CN102257126B - 减少发酵过程中的丙二酸副产物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了在生物发酵期间基于异源丙二酰-CoA合成酶的表达来减少副产物有机酸的量的方法。产生多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的所述含油酵母—解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株经工程改造表达异源丙二酰-CoA合成酶基因。所述表达不会影响PUFA的产量，但是相比所述不表达丙二酰-CoA合成酶的亲代菌株中产生的丙二酸的量，所述表达会导致丙二酸的量减少。

Description

减少发酵过程中的丙二酸副产物
本专利申请要求提交于2008年12月18日的美国临时申请61/138922的优先权，其公开内容全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明属于用于在生物发酵期间基于编码丙二酰-CoA合成酶的基因表达来减少有机酸副产物尤其是丙二酸的方法。
发明背景
发酵是通过使用生物催化剂由一种或多种底物产生一种或多种产物的工艺，其中生物催化剂可以是整个微生物、分离的酶、或它们的任何组合。
在分批发酵中，发酵从培养过程开始，在该过程中培养基接种了所需的微生物。继而发生生长或代谢活动。该体系内的代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。通常，微生物细胞的生长速率从静态停滞期上升至高生长对数期(或指数生长)，最终达到稳定期，此时生长减缓或停止。虽然微生物产物的生成通常在高生长对数期间发生，但是由于培养生物的生长，培养基的营养物质会耗尽并会使培养基富含产物(如果产物分泌到体外的话)和副产物，该生长期不能无限延续下去。除了别的物质外，副产物还可包含多糖、碳水化合物、氨基酸、蛋白质、盐和各种有机酸，所述有机酸例如乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丙酮酸、延胡索酸、柠檬酸、异柠檬酸、乙醛酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和丙二酸。
发酵是生物合成多种微生物产物的重要技术，所述微生物产物包括氨基酸、乙醇、多不饱和脂肪酸和抗生素。一些化学品的发酵生产和商业化已有所报道(W.Crueger和A.Crueger，Biotechnology：ATextbook of Industrial Microbiology，Sinauer Associates：Sunderland，MA.，第124-174页(1990)；B.Atkinson和F.Mavituna，BiochemicalEngineering and Biotechnology Handbook，第2版；Stockton：New York，第243-364页(1991))。然而，生物催化工艺在很多情况下受到若干熟知的限制因素的影响，这些限制因素可包括：1)产物范围相对较小；2)收率、滴定浓度和生产率低；3)难以从水溶液中回收和纯化产物；以及，4)产生有害副产物。因为工艺限制因素增加了所关注产物的制造成本，所以将上游代谢工程(即产物合成)与下游生物过程工程(即产物分离和过程设计)整合对于从工业发酵中获得巨大价值是极为重要的。
虽然各种生物化学、生理学和化学/物理因素可影响生物催化工艺的产量，但是重要的因素包括底物转化为产物的效率，以及对能量/碳流进入产生所关注产物的生物化学途径的优化。考虑到这些因素，已开发出多种代谢工程技术，以促进所需生物化学途径的上调和不可取生物化学途径的下调，不可取生物化学途径例如与所关注生物合成途径竞争的那些，或干扰特定终产物生成的那些。
本公开涉及在生物发酵合成产物期间丙二酸副产物的积聚。具体地讲，通过如下方式实现高产率产物和最小化废弃副产物：对生物进行工程化改造，使其表达异源丙二酰-CoA合成酶进行如下反应：丙二酸+ATP+CoA→丙二酰-CoA+AMP+焦磷酸[“PPi”]。副产物丙二酸向丙二酰-CoA的转化允许生物体内合成脂肪酸，从而避免发酵期间不能进一步利用的丙二酸“副产物”的积聚。因此避免了生物体内碳和能量的浪费，减少了发酵过程期间维持最适pH范围所需的碱的量，并且减少了发酵废气中需要中和的有机酸副产物的量。
