CN103080316B - 突变δ9延伸酶和它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途 - Google Patents

Abstract

本文公开了具有将亚油酸[18:2，LA]转化成二十碳二烯酸[20:2，EDA]和/或将α‑亚麻酸[18:3，ALA]转化成二十碳三烯酸[20:3，ETrA]的能力的突变Δ9延伸酶。本文还公开了分离的核酸片段和包含编码突变Δ9延伸酶的此类片段的重组构建体，以及用这些突变Δ9延伸酶在含油酵母中制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。

Description

突变Δ9延伸酶和它们在制备多不饱和脂肪酸中的用途

本申请要求2010年8月26日提交的美国临时申请61/377,248的权益，其以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及对编码突变Δ9脂肪酸延伸酶的多核苷酸序列的创建以及这些延伸酶在制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。

背景技术

人们正研究包括植物、藻类、真菌、原生藻菌和酵母在内的多种不同宿主作为商业化多不饱和脂肪酸[“PUFA”]生产的手段。基因工程已表明，一些宿主（即使那些天然限于亚麻酸[“LA”；18:2Ω-6]和α-亚麻酸[“ALA”；18:3ω-3]脂肪酸生产的宿主）可进行实质上的改造以产生对多种长链ω-3/ω-6PUFA的高水平生产。无论这是天然能力还是重组技术的结果，花生四烯酸[“ARA”；20:4ω-6]、二十碳五烯酸[“EPA”；20:5ω-3]、二十二碳五烯酸[“DPA”；22:5ω-3]和二十二碳六烯酸[“DHA”；22:6ω-3]可能均需要Δ9延伸酶基因的表达。

特化的Δ9延伸酶具有将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”；20:2ω-6]，以及将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”；20:3ω-3]的能力。然而，仅仅鉴定出少量的Δ9延伸酶。这些酶包括来自绿光等鞭金藻（Isochrysis galbana）的Δ9延伸酶[“IgD9e”]（SEQ ID NO:1和2；PCT公开WO2002/077213、WO2005/083093、WO2005/012316和WO2004/057001；GenBank登录号AAL37626、来自小型绿藻属（Eutreptiella sp.）CCMP389的Δ9延伸酶[“E389D9e”]（SEQ IDNO:3和4；美国专利7,645,604）、来自小眼虫（Euglena gracilis）的Δ9延伸酶[“EgD9e”]（SEQ ID NO:7和8；美国专利7,645,604）、以及来自Euglena anabaena的Δ9延伸酶[“EaD9e”]（SEQ ID NO:11和12；美国专利7,794,701）。尽管美国专利7,645,604鉴定出在EgD9e、E389D9e和IgD9e延伸酶之间保守的七种基序，但是仅仅使用IgD9e进行了一项研究来鉴定对于Δ9延伸酶功能性而言重要的氨基酸残基（Qi，B.等，FEBS Lett.，547:137-139（2003））。不存在来自Δ9延伸酶的可用晶体结构以指导对所述蛋白质的基因进化，并且对于Δ9延伸酶序列、结构和功能之间的关系了解甚少。尽管缺乏了解，对于在能够制备PUFA的生产宿主细胞中以高酶活性进行有效表达的Δ9延伸酶基因仍然存在需求。

已经发现了良好地适用于在商业可用的宿主细胞中整合进入PUFA生物合成途径的具有高活性的新型Δ9延伸酶突变体。令人惊异并且出乎意料的是，据发现，特定的点突变产生了Δ9延伸酶突变体，所述Δ9延伸酶突变体的酶活性基于LA向EDA的转化是野生型酶的96%至145%。

发明内容

在第一实施例中，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含：

(a)编码突变多肽的核苷酸序列，所述突变多肽具有Δ9延伸酶活性且具有如SEQID NO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:10具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

i)L35F突变；

ii)L35M突变；

iii)L35G突变；

iv)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；

v)L35G、W132T和I179R突变；

vi)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

vii)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

viii)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

ix)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

x)K58R和I257T突变；

xi)D98G突变；

xii)L130M和V243A突变；以及

xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T；

(b)部分（a）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成且是100%互补的。

所述分离的多核苷酸可具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:86、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQID NO:106和SEQ ID NO:109。

在第二实施例中，本发明涉及具有Δ9延伸酶活性的突变多肽，所述突变多肽由权利要求1的分离的多核苷酸编码。所述突变多肽可具有选自下列的蛋白质序列：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:110。

在第三实施例中，所述突变多肽具有Δ9延伸酶活性，所述Δ9延伸酶活性至少大致在功能上等同于如SEQ ID NO:10所示的多肽的Δ9延伸酶活性。优选地，当与如SEQ IDNO:10所示的多肽的亚油酸向二十碳二烯酸的底物转化百分比相比时，所述突变多肽的亚油酸向二十碳二烯酸的底物转化百分比为至少110%（即，对应于至少10%的活性改善），并且更优选地，所述突变多肽的亚油酸向二十碳二烯酸的底物转化百分比为至少120%（即，对应于至少20%的活性改善）。在第四实施例中，本发明涉及重组构建体，其包含权利要求1的分离的多核苷酸，所述重组构建体可操作地连接至少一种调控序列。

在第五实施例中，本发明涉及转化的细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸。所述转化的细胞可优选地选自：植物、细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。

在第六实施例中，本发明涉及转化的含油酵母，所述含油酵母产生其干细胞重量的至少约25%的油，所述含油酵母包含：

(a)至少一种重组DNA构建体，其包含本发明的分离的多核苷酸；以及

(b)至少一种重组DNA构建体，其包含可操作地连接至少一种调控序列的分离的多核苷酸，所述构建体编码选自下列的多肽：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶；

其中所述转化的含油酵母可产生选自下列的长链多不饱和脂肪酸：花生四烯酸、二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ亚麻酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。

更具体地，本发明的转基因含油酵母是解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。

在第七实施例中，本发明涉及生产多不饱和脂肪酸的方法，其包括：

a)提供含油酵母，所述含油酵母包含：

i)可操作地连接至少一种调控序列的重组构建体，其中所述重组构建体包含编码突变多肽的分离的多核苷酸，所述突变多肽具有Δ9延伸酶活性且具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:10具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

(a)L35F突变；

(b)L35M突变；

(c)L35G突变；

(d)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；

(e)L35G、W132T和I179R突变；

(f)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

(g)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

(h)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

(i)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

(j)K58R和I257T突变；

(k)D98G突变；

(l)L130M和V243A突变；以及

(m)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T；以及

ii)选自亚油酸和α-亚麻酸的底物脂肪酸来源；

b)使步骤（a）的酵母在使编码具有Δ9延伸酶活性的突变多肽的重组构建体表达且使所述底物脂肪酸转化成产物脂肪酸的条件下生长，其中亚油酸转化成二十碳二烯酸并且α-亚麻酸转化成二十碳三烯酸；以及

c)任选地回收步骤（b）的产物脂肪酸。

在第八实施例中，本发明涉及微生物油，所述微生物油获自本发明的含油酵母。

在第九实施例中，本发明涉及重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞产生油，所述油包含以干细胞重量的重量百分比测量的至少22.5重量%的二十碳五烯酸，所述重组微生物宿主细胞包含至少一种本发明的突变Δ9延伸酶多肽。

生物保藏

下列生物材料保藏于美国典型培养物保藏中心（American Type CultureCollection）（ATCC）（10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209），并具有下列名称、保藏号和保藏日期。

生物材料	保藏号	保藏日期
			解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）Y8412	ATCC PTA-10026	2009年5月14日

上面列出的生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

根据美国专利申请公开2010-0317072-A1中描述的方法，解脂耶氏酵母Y9502来源于解脂耶氏酵母Y8412。

附图说明和序列表

图1是使用绿光等鞭金藻[“IgD9e”]（SEQ ID NO:2）、小型绿藻属CCMP389[“E389D9e”]（SEQ ID NO:4）、小眼虫[“EgD9e”]（SEQ ID NO:8）和Euglena anabaena[“EaD9e”]（SEQ ID NO:12）的Δ9延伸酶的比对，其使用Vector 的AlignX程序进行（Invitrogen Corporation Carlsbad，CA）。

图2是pZUFmEgD9ES的质粒图谱。

图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G和3H是来自玻璃海鞘（Ciona intestinalis）（SEQ IDNO:43）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）（SEQ ID NO:44）、地钱（Marchantia polymorpha）（SEQ ID NO:45）、小立碗藓（Physcomitrella patens）（SEQ ID NO:46）、地钱（SEQ ID NO:47）、青绿藻（Ostreococcus tauri）（SEQ ID NO:48）、巴夫藻属（Pavlova sp.）CCMP459（SEQID NO:49）、盐生巴夫藻（Pavlova salina）（SEQ ID NO:50）、青绿藻（SEQ ID NO:51）、Euglena anabaena（SEQ ID NO:12）、小眼虫（SEQ ID NO:8）、小型绿藻属CCMP389（SEQ IDNO:4）、绿光等鞭金藻（SEQ ID NO:2）、假微型海链藻（Thalassiosira pseudonana）（SEQ IDNO:52）、假微型海链藻（SEQ ID NO:53）、高山被孢霉（Mortierella alpina）（SEQ ID NO:54）和破囊壶菌属（Thraustochytrium sp.）FJN-10（SEQ ID NO:55）的十七种脂肪酸延伸酶的比对，其使用ClustalW比对方法。

图4A示出了EgD9eS的膜拓扑模型；各个垂直圆柱体表示跨膜片段，而各个水平圆柱体表示处于或接近内膜小叶的疏水伸展区。

图4B示出了来源于小眼虫的合成突变Δ9延伸酶的示意图（即，“EgD9eS-突变共有区”；SEQ ID NO:22），其任选地包含：L35F突变；L35M突变；L35G突变；L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；L35G、A21V、L108G和I179R突变；L35G、W132T和I179R突变；L35G、S9D、Y84C和I179R突变；L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；K58R和I257T突变；D98G突变；L130M和V243A突变；以及至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T。

图5A和图5B示出了ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途径，并且应一同浏览。

图6图示了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株Z1978的发育，该菌株在总脂质级份中生产大于58.7%的EPA。

图7提供了下列质粒的图谱：（A）pZKUM；和（B）pZKL3-9DP9N。

根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825（“对含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”（“Requirements for Patent ApplicationsContaining Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures-theSequence Rules”）），并且符合世界知识产权组织（World Intellectual PropertyOrganization）（WIPO）ST.25标准（1998）以及EPO和PCT的序列表要求（规则5.2和49.5（a-bis）以及行政指令（Administrative Instructions）的208节和附录C）。核苷酸的符号和格式以及氨基酸序列数据符合如37C.F.R.§1.822所示的规则。

SEQ ID NO:1至111是表1中鉴定的ORF编码基因、蛋白质（或它们的部分）、引物或质粒。

表1：核酸和蛋白质序列号概述

具体实施方式

本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用方式将其全文并入本文。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。遵照在Nucleic Acids Research，13:3021-3030（1985）和Biochemical Journal，219（2）:345-373（1984）（其以引用方式并入本文）中描述的IUPAC-IYUB标准，通过氨基酸的单字母密码或三字母密码来标识氨基酸。

给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为“ORF”。

“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。

如本文所用的，术语“发明”或“本发明”旨在指如本文中的权利要求和说明书中所描述的本发明的所有方面和所有实施例，并无意于局限于任一具体实施例或方面。

术语“脂肪酸”是指不同链长的长链脂族酸（链烷酸），链长为约C₁₂-C₂₂（尽管更长和更短链长的酸均是已知的）。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳（“C”）原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”（“PUFA”）、以及“ω-6脂肪酸”（ω-6或n-6）对“ω-3脂肪酸”（ω-3或n-3）之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供，该专利以引用方式并入本文。

表2提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始（为此ω碳的编号为1）。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的通用名称、将在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名。

表2：多不饱和脂肪酸及其前体的命名

通用名称	缩写	化学名	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	棕榈酸	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八碳烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9,12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ亚麻酸	GLA	顺式-6,9,12-十八碳三烯酸	18:3ω-6
二十碳二烯酸	EDA	顺式-11,14-二十碳二烯酸	20:2ω-6
				二高-γ亚麻酸	DGLA	顺式-8,11,14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
花生四烯酸	ARA	顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
				α亚麻酸	ALA	顺式-9,12,15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
十八碳四烯酸	STA	顺式-6,9,12,15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
				二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11,14,17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
二十碳四烯酸	ETA	顺式-8,11,14,17-二十碳四烯酸	20:4ω-3
				二十碳五烯酸	EPA	顺式-5,8,11,14,17-二十碳五烯酸	20:5ω-3
二十二碳四烯酸	DTA	顺式-7,10,13,16-二十二碳四烯酸	22:4ω-6
				二十二碳五烯酸	DPAn-6	顺式-4,7,10,13,16-二十二碳五烯酸	22:5ω-6
二十二碳五烯酸	DPA	顺式-7,10,13,16,19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
				二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

尽管通过使用本文所述方法，表2列出的ω-3/ω-6PUFA是最有可能在微生物和植物宿主的油级份中积聚的，但是该列表不应被理解为限制性的或完全的。

术语“油”是指在25℃下为液体的脂质物质；所述油是疏水性的，但可溶于有机溶剂中。在含油的生物中，油构成了总脂质的主要部分。“油”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成，但还可包含其它中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油中的脂肪酸组合物和总脂质的脂肪酸组合物一般来讲是相似的。因此，总脂质中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油中的PUFA浓度的提高或降低，反之亦然。

“中性脂质”是指那些通常以贮存脂肪形式存在于细胞中的脂质体中的脂质，它们如此地命名是因为在细胞pH下，所述脂质无带电基团。它们一般是完全非极性的，对水无亲和力。中性脂质一般指脂肪酸的甘油单酯、二酯和/或三酯，也分别称为单酰基甘油[“MAG”]、二酰基甘油[“DAG”]或三酰基甘油，或统称为酰基甘油。为了从酰基甘油中释放游离脂肪酸，必须发生水解反应。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]指由酰化甘油分子的三个脂肪酰残基组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及链较短的饱和的以及不饱和的脂肪酸。

术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文是指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定例子中能通过碱酯交换方法（本领域已知的方法）被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级份（包括DAG、MAG和TAG）和来自极性脂质级份（包括例如磷脂酰胆碱[“PC”]和磷酸酰乙醇胺[“PE”]级份）的脂肪酸，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，虽然其以干细胞重量[“DCW”]的百分比的形式表示，不过总脂质含量可近似地以FAME占DCW的百分比[“FAME%DCW”]量度。因此，总脂质含量[“TFA%DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。

总脂质中的脂肪酸浓度本文表示为TFA的重量百分比[“%TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于按%TFA计的脂肪酸浓度（例如总脂质的%EPA等同于EPA%TFA）。

在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为它占干细胞重量的重量%[“%DCW”]是有用的。因此例如可根据下式测定EPA%DCW：（EPA%TFA）*（TFA%DCW）]/100。然而，以给定的脂肪酸占干细胞重量的重量百分比[“%DCW”]表示的给定的脂肪酸在细胞中的含量可以近似计算为：（EPA%TFA）*（FAME%DCW）]/100。

术语“脂质特征”和“脂质组合物”是可互换的，并且指在特定脂质级份（例如在总脂质或油中）中包含的单个脂肪酸的量，其中所述量用TFA重量百分比形式表示。混合物中存在的各单个脂肪酸的总量应当是100。

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。这一过程详细地描述于文献中（例如，参见美国专利7,932,077）。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶（称为“PUFA生物合成途径酶”）进行。更具体地，“PUFA生物合成途径酶”是指关联PUFA的生物合成的以下任何酶（以及编码所述酶的基因），包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶、和/或C_20/22延伸酶。

术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”将指最低程度包括至少一种Δ9延伸酶和至少一种Δ8去饱和酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。当表达其它去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA和DHA。

术语“去饱和酶”是指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和（即引入双键）而产生所关注的脂肪酸或前体的多肽。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文所特别关注的是：Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ15去饱和酶和Δ9去饱和酶。

术语“延伸酶”是指能延长底物脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用在其上的脂肪酸底物长2个碳原子的脂肪酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利7,659,120所述。由延伸酶体系催化的反应的例子是将LA转化成EDA、将ALA转化成ETrA、将GLA转化成DGLA、将STA转化成ETA、将ARA转化成DTA、以及将EPA转化成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C_14/16延伸酶可利用C₁₄底物（例如肉豆蔻酸），C_16/18延伸酶可利用C₁₆底物（例如棕榈酸酯），C_18/20延伸酶可利用C₁₈底物（例如GLA、STA、LA和ALA），并且C_20/22延伸酶（也称为Δ5延伸酶或C20延伸酶）可利用C₂₀底物（例如ARA、EPA）。就本文目的而言，能够确定两种不同类型的C_18/20延伸酶：Δ6延伸酶能够催化GLA和STA分别转化成DGLA和ETA，而Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。

