；日本专利公布（Kokai）199588/1989）]。此外，已知以下微生物具有产生DHA的能力：海产弧菌（Vibrio marinus）（从深海中分离出的细菌；ATCC15381）；微藻类隐秘小环藻（Cyclotella cryptica）和绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）；以及鞭毛虫真菌如金黄色破囊壶菌（Thraustochytrium aureum）（ATCC34304；Kendrick，Lipids，27:15（1992））和破囊壶菌属（Thraustochytrium sp.），它们称为ATCC28211、ATCC20890和ATCC20891。目前有至少三种不同的发酵方法用于DHA的商业生产：发酵寇氏隐甲藻（C.cohnii）以生产DHASCOTM（Martek Biosciences Corporation，Columbia，MD）；发酵裂殖壶菌属（Schizochytrium sp.）以生产以前已知为DHAGold的油（MartekBiosciences Corporation）；以及发酵吾肯氏壶菌属（Ulkenia sp.）以生产DHActiveTM（Nutrinova，Frankfurt，Germany）。
期望使用重组方法，用微生物生产PUFA，该方法与从天然微生物来源的生产相比具有多个优点。例如，可使用具有优选的油生产特性的重组微生物，因为可通过将新的生物合成途径导入宿主和/或通过抑制非期望的途径改变宿主天然存在的微生物脂肪酸特征，从而导致期望PUFA（或其共轭形式）的产量提高并降低非期望PUFA的产量。第二，重组微生物能够提供特殊形式的PUFA，该PUFA可具有特别的用途。此外，可通过控制培养条件操纵微生物油生产，要注意的是通过向微生物表达的酶提供特定的底物源，或通过加入化合物/基因工程以抑制不可取的生物化学途径。因此例如改变由此生产的ω-3对ω-6脂肪酸的比率，或工程化生产不显著积聚其它下游或上游PUFA产物的特殊PUFA（例如EPA）是可能的。
因此，例如通过导入合适的PUFA生物合成途径基因，例如Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶的特定组合，可将缺乏制造EPA的天然能力的微生物工程化以表达PUFA生物合成途径，但是应当认识到导入的特定酶（以及编码那些酶的基因）绝不受本发明的限制。
已经将多个类型的酵母进行了重组工程化以产生至少一种PUFA。参见例如对啤酒糖酵母的研究（Dyer，J.M.等人，Appl.Eniv.Microbiol.，59:224-230（2002）；Domergue，F.等人，Eur.J.Biochem.，269:4105-4113（2002）；美国专利6,136,574；美国专利申请公布2006-0051847-A1）和含油酵母、解脂耶氏酵母（美国专利7,238,482；美国专利7,465,564；美国专利7,588,931美国专利7,932,077；美国专利7,550,286美国专利申请公布2009-0093543-A1；和美国专利申请公布2010-0317072-A1）。
在一些实施例中，如果微生物宿主是含油的，注意到其具有优点。含油酵母天然能够合成并积聚油，其中总油含量可占细胞干重的超过约25%，更优选占细胞干重的超过约30%，而最优选占细胞干重的超过约40%。在其它实施例中，非含油酵母可经基因修饰变成含油酵母，使得它能够产生占细胞干重超过25%的油，例如酵母如啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）（国际专利申请公布WO2006/102342）。
通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyii）、产油油脂酵母（L.lipoferus）、拉可夫氏假丝酵母（Candida revkaufi）、铁红假丝酵母（C.pulcherrima）、热带假丝酵母（C.tropicalis）、产朊假丝酵母（C.utilis）、茁芽丝孢酵母（Trichosporon pullans）、皮状丝孢酵母（T.cutaneum）、胶粘红酵母（Rhodotorula glutinus）、禾木科红酵母（R.graminis）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）（以前归类为解脂假丝酵母（Candida lipolytica））。
最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其它实施例中，最优选的是命名为ATCC76982、ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944和/或LGAM S（7）1的解脂耶氏酵母菌株（Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.82（1）:43-9（2002））。
在一些实施例中，期望含油酵母能够“高水平地生产”，其中所述生物能够产生总脂质中至少约5-10%的期望PUFA（即，LA、AlA、EDA、GLA、STA、ETrA、DGLA、ETA、ARA、DPA n-6、EPA、DPA n-3和/或DHA）。更优选地，含油酵母将产生占总脂质至少约10-70%的期望PUFA。虽然PUFA的结构形式是不受限制的，优选地TAG包含PUFA。
因此，本文所述的PUFA生物合成途径基因和基因产物可在异源性微生物宿主细胞、尤其是在含油酵母（例如耶氏酵母）细胞中产生。重组微生物细胞中的表达可有用于产生多种不同的PUFA途径中间产物，或用于已经存在于所述宿主中的调控PUFA途径以在其中合成此前不可能使用该宿主产生的新产物。
虽然基于上文提供的引用文献多种含油酵母能够经工程化以产生优选的ω-3/ω-6PUFA，在表5中描述了含油酵母解脂耶氏酵母的代表性的PUFA生产菌株。这些菌株具有以下PUFA生物合成途径基因的多种组合：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和C20/22延伸酶，但是应当认识到导入的特定酶（以及编码那些酶的基因）和产生的特定PUFA绝不受本发明的限制。
本领域的技术人员将会知道本发明的方法不限于上述解脂耶氏酵母菌株，也不限于使用其中本发明已经展示的菌种（即，解脂耶氏酵母或属（即，耶氏酵母属），因为将PUFA生物合成途径导入含油酵母的方法是熟知的。相反地，任何含油酵母或能够产生PUFA的任何其它适用的微生物将在本发明方法中是同样有用的。