异源丙二酰CoA合成酶预先在微生物体内表达，从而增加各种聚酮化合物的产量(美国专利6,939,691、美国专利申请公布2003/0073205)。如Lombó，F.等人所概述(Biotechnol.Prog.，第17卷第4期，第612-617页(2001))，在天然和异源宿主中聚酮化合物发酵过程的产量很多情况下受到体内前体可用性的限制，该前体衍生自α-羧化CoA硫酯，例如丙二酰-CoA和(2S)-甲基丙二酰-CoA。丙二酰-CoA合成酶的表达可减弱这个限制并且显著增加聚酮化合物的产量。上述公开未想到利用异源丙二酰CoA合成酶的表达来减少丙二酸的产量，从而避免生物对碳和能量的浪费。
申请人已经解决所述问题，其中丙二酸“副产物”在生物发酵期间积聚，从而导致碳和能量浪费、所关注产物合成量减少并产生需要中和的废气(从而增加制备的总成本)。本文描述了表达异源丙二酰CoA合成酶蛋白的新型生物。
发明概述
在第一实施方案中，本发明涉及用于至少一种产物发酵的转基因生物，该生物包含至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因，该基因受到至少一种调控序列的调控；其中转基因生物产生的发酵副产物丙二酸的量与转基因或非转基因的相同生物产生的丙二酸的量相比减少，前提条件是所述相同生物：
a)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
b)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
优选地，生物积聚的油量占其细胞干重至少约25％。生物选自藻类、真菌、类眼虫、酵母、细菌和原生藻菌(stramenopiles)。更优选地，生物为选自耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的含油酵母。
在第二实施方案中，本发明的转基因生物具有的调控序列还包含强启动子。
在第三实施方案中，包含至少一个编码丙二酰-CoA合成酶的基因的本发明转基因生物可以是多拷贝的。
在第四实施方案中，本发明的转基因生物包含至少一种编码丙二酰-CoA合成酶多肽的序列，该多肽具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。
在第五实施方案中，本发明的转基因生物包含至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的序列，其中所述序列选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：3。
在第六实施方案中，本发明的转基因生物产生的至少一种产物的滴度相对于转基因的或非转基因的相同生物产生的至少一种产物的滴定浓度，未降低，前提条件是所述相同生物：
a)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
b)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
在第七实施方案中，本发明的转基因生物还包含至少一种基因突变。该至少一种基因突变可以造成至少一种天然过氧化物酶体生物发生(biogenesis)因子蛋白被破坏。
在第八实施方案中，本发明包括操纵转基因生物中丙二酸含量的方法，该方法包括：
a)提供转基因生物，该生物用于至少一种产物的发酵，其中转基因生物包含至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因，该基因受到合适调控序列的调控；以及，
b)培养所述生物以允许所述至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因的表达，使得转基因生物产生的发酵副产物丙二酸的量与相同生物产生的丙二酸的量与转基因或非转基因的相同生物产生的丙二酸的量相比减少，前提条件是所述生物：
(i)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
(ii)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
优选地，至少一种编码丙二酰-CoA合成酶多肽的基因具有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的氨基酸序列。此外，至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因选自SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3。
在第九实施方案中，转基因耶氏酵母种(Yarrowia sp.)宿主细胞包含：
a)至少一种基因突变，其中该突变为至少一种天然过氧化物酶体生物发生因子蛋白中的破坏；以及，
b)至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因，该基因受到至少一种调控序列的调控；以及，