术语“EgD9e”是指分离自小眼虫的、由本文SEQ ID NO:7编码的Δ9延伸酶（SEQ IDNO:8）。类似地，术语“EgD9eS”是指来源于小眼虫的合成Δ9延伸酶（即，SEQ ID NO:9和10），其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达。有关EgD9e和EgD9eS的进一步详细描述于美国专利7,645,604中。

为了本文目的，术语“EaD9e”是指分离自Euglena anabaena的、由本文SEQ ID NO:11编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:12）。类似地，术语“EaD9eS”是指来源于E.anabaena的合成Δ9延伸酶（即，SEQ ID NO:13和14），其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达。有关EaD9e和EaD9eS的进一步详细描述于美国专利7,794,701中。

术语“E389D9e”是指分离自小型绿藻属CCMP389的、由本文SEQ ID NO:3编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:4）。类似地，术语“E389S9eS”是指来源于小型绿藻属CCMP389的合成Δ9延伸酶（即，SEQ ID NO:5和6），其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达。有关E389D9e和E389D9eS的进一步详细描述于美国专利7,645,604中。

术语“IgD9e”是指分离自绿光等鞭金藻的、由本文SEQ ID NO:1编码的Δ9延伸酶（SEQ ID NO:2；NCBI登录号AAL37626（GI17226123））。

术语“保守结构域”或“基序”意指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其它位置的氨基酸可以有所不同，但在特定位置高度保守的氨基酸表明这些氨基酸对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是重要的。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。

Δ9延伸酶基序描述于美国专利7,645,604中并且包括：Y-N-X-（L或F）-X₄-S-X₂-S-F（SEQ ID NO:15）；F-Y-X-S-K-X₂-（E或D）-Y-X-D-（T或S）-X₂-L（SEQ ID NO:16）；L-（Q或H）-X-F-H-H-X-G-A（SEQ ID NO:17）；M-Y-X-Y-Y-X₇-（K或R或N）-F（SEQ ID NO:18）；K-X-L-（I或L或M）-T-X₂-Q（SEQ ID NO:19）；W-X-F-N-Y-X-Y（SEQ ID NO:20）；以及Y-X-G-X-V-X₂-L-F（SEQ ID NO:21）；其中X可以是任何氨基酸，并且有下划线的氨基酸对于Δ9延伸酶而言可能是独特的。图1示出了使用Vector 的AlignX程序（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）的默认参数对IgD9e（SEQ ID NO:2）、EgD9e（SEQ ID NO:8）、E389D9e（SEQ IDNO:4）和EaD9e（SEQ ID NO:12）进行的多氨基酸序列比对。所述图中以共有序列中加下划线的黑体文字示出了美国专利7,645,604的Δ9延伸酶基序，其在全部比对序列中是保守的。

术语“突变EgD9eS”是指本发明的Δ9延伸酶，其相对于来源于小眼虫的经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ9延伸酶（即EgD9eS[SEQ ID NO:9和10]）具有至少一种核苷酸或氨基酸突变。虽然“突变”可包括任何缺失、插入和点突变（或它们的组合），但在优选的实施例中，突变EgD9eS为如SEQ ID NO:22所示（图4B），其中SEQ ID NO:22与SEQID NO:10具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：a）L35F突变；b）L35M突变；c）L35G突变；d）L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；e）L35G、A21V、L108G和I179R突变；f）L35G、W132T和I179R突变；g）L35G、S9D、Y84C和I179R突变；h）L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；i）L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；j）K58R和I257T突变；k）D98G突变；l）L130M和V243A突变；以及m）包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T。对于所列出的各个替换，第一个字母对应于EgD9eS中的氨基酸（SEQ ID NO:10），第二个字母对应于所述突变体中相同位置上的氨基酸（SEQ ID NO:22），即，L35F表明在EgD9eS的第35位上的Leu[L]变为所述EgD9eS突变体中的Phe[F]。这一命名法在整个说明书中使用以指明本文所述的Δ9延伸酶蛋白中的突变；类似的命名用于描述所述核苷酸序列中的替换（即，C62T表明在EgD9eS（SEQ ID NO:9）的第62位上的胞嘧啶[C]变为所述EgD9eS突变体中的胸腺嘧啶[T]）。

当所述突变EgD9eS序列的酶活性（以及任选地，特异选择性）与EgD9eS的酶活性相当时（尽管多肽序列不同），突变EgD9eS与EgD9eS“至少大致在功能上相同”。因此当比较各个酶的“转化效率”时，功能上等同的突变EgD9eS序列将具有基本上不低于EgD9eS的Δ9延伸酶活性（即，突变EgD9eS将具有至少约50%，优选至少约75%，更优选至少约85%，最优选至少约95%的EgD9eS酶活性）。在更优选的实施例中，突变EgD9eS当与EgD9eS相比时将具有更高的酶活性（以及任选地，特异选择性）（即，至少约101-150%，更优选至少约151-200%，以及最优选至少约201-250%的EgD9eS酶活性）。尽管优选的范围如上所述，相对于EgD9eS的转化效率的有用例子包括50%至至少250%的任何整数百分比，诸如51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、111%、112%、113%、114%、115%、116%、117%、118%、119%、120%、121%、122%、123%、124%、125%、126%、127%、128%、129%、130%、131%、132%、133%、134%、135%、136%、137%、138%、139%、140%、141%、142%、143%、144%、145%、146%、147%、148%、149%、150%等，直至并包括250%。

术语“转化效率”和“底物转化百分比”是指特定酶（如Δ9延伸酶）能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：（[产物]/[底物+产物]）*100，其中‘产物’包括直接产物和途径中来源于它的所有产物。因此，“由LA形成EDA的转化效率”是指所述底物LA转化成为产物EDA的转化效率。

一般来讲，术语“含油的”是指趋于以油的形式贮存它们的能源的生物（Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980）。在该过程中，含油微生物的细胞油含量通常符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数培育生长期晚期或稳定培育生长期早期时它达到最高浓度，随后在稳定培育生长期晚期和死亡期期间逐渐下降（Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57:419-25（1991））。出于本发明的目的并且当用于微生物时，术语“含油的”是指可积累其DCW至少约25%的油的微生物。

术语“含油酵母”是指归类属于酵母的含油的微生物，其可产生油，即，其中所述油可积累超过其DCW的约25%。含油酵母的例子包括但不限于下列属：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。积累油超过所述酵母DCW的约25%的能力可以是通过重组工程的工作，或通过所述生物的天然能力。

术语“保守氨基酸取代”是指将给定蛋白质中的氨基酸残基用另一种氨基酸取代而不改变该蛋白质的化学或功能性质。例如，在本领域中熟知，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸（但不影响所编码、折叠蛋白质的结构和功能特性）的基因改变是常见的。出于本文的目的，将“保守氨基酸取代”定义为下列五组中的一组内的互换：

1.小脂肪族、非极性或弱极性的残基：Ala[A]、Ser[S]、Thr[T]（Pro[P]、Gly[G]）；

2.极性、带负电残基及其酰胺类：Asp[D]、Asn[N]、Glu[E]、Gln[Q]；

3.极性、带正电残基：His[H]、Arg[R]、Lys[K]；

4.大脂肪族、非极性残基：Met[M]、Leu[L]、Ile[I]、Val[V]（Cys[C]）；以及

5.大芳香族残基：Phe[F]、Tyr[Y]、Trp[W]。

因此如Ala这样的弱疏水性氨基酸可以由另一种疏水性更弱的残基（例如Gly）取代。类似地，还预期由一种带负电的残基取代另一种带负电的残基（例如Asp取代Glu）或一种带正电的残基取代另一种带正电的残基（例如Lys取代Arg）所引发的改变能产生功能上等同的产物。同样的，保守氨基酸取代一般保持：1）取代区域中的多肽主链的结构；2）靶位点上的分子电荷或疏水性；或3）侧链大小。此外，在许多情形中，改变蛋白质分子的N末端和C末端部分也将预计不会改变蛋白质的活性。

术语“非保守氨基酸取代”是指通常预期会使蛋白质性质发生最大变化的氨基酸取代。因此，例如，非保守氨基酸取代可以是：1）亲水性残基取代疏水性残基/被疏水性残基取代（例如，Ser或Thr取代Leu、Ile、Val/被Leu、Ile、Val取代）；2）Cys或Pro取代任何其它残基/被任何其它残基取代；3）具有带正电的侧链的残基取代带负电的残基/被带负电的残基取代（例如，Lys、Arg或His取代Asp或Glu/被Asp或Glu取代）；或4）具有大侧链的残基取代不具侧链的残基/被不具侧链的残基取代（例如，Phe取代Gly/被Gly取代）。有时，这五组中的两组之间的非保守氨基酸取代将不会影响所编码的蛋白质的活性。

术语“沉默突变”是指DNA序列中并不导致所编码的多肽中发生氨基酸变化的突变。这些突变通常是基因密码简并性的结果，其中超过一种的密码子可表示一种氨基酸。例如，TCT、TCA、TCG和TCC均编码氨基酸Ser；因此DNA序列中TCT向TCA的突变应仅可通过对所述基因（或其mRNA）进行测序而检测到，这是因为所合成的蛋白质的氨基酸（即Ser）中没有变异。

术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式存在的多核苷酸可由一个或多个cDNA、基因组DNA、合成DNA、或它们的混合物的链段构成。核苷酸（通常以它们的5’-单磷酸形式存在）通过单字母命名指代如下：“A”是指腺苷酸或脱氧腺苷酸（分别用于RNA或DNA），“C”是指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”是指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”是指尿苷酸，“T”是指脱氧胸苷酸，“R”是指嘌呤（A或G），“Y”是指嘧啶（C或T），“K”是指G或T，“H”是指A或C或T，“I”是指肌苷，“N”是指任何核苷酸。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定而鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST（Basic Local AlignmentSearch Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215:403-410（1993））的算法进行计算机自动化的序列比较和鉴定。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多个邻接氨基酸或者三十个或更多个核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定（如Southern杂交）和基因分离（如细菌菌落或噬斑的原位杂交）的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本文所公开内容详述了编码特定延伸酶的完整氨基酸和核苷酸序列。技术人员在受益于本文所报道的序列的情况下现在可将所公开序列的全部或基本部分用于本领域的技术人员所知的目的。因此，本公开包括在附随序列表中报道的完全序列，以及那些上述序列的主要部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开涵盖了与所附序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段，以及基本相似的核酸序列。

术语“同源性”、“同源的”、“基本上类似的”和“基本上对应的”在本文中可互换使用。它们是指具有类似但不相同序列的核酸片段或多肽。这些术语有时也指核酸片段的修饰（例如通过删除或插入一个或多个核苷酸），相对于初始的未经修饰的片段其基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域的技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。

在核酸或多肽序列上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指两序列中的核酸碱基或氨基酸残基当在指定比较窗口中比对最大匹配时是相同的。

因此，“序列同一性百分比”或“百分比同一性”是指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列而测得的值，其中在与参考序列（其不包含添加或缺失）进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失（即缺口）以实现两个序列的最佳比对。百分比通过以下方法进行计算：测定两序列中具有相同核酸碱基或氨基酸残基以产生匹配位置的位置数目，将该匹配位置的数目除以比较窗口两序列中的位置总数，并且所得结果乘以100来获得序列同一性的百分比。

用于测定“百分比同一性”和“百分比相似性”的方法在被编码于可公开获得的计算机程序中。百分比同一性和百分比相似性可通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于下列中所述的方法：1）Computational Molecular Biology（Lesk，A.M.编辑）Oxford University:NY（1988）；2）Biocomputing:Informatics and Genome Projects（Smith，D.W.编辑）Academic:NY（1993）；3）Computer Analysis of Sequence Data，部分I（Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑）Humania:NJ（1994）；4）Sequence Analysis in Molecular Biology（von Heinje，G.编辑）Academic（1987）；以及5）Sequence Analysis Primer（Gribskov，M.和Devereux，J.编辑）Stockton:NY（1991）。

序列比对和百分比同一性或百分比相似性的计算可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.，Madison，WI）的MegAlign^TM程序。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干种不同的算法，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”（描述于Higgins和Sharp，CABIOS，5:151-153（1989）；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8:189-191（1992））并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包（DNASTAR Inc.）的MegAlign^TM程序（版本8.0.2）中。用任一Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

对于使用Clustal V比对方法的多重比对，默认值对应于GAP PENALTY=10、以及GAP LENGTH PENALTY=10。用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE=1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、以及DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WINDOW=4、以及DIAGONALS SAVED=4。

使用Clustal W比对方法进行的多重比对的默认参数为GAP PENALTY=10、GAPLENGTH PENALTY=0.2、Delay Divergent Seqs（%）=30、DNA Transition Weight=0.5、Protein Weight Matrix=Gonnet系列、DNA Weight Matrix=IUB。

“BLASTN比对方法”是由美国国立生物技术信息中心[“NCBI”]提供的算法，采用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，采用默认参数比较蛋白质序列。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的核酸片段，即根据本文公开的分离的多核苷酸，编码与本文报道的氨基酸序列至少约70-85%相同的多肽，而较优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列至少约85-95%相同的氨基酸序列。尽管上文已描述了优选的范围，百分比同一性的可用例子包括从70%至100%的任何整数百分比，例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。而且，所关注的是这种分离的核苷酸片段的任何全长的或部分的互补序列。

合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。

“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本文描述了编码氨基酸序列的全部或基本部分的任意核酸片段，所述氨基酸序列编码本发明的Δ9延伸酶多肽，其如EgD9eS-L35F（SEQ ID NO:29）、EgD9eS-K58R/I257T（SEQ ID NO:32）、EgD9eS-L130M/V243A₁（SEQ ID NO:35）、EgD9eS-D98G（SEQ ID NO:38）、EgD9eS-L130M/V243A₂（SEQ ID NO:41）、EgD9eS-L35G（SEQ ID NO:59）、EgD9eS-L35M/Q107E（SEQ ID NO:62）、EgD9eS-A21V/L35G/L108G/I179R（SEQ ID NO:87）、EgD9eS-L35G/W132T/I179R（SEQ ID NO:101）、EgD9eS-L35G/S9D/Y84C/I179R（SEQ IDNO:104）、EgD9eS-L35G/Y84C/I179R/Q244N（SEQ ID NO:107）、EgD9eS-L35G/A21V/W132T/I179R/Q244N（SEQ ID NO:110）和EgD9eS-突变共有区（SEQ ID NO:22）所列。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位装配而成。将这些寡核苷酸基本单位构件进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因（其中序列信息可获得）的检测。例如，在美国专利7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用谱。

“基因”是指表达特定蛋白质的核酸片段，并且其可单独指所述编码区或可包括所述编码区上游和/或下游调控序列（例如，所述编码区的转录起始位点上游的5'非翻译区、3'非编码区）。“天然基因”是指自然状态下与其自身的调控序列一起的基因。“嵌合基因”是指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移引入至宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、引入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法引入基因组内的基因。“经密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“调控序列”是指位于所述编码序列的转录起始位点上游的核苷酸序列5'非翻译区以及3'非编码区，并且其可影响转录、RNA加工或稳定性、或者相关编码序列的翻译。调控序列可包括但不限于：启动子、增强子、沉默子、5'非翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，启动子序列位于编码序列的5'上游。启动子可整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在细胞生长和/或发育的不同阶段，或响应不同的环境条件而引导基因的表达。使基因在几乎全部发育阶段表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全测定调控序列的确切范围（尤其是在其5'端），DNA片段一些变体可能具有相同的启动子活性。

术语“3'非编码序列”、“转录终止子”、“终止子”和“终止序列”是指位于编码序列3'下游的DNA序列。这包括多聚腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。多聚腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3'端。3'区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物。当RNA转录物是来源于转录后加工的初级转录物的RNA序列时，它指成熟的RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”是指与mRNA模板互补并用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链。“正义”RNA是指包括mRNA在内并且在细胞内或体外能被翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”是指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补并且可阻断靶基因的表达的RNA转录物（美国专利5,107,065）。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达（即，该编码序列受到该启动子的转录控制）时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以正义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

术语“重组体”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。

如本文所用，术语“表达”是指正义（mRNA）或反义RNA的转录和稳定积聚。表达还包括mRNA翻译成蛋白质（其为前体蛋白或成熟蛋白）。

”转化”是指将核酸分子转移进宿主生物中，从而导致在遗传上稳定的遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，或它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”或“转化体”生物。

术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以具有自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，并且可能是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA（源自任何来源），其中多个核苷酸序列已连接或重组进入独特的结构，该独特结构能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”是指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中表达的元件的DNA片段。表达盒一般应包含所选基因的编码序列和位于所述编码序列之前（5'非编码序列）和之后（3'非编码序列）的所选基因产物表达所需的调控序列。因此，表达盒通常由下列组成：1）启动子序列；2）编码序列（即，ORF）；和3）在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点的终止子。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

术语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”本文可互换使用。重组构建体包括人造的核酸片段组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于用以转化宿主细胞的方法，该宿主细胞是本领域的技术人员所熟知的。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包括本文所述的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达（Jones等人，EMBO J.，4:2411-2418（1985）；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86（1989）），因此为了获得显示所需表达水平和模式的菌株或细胞系，必须对多个事件进行筛选。可通过对DNA的Southern分析、对mRNA的Northern分析、对蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、特异性产物的形成、对所述PUFA产物的表型分析或GC分析、以及其它发方法进行此类筛选。