可培养产生包含期望PUFA的脂质的微生物菌种并在使所述微生物产生PUFA的条件下，在发酵培养基中培养所述微生物。通常向所述微生物提供碳源和氮源、以及许多附加的化学物质或底物，它们允许所述微生物生长和/或产生PUFA。如上文引文所述，发酵条件将取决于使用的微生物，并且可经优化以在所得生物质中得到高含量的PUFA。
通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。例如解脂耶氏酵母通常在复合培养基，例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖液体培养基（YPD），或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择生产PUFA所需重组表达盒的最低限定培养基（例如，Yeast Nitrogen Base（DIFCO Laboratories，Detroit，MI））中生长。
当微生物已经产生所需量的PUFA时，可处理发酵液体培养基以获取包含PUFA的微生物生物质。例如发酵培养基可经过滤或换句话讲经处理以除去至少部分的含水组分。可经由其它装置巴氏消毒或处理发酵培养基和/或微生物生物质以降低能够损害微生物油和/或PUFA产量的内源性微生物酶的活性。
可机械加工微生物生物质，例如干燥生物质、破坏生物质（例如经由细胞裂解）、粒化生物质、或这些方法的组合。可干燥未处理的微生物生物质例如干燥至期望的含水量、制粒或粒化以便于处理、和/或机械破坏如经由物理装置如珠磨器、螺杆挤出等破坏以更易于触及细胞内容物。微生物生物质将是指未处理的生物质，甚至在任何机械加工后，因为尚未进行油提取，仍然如此。
如美国临时申请61/441,836（代理人档案号CL5053USPRV，提交于2011年2月11日）和美国专利申请XX/XXX,XXX（代理人档案号CL5053USNA（共提交附上的）（它们每个均以引用的方式并入本文）所述，机械加工的优选方法涉及用能够吸油的研磨剂（例如二氧化硅、硅酸盐）双螺杆挤出干酵母以提供破坏的生物质混合物，随后共混粘合剂（例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、可溶解淀粉）与所述破坏的生物质混合物以提供能够形成固体粒料的可固定混合物，并且然后由可固定混合物形成固体粒料（例如～1mm直径×6-10mm长度）。
在任选的机械加工后，微生物油与可存在于经由提取产油的微生物中的其它细胞材料分离。从未处理生物质中提取微生物油的方法是本领域熟知的。这些方法将产生残余生物质（即，细胞碎片等）和提取油；优选的方法依靠溶剂提取。
在较优选的实施例中，进行超临界CO2提取，这如美国专利申请公布2011-0263709-A1所公开的那样。这种特定方法使未处理的微生物生物质经受溶剂提取以除去磷脂和残余生物质，并且然后分级所得提取物以产生具有包含至少一种PUFA的精制脂质组合物的提取油，所述精制的脂质组合物相对于未处理微生物生物质的油组合物富含TAG。
在一些实施例中，提取油可经受进一步的加工步骤如脱胶（例如使用磷酸）、漂白（例如使用二氧化硅或粘土）、和/或脱臭，从而产生精制的脂质组合物。
根据本发明，提取油或精制的脂质组合物随后经受在短程蒸馏条件下的蒸馏。具体地，蒸馏步骤包括使含甾醇微生物油通过短程蒸馏（SPD）至少一次。商业SPD蒸馏器是化学工程领域所熟知的。适用的蒸馏器可购自例如Pope Scientific（Saukville，WI）。SPD蒸馏器包括蒸发器和冷凝器。典型的蒸馏受到蒸发器温度、冷凝器温度、油进料到蒸馏器中的进料速率和蒸馏器真空水平的控制。
本领域的技术人员将会知道，通过SPD蒸馏器的次数将取决于含甾醇微生物油的含水量。如果含水量低，通过SPD蒸馏器一次可能足够了。
然而，优选地蒸馏是多次通过的过程，其包括使含甾醇微生物油连续通过SPD蒸馏器两次或更多次。第一次通过通常在约1至50torr，以及优选地约5至30torr的压力下进行，并且蒸发器的表面温度相对较低，例如约100至150℃。这产生脱水的油，因为残余的水和低分子量的有机材料被蒸发了。脱水的油随后在较高的蒸发器温度和较低压力下通过蒸发器以提供富含甾醇的馏出液级份和与不经受短程蒸馏的油相比具有减量甾醇的包含TAG的级份。可使包含TAG的级份再次通过蒸馏器以进一步除去甾醇。随着每次附加通过的进行，可相对于蒸馏温度可相对于之前刚进行的蒸馏的温度提高。优选地，进行足够次数的通过使得甾醇级份的量在与含甾醇微生物油中的甾醇级份进行比较时减少至少约40%-70%，优选地至少约70%-80%，并且更优选地大于约80%。
优选地，SPD条件包括使含甾醇微生物油在不超过30mTorr，以及优选地不超过5mTorr的真空水平下通过至少一次。优选地，SPD条件包括在约220至300℃，以及优选地在约240至280℃下通过至少一次。
SPD方法产生包含具有减少的甾醇级份的TAG的级份（即，SPD-纯化油），甾醇级份在与尚未经受SPD的含甾醇微生物油组合物进行比较时具有改善的透明度。改善的透明度是指油中无浑浊或不透明现象。含甾醇微生物油在低于约10℃的温度下储存时变得浑浊，这是由于油中的甾醇在较低温度下降低的溶解度。蒸馏方法用于除去大部分甾醇级份，使得所得包含TAG的级份具有减量的甾醇，因此在约10℃下储存时保持澄清或基本上澄清。可用于评估油透明度的测试方法是American Oil Chemists’Society（AOCS）Official Method Cc11-53（“Cold Test”，Official Methodsand Recommended Practices of the AOCS，第6版，Urbana，IL，AOCSPress，2009，以引用的方式并入本文）。
令人惊讶地是，减少蒸馏方法中的甾醇量可在不显著降解油的情况下完成，所述油富含高度不饱和的脂肪酸如EPA。可基于PUFA含量和色谱分离表达谱（如实例3所示，见下文）评估油降解。
可通过在完成通过蒸发器后使级份改道通向合适容器来回收包含TAG的级份。
实例
本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实例，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明做出各种变化和修改以使其适用于各种用法和条件。
使用以下缩写：“C”是摄氏度，“mm”是毫米，“μm”是微米，“μL”是微升，“mL”是毫升，“L”是升，“min”是分钟，“mM”是毫摩尔每升，“mTorr”是毫托，“cm”是厘米，“g”是克，“wt”是重量，“h”或“hr”是小时，“temp”或“T”是温度，并且“i.d.”是内径。
实例1A
从解脂耶氏酵母菌株Z1978中制备包含EPA的未处理微生物生物质