c)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因。
附图简述和序列表
图1由图1A、图1B、图1C和图1D组成，它们一起示出了豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841(Rhizobium leguminosarum bv.viciae 3841)丙二酰-CoA合成酶基因(GenBank登录号YP_766603；SEQ ID NO：1)和经密码子优化以在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达的合成基因(SEQ ID NO：3)的DNA序列比对。
图2提供了pZP2-MCS的质粒图谱。
图3由图3A和图3B组成，它们一起示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑对该途径的描述时应被视为一起。
图4图示了解脂耶氏酵母菌株Y4305的构建。
根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的详细描述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。
下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求—序列规则”(“Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。
SEQ ID NO：1-22是编码基因或蛋白质或质粒的开放阅读框(ORF)，如表1中所示。
表1：核酸和蛋白质SEQ ID编号摘要
发明详述
本文描述了在发酵生成产物期间避免不能进一步利用的丙二酸“副产物”积聚的一般方法。这些方法依靠宿主中异源丙二酰-CoA合成酶蛋白的表达。这些方法具有广泛适用性，因为它们在通过发酵生成各种产物期间，可减少多种生物产生的丙二酸副产物，这些生物包括藻类、真菌、类眼虫、酵母、细菌和原生藻菌。这些方法可在含油酵母中进行，具体地讲，可在预先经遗传工程改造而产生多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的解脂耶氏酵母中进行。研究发现，与工程化生产PUFA相关的基因突变在发酵期间增加了丙二酸副产物的产量(丙二酸占积聚的总有机酸的约45％)。异源丙二酰-CoA合成酶的表达逆转了该效应，并且大幅减少丙二酸副产物的产量。
在本公开中，使用以下缩写：
“开放阅读框”缩写为ORF。
“聚合酶链反应”缩写为PCR。
“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。
“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。
“三酰基甘油”缩写为“TAG”。
“总脂肪酸”缩写为“TFA”。
“脂肪酸甲酯”缩写为“FAME”。
“细胞干重”缩写为“DCW”。
“辅酶A”缩写为“CoA”。
如本文所用，术语“发明”或“本发明”不旨在限制而是通常适用于权利要求中的或本文所述的任何发明。
根据国际纯粹与应用化学联合会[“IUPAC”]系统命名法，术语“丙二酸”也称为丙烷二酸，是指具有如CH2(COOH)2所示的化学结构的二元羧酸。丙二酸或丙烷二酸离子由丙二酸失去两个氢离子(即CH2(COO)2 2-)衍生而来。丙二酸的盐和酯包括但不限于丙二酸二乙酯[(C2H5)2(C3H2O4)]、丙二酸二甲酯[(CH3)2(C3H2O4)]以及丙二酸二钠[Na2(C3H2O4)]。
如本文所用，“丙二酸”是指丙二酸的电离形式，以及其酯和盐。所有这些在本文中共同称为“丙二酸”。
如本文所用，“丙二酰-CoA”[CAS登记号524-14-1]是指通过乙酰-CoA羧化反应生成丙二酰-CoA而形成的酰基硫酯。作为另外一种选择，丙二酰-CoA可由底物丙二酸经丙二酰-CoA合成酶的酶促催化而生成。
如本文所用，“丙二酰-CoA合成酶”[EC 6.2.1.-]催化以下酶促反应：丙二酸+ATP+CoA→丙二酰-CoA+AMP+焦磷酸[“PPi”]。该酶首先从用丙二酸培养的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中纯化(Kim，Y.S.和S.K.Bang，J.Biol.Chem.，第260卷，第5098-5104页(1985))，但自此以后已从豆科植物根瘤中的类菌体分离出多种根瘤菌同源物(参见例如Kim，Y.S.和H.Z.Chae，Biochem.J.，第273卷，第511-516页(1991)以及Kim，Y.S.和S.W.Kang，Biochem.J.，第297卷，第327-333页(1994))。