术语“宿主细胞”和“宿主生物”在本文中可互换使用，并且是指能够接收外来或异源基因并且能够表达这些基因的任意生物，诸如微生物或植物（即，油料种子植物）。“重组宿主细胞”是指已经受到重组工程改造的宿主细胞。

术语“序列分析软件”是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1）GCG程序软件包（Wisconsin Package Version9.0，Genetics Computer Group（GCG），Madison，WI）；2）BLASTP，BLASTN，BLASTX（Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410（1990））；3）DNASTAR（DNASTAR，Inc.Madison，WI）；4）Sequencher（Gene CodesCorporation，Ann Arbor，MI）；和5）整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序（W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.]（1994），会议日期1992，111-20，编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY）。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是为人所熟知的，并且更为全面地描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning:LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1989）；Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1984）；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocolsin Molecular Biology，公布于Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience，Hoboken，NJ（1987）。

本文中公开了新的突变Δ9延伸酶和编码这些延伸酶的基因，其可用于操纵产生健康的PUFA的生化途径。

图5A和5B共同示出了用于生产特定ω-3/ω-6脂肪酸的多种替代性途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”]（第一个ω-6脂肪酸）。然后，使用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并用LA作底物，如下形成长链ω-6脂肪酸：1）通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2）通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3）通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4）通过C₂₀/₂₂延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及5）通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。

“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”也能够利用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物如下生产长链ω-3脂肪酸：1）通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA，第一个ω-3脂肪酸；2）通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3）通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4）通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5）通过C₂₀/₂₂延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及6）通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸。例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。

用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径利用了Δ6去饱和酶和C₁₈/₂₀延伸酶，即，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ6去饱和酶被分别转化成GLA和十八碳四烯酸[“STA”]；然后，C₁₈/₂₀延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。随后如上所述形成下游PUFA。

预期需要在特定宿主生物中引入的特定功能（其实现或增强所述生物产生ω-3/ω-6脂肪酸的能力）将取决于宿主细胞（及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况）、底物的可利用性和所需的终产物。对这些考虑点的讨论以及影响鉴定和选择编码去饱和酶和延伸酶（例如，Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C_20/22延伸酶）的特定基因的因素可见于美国专利7,238,482和美国专利7,932,077。

然而，本发明所特别相关的一个方面是将要表达于特定宿主生物中的各特定去饱和酶和/或延伸酶的转化效率。更具体地，由于每种酶极少能以100%的效率将底物转化成产物，宿主细胞所产生的未纯化的油的最终脂质概况将通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当使所需脂肪酸的生物合成优化时，通常考虑每种酶的转化效率。

一旦脂肪酸在生物体内合成（包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链脂肪酸），它们可能被掺入TAG。TAG是脂肪酸的主要储存单位。

共同拥有的美国专利公开2007-0118929-A1和美国专利7,645,604均公开了能够将LA延伸成为EDA的小眼虫Δ9延伸酶（“EgD9e”；本文中的SEQ ID NO:7和8）。此外，来自小眼虫且经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达的合成Δ9延伸酶（“EgD9eS”；本文中的SEQID NO:9和10）还公开于美国专利7,645,604中。具体地，除了修饰翻译起始位点之外，还修饰了777bp的编码区的117bp（15.1%）并优化了106个密码子（然而由密码子优化的基因[即，SEQ ID NO:10]编码的蛋白质序列与野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO:8]相同）。根据测定EgD9eS在表达于解脂耶氏酵母中时在将LA延伸成为EDA上效率比野生型EgD9e高约16.2%。

文献中已经建立了用于合成序列并将序列组合到一起的方法。而且，通常采用多种技术以获得天然存在的基因的突变体（其中此类突变可包括缺失、插入和点突变、或它们的组合）。本发明的工作以鉴定EgD9eS内的适当突变为目的，当其表达于所述含油酵母解脂耶氏酵母中时所述突变应提高所述酶对LA向EDA的转化效率。提高的转化效率作为提高PUFA生物合成的整体速度和量的手段是理想的。本文描述了多种突变，上文描述的全部这些突变蛋白质和编码它们的核苷酸序列（衍生自野生型（即SEQ ID NO:8）和合成的经密码子优化的（SEQ ID NO:10）的Δ9延伸酶）均处于本文所述的范围之内。

尽管Δ9延伸酶含有多种保守序列（图1；即，SEQ ID NO:15-21），此前仅仅研究了这些基序之一的一部分以确定其在最佳酶功能中的作用。具体地，Qi，B.等人（FEBS Lett.，547:137-139（2003））检测了绿光等鞭金藻Δ9延伸酶[“IgD9e”]（其为第一种经鉴定具有Δ9延伸酶活性的PUFA-特异性延伸酶）的变体组氨酸盒[“His-box”]。由于IgD9e在Δ6延伸酶中是（当时）仅知的加工Gln-Xaa-Xaa-His-His[“QxxHH”；SEQ ID NO:23]基序（而非高度保守的His-Xaa-Xaa-His-His[“HxxHH”；SEQ ID NO:24]基序）的PUFA-特异性延伸酶，因此实施了一系列的突变来以His、Ala或Phe残基取代Gln并且通过表达于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分析了所述突变蛋白质的活性。Qi等人测定，全部所述替换导致了更低的Δ9延伸酶活性并且因此作出了“该组氨酸盒中的谷氨酰胺残基看来对于最佳酶催化是关键性的”的结论。

根据上文仅有的研究以及对任何Δ9延伸酶晶体结构的缺乏，在Δ9延伸酶中鉴定适当突变的逻辑性定位方法并非是理想的。以EgD9eS（SEQ ID NO:9）作为模板通过易错PCR[“ePCR”]合成工程化了编码Δ9延伸酶的突变序列文库，其中EgD9eS被包含在含有嵌合型FBAINm::EgD9eS::Pex20基因的质粒构建体中。随后将所述ePCR文库转化进入解脂耶氏酵母，并且根据GC分析和EDA的产生筛选改善的Δ9延伸酶活性。

大量克隆经鉴定导致完全无功能的突变Δ9延伸酶（即，不具可检测的Δ9延伸酶活性）或具有与非突变野生型酶EgD9eS相比具有大幅降低的Δ9延伸酶活性的突变Δ9延伸酶。然而，出人意料的是，鉴定出了导致改善的LA向EDA的转化效率的多种突变[根据（[EDA]/[LA+EDA]）×100计算]。具体地，5种转化体菌株经鉴定包含4种不同的突变Δ9延伸酶基因（即，当与EgD9eS的蛋白质序列[SEQ ID NO:10]相比时分别包含K58R/I257T突变、L35F突变、D98G突变和L130M/V243A突变），其中所述Δ9延伸酶转化活性在105%至117%的范围内（下文表3），相当于5-17%的改善。因此，该工作显示了EgD9eS的Δ9延伸酶活性可实际上通过蛋白质工程加以改善。

随后将获自上述EgD9eS ePCR文库的初始数据用于推理鉴定EgD9eS中的两种不同的氨基酸残基（即，残基35和107），所述残基是创建位点饱和文库的适当靶点。同样，筛选了各个突变对于所产生的突变EgD9eS蛋白的Δ9延伸酶活性的效果，从而得以鉴定导致改善的LA向EDA的转化效率的两种另外突变。具体地，鉴定出了在所述突变Δ9延伸酶中包含L35G突变或L35M/Q107E突变的转化体菌株，其中与EgD9eS相比，所述Δ9延伸酶转化活性为142%-145%或132%（下文表3），相当于32-45%的改善。

在对L35G的突变进行鉴定之后，使用技术并以该EgD9eS-L35G基因为靶标创建了靶向50种不同氨基酸残基的后续文库。鉴定出了25种不同的突变，各突变均结合以L35G突变，与亲本延伸酶（即，EgD9eS-L35G）相比其产生了96%至141%的Δ9延伸酶转化活性（下文表3），相当于-4%至41%的改善。

最后，新近的工作致力于组合（或“堆叠”）在所述文库中鉴定出的多种有利突变，从而在所述合成的密码子优化的EgD9eS序列中“堆叠”适当的单一氨基酸突变。因此，例如，已经表明相对于SEQ ID NO:10[EgD9eS]而言包含A21V、L35G、W132T、I179R和Q244N突变的突变Δ9延伸酶产生了相对于EgD9eS的123%的Δ9延伸酶转化活性（下文表3），相当于23%的改善。

表3：具有提高的Δ9延伸酶活性的突变体的概述

a“相对活性”是指各突变EgD9eS相对于SEQ ID NO:10所示的EgD9eS的Δ9延伸酶活性的Δ9延伸酶活性。

b“相对活性”是指各突变EgD9eS相对于SEQ ID NO:59所示的EgD9eS-L35G的Δ9延伸酶活性的Δ9延伸酶活性。

本领域的技术人员应当理解本发明的可用突变Δ9延伸酶不限于上文所述的37种突变组合。而是据预期大量的上述保守和非保守氨基酸取代（即，突变）可相互以任何组合使用。并且本文所述的来源于EgD9e和/或EgD9eS的所有此类突变蛋白质和编码它们的核苷酸序列属于本发明的范围内。

例如，本发明工作的实验性策略大体上基于对另外的保守和非保守氨基酸取代的鉴定，所述氨基酸取代可堆叠进入EgD9eS-L35G并且在与所述合成的经密码子优化的EgD9eS或EgD9eS-L35G相比时，其给予所述Δ9延伸酶转化效率进一步的优势。虽然鉴定出了多种突变Δ9延伸酶（其相对于EgD9eS而言包括两种突变），但是从所述组合库中仅仅表征了5种突变体，各突变体相对EgD9eS而言具有3至5种突变。预计可鉴定出其它突变体，其相对EgD9eS或EgD9eS-L35G而言具有至少在功能上相同的活性或改善的Δ9延伸酶转化效率，并且相对EgD9eS而言具有2、3、4、5、6或更多种突变。

作为另外一种选择，本领域的技术人员可容易地使用（例如）EgD9eS-D98G作为模板（即，并非EgD9eS-L35G）并且确定选自K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T中的能够进行有利地堆叠的突变，由此而产生相对EgD9eS而言具有2、3、4、5、6或更多种突变的最终的突变Δ9延伸酶。

因此，在一个实施例中，根据图4B所示，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含

a)编码突变多肽的核苷酸序列，所述多肽具有Δ9延伸酶活性且具有如SEQ IDNO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:10具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

i)L35F突变；

ii)L35M突变；

iii)L35G突变；

iv)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；

v)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

vi)L35G、W132T和I179突变；

vii)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

viii)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

xi)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

x)K58R和I257T突变；

xi)D98G突变；

xii)L130M和V243A突变；以及

xiii)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T；以及

b)部分（a）的核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成且是100%互补的。

在一些实施例中，本发明的突变多肽在此可具有选自下列的蛋白质序列：SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:62、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:110，尽管这些例子并非对本发明的限制。

用于产生本发明的突变多肽的方法和用于鉴定本发明的突变多肽的方法在此均不应视作为限制。

例如，体外诱变和选择或易错PCR（Leung等人，Techniques，1:11-15（1989）；Zhou等人，Nucleic Acids Res.，19:6052-6052（1991）；Spee等人，Nucleic Acids Res.，21:777-778（1993）；Melnikov等人，Nucleic Acids Res.，27（4）:1056-1062（1999年2月15日））可用作为获得天然Δ9延伸酶基因的突变的方法，其中所述突变可包括缺失、插入和点突变、或它们的组合。易错PCR的主要优点是，通过该方法引入的所有突变都将位于所期望的延伸酶基因内，并且任何改变均可容易地通过改变PCR条件加以控制。作为另外一种选择，可使用以可商购获得的材料进行的体内突变诱变，诸如来自Stratagene的大肠杆菌XL1-Red菌株和Epicurian coli XL1-Red突变者菌株（La Jolla，CA；还参见Greener和Callahan，Strategies，7:32-34（1994））。该菌株缺少了三条主要的DNA修复途径（mutS、mutD和mutT），导致比野生型高5000倍的突变率。体内诱变并不依赖于连接效率（如易错PCR）；然而，突变可在所述载体的任何区域发生并且所述突变速度通常远为更低。

还预期可使用“基因改组”方法（美国专利5,605,793；美国专利5,811,238；美国专利5,830,721；和美国专利5,837,458）构建具有不同的或增强的Δ9延伸酶活性的突变Δ9延伸酶。基因改组方法尤其具有吸引力，因为它易于实施并且具有高诱变率。基因改组的过程涉及将所关注的基因进行限制酶切成为特定大小的片段，酶切在另外的DNA区域的群体存在下进行，与所关注的基因相似的（或不同的）DNA区域均包括在所述群体中。上述片段的集合将变性，然后退火，以产生突变的基因。然后就改变的活性对突变的基因进行筛选。任何这些方法均可用于创建具有改善活性的Δ9延伸酶突变酶。

作为另外一种选择，技术人员应能够设想另外的筛选以用于选择编码具有Δ9延伸酶活性的蛋白质的基因。例如可以通过检测分析法检测延伸酶活性，其中将包含一种酶的制备物与合适形式的脂肪酸底物一起培养并分析此底物向预想的脂肪酸产物的转化情况。作为另外一种选择，可以将提出的用于编码延伸酶蛋白质的DNA序列引入合适的载体构建体，并通过该构建体在正常情况下不能延伸特定脂肪酸底物的细胞中表达。然后可以通过向以包含编码延伸酶的DNA序列的载体转化的细胞和合适的对照细胞（例如单独用空载体转化的细胞）提供合适形式的脂肪酸底物展示该DNA序列编码的延伸酶的活性。在这一实验中，在包含编码延伸酶的DNA序列的细胞中检测到预想的脂肪酸产物，而在对照细胞中检测不到该脂肪酸产物，由此确定延伸酶的活性。

本领域的技术人员应认识到，有用的突变Δ9延伸酶不限于以上所述的突变。对应的是，所述结果提示可使用多种替代性Δ9延伸酶作为亲本（即，来自不同属、种等等）进行类似的实验，从而工程改造出具有提高Δ9延伸酶活性的突变Δ9延伸酶。优选地，进行诱变的所述Δ9延伸酶应包含描述于美国专利7,645,604之中并且由SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20和21示出的7种Δ9延伸酶基序中的至少一种。更加可能的是，适当的亲本Δ9延伸酶应与EgD9eS至少约35%-50%的同一性，其中具有至少约50%-65%同一性的序列尤其适合，而具有至少约65%-80%同一性的序列是最优选的。尽管上文已描述了优选的范围，序列同一性百分比的可用的例子包括从35%至100%的任何整数百分比，例如36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。应当理解，具有提高的Δ9延伸酶活性的突变酶可用于实现ω-3/ω-6脂肪酸的提高生产。

例如，很容易改善绿光等鞭金藻的Δ9延伸酶（即，IgD9e[SEQ ID NO:2]；与EgD9eS具有～35%的序列同一性）、小型绿藻属CCMP389的Δ9延伸酶（即，E389D9e[SEQ ID NO:4]；与EgD9eS具有～60%的序列同一性）、以及Euglena anabaena的Δ9延伸酶（即，EaD9e[SEQID NO:12]；与EgD9eS具有～60%的序列同一性）的Δ9延伸酶活性，应为这些基因应有可能以类似于在小眼虫中可见的方式耐受突变。虽然通过针对任意这些亲本分子创建（例如）易错PCR文库起始诱变是理想的，但是应当合理地预见到可根据与EgD9eS的那些位点具有同源性的氨基酸残基突变鉴定改善的突变体。使用AlignX program（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）的默认参数制得的IgD9e、E389D9e、EgD9e和EaD9e的比对在图1中示出。此前已经参照可能表明Δ9延伸酶活性的基序的序列讨论了所述共有序列中的下划线标记的黑体文字。SEQ ID NO:8的EgD9e序列（其在序列上等同于SEQID NO:10示出的EgD9eS序列）中的黑体文字标出了在本发明中受到突变以产生具有改善的Δ9延伸酶活性的突变延伸酶的残基。这些突变的定位还以所述比对各行上方的星号标出。根据这一比对的分析，本领域的技术人员可推定对描述于下文表4中的任意残基的修饰也可分别在EaD9e、E389D9e和IgD9e中产生改善的Δ9延伸酶活性。因此，例如，SEQ ID NO:4[E389D9e]的氨基酸残基13（即，Ala[A]）与SEQ ID NO:10[EgD9eS]的氨基酸残基9（即，Ser[S]）形成比对；因此，可以预计对E389D9e中的该Ala的替换可能产生具有提高Δ9延伸酶活性的延伸酶，其方式类似于在EgD9eS中所见的方式（当所述Ser以Ala、Asp、Gly、Ile、Lys或Gln进行替换时）对各个氨基酸残基处的最优选替换的可通过实验进行测定。