这个实例描述了经工程化以生产EPA的重组解脂耶氏酵母菌株Z1978和使用2-阶段分批补料方法培养这种菌株的方法。预处理微生物生物质以产生干燥的、未处理的微生物生物质，其具有56.1的EPA%TFA。
解脂耶氏酵母菌株Y9502的基因型
菌株Y9502的生成描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1，其全文以引用的方式并入本文。菌株Y9502来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够经由表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0%的EPA。
针对野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y9502的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。上述表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。缩写如下：FmD12是串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫（Euglena gracilis）Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成突变Δ8去饱和酶基因[美国专利7,709,239]，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,256,033]；EaD8S是经密码子优化的Δ8去饱和酶基因，来源于Euglenaanabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是通过将来源于小型绿藻属（Eutreptiella sp）CCMP389Δ9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“E389D9eS”）（美国专利7,645,604）连接到Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD9eS/EgD8M是通过将Δ9延伸酶“EgD9eS”（参见上文）连接到Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EaD9eS/EgD8M是通过将来源于EuglenaanabaenaΔ9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“EaD9eS”）[美国专利7,794,701]连接到Δ8去饱和酶“EgD8M”（参见上文）产生的DGLA合酶[美国专利申请公布2008-0254191-A1]；EgD5M和EgD5SM是合成突变Δ5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，来源于小眼虫（Euglena gracilis）[美国专利7,678,560]；EaD5SM是合成突变Δ5去饱和酶基因[美国专利申请公布2010-0075386-A1]，其来源于Euglenaanabaena[美国专利7,943,365]；PaD17是瓜果腐霉菌（Pythiumaphanidermatum）Δ17去饱和酶基因[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶基因，来源于瓜果腐霉菌（Pythiumaphanidermatum）[美国专利7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[美国专利7,932,077]；MCS是经密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因，来源于豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum bv.viciae）3841[美国专利申请公布Pub.2010-0159558-A1]；并且MaLPAAT1S是经密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，来源于高山被孢霉（Mortierella alpina）[美国专利7,879,591]。
为对菌株Y9502中的总脂质含量和组分进行详细分析进行了烧瓶检测分析，其中细胞在总计7天中进行2阶段生长。根据分析，菌株Y9502产生3.8g/L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为37.1[“TFA%DCW”]，以干细胞重量%[“EPA%DCW”]表示的EPA含量为21.3，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量%TFA[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.5，16:1（棕榈油酸）--0.5，18:0（硬脂酸）--2.9，18:1（油酸）--5.0，18:2（LA）—12.7，AlA—0.9，EDA—3.5，DGLA—3.3，ARA--0.8，ETrA--0.7，ETA—2.4，EPA—57.0，其它—7.5。
解脂耶氏酵母菌株Z1978从菌株Y9502的生成
菌株Z1978的开发描述于美国专利申请公布13/218591（代理人档案号CL4783USNA，提交于2011年8月26日）和13/218708（代理人档案号CL5411USNA，提交于2011年8月26日），它们以引用的方式并入本文。
具体地，为了破坏菌株Y9502中的Ura3基因，构建体pZKUM（图2A；SEQ ID NO:1；描述于美国专利申请公布2009-0093543-A1的表15中）以将Ura3突变基因整合进菌株Y9502的Ura3基因中。转化根据美国专利申请公布2009-0093543-A1的方法进行，其以引用的方式并入本文。总计27个转化体（选自包含8个转化体的第一组、包含8个转化体的第二组、和包含11个转化体的第三组）在5-氟乳清酸[“FOA”]平板上生长（FOA平板每升包括：20g葡萄糖、6.7g酵母氮源、75mg尿嘧啶、75mg尿苷，并且基于对一系列从100mg/L至1000mg/L的浓度的FOA活性试验（因为供应商提供的每批料中会发生改变），选用适量的FOA（ZymoResearch Corp.，Orange，CA））。进一步的实验确定了仅第三组转化体拥有真正的Ura-表型。