表4：根据在EgD9eS中鉴定出的残基位点，预计在EaD9e、E389D9e和IgD9e中改善Δ 9延伸酶活性的残基位点

预计引入编码本文所述的Δ9延伸酶（相对于EgD9eS具有提高的Δ9延伸酶活性）的处于合适启动子控制下的嵌合基因将会分别导致EDA和/或ETrA在转化的宿主生物中的生产提高。同样的，本文描述了用于直接产生PUFA的方法，其中所述方法包含将脂肪酸底物暴露（即，LA和/或ALA）于本文所述的突变延伸酶（如SEQ ID NO:22），从而使所述底物转化成为所需的脂肪酸产物（即，分别成为EDA和/或ETrA）。

更具体地，本文描述了生产多不饱和脂肪酸的方法，其包括：

a)提供含油酵母，所述含油酵母包含：

i)可操作地连接至少一种调控序列的重组构建体，其中所述重组构建体包含编码突变多肽的分离的多核苷酸，所述突变多肽具有Δ9延伸酶活性且具有如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:22与SEQ ID NO:10[EgD9eS]具有至少一个氨基酸突变的差异，所述突变选自：

(a)L35F突变；

(b)L35M突变；

(c)L35G突变；

(d)L35G突变和至少一种选自下列的其它突变：S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、Q107E、L108G、G127L、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、Q244N、A254W和A254Y；

(e)L35G、A21V、L108G和I179R突变；

(f)L35G、W132T和I179突变；

(g)L35G、S9D、Y84C和I179R突变；

(h)L35G、Y84C、I179R和Q244N突变；

(i)L35G、A21V、W132T、I179R和Q244N突变；

(j)K58R和I257T突变；

(k)D98G突变；

(l)L130M和V243A突变；以及

(m)包含至少两种突变的任何组合，其中所述突变选自：K58R、L35F、L35G、L35M、S9A、S9D、S9G、S9I、S9K、S9Q、Q12K、A21D、A21T、A21V、V32F、Y84C、D98G、Q107E、L108G、G127L、L130M、W132T、M143N、M143W、L161T、L161Y、W168G、I179M、I179R、C236N、V243A、Q244N、A254W、A254Y和I257T；以及

ii)选自亚油酸和α-亚麻酸的底物脂肪酸来源；

b)使步骤（a）的酵母在使编码具有Δ9延伸酶活性的突变多肽的重组构建体表达且使所述底物脂肪酸转化成产物脂肪酸的条件下生长，其中亚油酸转化成二十碳二烯酸并且α-亚麻酸转化成二十碳三烯酸；以及

c)任选地回收步骤（b）的产物脂肪酸。

作为另外一种选择，本文所述的各种突变Δ9延伸酶基因及其对应的酶产物可用于提高多种ω-6和ω-3PUFA的生产（参见图5A和图5B；美国专利7,238,482和美国专利公开2009-0093543-A1）。进行了ω-3/ω-6PUFA的提高生产，其中所述脂肪酸底物经由中间步骤或途径中间产物间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期本文所述的突变Δ9延伸酶可结合编码PUFA生物合成途径的其它酶（例如Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、Δ17去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ4去饱和酶、C_20/22延伸酶）进行表达以产生高含量的长链ω-3/ω-6脂肪酸（例如DGLA、ETA、ARA、EPA、DTA、DPAn-6、DPA和/或DHA）。

优选地，本文所述的Δ9延伸酶将结合至少一种Δ8去饱和酶进行表达。然而，包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞（及其PUFA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况）、底物的可利用性和所需的终产物。

突变Δ9延伸酶对于提高生产ω-3/ω-6PUFA的用途在本文实例11中展示，其中构建了解脂耶氏酵母的Z1978菌株以产生相对于总脂质约58.7%的EPA，其总脂质含量为38.3%[“TFA%DCW”]。在这一具体的实例中假定了所述突变Δ9延伸酶在Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径中具有提高Δ9延伸酶活性的功能。

因此，本发明的一个方面涉及重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞产生油，所述油包含以DCW的重量百分比测量的至少22.5重量%的EPA，所述重组微生物宿主细胞包含至少一种本发明的突变Δ9延伸酶多肽。

本文所述的突变Δ9延伸酶基因及其基因产物可在多种宿主细胞中产生，尤其是在选自下列的细胞中：植物、细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和真菌。一般来讲，本领域的技术人员可假定本发明的突变Δ9延伸酶应适于在能够表达所述突变体所源自于的野生型EgD9eS或经密码子优化的EgD9eSΔ9延伸酶的任意宿主细胞中进行表达，或适于在已经表达Δ9延伸酶同源物的宿主中进行表达。

美国专利7,645,604描述了用于表达EgD9e和EgD9eS的植物表达系统、盒、载体及其转化方法，并且其中的讨论全文以引用的方式并入本文。可表达所述突变Δ9延伸酶的特别优选的植物包括油料植物（例如，大豆、芸苔属物种、向日葵、玉米、棉花、亚麻和红花）。

类似地，美国专利7,645,604还描述了用于表达EgD9e和EgD9eS的微生物表达系统、盒、载体及其转化方法。其中的讨论应结合下文加以考虑。具体地，本文所述的突变Δ9延伸酶基因和基因产物还可在异源微生物宿主细胞中产生，尤其是在含油酵母（例如，解脂耶氏酵母）的细胞中产生。重组微生物细胞中的表达可有用于产生多种不同的PUFA途径中间产物，或用于已经存在于所述宿主中的调控PUFA途径以在其中合成此前不可能使用该宿主产生的新产物。

包含引导外来基因高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。这些表达系统和表达载体的任一种均可用于构建用于产生本发明序列的任何基因产物的嵌合基因。然后可以将这些嵌合基因通过转化引入合适的微生物中以提供所编码蛋白质的高水平表达。

用于转化合适的微生物或植物宿主细胞的载体（如构建体、质粒）和DNA表达盒是本领域熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于所需的表达产物（同上）、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化的细胞分离转化的细胞的手段。然而，通常该载体包含至少一个表达盒、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。适当的表达盒一般包含启动子、选定基因的编码序列和终止子。最优选的情况下两个控制区均来源于来自转化宿主细胞的基因。

可用于引导本文的Δ9延伸酶ORF在所需微生物宿主细胞或植物细胞中的表达的启动子数量众多并且为本领域的技术人员所知。实际上能够引导这些基因在所选宿主细胞中的表达的任何启动子（即，天然的、合成的、或嵌合的启动子）都是适用的。在宿主细胞中的表达可以诱导型或组成型的方式实现。诱导型表达可通过诱导可操作地连接至所关注的基因的可调节启动子的活性来完成，而组成型表达可通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子来实现。

例如，美国专利公开2009-0093543-A1描述了用于解脂耶氏酵母的启动子。可使用许多启动子的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等。

已经发现围绕翻译起始密码子“ATG”的核苷酸序列影响酵母细胞的表达。如果所需多肽在酵母中表达差，则可以修饰外源基因的编码区以包括有效的酵母翻译起始序列来获得最佳的基因表达。对酵母中的表达来说，这可以通过定点诱变低表达基因来完成，即通过将其融合到内源酵母基启动子的框架区中，其优选地是高表达的启动子。作为另外一种选择，可将所述宿主的共有翻译起始序列经工程改造引入异源基因以用于它们的最优表达。

终止子可源于从中获得启动子的基因的3'区或源于不同的基因。大量的终止子是已知的并且（在用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时）在多种宿主中令人满意地发挥功能。终止子的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。终止子可源于所述优选宿主天然的多种基因。所述终止子还可以是合成的，因此本领域的技术人员可利用已有的信息设计并合成终止子。终止子可能并非必需，但其是高度优选的。

仅将基因插入克隆载体并不能保证它以所期望的速度、浓度、量等表达。作为对高水平表达的需求的响应，通过调节控制着转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和定位、氧气限制和从微生物宿主细胞或植物细胞的分泌的特定性质，构建了许多专门的表达载体。这些特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质；克隆基因的拷贝数（其中可通过增加质粒拷贝数或将克隆基因多次整合到基因组中将附加的拷贝在单个表达构建体中克隆和/或将附加的拷贝引入宿主细胞中）；基因是质粒转染的还是整合到宿主细胞基因组中的；合成外来蛋白的最终细胞位置；蛋白在宿主生物中的翻译效率和正确折叠；克隆基因的mRNA和蛋白在宿主细胞中的内在稳定性；以及在克隆基因中的密码子使用频率。这些性质每种均可被用于本文所述的方法和宿主细胞中，以进一步优化本文所述的突变Δ9延伸酶的表达。

一旦已经获得适用于在合适的微生物宿主细胞中表达的DNA盒（例如包含启动子、ORF和终止子的嵌合基因），则将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或将其直接整合进宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

如果两个或更多个基因从独立的复制载体表达，则希望每个载体具有不同的选择手段并且应该缺乏与其它构建体的同源性以便保持稳定表达和防止元件在构建体之间重配。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有引入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。

包含所关注的基因的构建体可以通过任何标准技术引入微生物宿主细胞或植物宿主细胞中。这些技术包括转化（如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194:186-187（1991）]）、原生质体转化、基因枪轰击、电穿孔、显微注射或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其它方法。

为方便起见，已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列（如表达盒）的宿主细胞在本文中将称为“转化的”、“转化体”或“重组子”（这些术语将在本文中可互换地使用）。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达构建体，并且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合到基因组内的、被扩增的、还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。

转化的宿主细胞能通过就所引入的构建体上包含的标记进行的选择得到鉴定。作为另外一种选择，单独的标记构建体可与所期望的构建体进行共转化，该方法与将多种DNA分子引入宿主细胞的多种转化技术一样。

通常转化宿主通过它们在选择培养基上生长的能力进行选择，选择培养基可掺入抗生素或缺乏未转化宿主必需的生长因子，如营养物质或生长因子。引入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。也可在表达标记能被直接地或间接地检测出来时进行转化宿主的选择。更多的选择技术描述于美国专利7,238,482、美国专利7,259,255和美国专利7,932,077中。

转化后，适合本发明的突变Δ9延伸酶（以及任选地，在宿主细胞中共表达的其它PUFA酶）的底物可以由宿主天然地产生或通过转基因产生，或者它们可以由外部来源提供。

用于表达本发明基因和核酸片段的微生物宿主细胞可以包括在多种原料（包括简单或复杂的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油、甘油和醇，和/或碳氢化合物）上于宽的温度和pH值范围内生长的宿主。基于申请人的受让人的需要，本发明描述的延伸酶已经在含油酵母（并且特别是解脂耶氏酵母）中表达。根据预期，由于转录、翻译和蛋白质生物合成结构是高度保守的，因此任何细菌、酵母、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和/或真菌均将是用于表达本发明的核酸片段的合适微生物宿主。

然而，优选的微生物宿主是含油生物，例如含油酵母。这些生物天然能够合成并积聚油，其中所述油可占细胞干重[“DCW”]的超过约25%，更优选占DCW的超过约30%，更优选占DCW的超过约40%，更优选占DCW的超过约50%，而最优选占DCW的超过约60%。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。更具体地讲，示例性的合成油的酵母包括：圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、斯达氏油脂酵母（Lipomyces starkeyii）、产油油脂酵母（L.lipoferus）、拉可夫氏假丝酵母（Candida revkaufi）、铁红假丝酵母（C.pulcherrima）、热带假丝酵母（C.tropicalis）、产朊假丝酵母（C.utilis）、茁芽丝孢酵母（Trichosporon pullans）、皮状丝孢酵母（T.cutaneum）、胶粘红酵母（Rhodotorulaglutinus）、牧草红酵母（R.graminis）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）（过去被分类为解脂假丝酵母（Candida lipolytica））。在替代实施例中，非含油生物能够经基因修饰变成含油，例如酵母如啤酒糖酵母（参见国际申请公开WO2006/102342）。

因此，在本文的一个实施例中提供了含油酵母，所述含油酵母包含：（a）可操作地连接至少一种调控序列的第一种重组DNA构建体，其包含编码突变Δ9延伸酶多肽的分离的多核苷酸；和（b）至少一种可操作地连接至少一种调控序列的另外的重组DNA构建体，其包含编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽选自：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶。

最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母。在其它实施例中，最优选的是命名为ATCC76982、ATCC20362、ATCC8862、ATCC18944、和/或LGAM S（7）1的解脂耶氏酵母菌株（Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82（1）:43-9（2002））。

可用于通过基于DNA的线型化片段的整合技术转化含油酵母（即，解脂耶氏酵母）的具体指导包括美国专利4,880,741和美国专利5,071,764以及Chen，D.C.等人（Appl.Microbiol.Biotechnol.，48（2）:232-235（1997））。可用于在解脂耶氏酵母中工程改造ARA、EPA和DHA生产的具体指导分别提供于美国专利7,588,931、美国专利7,932,077和美国专利公开2009-0093543-A1、以及美国专利7,550,286之中。

其它优选的微生物宿主包括含油的细菌、藻类、类眼虫、原生藻菌、卵菌和/或真菌。在该广泛的微生物宿主的组中，特别关注的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物（或能被基因工程化而达到该目的的微生物，如其它酵母，例如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae））。因此，例如，用任何本发明的Δ9延伸酶基因在诱导型或调控型启动子的控制下转化高山被孢霉（其商业用于生产ARA）能够产生转化生物，该转化生物能够合成增量的EDA，其在共表达Δ8延伸酶基因的情况下可进一步转化成增量的DGLA。Mackenzie等人（Appl.Environ.Microbiol.，66:4655（2000））描述了转化高山被孢霉的方法。类似地，用于转化破囊壶菌目微生物（例如破囊壶菌属（Thraustochytrium）、裂殖壶菌属（Schizochytrium））的方法在美国专利7,001,772中公开。

无论选择用什么宿主表达本文所述的突变Δ9延伸酶，为了获得表现出所需表达水平和模式的菌株，必须筛选多个转化体。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析（Southern，J.Mol.Biol.，98:503（1975））、mRNA表达的Northern分析（Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618（1-2）:133-145（1993））、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

使转化的微生物宿主细胞在使嵌合的去饱和酶和延伸酶基因的表达优化而且产生的所需PUFA的产率最大且最经济的条件下生长。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。通常使所关注的微生物例如含油酵母（如解脂耶氏酵母）在复合培养基例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基[“YPD”]，或缺乏生长所必需的成分并因此强迫选择所需表达盒的最低限定培养基（例如Yeast Nitrogen Base（DIFCO Laboratories，Detroit，MI））中生长。

用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源，如在美国专利7,238,482和美国专利公开2011-0059204-A1中所提出的。本文所述的方法和宿主细胞中的适当碳源包括广泛的来源，优选的碳源是糖（例如，葡萄糖、转化蔗糖、果糖、以及它们的组合）、甘油和/或脂肪酸。

氮可以由无机源（如（NH₄）₂SO₄）或有机源（如尿素或谷氨酸）提供。除了合适的碳源和氮源外，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生所必需的酶促途径的其它组分。特别关注的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子，例如Fe⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²和Mg⁺²（Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页（1992））。

用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮基培养基（Yeast Nitrogen Base，DIFCO Laboratories，Detroit，MI）。也可使用其它确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学领域的技术人员来说将是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH4.0至pH8.0之间，其中优选将pH5.5至pH7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA需要包括两个阶段的过程，由于代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选的是，包括两个阶段的发酵过程是在含油酵母（如解脂耶氏酵母）中产生PUFA所必需的。这种方法在美国专利公开7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计（即分批式、补料分批式和连续式）和生长过程中的注意事项。

PUFA可以游离脂肪酸或酯化形式（如甘油酯、磷脂、硫脂或糖脂）存在于宿主微生物和植物中，并且可以通过多种本领域熟知的方法从宿主细胞中提取出来。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs（Critical Reviews inBiotechnology，12（5/6）:463-491（1992））的综述。关于下游处理的简述也可参见A.Singh和O.Ward（Adv.Appl.Microbiol.，45:271-312（1997））。

一般而言，用于纯化PUFA的方法可包括用有机溶剂提取（例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564）、超声处理、超临界流体提取（例如使用二氧化碳）、皂化和物理方法如挤压，珠粒搅拌器、或它们的组合。更多细节参见美国专利7,238,482。

市场目前支持许多种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸（尤其例如ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA）的食物和饲料产品。可以预期，通过本文所述方法和宿主细胞制备的包含长链PUFA的微生物生物质、包含PUFA的部分纯化微生物或植物生物质、包含PUFA的纯化油和/或纯化的PUFA将赋予健康有益效果，通过加入这些物质改善了对食物或饲料的摄取。更具体地，可将包含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油加入：食物类似物、肉制品、谷物制品、烘烤制品、点心食品和乳制品，以上仅举数例。参见美国专利公开2009-0093543-A1，其以引用的方式并入本文。

这些组合物还可通过加入到医疗食品（包括医疗营养物质、饮食补充剂、婴儿代乳品和药品）中以赋予健康有益效果。本领域的技术人员应当了解添加至食品、饲料、饮食补充剂、营养物质、药品和其它可摄取的产品中以赋予健康有益效果的油的量。本领域描述了摄取这些油获得的健康有益效果，它是技术人员已知的并进行了持续的研究。本文所指的量应是“有效”量，除了其它方面的原因，它应取决于摄入的包含这些油的产品的性质以及它们旨在治疗的病症。

实例

在以下实例中进一步描述本发明，所述实例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能变型。

一般方法

实例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是为人们所熟知的并且描述于：1）Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning:LaboratoryManual；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1989）；2）T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory:Cold Spring Harbor，NY（1984）；和3）Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版（1987）。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下文实例的技术可见于Manual of Methods for General Bacteriology（P.Gerhardt，R.G.E.Murray，R.N.Costilow，E.W.Nester，W.A.Wood，N.R.Krieg和G.B.Phillips编辑），American Society for Microbiology:Washington，D.C.（1994））；或Thomas D.Brock inBiotechnology:Textbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates:Sunderland，MA（1989）所描述。除非另外指明，用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自Aldrich Chemicals（Milwaukee，WI）、GIBCO/BRL（Gaithersburg，MD）、DIFCO Laboratories（Detroit，MI）、New England Biolabs（Ipswich，MA）、或SigmaChemical Company（St.Louis，MO）。大肠杆菌菌株通常在37℃下在Luria Bertani[“LB”]平板上生长。

一般的分子克隆根据标准方法（Sambrook等人，同上）来完成。序列编辑是在Sequencher（Gene Codes Corp.，Ann Arbor，MI）中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。使用DNASTAR软件（DNASTAR Inc.，Madison，WI）或内部创建的类似软件（E.I.duPont de Nemours&Co.，Inc.，Wilmington，DE）实施对基因序列的比较。

缩写含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μl”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，并且“kB”表示千碱基。

表达盒的命名：表达盒的结构将通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段，Z描述终止子片段，它们都可操作地彼此连接。

解脂耶氏酵母的转化和培育：解脂耶氏酵母菌株（ATCC保藏号20362、76982和90812）购自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD）。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃下生长。根据标准方法，按要求通过将20g/L琼脂加入到每个液体培养基中来制备琼脂板。

YPD琼脂培养基（每升）：10g酵母提取物[Difco]、20g Bacto蛋白胨[Difco]和20g葡萄糖。

基本最低培养基[“MM”]（每升）：20g葡萄糖、1.7g不含氨基酸的酵母氮基、1.0g脯氨酸，pH6.1(无需调节)。

基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”](每升)：20g葡萄糖、6.7g酵母氮基、75mg尿嘧啶、75mg尿苷和合适量的FOA（Zymo Research Corp.，Orange，CA），基于对100mg/L至1000mg/L的浓度范围内进行的FOA活性测试（因为从供应商处收到的每一批活性均发生变化）。

高葡萄糖培养基[“HGM”]（每升）：80葡萄糖、2.58g KH₂PO₄和5.36g K₂HPO₄，pH7.5（不需要调节）。

发酵培养基[“FM”]（每升）：6.70g/L酵母氮基、6.00g KH₂PO₄、2.00g K₂HPO₄、1.50gMgSO₄*7H₂O、20g葡萄糖和5.00g酵母提取物（BBL）。

解脂耶氏酵母的转化如美国专利申请公开2009-0093543-A1所述进行，其以引用方式并入本文。

实例1

解脂耶氏酵母表达载体pZuFmEgD9ES的构建，其包含合成Δ9延伸酶基因（来源于 小眼虫），经密码子优化以在解脂耶氏酵母中的表达[“EgD9eS”]

包含嵌合型FBAINm::EgD9eS::Pex20基因（其中的EgD9eS是来自合成Δ9延伸酶小眼虫并经密码子优化以在耶氏酵母中的表达）的解脂耶氏酵母载体pZuFmEgD9ES（图2；SEQID NO:25）的构建描述于美国专利7,645,604的实例8中，其以引用的方式并入本文。EgD9eS（SEQ ID NO:9）的核苷酸序列不同于野生型小眼虫Δ9延伸酶的核苷酸序列（“EgD9e”；SEQID NO:7），这是因为除对翻译起始位点的修饰之外该777bp编码区中的117bp受到修饰（15.1%）并且106个密码子经过了优化（40.9%）（然而所述经密码子优化的基因所编码的蛋白质序列[即，SEQ ID NO:10]等同于野生型蛋白质序列[即，SEQ ID NO:8]）。

实例2

分析包含具有提高Δ9延伸酶转化效率的突变Δ9延伸酶的解脂耶氏酵母转化体 的通用方法

本实例描述了用于分析解脂耶氏酵母菌株Y2224（来自野生型耶氏酵母菌株ATCC20362[其分离描述于国际申请公开WO2008/073367的实例7]Ura3基因的自发突变的FOA抗性突变体）的pZUFmEgD9ES转化体生物中的脂质特征的通用方法，所述转化体表达非突变的EgD9eS基因（SEQ ID NO:9（称为“对照”或“野生型”）或多种突变的EgD9eS基因，其产生于易错聚合酶链反应[“ePCR”]文库（实例3）、位点饱和文库（实例5）、文库（实例7）或组合文库（实例9）（下文描述）。

突变文库向大肠杆菌和解脂耶氏酵母

中的转化将来自各突变文库的DNA通过电穿孔转化进入大肠杆菌Top10电感受态细胞（目录号C404052，Invitrogen，Carlsbad，CA）。转化的细胞涂布于具有100mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani[“LB”]琼脂平板之上并且在37℃温箱中生长过夜。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen Inc.，Valencia，CA）根据制造商的方案从所述转化体大肠杆菌细胞中提取质粒DNA。

随后根据一般方法的描述，将所述DNA分子转化进入解脂耶氏酵母菌株Y2224，并且在MM平板上选择所述转化体。在30℃生长2天后，采集在MM平板上选择的转化体并再划线接种到新制MM平板上。

快速筛选平板分析测定

使用快速筛选“平板分析测定”对各突变文库进行初步功能分析。对于这一平板分析测定，从所述培养基平板中直接分析来自上文再划线接种的MM平板的转化体耶氏酵母细胞。使用三甲基氢氧化锍[“TMSH”]制备脂肪酸甲酯[“FAME”]。

通过三甲基碘化锍[“TMSI”]在与氧化银在甲醇中反应而转化成为氢氧化物溶液而制备所述TMSH。具体地，将4.4g TMSI在100mL MeOH中混合并且使其在50℃水浴中孵育1h；随后向该溶液中加入5g Ag₂O并且在室温下搅拌4h。在使用前过滤该最终溶液。TMSH引起了三酰基甘油（即，TAG）的碱催化型酯交换和游离脂肪酸的酯化（A.H.El-Hamdy&W.W.Christie，J.of Chromatography，630:438-441（1993））。

使用1μl接种环直接从所述再划线接种的MM平板上获取细胞并且在具有0.35mL内衬管的气相色谱[“GC”]瓶中悬浮于50μl TMSH内。随后向该瓶的内衬管内加入庚烷（150μl），将该瓶加盖并且在室温下振荡孵育20分钟。随后，将来自所述庚烷层的1μl进样于装配以ωwax320弹性石英毛细管柱（Supelco Inc.，Bellefonte，PA）的Hewlett Packard 7890GC中以对FAME进行GC分析。将持留时间与来自商业标准物（标准物461，Nu-Chek Prep，Inc.，Elysian，MN）的甲酯的持留时间进行比较。

将获自包含所述EgD9eS突变体的细胞的FAME特征与非突变EgD9eS对照进行比较。这一初步筛选的结果作为选择将进行次级证实分析的突变体的基础使用。用于选择突变体以进行所述证实分析的标准是基于该脂质特征的，尤其是EDA的浓度，其通过对应的FAME的GC峰面积相对全部积分峰之和的百分比[“EDA%TFA”]和/或LA向EDA的转化效率而计算。根据以下公式针对各转化体计算LA向EDA的转化效率[“转化%”]：（[产物]/[底物+产物]）*100，其中所述产物是EDA%TFA并且所述底物是作为相对TFA的面积百分比的LA浓度[“LA%TFA”]。

“证实”分析

通过所述快速筛选“平板分析测定”而相对于对照物表现出Δ9延伸酶活性改善的突变体被选用于后续的证实分析。

首先通过新鲜再划线接种的MM平板使使用突变体进行转化的耶氏酵母生长，并且随后在将30℃各突变体接种进入包含3mL液体MM的三份培养物内并且以250rpm/min振荡2天。通过离心收集所述细胞，提取脂质并且通过以甲醇钠对所述脂质提取物进行酯交换而制备FAME （Roughan，G.和Nishida I.，Arch.Biochem.Biophys.，276（1）:38-46（1990））并随后根据对所述平板分析测定的描述通过GC进行分析（同上）。

在证实改善的Δ9延伸酶活性之后，各突变pZUFmEgD9ES质粒从表达该质粒的转化解脂耶氏酵母菌株Y2224中回收，这使用Zymoprep^TMYeast Plasmid Miniprep II试剂盒（目录号D2004，Zymo Research，Orange，CA）根据制造商的建议进行。

使用表中的DNA测序方法表征所回收质粒的序列。简而言之，DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止子技术（美国专利5,366,860；EP272,007）使用载体和插入片段特异性引物的组合来产生的。使用本领域中所熟知的表中工具实施对基因序列的比较。

实例3

两种EgD9eS易错PCR文库

本实例描述了两种Δ9延伸酶易错聚合酶链反应[“ePCR”]文库的合成。所述两种ePCR文库在两步法中创建，第一步需要产生在模板中包含随机突变的成套巨型引物，随后使用这些巨型引物向pZuFmEgD9ES中制备点突变。该构建体pZuFmEgD9ES（SEQ ID NO:25）（实例1）作为DNA模板用于第一种ePCR文库。第二种ePCR文库使用来自第一种ePCR文库的命中物作为DNA模板。

使用随机诱变试剂盒创建巨型引物

使用GeneMorph II Random Mutagenesis试剂盒（目录号200550，Stratagene，LaJolla，CA）在靶蛋白中创建随机氨基酸取代。其通过使用新型易错PCR酶混合物在易错PCR期间将突变引入所述靶基因而发挥作用，所述混合物包含两种不同的聚合酶的组合以产生偏差较低的突变谱系（A和T对比G和C具有相同的突变率）。据宣称使用针对高产量进行优化的单组缓冲条件可获得1-16个突变每kB的突变率。可通过改变反应中的模板DNA的初始量和/或执行的扩增循环次数来控制所需的突变率。

使用制造商建议的方法以上述试剂盒产生EgD9eS“巨型引物”。这些巨型引物长约930bp并且包含编码EgD9eS（SEQ ID NO:9）的777bp。对于第一种ePCR文库，该反应混合物每μl包含16ng DNA模板，对于第二种文库每μl包含2.0ng DNA模板。其还包含反应缓冲液、dNTP（0.8mM）、引物pZUFm_6980_012208f（SEQ ID NO:26）（2μM）、引物pZUFm_210_012208r（SEQ ID NO:27）（2μM）和II DNA聚合酶（0.25U/μl）。所述PCR反应在薄壁200μl管中于Mastercycler梯度设备内进行（Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury，NY）。扩增使用如下条件进行：95℃2分钟，然后是30个循环的95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒。在72℃进行4分钟的最终延伸循环，随后在4℃终止反应。

使用DNA Clean&Concentrator^TM-5试剂盒（目录号D4003，Zymo Research，Orange，CA）根据制造商的建议纯化所述PCR产物。所述纯化的双链PCR产物用作为“巨型引物”，其各自在EgD9eS内包含多种突变。

用于创建EgD9eS的ePCR突变基因的标准克隆方法

对于第一种ePCR文库，使用NcoI和NotI限制性酶来消化“巨型引物”。随后使用T4DNA连接酶（Prω，Madison，WI）通过在室温下5小时的连接反应直接将经凝胶纯化的NcoI/NotI基因片段连接进入经凝胶纯化的NcoI/NotI pZUFmEgD9ES载体（SEQ ID NO:25）。

用于创建EgD9eS的ePCR突变基因的定点诱变

为创建第二种ePCR文库，将上文描述的“巨型引物”用于经设计以向pZuFmEgD9ES（图2；SEQ ID NO:25）中引入所述“巨型引物”中的EgD9eS突变的反应，由此以多种突变EgD9eS基因取代了非突变EgD9eS基因。其使用II XL定点诱变试剂盒而实现（目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA）。

该II定点诱变试剂盒用于在双链载体的目的插入物中制造点突变、替换氨基酸和删除或插入单一/多个相邻的氨基酸，其使用高保真的PfuUltra DNA聚合酶对两条质粒链进行由诱变性引物介导的复制。该试剂盒不需要专门的载体、单一限制性位点或多重转化，并且实际上允许在任何双链质粒中的位点特异性突变。基本的方法使用了两种合成寡核苷酸引物，两引物均包含所需的突变并且与所述引物相对的链互补，其在温度循环期间以所述高保真DNA聚合酶加以延伸而不进行引物置换。所述寡核苷酸引物的延伸产生了包含交错缺口的突变质粒，随后使用Dpn I内切核酸酶对其处理。这一限制性酶特异于甲基化和半甲基化的DNA，由此而实现了对亲本DNA模板的消化和对包含突变的合成DNA的选择。然后用包含所需突变的带切口的载体DNA转化大肠杆菌宿主并在其中增殖。

但是，在本方法中使用包含多种突变EgD9eS基因的双链巨型引物取代传统的合成寡核苷酸引物。具体地，制备了包含5.0μl 10×试剂盒供应的反应缓冲液、1.0μl 50ng/μlpZUFmEgD9ES模板（SEQ ID NO:25）、42μl巨型引物、1.0μl 40mM试剂盒供应的dNTP混合物和1.0μl试剂盒供应的Pfu-Ultra DNA聚合酶的50μl反应物。将这一反应混合物置于薄壁200μl容量PCR管内并且进行PCR扩增，其使用以下条件：95℃30秒，随后25个循环的95℃变性30秒、55℃退火1分钟以及68℃延伸6分钟。最后在68℃下进行8分钟的最终延伸循环，然后在4℃下终止反应。

将试剂盒供应的DpnI限制性酶（1.0μl）直接加入该完成的定点诱变反应混合物中并且在37℃下进行1小时的酶消化以除去所述DNA模板。使用DNA净化试剂盒（ZymoResearch）纯化经消化的产物并且进行洗脱以产生10μl的纯化DNA，其包含多种突变EgD9eS基因，所述基因包含于该pZUFmEgD9ES载体主链之中。

实例4

对具有改善的Δ9延伸酶转化效率的ePCR EgD9eS文库突变体的鉴定

本实例描述了：1）对与野生型蛋白EgD9eS（SEQ ID NO:10）相比具有改善的LA向EDA的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS ePCR文库突变体的鉴定；以及2）对这些EgD9eS ePCR文库突变体的序列分析。

对EgD9eS ePCR突变体的鉴定

根据实例2所述，将在实例3中制备的ePCR基因文库突变体转化进入大肠杆菌Top10电感受态细胞中，进行纯化并且随后转化进入解脂耶氏酵母菌株Y2224。使用实例2的快速筛选“平板分析测定”筛选1,724个耶氏酵母转化体的脂肪酸特征。这些突变体中的大多数与对照相比表现出降低的活性。但是，根据实例2的证实分析所证实，5个转化体与对照相比表现出改善的Δ9延伸活性。

来自两次独立的证实分析的数据在表5和表6中示出，并且将单个pZuFmEgD9ES对照转化体的FAME特征与ePCR突变体的特征加以比较。更具体地，在下文表5和表6中针对各菌株示出了根据对应的FAME的GC峰面积而计算的各种脂肪酸浓度（其为FAME相对于全部积分峰之和的百分数[“%TFA”]）和LA向EDA的转化%（根据实例2中的描述测定），而平均值以灰色标出并且标以“平均”。脂肪酸经鉴定为16:0（棕榈酸）、16:1（棕榈油酸）、18:0（硬脂酸）、18:1（油酸）、LA和EDA。各个突变体相对EgD9eS对照的比较应仅在特定的证实分析之内做出，所述分析中对各突变体进行了分析（即，分析1和分析2之间不可进行比较）。

表5：证实分析1：表达EgD9eS或其ePCR文库突变体变种的转化体解脂耶氏酵母菌 株Y2224中的脂质组成。

表6：证实分析2：表达EgD9eS或其ePCR文库突变体变种的转化体解脂耶氏酵母菌 株Y2224中的脂质组成。

总结上文证实分析1中示出的数据，使用包含非突变的经密码子优化的EgD9eS基因的pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母菌株Y2224的克隆产生了平均3.1EDA%TFA，而这5个克隆中的LA向EDA的平均转化效率[“转化%”]经测定为约15.5%。与之对比，突变菌株1.2ep-8的LA向EDA的平均转化%为17.8%（或相对于对照物为115%）；突变菌株1.9ep-63的平均转化%为16.3%（或相对于对照物为105%）；并且突变菌株1.4ep-161的平均转化%为16.4%（或相对于对照物为106%）。