为了进行脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并提取脂质，如Bligh，E.G.和Dyer，W.J.（Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917（1959））所述。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”]（Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.,276（1）:38-46（1990））并随后将其用配有30m×0.25mm（内径）HP-INNOWAX（Hewlett-Packard）柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪（GC）进行分析。炉温以3.5℃/min从170℃（保持25min）升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母细胞（0.5mL培养物），在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10min。将甲醇钠（100μl，1%）和已知量的C15:0三酰基甘油（C15:0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN）加入样品，然后涡旋振荡并于50℃摇动样品30min。加入3滴1M NaCl和400μl己烷，然后涡旋振荡并旋转样品。移除上层并用GC进行分析（参见上文）。
作为另外一种选择，Lipid Analysis，William W.Christie，2003中描述的修改的碱催化酯交换方法被用于对来自发酵或烧瓶样品的培养液体样品的常规分析。具体地，将培养液体样品在室温下快速融化，随后称量（至0.1mg）进入油化的2mL微量离心管中，其具有0.22μm 
离心管滤器（目录号8161）。根据先前测定的DCW，使用了样品（75-800μl）。用Eppendorf5430离心机，以14,000rpm离心样品5-7min或移除培养液体所需的时间长度。移除过滤器，倒出液体，加入～500μl去离子水至过滤器中洗涤样品。离心除去水后，再次移出过滤器，倒出液体并重新插入过滤器。然后将管子重新插入离心机中，这一次保持盖子打开，离心～3-5min进行干燥。然后在管子上方大约1/2处切开过滤器，并插入新的2mL圆底Eppendorf管（目录号2236335-2）。
用仅接触切开的过滤器容器边缘而不接触样品或过滤材料的适当的工具将过滤器推至管子的底部。加入溶于甲苯的已知量的C15:0TAG（参见上文）以及500μl新鲜制备的1%甲醇钠溶于甲醇的溶液。用适当的工具将样品沉淀块用力捣碎，盖上管子并置于50℃加热块（VWR目录号12621-088）中30min。然后使管子冷却至少5min。然后，加入400μl己烷和500μl1M NaCl水溶液，涡旋振荡管子2×6秒并离心1min。将大约150μl的顶层（有机层）置于具有插入件的GC小瓶中并通过GC进行分析。
经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准物（C15:0TAG）的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME的近似量（μg）[“μg FAME”]：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/标准物FAME峰的面积）*（标准物C15:0TAG的μg数），而任何脂肪酸的量（μg）[“μg FA”]根据下式计算：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/标准物FAME峰的面积）*（标准物C15:0TAG的μg数）*0.9503，因为1μg的C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。
概述每种单个脂肪酸以TFA%重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行计算。
用这种方法，GC分析显示分别有TFA的28.5%、28.5%、27.4%、28.6%、29.2%、30.3%和29.6%EPA在第3组的pZKUM-转化体1、3、6、7、8、10和11中。这七个菌株分别被命名为菌株Y9502U12、Y9502U14、Y9502U17、Y9502U18、Y9502U19、Y9502U21和Y9502U22（统称为Y9502U）。
然后，构建了构建体pZKL3-9DP9N（图2B；SEQ ID NO:2），以将一种Δ9去饱和酶基因、一种磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因和一种Δ9延伸酶突变基因整合进菌株Y9502U的耶氏酵母YALI0F32131p基因座（GenBank登录号XM_506121）。pZKL3-9DP9N质粒包含以下组分：
表6：质粒pZKL3-9DP9N（SEQ ID NO:2）的描述
用AscI/SphI消化pZKL3-9DP9N质粒，然后用于转化菌株Y9502U17。将转化细胞接种到基本培养基[“MM”]平板上并保持在30℃下3至4天（基本培养基每升包含：20g葡萄糖、1.7g不含氨基酸的酵母氮源、1.0g脯氨酸、和pH6.1（不需要调节）。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min摇动2天。离心收集细胞，重悬浮在高糖培养基[“HGM”]中，随后在250rpm/min下振荡培养5天（高糖培养基每升包含：80葡萄糖、2.58g KH2PO4和5.36gK2HPO4，pH7.5（不需要调节）。对上述细胞进行脂肪酸分析，参见上文。
GC分析显示，所选择的96个用pZKL3-9DP9N产生的Y9502U17菌株中大多数产生占TFA50-56%的EPA。将生产了TFA的约59.0%、56.6%、58.9%、56.5%和57.6%EPA的五个菌株（即，31、32、35、70和80）分别命名为菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981。
这些pZKL3-9DP9N转化菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，未知9-，未知10-，未知11-，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，YAT1::ME3S::Lip1，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，GPAT::EgD9e::Lip2，YAT1::EgD9eS::Lip2，YAT::EgD9eS-L35G::Pex20，FBAINm::EgD8M::Pex20，EXP1::EgD8M::Pex16，FBAIN::EgD8M::Lip1，GPD::EaD8S::Pex16（2拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2，GPDIN::YlD9::Lip1，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::Aco，GPDIN::FmD12::Pex16，EXP1::EgD5M::Pex16，FBAIN::EgD5SM::Pex20，GPDIN::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，FBAINm::PaD17::Aco，EXP1::PaD17::Pex16，YAT1::PaD17S::Lip1，YAT1::YlCPT::Aco，YAT1::MCS::Lip1，FBA::MCS::Lip1，YAT1::MaLPAAT1S::Pex16，EXP1::YlPCT::Pex16。
在任何这些通过用pZKL3-9DP9N转化产生的EPA菌株中，YALI0F32131p基因座（GenBank登录号XM_50612）在菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981中的敲除未被确认。
培养了来自YPD平板的菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的细胞并按照下文方法部分就总脂质含量和组成对它们进行了分析。
为了详细分析在解脂耶氏酵母的特定菌株中的总脂质含量和组成，如下进行了烧瓶检测分析。具体地，将一接种环新制细胞划线接种到3mL发酵液体培养基[“FM”]中并在250rpm和30℃下生长过夜（发酵液体培养基每升包含：6.70g/L酵母氮源基础、6.00g KH2PO4、2.00g K2HPO4、1.50gMgSO4*7H2O、20g葡萄糖、和5.00g酵母提取物（BBL）。测量OD600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析（参见上文），并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。
就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5min，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。在80℃的真空炉中干燥上述细胞悬浮液过夜。测定细胞的重量。
计算细胞总脂质含量[“TFA%DCW”]，并且将其与列表显示以TFA%重量[“%TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA%DCW”]的数据综合考虑。
从而，下表7概述了菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的总脂质含量和组合物，其通过烧瓶测定法进行测定。具体地，该表概述细胞的干细胞总重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA%DCW”]、以TFA%重量[“%TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA%DCW”]。
解脂耶氏酵母菌株Z1978的发酵
在摇瓶中从解脂耶氏酵母菌株Z1978的冷冻培养物制备菌剂。在孵育期后，使用培养物接种种子发酵罐。当种子培养物达到合适的目标细胞密度时，用它接种较大的发酵罐。发酵是2-阶段分批补料方法。在第一阶段，在促进酵母快速生长至高细胞密度的条件下培养酵母；培养基包含葡萄糖、多种氮源、微量金属和维生素。在第二阶段，限制酵母的氮源并连续给料葡萄糖以促进脂质和PUFA积聚。方法变量包括温度（控制在30-32℃之间）、pH（控制在5-7之间）、溶解氧浓度和葡萄糖浓度，监控并按照标准运行条件控制这些变量以确保过程性能始终如一和最终的PUFA油质量。
发酵领域的技术人员将了解特定耶氏酵母属菌株的油特征将取决于发酵运行自身、培养条件、方法参数、规模大小等、以及特定的培养物取样时间点而发生变化（参见例如美国专利申请公布2009-0093543-A1）。
在发酵后，酵母生物质进行脱水和洗涤以除去盐和残余培养基、以及最小化脂肪酶活性。随后进行滚筒干燥以减少含水量至小于5%，确保在短期储存和运输期间的油稳定性。
表征干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质
干燥的和未处理的酵母生物质的脂肪酸组合物使用以下气相色谱法[“GC”]进行分析。具体地，通过使用甲醇钠在甲醇中的酯交换将甘油三酯转化成脂肪酸甲酯[“FAME”]。使用配备了30-m×0.25mm（内径）OMEGAWAX（Supelco）柱的Agilent7890GC，在稀释于甲苯/己烷（2:3）之后，分析了所得到的FAME。炉温以5℃/min的速度从160℃升高至200℃，然后以10℃/min的速度从200℃升高至250℃（保持10min）。
在与已知甲酯[“ME”]进行比较时，经由GC分析记录的FAME峰通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME峰面积与已知量内标（C15:0甘油三酯，通过酯交换方法与样品一起取出）的峰面积进行定量。因此，大约的量（mg）的任何脂肪酸FAME[“mg FAME”]按照下式被计算：（特定脂肪酸的FAME峰的面积/15:0FAME峰的面积）*（内部标准物C15:0FAME的mg数）。然后可通过除以合适的分子量转换因子1.042-1.052将FAME结果修正至对应脂肪酸mg。
概述每种单个脂肪酸以TFA%重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行近似计算（在±0.1重量%内）。
来自解脂耶氏酵母菌株Z1978的干燥的和未处理的酵母生物质包含56.1EPA%TFA，如表8所示。
表8：干燥的和未处理的Z1978生物质的脂肪酸组合物
| 脂肪酸 | 总脂肪酸重量% |