在证实分析2中，使用pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母菌株Y2224产生了2.9EDA%TFA，其中这4种菌株的LA向EDA的平均转化%经测定为约16.9%。突变菌株2.1ep-94的LA向EDA的平均转化%为19.8%（或相对于对照物为117%）；并且突变菌株2.1ep-95的平均转化%为18.8%（或相对于对照物为111%）。

因此，这些实验证实了EgD9eS的ePCR突变体1.2ep-8、1.9ep-63、1.4ep-161、2.1ep-94和2.1ep-95所表现出的改善的Δ9延伸酶转化效率。

EgD9eS ePCR突变体的序列

通过DNA测序表征从突变体1.2ep-8、1.9ep-63、1.4ep-161、2.1ep-94和2.1ep-95中回收的质粒，并且如表7所示分析揭示了所述突变EgD9eS基因中的多种核苷酸替换和所表达的氨基酸取代。对各突变EgD9eS基因和包含所述突变EgD9eS基因的各突变pZuFmEgD9ES质粒给出了表明氨基酸取代的命名。对于所列出的各个替换（即L35G），第一个字母对应于所述非突变EgD9eS（即，SEQ ID NO:10）中的氨基酸，第二个字母对应于所述突变体中相同位置上的氨基酸，即，L35G表明在EgD9eS的第35位上的Leu变为所述EgD9eS突变体中的Gly。

表7：对经测序的EgD9eS ePCR文库突变体的总结

因此，例如，回收自突变体1.2ep-8的质粒包含2种核苷酸替换（即，C103T和A654G）。这两种核苷酸替换对应于一种表达的氨基酸取代（即，L35F）和一种沉默氨基酸突变（即，G218G；这是因为GGA和GGG均编码Gly，这一氨基酸在由于A654G核苷酸替换所产生的突变蛋白质中保持不变）。包含C103T和A654G突变（其产生氨基酸变化L35F）的质粒命名为pZuFmEgD9ES-L35F（SEQ ID NO:30），而其中突变Δ9延伸酶的核苷酸序列命名为“EgD9eS-L35F”（SEQ ID NO:28），其蛋白质序列如SEQ ID NO:29所示。

实例5

双位点饱和EgD9eS基因文库的构建

本实例描述了位点饱和[“SS”]文库的合成，其通过靶定EgD9eS（SEQ ID NO:10）中的第35和107位氨基酸而制备。靶定第35位的逻辑性是基于实例4的结果，而靶定第107位的逻辑性在下文描述。所述SS文库在两步法中创建，其首先需要产生在模板中包含靶定突变的巨型引物，随后使用这些巨型引物向pZuFmEgD9ES中制造点突变。

靶定EgD9eS的第107位的逻辑性

首先根据下文表8描述使用ClustalW比对方法比对了17种脂肪酸延伸酶的氨基酸序列。

表8：进行保守模式分析的脂肪酸延伸酶

Thompson等人（Nucleic Acids Res.22:4673-4680（1994））所述的Clustal W比对方法使用ClustalW软件包（版本1.83）以默认参数进行（即，protein weight matrix=Gonnet250、gap opening penalty=10、gap extension penalty=0.2、以及完全比对算法）。所述比对的结果在图3中示出（包含图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G和3H）。根据下文定义，“迹线（Trace）_1”、“迹线_2”、“迹线_3”和“迹线_4”是功能性组I、组II、组III和组IV的各栏的共有序列，即，迹线1是组I中的蛋白质序列的共有序列，其包含Ci_elo、Om_elo、Mp_elo1、Pp_elo1、Mp_d5e和Ot_elo1。各栏的共有序列如下定义。具体地，如果该栏完全保守，则所述共有序列以该保守氨基酸表示（以大写字母示出）。如果该栏对于生理-化学特征而言是保守的，则所述保守序列以小写字母表示，其中“k”表示氨基酸D和E（带负电），“q”表示氨基酸H、K和R（带正电）、“p”表示氨基酸N和Q（极性）、“a”表示氨基酸I、L和V（脂肪族）、“d”表示氨基酸F、W和Y（芳香族）、“h”表示氨基酸A和G（微小）、“s”表示氨基酸D、E、N、Q、H、K、R、S和T（亲水），并且“f”表示氨基酸I、L、V、F、W、Y、C和M（疏水）。如果该栏并不保守，则所述共有序列以大写字母“X”表示。

通过所述Clustal W比对产生了邻接树。根据该树的拓扑结构，所述17种序列分为4组，推测其对应于不同底物特异性的功能性组：组I包含Ci_elo、Om_elo、Mp_elo1、Pp_elo1、Mp_d5e和Ot_elo1；组II包含Pav_elo2、Ps_elo2和Ot_elo2；组III包含Ea_d9e、Eg_d9e、E398_d9e和Ig_d9e；并且组IV包含Tp_elo2、Tp_elo1、Ma_d6e和Th_elo2。

考虑图3的比对和所述邻接树的分组构成得出了以下结论。首先，某些位点在组I、II、III和IV中的全部17种序列上是绝对保守的。这些位点据认为对于所述延伸酶的催化活性可能是关键性的，并且因此而排除作为突变靶点。某些位点仅在组I、II、III和IV中的一些序列上是保守的（即，并非绝对保守）。这些位点据认为对于组I、II、III和IV中的延伸酶所表现出的底物特异性可能是重要的。某些位点在组III内相对保守（包含全部4种已知的Δ9延伸酶），但也表现出不同；参见氨基酸位点22、47、54、101、107、111、115、161、182、192和242（基于EgD9eS的编号）。这些位点据认为对于Δ9延伸酶的活性有可能是重要的，并且推测其调控Ea_d9e（SEQ ID NO:12）、Eg_d9e（SEQ ID NO:8）、E398_d9e（SEQ ID NO:4）和Ig_d9e（SEQ ID NO:2）在底物特异性上的差别。

对EgD9eS内的跨膜[“TM”]结构域的分析使用TMHMM程序进行（“Prediction oftransmembrane helices in proteins”；TMHMM Server v.2.0，Center for BiologicalSequence Analysis，BioCentrum-DTU，Technical University of Denmark，DK-2800Lyngby，Denmark）。所述预测显示了6个跨膜螺旋（对应于氨基酸残基32-51、66-88、114-136、156-175、188-206、221-243），N和C末端均位于细胞质侧。当使用所述TMHMM程序对Ot_elo2、Ig_elo1、Pav_elo2和Tp_elo2进行类似分析时，跨膜螺旋的数量从4至8不等。因此，为统一这些不同的预测使用了以下部分的功能性信息。

1.高度保守的富组氨酸基序[Q/H]xxHH（“His-box”）据显示对于Ig_d9e（SEQ IDNO:2）的最佳酶活性是关键性的，但其并非直接负责底物特异性（Qi等人，FEBS Letters，547:137-139（2003））。因此其强烈提示该His-box（对应于EgD9eS中的氨基酸残基134-138）参与活性位点；并且其应当定位于该折叠蛋白的细胞质侧之中或附近，从而使底物得以进入所述活性位点。

2.EgD9eS的C末端中存在具带电残基的多个高度保守的位点。它们有可能与活性相关并且因此C末端可能定位于该折叠蛋白的细胞质侧。

与TMHMM的结果（将氨基酸残基114-136和氨基酸残基156-175之间预测为跨膜螺旋）对比，上述设想显示残基114-136之间的序列区域并不跨越细胞膜，这是因为该His-box不能定位于细胞膜的外侧。如果C末端定位于细胞质侧，则所预测的156-175之间的TM结构域也非跨越细胞膜。因为延伸酶的底物是高度疏水的，因此其应有可能进入脂质双层内。所述活性位点（包括该His-box）可能存在于或非常接近于细胞膜表面。

因此，据预测这两个疏水区域（即，对应于氨基酸残基114-136和氨基酸残基156-175）位于或接近于内膜小叶以确保所述该活性位点接近细胞膜。针对EgD9eS所预测的最终膜拓扑模型在图4A中示出。具体地，各个垂直圆柱体表示跨膜片段，而各个水平圆柱体表示处于或接近内膜小叶的疏水伸展区。处于该His-box中的保守谷氨酰胺[Q]和组氨酸[H]（即，对应于氨基酸残基134-138）以小圆圈标出。最后，“内”对应于细胞质空间，而“外”对应于膜周质空间。

虽然保守模式分析在组IIIΔ9延伸酶（即，Ea_d9e[SEQ ID NO:12]、Eg_d9e[SEQID NO:8]、E398_d9e[SEQ ID NO:4]和Ig_d9e[SEQ ID NO:2]）鉴定出了据预测影响酶活性的中的11种不同氨基酸残基，但是来自预测拓扑模型的结果进一步限制了候选残基。具体地，据推断对于酶活性至关重要的位点必须位于活性位点所处的细胞质侧或其附近。氨基酸残基47、54和192未能满足这一标准并且因此假定它们对于调控Δ9延伸酶的活性并不重要。

根据上述逻辑性，有可能显著地影响EgD9eS的Δ9延伸酶活性的候选残基从SEQID NO:10的全长蛋白内的258个残基降至仅仅8个残基，其对应于第22、101、107、111、115、161、182和242位。这8个位点作为定点诱变靶推荐用于改善EgD9eS的底物转化率。下文的实验数据靶向于第107位。

用于所述位点饱和文库的巨型引物的创建

寡核苷酸EgD9E_102_053008f（SEQ ID NO:56）和EgD9E_760_053008r（SEQ ID NO:57）经设计用于分别靶向EgD9eS（SEQ ID NO:10）的氨基酸残基35和107。在对这些寡核苷酸进行商业合成之后，将它们用于PCR反应以创建适用于构建所述SS文库的巨型引物。具体地，50μl经制备以包含：5.0μl 10×反应缓冲液（与Pfu-Ultra聚合酶（Stratagene）一同提供）、1.0μl 50ng/μl EgD9eS（SEQ ID NO:10）、1.0μl 10pmol/μl引物EgD9E_102_053008f（SEQ ID NO:56）、1.0μl 10pmol/μl引物EgD9E_760_053008r（SEQ ID NO:57）、1.0μl40mMdNTP混合物（Promega，Madison，WI）、1.0μl high fidelity Pfu-Ultra DNA聚合酶（Stratagene）和40μl水。将所述混合物置于薄壁200μl管内以用于在Mastercycler梯度设备中进行所述PCR反应（Brinkmann Instruments，Inc.Westbury，NY）。使用以下条件进行PCR扩增：95℃30秒，随后是30个循环的95℃变性30秒、54℃退火1分钟以及72℃延伸2分钟。最后在72℃下进行4分钟的最终延伸循环，然后在4℃下终止反应。

使用DNA Clean&Concentrator^TM-5试剂盒（目录号D4003，Zymo Research，Orange，CA）根据制造商的建议纯化所述PCR产物。所述纯化的双链PCR产物用作为“巨型引物”，其各自在EgD9eS内包含多种突变。

用于创建EgD9eS的位点饱和突变基因的定点突变

随后将上文所述的“巨型引物”用于经设计以向pZuFmEgD9ES（图2；SEQ ID NO:25）中引入所述“巨型引物”中的EgD9eS突变的反应，由此而将非突变EgD9eS基因替换为多种突变EgD9eS基因。这可通过使用II XL定点诱变试剂盒而实现（目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA），如实例3中所描述。具体地，所述定点诱变反应的组成和扩增条件与实例3中所述相同，DpnI消化和DNA净化也是如此。

实例6

对具有改善的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS位点饱和文库突变体的鉴定

本实例描述了：1）对与野生型蛋白EgD9eS（SEQ ID NO:10）相比具有改善的La向EDA的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS突变体的鉴定，以及2）对这些EgD9eS突变体的序列分析。

对EgD9eS位点饱和突变体的鉴定

根据实例2所述，将在实例5中制备的SS文库转化进入大肠杆菌Top10电感受态细胞之中，进行纯化并且随后转化进入解脂耶氏酵母菌株Y2224。使用实例2的快速筛选“平板分析测定”分析具有来自所述SS文库的510种解脂耶氏酵母转化体的脂肪酸特征。根据实例2的证实分析所证实，3个转化体与对照相比表现出改善的Δ9延伸活性。

来自该证实分析的数据在表9中示出，并且将单个pZuFmEgD9ES对照转化体的FAME特征与SS文库突变体的特征加以比较。更具体地，对于各菌株的各种脂肪酸的浓度（作为TFA面积百分比[“%TFA”]）和LA向EDA的转化%（根据实例2中所述测定）在下文表9中示出，而平均值以灰色标出并标以“平均”。根据实例4的缩写标识脂肪酸。

表9：证实分析：表达EgD9eS或其SS文库突变体变种的转化体解脂耶氏酵母菌株 Y2224中的脂质组成。

在所述证实分析中，使用包含非突变的经密码子优化的EgD9eS基因的pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母菌株Y2224的克隆产生了平均3.5EDA%TFA，而这4个克隆中的LA向EDA的平均转化效率[“转化%”]经测定为约18.7%。与之对比，突变菌株2.4sd2-24的LA向EDA的平均转化%为27.2%（或相对于对照物为145%）；突变菌株2.4sd2-52的平均转化%为26.6%（或相对于对照物物为142%）；并且突变菌株2.4sd2-53的平均转化%为24.6%（或相对于对照物为132%）。因此，这一分析证实了位点饱和突变体2.4sd2-24、2.4sd2-52和22.4sd2-53所表现出的改善的Δ9延伸酶转化效率。

EgD9eS位点饱和突变体的序列

回收自突变体2.4sd-24、2.4sd-52和2.4sd-53的质粒通过DNA测序进行表征，并且根据表10中所示出，分析在所述突变EgD9eS基因中揭示了多种核苷酸替换和所表达的氨基酸取代。对各突变EgD9eS基因和包含所述突变EgD9eS基因的各突变pZuFmEgD9ES质粒给出了表明氨基酸取代的命名。

表10：对经测序的EgD9eS SS文库突变体的总结

正如本领域的技术人员所明了，本发明人认识到根据基因密码子的简并性多种核苷酸序列可编码（例如）EgD9eS-L35G所示的蛋白质。因此，例如，SEQ ID NO:59示出的突变蛋白中编码的第35位氨基酸残基Gly可以由GGG（如SEQ ID NO:58示出的Δ9延伸酶开放阅读框[“ORF”]）、GGA（如SEQ ID NO:95示出的Δ9延伸酶ORF）、GGC（如SEQ ID NO:96示出的Δ9延伸酶ORF）和GGA（如SEQ ID NO:97示出的Δ9延伸酶ORF）所编码。还考虑了所编码的蛋白质中产生沉默突变的多种其它核苷酸替换，并且本文所提供的编码EgD9eS-L35G（SEQ IDNO:59）的核苷酸序列不应被认为是对本文公开内容的限制。还考虑了本文所述的编码本发明的突变蛋白并具有Δ9延伸酶活性的任意核苷酸序列中的类似变异。

实例7

EgD9eS-L35G 文库的创建

本实例描述了文库的合成，所述文库通过靶向所述EgD9eS-L35G突变体（SEQ ID NO:59，实例6）内的50种不同的氨基酸位置而制备，当与亲本酶比较时其在LA向EDA的转化效率上表现出42-45%的改善。因此，本实例寻求鉴定可与包含L35突变的EgD9eS突变体进行“堆叠”的另外的有益突变。

（自动化机器人平台，下文另行详述）产生了文库，其中可精确地控制每个序列位置的突变体数量及其比率。因此，该自动化加工提供了益处，这是因为能够显著地提高可经实验检测以确定其对Δ9延伸酶活性的影响的候选残基数量，与之相比所述位点饱和文库的创建考虑了受限制的残基（实例5）。

靶向EgD9eS内的50种不同残基以用于功能性位点评估的逻辑性

已经鉴定了Δ9延伸酶并对其进行功能表征，其来自绿光等鞭金藻[“IgD9e”]（SEQID NO:2；PCT公开WO2002/077213、WO2005/083093、WO2005/012316和WO2004/057001；GenBank登录号AAL37626）、小型绿藻属CCMP389[“E389D9e”]（SEQ ID NO:4；美国专利7,645,604）、小眼虫[“EgD9e”]（SEQ ID NO:8；美国专利7,645,604）和E.anabaena[“EaD9e”]（SEQ ID NO:12；美国专利7,794,701）。据显示这些延伸酶各自均能够将LA转化成EDA。EgD9e、EaD9e和E389D9e相互之间具有高于60%的序列相似性，而IgD9E与EgD9e、EaD9e和E389D9e中的任意一个仅仅具有约35%的序列相似性（基于ClustalW（版本1.83）分析，使用默认参数（即，protein weight matrix=Gonnet250、gap opening penalty=10、gapextension penalty=0.2、以及完全比对算法）。

据观测导致具有改善Δ9延伸酶转化效率的突变体的（例如，D98G[实例4]和L35G[实例6]）具有中度序列保守性。建立IgD9e、EgD9e、EaD9e和E389D9e的氨基酸序列比对以鉴定其它中度保守的残基，其使用的AlignX程序的默认参数进行（Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA）（图1）。根据假定这些中度保守的残基可能是作为氨基酸取代的良好候选物，其用于潜在地产生相对所述非突变EgD9eS对照具有改善活性的第二代突变酶。