| C18:2（ω-6） | 14.2 |
| C20:5EPA | 56.1 |
| C22:6DHA | 未检出的（<0.05） |
| 其它组分 | 29.7 |
实例1B
从未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质中制备具有减少甾醇含量
的SPD-纯化的微生物油
本文实例描述了经由挤出和粒化用于破坏实例1A的干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质、使用超临界流体提取[“SCFE”]提取油、并且使用短程蒸馏条件通过蒸馏减少油的甾醇含量的方法。
经由挤出干燥的、未处理的酵母生物质进行破坏和粒化
将实例1A的干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Z1978生物质进料于双螺杆挤出机。具体地，将84重量%酵母（包含大约39%的总微生物油）和16%硅藻土（Celatom MN-4；EP Minerals，LLC，Reno，NV）的混合物进料于40mm双螺杆挤出机（Coperion Werner Pfleiderer ZSK-40mmMC，Stuttgart，Germany），进料速率为23kg/hr。在挤出机破坏区后以70mL/min的流速注入由26.5%的蔗糖制成的水/蔗糖溶液。挤出机以37kW马达和140rpm的高轴扭矩运行。%扭矩范围是17-22。在最终的水冷圆筒中将所得的破坏酵母粉末冷却至35℃。将含水的挤出粉末进料到LCIMulti-Granulator Model No.MG-55（LCI Corporation，Charlotte，NC）中，其配有1mm孔直径、1mm厚度的筛网，并设置在80rpm。用稳态2.2安培的最大电流，以27kg/hr的速度形成挤出物，并且使用常规的干燥设备进行干燥。干燥的粒料有大约1mm的直径×6至10mm的长度，其具有1.7%的最终含水量，这在Sartorius MA35水分分析仪（Sartorius AG，Goettingen，Germany）上测量。
提取挤出的酵母生物质
挤出的酵母粒料使用超临界液相二氧化碳（CO2）作为提取溶剂进行提取，从而产生富含甘油三酯的提取油，其包含EPA。具体地，将酵母粒料填充到320L的不锈钢提取容器中并包裹在聚酯泡沫过滤垫塞（Aero-FloIndustries，Kingsbury，IN）之间。密封容器，随后利用商业压缩机（Pressure Products Industries）通过换热器（预加热器）定量CO2并进料到立式提取容器中以从破坏酵母的粒料中提取富含甘油三酯的油。提取温度通过预加热器进行控制，并且用位于提取容器和分离容器之间的自动化控制阀（Kammer）保持提取压力。CO2和油提取物通过这一控制阀膨胀至较低压力。从膨胀溶液中收集提取油，它是在分离容器中的沉淀。分离容器中膨胀的CO2相的温度通过使用位于分离容器上游的附加换热器进行控制。这种较低压力的CO2流流出分离容器顶部并通过过滤器、冷凝器、和质量流量计再循环返回压缩机。提取油定期从分离容器中排出并收集作为产物。
提取容器初始填充有150kg挤出的酵母粒料。随后通过超临界流体CO2从粒料中提取富含甘油三酯的油，提取条件为5000psig（345巴）、55℃、以及32kg CO2/kg起始酵母粒料的溶剂-进料比率。从分离容器中收集总计39.6kg的提取油，向其加入约1000ppm的两种抗氧化剂：Covi-ox T70（Cognis，Ontario，Canada）和Dadex RM（Nealanders，Ontario，Canada）。提取油包含661mg的麦角固醇/100g油，这通过GC分析进行测定（参见下文）。
具体地，通过高效液相色谱法（HPLC）与紫外（UV）检测测定麦角固醇含量。提取油样品（100mg）用14mL9:102-丙醇:1-庚醇稀释并充分混合。制备在2-丙醇中的10至300μg/mL范围内的96%纯度的麦角固醇校正标准物（Alfa Aesar，Inc.，Ward Hill，MA）。在XDB-C8HPLC柱（4.6mm内径，150mm长度，5μm粒度，Agilent Technologies，Inc.，Wilmington，DE）上进行样品和标准物的色谱分析，使用0.02%碳酸铵水溶液-乙腈梯度（在12.5min内从65至100%乙腈）。注射体积是5μL，流量为1.2mL/min并且柱温是50℃。麦角固醇峰的UV（282nm）响应与在相同条件下分析的校正标准物的那些峰进行比较。
在SPD条件下蒸馏
提取油脱气并且虽然通过6”不锈钢分子蒸馏器（POPE Scientific，Saukville，WI），使用12kg/hr的进料速率以除去残余的水。蒸发器和冷凝器的表面温度分别设为140℃和15℃。真空度保持在15torr。大约3重量%的提取油随着馏出液中的水被除去。脱水的提取油基本上不含磷脂，包含0.5ppm的磷。在目测时，脱水的提取油在室温下是浑浊的。
脱水的提取油以12kg/hr的进料速率二次通过6”的分子蒸馏器。将真空度降低至1mtorr，并且蒸发器和冷凝器的表面温度分别保持在240℃和50℃。大约7重量%的脱水提取油随着馏出液被除去；这一级份主要包含游离脂肪酸和麦角固醇。也获得含三酰基甘油级份（即，SPD-纯化油），其包含284mg的麦角固醇/100g油（麦角固醇含量在与提取油中的麦角固醇含量进行比较时减少了～57%）。SPD-纯化油在储存在10℃下多天后是澄清的。
实例2
从未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质中制备具有减少甾醇含量
的SPD-纯化的微生物油
本文实例描述了经由挤出用于破坏干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质、使用超临界流体提取[“SCFE”]提取油、并且使用短程蒸馏条件通过蒸馏减少油的甾醇含量的方法。
制备干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质
解脂耶氏酵母菌株Y9502（实例1A）根据实例1A所示的方法以2-阶段分批补料方法培养并且将所得微生物生物质脱水、洗涤并干燥。
经由挤出干燥的、未处理的酵母生物质进行破坏
将干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y9502生物质进料于双螺杆挤出机。具体地，酵母生物质（包含大约37%的总微生物油）在不含硅藻土的情况下以270kg/hr的速率进料于70mm的双螺杆挤出机（CoperionWerner Pfleiderer ZSK-70mm SCD，Stuttgart，Germany）。
挤出机以150kW马达和150rpm的高轴扭矩以及33%的总安培范围运行。在最终的水冷圆筒中将所得的破坏酵母生物质冷却至81℃。破坏生物质的含水量为2.8重量%，这在Sartorius MA35水分分析仪（Sartorius AG，Goettingen，Germany）上测量。
提取挤出的酵母生物质
挤出的酵母生物质与硅藻土混合以防止床压实并使用超临界液相二氧化碳（CO2）作为提取溶剂来提取，产生粗制甘油三酯油，其包含EPA（即，“提取油”）。具体地，总计82.7kg的挤出酵母生物质与41kg的硅藻土（Celatom MN-4；EP Minerals，LLC，Reno，NV）混合并填充到320L的不锈钢提取容器中，其方式与实例1B中所述的方式相同，不同的是：（i）通过预加热器将提取温度控制在40℃；（ii）将提取压力保持在4500psig（310巴）；（iii）使用44kg CO2/kg起始酵母的溶剂-进料比进行提取。用这种方法，从破坏酵母中提取23.2kg的油。提取油包含774mg的麦角固醇/100g油，这通过根据实例1B方法的GC分析进行测定。
在SPD条件下蒸馏
提取油通过2”玻璃分子蒸馏器以提供脱水的提取油。将流量保持在大约480g/hr。真空度、蒸发器和冷凝器温度分别为0.2mm汞柱、130℃和60℃。然后脱水的提取油在1mtorr的真空度下通过不同温度的蒸馏器三次，如下表所示。在每次通过后，如前文所述测定含三酰基甘油级份（即，SPD-纯化油）中的麦角固醇含量、EPA含量（以重量%TFA表示）和总ω-3含量（以重量%TFA表示）。
表9：SPD-纯化油中的麦角固醇和PUFA含量
| 通过1 | 通过2 | 通过3 | |
| 温度（℃） | 210 | 240 | 270 |
| 麦角固醇（mg/100g） | 110 | 52.8 | 1.21 |
| C20:5EPA（重量%TFA） | 54.9 | 55.2 | 55.4 |
| 总ω-3（重量%TFA） | 57.51 | 57.92 | 57.18 |
因此，在210℃下，SPD-纯化油中的麦角固醇含量是110mg/100g油并且它在240℃下降低至约53mg/100g油。当温度进一步提高到270℃时麦角固醇几乎完全转移到1mg/100g油中。这分别对应于在与提取油中的麦角固醇含量进行比较时，在通过1、通过2和通过3中的～57%、～86%和～99.8%的麦角固醇含量减少。
相对于SPD-纯化油中的PUFA含量，表9的数据说明未发生显著的EPA或总ω-3内容物降解，甚至当油在270℃下通过SPD蒸馏器时依然如此。
使用色谱分离表达谱进一步分析通过3的SPD-纯化油的非期望组分和污染物的外观。具体地，测试如下完成：（i）带有火焰离子化检测器（GC/FID）的气相色谱；（ii）薄层色谱法（TLC）；以及（iii）带有质谱仪、光散射和紫外检测器（HPLC/MS/ELSD/UV）的液相色谱。SPD-纯化油样品的甲酯运行GC/FID表达谱。TLC和HPLC/MS/ELSD/UV表达谱直接对SPD-纯化油运行。在所有情况下，SPD-纯化油的表达谱与用解脂耶氏酵母菌株Y4305生物质制备的基准油进行比较。
具体地，根据实例1A所示的方法从干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y4305生物质中制备基准油。菌株Y4305能够制备55.6EPA%TFA，它在美国专利申请公布2009-0093543A1中有所描述。干燥的和未处理的生物质使用磨机，利用1对7的油对异己烷溶剂比率进行机械破坏。使用滗析离心机除去残余的生物质（即，细胞碎片）并且蒸发溶剂以产生包含甘油三酯的提取油。提取油使用冷丙酮，利用1对1.5的提取油对溶剂比率来脱胶，随后用50%的含水柠檬酸进行酸脱胶。然后用酸活化的粘土漂白脱胶的油并在210℃下脱臭30min以产生基准油样品。
通过3的SPD-纯化油色谱分离表达谱不包含在参照样品表达谱中未见的任何峰。两个样品均在同一天在相同条件下运行。另外，在SPD-纯化油中无未鉴定的峰，所述纯化油具有比参照样品表达谱中的对应峰显著更高的响应。在通过3的SPD-纯化油中也没有峰具有比通过1或通过2的SPD-纯化油中的相应峰更高的响应，其在较低温度（即，分别在210℃和240℃）下产生。这些分析表明在高温下使用SPD除去麦角固醇不产生油中降解产物的外观；因此，假设实施这种加工技术不显著降解PUFA。
实例3
从未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质中制备具有减少甾醇含量
的SPD-纯化的微生物油
本文实例描述了经由使用磨机的机械破坏用于破坏干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质、使用异己烷溶剂提取原油、以及使用短程蒸馏条件通过蒸馏减少丙酮脱胶的油的甾醇含量的方法。
解脂耶氏酵母菌株Y8672的基因型
菌株Y8672的生成描述于美国专利申请公布2010-0317072-A1。菌株Y8672来源于解脂耶氏酵母ATCC20362，能够经由表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约61.8%的EPA。
针对野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y8672的最终基因型为Ura+，Pex3-，未知1-，未知2-，未知3-，未知4-，未知5-，未知6-，未知7-，未知8-，Leu+，Lys+，YAT1::ME3S::Pex16，GPD::ME3S::Pex20，GPD::FmD12::Pex20，YAT1::FmD12::Oct，EXP1::FmD12S::ACO，GPAT::EgD9e::Lip2，FBAINm::EgD9eS::Lip2，EXP1::EgD9eS::Lip1，YAT1::EgD9eS::Lip2，FBAINm::EgD8M::Pex20，FBAIN::EgD8M::Lip1，EXP1::EgD8M::Pex16，GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝），YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1，YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco，FBAIN::EgD5SM::Pex20，YAT1::EgD5SM::Aco，GPM::EgD5SM::Oct，EXP1::EgD5M::Pex16，EXP1::EgD5SM::Lip1，YAT1::EaD5SM::Oct，YAT1::PaD17S::Lip1，EXP1::PaD17::Pex16，FBAINm::PaD17::Aco，GPD::YlCPT1::Aco和YAT1::MCS::Lip1。缩写如实例1A所定义。