通过比较这四种同源酶的序列，258个氨基酸位置中的58个经测定在全部四种延伸酶中保守，因此这些残基不予考虑。此外，92个位置经测定在EgD9e、EaD9e和E389D9e之间是保守的；这些位置也不予考虑。最后，由于在同源物之间具有随机氨基酸的位置正常情况下在蛋白质功能中并不发挥显著作用，经测定在全部四种延伸酶之间具有四种不同氨基酸残基的另外22个位置因此而不作为功能评估的靶向位置来考虑。

SEQ ID NO:8的剩余86个位置（即，第1、3、4、5、9、12、21、22、27、28、29、32、35、37、41、42、45、47、48、51、52、53、54、57、58、60、62、63、66、67、70、71、73、74、80、83、84、85、89、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、155、156、161、168、169、179、181、182、192、196、204、207、209、210、211、216、218、222、223、225、229、236、239、242、244、245、247、250、254、257和258位）作为功能性位点评估的靶点进行考虑。编码EgD9e（SEQ ID NO:8）、EaD9e（SEQ ID NO:12）和E389E9e（SEQ ID NO:4）中的这些各位置之一的氨基酸残基的比较在表11中示出。

表11：用于功能性位点评估的位置

位置*

EgD9e

EaD9e

389D9e

位置*

EgD9e

EaD9e

389D9e

1

M

M

I

105

T

T

A

3

V

A

V

107

Q

Q

K

4

V

A

A

108

L

L

V

5

N

K

N

111

L

L

Y

9

S

S

A

115

L

V

L

12

Q

Q

A

127

G

D

A

21

A

A

Q

131

T

S

S

22

Q

Q

R

132

W

F

F

27

A

A

I

143

M

I

M

28

S

S

Y

149

Y

Y

V

29

H

S

S

152

R

R

S

32

V

V

L

153

N

N

G

35

L

L

F

155

A

G

S

37

I

V

I

156

V

V

I

41

I

A

I

161

L

L

F

42

L

I

L

168

W

W

F

45

T

M

T

169

I

I

V

47

G

R

G

179

I

I

M

48

P

P

E

181

L

L

F

51

P

L

D

182

K

N

N

52

K

K

S

192

S

S

A

53

G

R

G

196

I

I

T

54

Q

Q

K

204

I

I

L

57

M

L

L

207

K

K

W

58

K

K

R

209

R

R

K

60

V

L

L

210

N

N

D

62

T

T

K

211

I

V

I

63

N

A

W

216

Q

Q

K

66

L

F

L

218

G

G

P

67

L

L

F

222

F

F

L

70

I

I

V

223

G

A

A

71

Y

Y

F

225

F

I

I

73

L

F

L

229

F

W

W

74

G

G

V

236

C

L

L

80

A

A

G

239

L

L

I

83

M

L

I

242

Y

Y

F

84

Y

S

Y

244

Q

Q

K

85

T

V

T

245

T

T

S

89

M

L

Y

247

I

I

V

94

E

E

D

250

K

P

K

98

D

N

D

254

A

R

A

101

V

V

L

257

I

K

K

104

I

I

F

258

Q

E

V

*位置基于与EgD9e（SEQ ID NO:8）的比对，其具有与EgD9eS（SEQ ID NO:10）相同的序列。

上文在表11中鉴定的86个位置中，根据图4A的拓扑模型距膜周质空间接近程度最高的位点排除于进一步考虑之外（即，第45、47、48、51、52、53、54、57、58、60、62、63、66、67、70、71、73、74、204、207、209、210、211、216、218、222、223、225和229位）。以黑体文字用灰色标出的位点（即，EgD9eS的第3、5、9、12、21、22、27、28、32、37、41、42、80、84、85、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、156、161、168、169、179、181、182、192、196、236、239、242、244、245、247、250、254、257和258位）选择用于进一步的实验评估。

用于创建EgD9eS-L35G的 突变基因的

（美国专利7,695,906）使用成组双链DNA三联体作为通用构建模块用于合成组合文库“单次单密码子”（Sloning BioTechnology，Puchheim，Germany）。为进行文库生成，可在任意所需序列位置平行地引入多种密码子。功能性偏向的缺乏和选择并以任何比率精确地控制多达20种密码子的能力产生了包含全组所需突变的卓越的高质量文库。

随后由Sloning BioTechnology使用pZuFmEgD9ES-L35G（SEQ ID NO:60）作为模板创建了基因文库（总计50种），各基因文库在所述靶向位置（即，EgD9eS的第3、5、9、12、21、22、27、28、32、37、41、42、80、84、85、94、98、101、104、105、107、108、111、115、127、131、132、143、149、152、153、156、161、168、169、179、181、182、192、196、236、239、242、244、245、247、250、254、257或258位）具有至少16个独立并且独特的序列突变。

根据实例2中的描述，将全部EgD9eS-L35G突变体克隆进入pZuFmEgD9ES-L35G提供的载体主链并随后转化进入解脂耶氏酵母菌株Y2224并加以培养。所述转化的细胞（以甘油冻存株提供）和DNA获自Sloning BioTechnology。对少部分的转化的细胞和DNA进行测序并加以证实。

实例8

对具有改善的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G 突变体的鉴定

本实例描述了对EgD9eS-L35G突变体的鉴定，其与实例6中鉴定的变体蛋白EgD9eS-L35G（SEQ ID NO:59）的效率相比具有改善的LA向EDA的Δ9延伸酶转化效率。

使用实例2的“证实分析”方法筛选具有来自文库的构建体的807种耶氏酵母的转化体，从而将生长于新制再划线接种MM平板的细胞用于各自分别接种于包含3mL液体MM的三组重复培养物内。除所述807种突变体外，还将包含pZuFmEgD9ES-L35G（SEQID NO:60）的耶氏酵母菌株Y2224转化体三次重复地接种以作为实验对照。

来自在所述证实分析中选择的突变体的数据在表12中示出，将三组代表性EgD9eS-L35G对照的FAME特征与表现出在LA向EDA的平均转化%上的提高的文库突变体进行比较。更具体地，对于各菌株的各种脂肪酸的浓度（作为TFA面积百分比[“%TFA”]）和LA向EDA的转化%（根据实例2中所述测定）在下文表12中示出。根据实例4的缩写标识脂肪酸。各菌株的描述显示了存在于各自突变EgD9eS基因中的特定氨基酸取代。因此，菌株EgD9eS-L35G/S9A包含突变pZuFmEgD9ES质粒，其包含突变EgD9eS基因，所述基因当与SEQID NO:10示出的EgD9eS序列比较时具有L35G突变和S9A突变。

表12：证实分析：表达EgD9eS-L35G或其 突变体变种的转化体解脂耶 氏酵母菌株Y2224中的脂质组成。

值得注意的是，表12中示出的重复EgD9eS-L35G对照的脂肪酸特征和LA向EDA的转化%在一定程度上不同于此前示出的EgD9eS-L35G特征。在本组实验中，EgD9eS-L35G对照与此前的分析相比“性能不足”（即，LA向EDA的平均转化%在上文据测定为约18.1%，而在实例6表9中LA向EDA的平均转化%据测定为约26.6%和27.2%）。然而，具有EgD9eS-L35G的转化体产生了4.3EDA%TFA（平均值，见上文），其显著地高于具有EgD9eS的转化体所产生的EDA%TFA（即，3.1EDA%TFA[实例4，表5]、2.9EDA%TFA[实例4，表6]以及3.5EDA%TFA[实例6，表9]）。出于该原因，除本实验中EgD9eS-L35G性能之外，还使用先前实验（其重复了对EgD9eS-L35G的功能性分析）的表现（数据未示出）作为比较来自表12示出的EgD9eS位点评估文库的突变体的基础。

在表12中给出的26种选定的延伸酶变体中，11种经鉴定（以黑体标出）具有相对表12的对照数据是可比较的或改善的Δ9延伸酶转化活性。这些突变体包括EgD9eS-L35G/S9D（141%）、EgD9eS-L35G/A21V（118%）、EgD9eS-L35G/V32F（104%）、EgD9eS-L35G/Y84C（144%）、EgD9eS-L35G/L108G（104%）、EgD9eS-L35G/W132T（100%）、EgD9eS-L35G/M143N（96%）、EgD9eS-L35G/L161T（131%）、EgD9eS-L35G/I179R（141%）、EgD9eS-L35G/C236N（102%）和EgD9eS-L35G/Q244N（134%），其中相对EgD9eS的Δ9延伸酶转化活性在括号中示出。因此，在LA向EDA的转化效率上显示出最高达44%的改善。

实例9

EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/ Q244N组合文库的创建

本实例描述了突变EgD9eS组合文库的合成，其中上文实例8中鉴定出的有益突变（即，S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N和Q244N）的多种组合“垛叠”进入包含所述L35G突变的EgD9eS突变体。

用于构建所述组合文库的合成引物的创建

商业合成了11对引物，如SEQ ID NO:64-85中所描述（参见上文表13）。各引物对经设计以向所述EgD9eS-L35G基因中引入以下突变：S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N和Q244N。

所述引物在37℃下使用T4多核苷酸激酶[“PNK”]（目录号70031Z，USB Corp.）磷酸化60分钟，并随后在65℃下灭活20分钟。每20μl磷酸化反应混合物包含：2.0μl 10×T4PNK缓冲液、15.0μl引物DNA（约7μM）、0.6μl 100mM ATP、0.4μl T4PNK和2.0μl水。

用于创建EgD9eS-L35G的组合突变基因的多突变位点诱变

Change-IT^TMMultiple Mutation Site Directed Mutagenesis试剂盒（目录号78480，USB Corporation，Cleveland，OH）用于以6组反应系列向EgD9eS-L35G中引入S9D、A21V、V32F、Y84C、L108G、W132T、M143N、L161T、I179R、C236N和Q244N突变，各反应（除最终反应外）根据纳入引物组“A”的正向引物和反向引物与引物组“B”的正向引物和反向引物而引入两个新的突变（表13）。所述反应系列中的初始模板是EgD9eS-L35G，Change-IT^TM反应1的产物作为模板用于Change-IT^TM反应2等等。

更具体地，制备了两组25μl PCR反应混合物，各包含2.5μl 10×Change-IT^TM缓冲液、2.5μl磷酸化正向引物、2.5μl磷酸化反向引物、1.0μl模板（50ng/μl）、15.5μl无核酸酶水和1.0μl Change-IT^TMFideliTaq酶。第一个反应使用了来自引物组“A”的引物，而第二个使用了引物组“B”的引物。使用以下条件进行PCR扩增：95℃2分钟，随后是30个循环的95℃变性30秒、55℃退火30秒以及68℃延伸/连接25分钟。在68℃下进行了30分钟的最终延伸/连接循环，随后在4℃下终止反应。

在扩增后，通过加入DpnI酶去除该模板并且在37℃进行3小时的消化，使用所述PCR DNA通过电穿孔转化大肠杆菌Top10电感受态细胞（目录号C404052，Invitrogen，Carlsbad，CA）。所述转化的细胞涂布于具有100mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板之上，并且在37℃培养箱中生长过夜。使用Spin Miniprep试剂盒（Qiagen Inc.，Valencia，CA），根据制造商的方案从所述转化体大肠杆菌细胞中提取DNA。所述纯化的DNA随后作为模板用于下一个Change-IT^TM反应。在将11个突变的最后突变引入所述初始EgD9eS-L35G模板的第六个反应之后，根据上文所述从所述转化体大肠杆菌细胞中纯化DNA。随后将该DNA转化进入解脂耶氏酵母菌株Y2224（上文实例2）。

实例10

对具有改善的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/ W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244N组合文库突变体的鉴定

本实例描述了：1）对与野生型蛋白EgD9eS（SEQ ID NO:10）的转化效率相比具有改善的LA向EDA的Δ9延伸酶转化效率的EgD9eS-L35G/S9D/A21V/V32F/Y84C/L108G/W132T/M143N/L161T/I179R/C236N/Q244N组合文库突变体的鉴定；2）对这些EgD9eS突变体的序列分析；以及3）再度创建所述经测序的EgD9eS突变体以证实所述改善的Δ9延伸酶转化效率。

使用实例2的快速筛选“平板分析测定”筛选具有来自所述组合文库（实例9）的构建体的2,388个耶氏酵母转化体。与野生型对照EgD9eS（SEQ ID NO:10）相比，大多数这些突变体表现出降低的LA向EDA转化。但是，根据实例2的证实分析所证实，5个转化体与对照相比表现出改善的Δ9延伸活性。

使用菌落PCR测定所述突变EgD9eS基因的DNA序列。简而言之，使用无菌微量移液吸头从新制再划线接种平板上对少量的酵母细胞进行取样，并且将所述细胞重悬浮于20μl分子等级的水中。将细胞悬浮物（2μl）转至TaKaRa Ex Taq PCR混合物内，其根据制造商的建议而制备（Takara Biotechnology Co.，LTD.）。用于菌落PCR的引物是正向引物FBAIN-F（SEQ ID NO:98）和反向引物Y1026（SEQ ID NO:99。热循环仪程序包括94℃下5分钟的初始模板变性，随后是40个循环的94℃变性30秒、56℃退火30秒以及72℃延伸3分钟。在72℃下进行6分钟的最终延伸。

使用引物FBAIN-F（SEQ ID NO:98）和Y1026（SEQ ID NO:99）对所述PCR产物进行测序。对所述DNA序列数据的分析揭示了所述突变EgD9eS基因中的核苷酸替换和所表达的氨基酸取代。如表14所示，对各突变EgD9eS基因和包含所述突变EgD9eS基因的各突变pZuFmEgD9ES质粒给出了表明氨基酸取代的命名。

表14：经测序的EgD9eS组合文库突变体的总结

根据表14的氨基酸取代设计用于定点诱变的新引物。这些引物随后用于经设计以将所述“巨型引物”内的EgD9eS突变引入pZuFmEgD9ES的反应（图2；SEQ ID NO:25），由此而将所述非突变EgD9eS替换以表14中列出的多种突变EgD9eS基因。

其使用II XL定点诱变试剂盒而实现（目录号200524，Stratagene，La Jolla，CA），如实例3中所描述。根据实例2所述，将这些突变基因转化进入大肠杆菌Top10电感受态细胞之中，进行纯化并且随后转化进入解脂耶氏酵母菌株Y2224。通过该方法，在质粒上重新创建了表14中示出的突变EgD9eS基因并将其重新引入菌株Y2224以证实所述EgD9eS组合突变体所表现出的改善的Δ9延伸酶转化效率是由于所鉴定出的氨基酸取代导致。

来自这些证实分析的数据在表15中示出，并且将单个pZuFmEgD9ES对照转化体的FAME特征与所述组合文库的突变体加以比较。为进行保守性比较，针对各菌株所示的数据是各个菌株具有最高的LA向EDA转化%的3个分离株的FAME特征。更具体地，对于各菌株的各种脂肪酸的浓度（作为TFA面积百分比[“%TFA”]）和LA向EDA的转化%（根据实例2中所述测定）在下文示出，而平均值以灰色标出并标以“平均”。根据实例4的缩写标识脂肪酸。

表15：证实分析：表达EgD9eS或其组合文库突变体变种的转化体解脂耶氏酵母菌 株Y2224中的脂质组成。

使用包含SEQ ID NO:10的经密码子优化的EgD9eS基因（非突变）的pZuFmEgD9ES转化的解脂耶氏酵母菌株Y2224的克隆产生了平均2.5EDA%TFA，其中这3个克隆中的LA向EDA的平均转化效率[“转化%”]经测定为约16.1%。与之对比，突变菌株EgD9EN-427的LA向EDA的平均转化%为17.8%（或相对于对照物为110%）。类似地，突变菌株EgD9EN-1043的LA向EDA的平均转化%为17.5%（或相对于对照物为108%）。突变菌株EgD9EN-1534的LA向EDA的平均转化%为16.8%（或相对于对照物为104%）；突变菌株EgD9EN-1635的平均转化%为18.0%（或相对于对照物为111%）；并且突变菌株EgD9EN-1734的平均转化%为20.0%（或相对于对照物为123%）。

因此，这些实验由此证实了EgD9eS组合文库突变体EgD9EN-427、EgD9EN-1043、EgD9EN-1534、EgD9EN-1635和EgD9EN-1734所表现出的改善的Δ9延伸酶转化效率，其中所述改善介于4-23%之间。

实例11

生产占总脂肪酸约58.7%的EPA的解脂耶氏酵母菌株Z1978的构建

本实例描述了来源于解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Z1978的构建，该菌株通过Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径的表达能够生产相对于总脂质约58.7%的EPA并具有38.3%的总脂质含量[“TFA%DCW”]。所述菌株包含实例5和6的Δ9延伸酶位点饱和突变体，所述突变体包含所述L35G突变（即，EgD9eS-L35G[SEQ ID NO:58和59]）。