为了详细分析菌株Y8672中的总脂质含量和组合物，进行烧瓶测定，其中细胞在2个阶段生长总计7天。根据分析，菌株Y8672产生3.3g/L的干细胞重量[“DCW”]，细胞的总脂质含量为26.5[“TFA%DCW”]，以干细胞重量%[“EPA%DCW”]表示的EPA含量为16.4，并且脂质特征如下所示，其中每种脂肪酸的浓度为重量%TFA[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.3，16:1（棕榈油酸）--0.4，18:0（硬脂酸）--2.0，18:1（油酸）--4.0，18:2（LA）--16.1，AlA--1.4，EDA--1.8，DGLA--1.6，ARA--0.7，ETrA--0.4，ETA--1.1，EPA--61.8，其它--6.4。
制备干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质
解脂耶氏酵母菌株Y8672根据实例1A所示的方法以2-阶段分批补料方法培养并且将所得微生物生物质脱水、洗涤并干燥。
经由磨机和异己烷溶剂破坏并提取干燥的未处理酵母生物质以生产提
取油
干燥的和未处理的解脂耶氏酵母菌株Y8672生物质使用磨机，利用异己烷溶剂进行机械破坏。使用滗析离心机除去残余的生物质（即，细胞碎片）并且蒸发溶剂以产生包含甘油三酯的提取油。
提取油使用实例1B的方法进行分析。微生物油包含58.1EPA%TFA，如表10所示。
表10：提取的Y8672微生物油的脂肪酸组合物
| 脂肪酸 | 总脂肪酸重量% |
| C18:2（ω-6） | 15.6 |
| C20:5EPA | 58.1 |
| C22:6DHA | 未检出的 |
| 其它组分 | 26.3 |
一部分提取油使用冷丙酮，利用1对1.5的提取油对溶剂比率进行脱胶。丙酮脱胶的油包含880mg麦角固醇/100g油和74.5ppm的磷。
在SPD条件下蒸馏
根据实例1B的方法（不同的是蒸发器温度设为255℃），丙酮脱胶的油经受短程蒸馏。在第一次通过期间几乎收集不到馏出液，因为在丙酮脱胶的油中有非常少量的水。在第二次通过期间，收集到大约12重量%的馏出液。在含三酰基甘油级份（即，SPD-纯化油）中的最终麦角固醇含量是106mg/100g（麦角固醇含量在与丙酮脱胶的油中的麦角固醇含量进行比较时减少了～88%）。SPD-纯化油包含66ppm的磷。
Claims (14)
1.减少含甾醇微生物油组合物中甾醇量的方法，所述方法包括：
a)在短程蒸馏条件下蒸馏所述含甾醇微生物油至少一次，其中所述油包含：
(i)包含一种或多种多不饱和脂肪酸的三酰基甘油；和
(ii)至少300mg/100g油的甾醇级份；
其中所述蒸馏产生包含所述甾醇的馏出液级份和含三酰基甘油级份，所述含三酰基甘油级份在与尚未经受短程蒸馏的含甾醇微生物油组合物中甾醇量进行比较时具有减少的甾醇量；以及
b)任选地，回收所述含三酰基甘油级份。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述短程蒸馏条件包括使所述含甾醇微生物油在不超过30mTorr的真空水平和不超过300℃的温度下通过至少一次。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述甾醇级份包含一种或多种甾醇，所述甾醇选自：豆甾醇、麦角固醇、芸苔甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和链甾醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述甾醇级份包含麦角固醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述含三酰基甘油级份中甾醇量在与所述含甾醇微生物油组合物中甾醇量进行比较时减少至少40%。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述具有减少甾醇级份的含三酰基甘油级份在与所述尚未经受短程蒸馏的含甾醇微生物油组合物进行比较时具有改善的透明度。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述温度不超过280℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述含甾醇微生物油组合物是精制的脂质组合物，所述脂质组合物具有用电感耦合等离子体光发射光谱法测定的小于20ppm的磷。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述含甾醇微生物油组合物获取自酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、真菌、或它们的混合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述含甾醇微生物油组合物获取自含油微生物，所述含油微生物来自选自下列的属：被孢霉属（Mortierella）、破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述含甾醇微生物油组合物获取自重组耶氏酵母属细胞的微生物生物质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组耶氏酵母属细胞经工程化以产生至少一种多不饱和脂肪酸，所述多不饱和脂肪酸选自：亚油酸、γ-亚麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、ω-6二十二碳五烯酸、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、ω-3二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸以及它们的混合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述蒸馏包括对所述微生物油组合物的两个或更多个连续的短程蒸馏。
14.根据权利要求13所述的方法，其中每个连续的短程蒸馏的温度高于所述之前刚进行的短程蒸馏的温度。
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