菌株Z1978（图6）的开发需要构建菌株Y2224、Y4001、Y4001U、Y4036、Y4036U、L135、L135U9、Y8002、Y8006U6、Y8069、Y8069U、Y8154、Y8154U、Y8269、Y8269U、Y8412U6、Y8647、Y8467U、Y9028、Y9028U、Y9502和菌株Y9502U。

菌株构建中对解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

为了进行脂肪酸[“FA”]分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.（Can.J.Biochem.Physiol.，37:911-917（1959））中的描述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”]（Roughan，G.和Nishida I.，ArchBiochem Biophys.，276（1）:38-46（1990））并随后将其用配有30m×0.25mm（内径）HP-INNOWAX（Hewlett-Packard）柱的Hewlett-Packard6890气相色谱仪（GC）进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃（保持25分钟）升至185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母细胞（0.5mL培养物），在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠（100μl1%）和已知量的C15:0三酰基甘油（C15:0TAG；目录号T-145，Nu-Check Prep，Elysian，MN）加入样品中，然后将样品涡旋振荡30分钟，温度为50℃。在加入3滴1M NaCl和400μl己烷后，涡旋样品并离心。移除上层并用GC进行分析。

作为另外一种选择，将描述于Lipid Analysis，William W.Christie，2003中的碱催化酯交换反应的改进法用于对来自发酵或烧瓶样品的培养液体样品的常规分析。具体地，将培养液体样品在室温下快速融化，随后称量（至0.1mg）进入油化的2mL微量离心管中，其具有0.22μm 离心管滤器（目录号8161）。根据此前测定的DCW，使用样品（75-800μl）。使用Eppendorf5430离心机将样品在14,000rpm下离心5-7分钟或根据需要的时长以除去所述培养液体。移除该滤器，倒净液体，向该滤器加入～500μl的去离子水以洗涤所述样品。在经离心以除去水后，再度移除该滤器，倒净该液体并且重新插入滤器。随后将该管重新插入离心机，这一次敞口进行～3-5分钟用于干燥。在该管上部约1/2处切下该滤器并将其插入新的2mL圆底Eppendorf管（目录号2236335-2）。

以适当的工具将该滤器压入所述管的底部，所述工具仅仅接触该切下的滤器的边缘并且不接触所述样品或滤器材料。加入处于甲苯中的已知量的C15:0TAG（同上）和处于甲醇溶液中的500μl新制1%甲醇钠。使用适当的工具稳健地破碎所述样品沉淀，盖上该管并置于50℃的热块之上（VWR目录号12621-088）30分钟。随后冷却所述管至少5分钟。随后，加入400μl己烷和500μl 1M NaCl水溶液，涡旋该管6秒钟×2并离心1分钟。将约150μl的顶（有机）层置于具内衬管的GC瓶内并通过GC分析。

经由GC分析记录的FAME峰值在与已知脂肪酸进行比较时通过它们的保留时间进行鉴定，并且通过比较FAME与已知量的内部标准物（C15:0TAG）的峰面积进行定量。因此，根据下式计算任何脂肪酸FAME[“μg FAME”]的近似量（μg）：（指定脂肪酸的FAME峰面积/标准物FAME峰面积）*（μg标准物C15:0TAG），根据下式计算任何脂肪酸[“μg FA”]的量（μg）：（指定脂肪酸的FAME峰面积/标准物FAME峰面积）*（μg标准物C15:0TAG）*0.9503，因为1μg C15:0TAG等于0.9503μg脂肪酸。注意：0.9503的转换因子是大多数脂肪酸测定的近似值，其范围介于0.95和0.96之间。

概述每种单个脂肪酸以TFA%重量表示的量的脂质特征通过用单个FAME峰面积除以所有FAME峰面积的总数并乘以100进行计算。

通过烧瓶检测分析对菌株构建期间Yarrowia lipolytica的总脂质含量和组分的 分析

为了详细分析在解脂耶氏酵母的特定菌株中的总脂质含量和组成，如下进行了烧瓶检测分析。具体而言，一个接种环的新鲜划线的细胞被接种至3mL FM培养基，并于30℃以250rpm生长过夜。测量OD_600nm，在125mL烧瓶中，加入一个等分试样的细胞，使得25mL FM培养基中最终的OD_600nm为0.3。在30℃振荡培养箱中以250rpm培养2天后，通过离心收集6mL培养物，并在125mL烧瓶中重悬于25mL HGM中。30℃振荡培养箱中以250rpm培养5天后，使用1mL等分试样进行脂肪酸分析（同上），并且干燥10mL用于干细胞重量[“DCW”]测定。

就DCW测定而言，通过在Beckman GS-6R离心机的Beckman GH-3.8转子中以4000rpm离心5分钟，收集了10mL培养物。沉淀被重悬于25mL水中，并如上文所述重新收集。将洗涤后的沉淀物重悬在20mL水中并转移到预先称过重的铝盘上。细胞悬浮液在80℃真空炉中干燥过夜。测量细胞重量。

计算细胞总脂质含量[“TFA%DCW”]，并且将其与列表显示以TFA%重量[“%TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA%DCW”]的数据综合考虑。来自烧瓶检测分析法的数据在表中提供，该表概述细胞的干细胞总重量[“DCW”]、细胞的总脂质含量[“TFA%DCW”]、以TFA%重量[“%TFA”]表示的每种脂肪酸浓度和以干细胞重量百分比表示的EPA含量[“EPA%DCW”]。更具体地，脂肪酸被鉴定为16:0（棕榈酸）、16:1（棕榈油酸）、18:0（硬脂酸）、18:1（油酸）、18:2（LA）、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA以及其它。

解脂耶氏酵母菌株Y9502的基因型

菌株Y9502的产生描述于美国专利公开2010-0317072-A1中。来源于解脂耶氏酵母ATCC20362的菌株Y9502能够经由表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生相对于总脂质约57.0%的EPA（图6）。

菌株Y9502相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的最终基因型为Ura+、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝）、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16。缩写如下：FmD12是串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，其来自串珠镰刀菌[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C_16/18延伸酶基因，其来自高山被孢霉[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[美国专利7,645,604]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，其来自小眼虫[美国专利7,645,604]；EgD8M是合成的突变Δ8去饱和酶基因[美国专利7,709,239]，其来自小眼虫[美国专利7,256,033]；EaD8S是经密码子优化的Δ8去饱和酶基因，其来自Euglena anabaena[美国专利7,790,156]；E389D9eS/EgD8M是DGLA合成酶，其通过将来自小型绿藻属CCMP389Δ9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“E389D9eS”）（美国专利7,645,604）连接于Δ8去饱和酶“EgD8M”（同上）[美国专利公开2008-0254191-A1]而产生；EgD9eS/EgD8M是DGLA合成酶，其通过将Δ9延伸酶“EgD9eS”（同上）连接于Δ8去饱和酶“EgD8M”（同上）[美国专利公开2008-0254191-A1]而产生；EaD9eS/EgD8M是DGLA合成酶，其通过将来自E.anabaena的Δ9延伸酶的经密码子优化的Δ9延伸酶基因（“EaD9eS”）[美国专利7,794,701]连接于Δ8去饱和酶“EgD8M”（同上）[美国专利公开2008-0254191-A1]而产生；EgD5M和EgD5SM是合成的突变Δ5去饱和酶基因[美国专利公开2010-0075386-A1]，其来自小眼虫[美国专利7,678,560]；EaD5SM是合成的突变Δ5去饱和酶基因[美国专利公开2010-0075386-A1]，其来自E.anabaena[美国专利7,943,365]；PaD17是瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）Δ17去饱和酶基因[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶基因，其来自瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]；YlCPT1是解脂耶氏酵母的二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因[美国专利7,932,077]；MCS是经密码子优化的丙二酰-辅酶A合成酶基因，其来自豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）bv.viciae3841[美国专利公开2010-0159558-A1]并且MaLPAAT1S是经密码子优化的溶血磷脂酸酰基转移酶基因，其来自高山被孢霉[美国专利7,879,591]。

为对菌株Y9502中的总脂质含量和组分进行详细分析进行了烧瓶检测分析，其中细胞在总计7天中进行两阶段生长。根据分析，菌株Y9502产生了3.8g/L DCW、37.1TFA%DCW、21.3EPA%DCW，并且脂质特征如下，其中各组合物的浓度为对TFA的重量百分比[“%TFA”]：16:0（棕榈酸）—2.5、16:1（棕榈油酸）—0.5、18:0（硬脂酸）—2.9、18:1（油酸）—5.0、18:2（LA）—12.7、ALA—0.9、EDA—3.5、DGLA—3.3、ARA—0.8、ETrA—0.7、ETA—2.4、EPA—57.0、其它—7.5。

菌株Y9502U（Ura3-）的构建

为破坏菌株Y9502中的Ura3基因，使用经SalI/PacI-消化的构建体pZKUM（图7A；SEQ ID NO:89；描述于美国专利公开2009-0093543-A1的表15中，其以引用的方式并入本文）将Ura3突变基因整合进入菌株Y9502的Ura3基因，其根据常规方法进行。将总计27个转化体（选自包含8个转化体的第1组、包含8个转化体的第2组和包含11个转化体的第3组）生长于基本培养基+5-氟乳清酸[“MM+5-FOA”]选择平板上并在30℃下维持2至5天。进一步的实验测定仅仅第3组转化体具有真正的Ura-表型。

将所述Ura-细胞从该MM+5-FOA平板刮下并且根据常规方法进行脂肪酸分析。通过该方法，GC分析显示在生长于MM+5-FOA平板上的第3组pZKUM-转化体1、3、6、7、8、10和11中分别具有占TFA28.5%、28.5%、27.4%、28.6%、29.2%、30.3%和29.6%的EPA。将这七种菌株分别命名为菌株Y9502U12、Y9502U14、Y9502U17、Y9502U18、Y9502U19、Y9502U21和Y9502U22（统称Y9502U）。

菌株Z1978的构建

随后产生了构建体pZKL3-9DP9N（图7B；SEQ ID NO:90）以将一个Δ9去饱和酶基因、一个磷酸胆碱转胞苷酰酶基因以一个Δ9延伸酶突变基因整合进入菌株Y9502U的耶氏酵母YALI0F32131p基因座（GenBank登录号XM_506121）。pZKL3-9DP9N质粒包含如下组分：

表16：质粒pZKL3-9DP9N（SEQ ID NO:90）的描述

使用AscI/SphI消化pZKL3-9DP9N质粒并且随后将其用于转化菌株Y9502U17。将转化体细胞平铺于基本培养基[“MM”]平板上并且在30℃下维持3至4天。将单菌落再次划线至MM平板上，随后将其在30℃下接种至液体MM中并以250rpm/min振荡2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于高糖培养基[“HGM”]中，然后以250rpm/min振荡5天。对所述细胞进行脂肪酸分析，如上文所述。

GC分析显示，所选择的具有pZKL3-9DP9N的96个Y9502U17菌株中大多数生产占TFA50-56%的EPA。生产约占TFA59.0%、56.6%、58.9%、56.5%和57.6%的EPD的五个菌株（即，31、32、35、70和80）被分别命名为菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981。

这些pZKL3-9DP9N转化体菌株相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC20362的最终基因型为Ura+、Pex3-、未知1-、未知2-、未知3-、未知4-、未知5-、未知6-、未知7-、未知8-、未知9-、未知10-、未知11-、YAT1::ME3S::Pex16、GPD::ME3S::Pex20、YAT1::ME3S::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、GPAT::EgD9e::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD8M::Lip1、GPD::EaD8S::Pex16（2个拷贝）、YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1、YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco、FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2、GPDIN::YlD9::Lip1、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、GPDIN::FmD12::Pex16、EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::YlCPT1::Aco、YAT1::MCS::Lip1、FBA::MCS::Lip1、YAT1::MaLPAAT1S::Pex16、EXP1::YlPCT::Pex16。

在这些以pZKL3-9DP9N转化而产生的任何EPA菌株中均未证实菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981中的YALI0F32131p基因座的敲除（GenBank登录号XM_50612）。

使来自菌株Z1977、Z1978、Z1979、Z1980和Z1981的YPD平板的细胞生长并通过烧瓶检测分析来分析总脂质含量和组成。下文表17概述了这些各菌株中的总脂质含量和组成。具体地，该表概述了总DCW、TFA%DCW、各种脂肪酸的浓度（各种脂肪酸的TFA[“%TFA”]重量百分比）和EPA%DCW。

随后对菌株Z1978进行部分基因组测序。根据美国专利临时申请61/428,277（E.I.duPont de Nemours&Co.，Inc.，代理人档案号CL5267USPRV，2010年12月30日提交），该项工作确定所述经工程改造的菌株实际上仅仅具有四种Δ5去饱和酶基因（即，EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、EXP1::EgD5SM::Lip1和YAT1::EaD5SM::Oct）而并非整合进入耶氏酵母基因组的六种Δ5去饱和酶基因（即，嵌合型基因EXP1::EgD5M::Pex16、FBAIN::EgD5SM::Pex20、GPDIN::EgD5SM::Aco、GPM::EgD5SM::Oct、EXP1::EgD5SM::Lip1、YAT1::EaD5SM::Oct）。

解脂耶氏酵母菌株Y9502和菌株Z1978的比较

表达于菌株Z1978中的异源基因仅仅由于额外表达一种Δ9去饱和酶、一种磷酸胆碱转胞苷酰酶基因和一种Δ9延伸酶突变体（即，SEQ ID NO:58和59示出的EgD9eS-L35G）而不同于在菌株Y9502中表达的基因。表18中针对Y9502和Z1978菌株计算了LA与ALA向EPA的总Δ9延伸酶转化效率[“转化%”]，其根据以下公式：（[产物]/[底物+产物]）*100，其中所述产物是EDA%TFA、ETrA%TFA、DGLA%TFA、ETA%TFA、ARA%TFA和EPA%TFA之和，并且所述底物是LA%TFA、ALA%TFA、EDA%TFA、ETrA%TFA、DGLA%TFA、ETA%TFA、ARA%TFA和EPA%TFA之和。

表18：转化体解脂耶氏酵母菌株Y9502和Z1978中的总脂质含量和组成以及Δ9延 伸酶活性的比较

根据上文所示出，所述总Δ9延伸酶转化效率在菌株Y9502中据测定为83.3%，而在菌株Z1978中该效率受到改善（即，85.3%）。根据所述Δ9延伸酶活性中的这一改善认为EgD9eS-L35G是有用的突变基因，其用于PUFA的生物合成的功能性Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径。

本发明的任意所述突变Δ9延伸酶均可类似地引入适当的载体以用于在解脂耶氏酵母的优选菌株中的表达，如本实例所展示。

Claims (15)

1.分离的多核苷酸，由编码具有Δ9延伸酶活性的突变多肽的核苷酸序列组成，其中所述多肽由选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:107 和SEQ ID NO:110的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列选自：SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 103、SEQID NO: 106和SEQ ID NO: 109。

3.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多肽由SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列组成。

4.具有Δ9延伸酶活性的突变多肽，其中所述多肽由选自SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 107和SEQ ID NO: 110的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求4所述的突变多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列组成。

6.重组构建体，包含权利要求1-3中任一项的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列可操作地连接至少一种调控序列。

7.转化的酵母，包含权利要求6的重组构建体。

8.根据权利要求7所述的转化的酵母，其中所述酵母是产生其干细胞重量的至少25%的油的含油酵母。

9.根据权利要求8所述的转化的酵母，其中所述含油酵母选自：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、隐球酵母属（Cryptococcus）、丝孢酵母属（Trichosporon）和油脂酵母属（Lipomyces）。

10.根据权利要求9所述的转化的酵母，其中所述含油酵母是解脂耶氏酵母（Yarrowialipolytica）。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的转化的酵母，其中所述含油酵母还包含至少一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的分离的多核苷酸，所述重组DNA构建体编码选自下列的多肽：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶和C_20/22延伸酶。

12.根据权利要求8-10中任一项所述的转化的酵母，其中所述含油酵母包含选自下列的长链多不饱和脂肪酸：二十碳二烯酸、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。

13.根据权利要求8-10中任一项所述的转化的酵母，其中所述含油酵母包含选自下列的长链多不饱和脂肪酸：花生四烯酸和二高-γ-亚麻酸。

14.生产多不饱和脂肪酸的方法，所述方法包括：

a)提供根据权利要求8-13中任一项所述的转化的酵母，所述酵母包含选自亚油酸和α-亚麻酸的脂肪酸；

b)使步骤（a）的酵母在其中使编码具有Δ9延伸酶活性的突变多肽的重组构建体表达且使所述底物脂肪酸转化成产物脂肪酸的条件下生长，其中亚油酸转化成二十碳二烯酸并且α-亚麻酸转化成二十碳三烯酸；以及

c)任选地回收步骤（b）的产物脂肪酸。

15.重组酵母细胞，所述重组酵母细胞产生包含二十碳五烯酸的油，其中所述二十碳五烯酸为所述酵母细胞的干细胞重量的至少22.5重量%，并且其中所述酵母细胞包含至少一种突变Δ9延伸酶多肽，所述突变Δ9延伸酶多肽由SEQ ID NO: 59所示的氨基酸序列组成。