术语“rMCS”是指编码豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841的丙二酰-CoA合成酶(SEQ ID NO：2)的基因(SEQ ID NO：1)(GenBank登录号YP_766603)。类似地，术语“MCS”是指编码丙二酰-CoA合成酶的合成基因，该基因来源于豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841，其经密码子优化以在解脂耶氏酵母中表达(即SEQ ID NO：3和4)。
术语“根瘤菌属”是指固氮的革兰氏阴性土壤细菌属(包括超过30个不同的菌种)，即固氮生物。根瘤菌属与豆类(例如豌豆、菜豆、三叶草和大豆)的根形成内共生的固氮共生体。细菌定殖于植物细胞的根瘤中，将大气的氮转化为氨，然后为植物提供有机含氮化合物例如谷氨酰胺或酰脲。植物为细菌提供光合作用制备的有机化合物。根据最新研究，三叶草根瘤菌是豌豆根瘤菌的晚出异名(M.H.Ramírez-Bahena等人，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.，第58卷，第2484-2490页(2008))。
“发酵”是指通过使用生物催化剂催化底物反应生成产物的工艺。
“生物催化剂”产生或改变底物和产物之间化学反应的速率。生物催化剂可以是整个微生物、分离的酶、或它们的任何组合。出于本文所述的目的，生物催化剂将是整个微生物，例如藻类、真菌、类眼虫、酵母、细菌或原生藻菌。
“发酵罐”或“生物反应器”是指能够在内部实施发酵过程的容器。发酵罐为具有两相或更多相(如液相、气相、固相)的非均相体系。发酵的最佳条件需要将物质、热量和动量有效地从一个相传递至另一个相。发酵罐提供下列条件：1)搅拌(用于细胞和培养基的混合)；2)通气，用于O2供给；3)对温度、pH、压力、通气、营养物质供给、液位等因素的调节；4)灭菌和无菌性的维持；以及，5)细胞/培养基的取出(对于连续发酵罐)。一般来讲，发酵罐留下20-25％的未填充培养基体积作为“顶部空间”，以允许喷射、起泡和通气。发酵罐的设计可以有很大的差别，这取决于其所用发酵的类型。现代发酵罐通常与计算机集成在一起，用于高效过程监测、数据采集等。
术语“肉汤”或“培养基”是指用于培养微生物的包含营养物质的液体溶液，一般包含水、能源、碳源、氮源和微量营养素。在发酵期间和/或结束后，肉汤还可包含生物催化剂、生物催化剂合成的产物、代谢中间体、副产物以及其他培养基组分，例如盐、维生素、氨基酸、辅因子和抗生素。
“产物”是指在发酵作用下通过生物催化生成的任何主要受关注产物。这可以是在生物催化剂催化下天然生成的化合物，或者可以通过遗传工程操作将非天然基因导入微生物，以使这些基因在发酵期间进行功能性表达。
与此相反，术语“副产物”是指在生物催化剂催化底物转化成产物期间形成的次要或附带产物。通常，希望从发酵体系中选择性除去
“副产物”，以消除反馈抑制和/或使生物催化剂活性最大化。典型的发酵副产物可包括，例如：多糖、碳水化合物、氨基酸、蛋白质、盐和各种有机酸，所述有机酸例如乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丙酮酸、延胡索酸、柠檬酸、异柠檬酸、乙醛酸、琥珀酸、α-酮戊二酸和丙二酸。
“容积产量”是指单位时间内在给定体积的发酵罐中生成的产物的质量，单位为克/(升小时)(缩写为g/(L h))。该量度由生物催化剂的比活性和生物催化剂的浓度确定。它可由滴定浓度、运行时间、和发酵罐的工作体积计算。
“滴定浓度”是指产物的浓度，单位为克/升(缩写为g/L)。
术语“保守结构域”或“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。
术语“含油的”指那些倾向于以油脂形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。通常，含油微生物的细胞油脂含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，第57卷，第419-425页(1991))。含油微生物积累油脂超过它们的细胞干重的约25％的情形是常见的。
术语“含油酵母”指那些能够产油并被归类为酵母的微生物。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。
术语“脂质”指任何脂溶性的(即，亲脂的)、天然存在的分子。脂质是具有多种关键生物学功能的化合物的各种不同基团，所述功能例如细胞膜的结构组分、能量贮存来源和信号途径的中间体。可以将脂质广泛定义为疏水性或两亲性小分子，它们完全地或部分地起源于酮脂酰或异戊二烯基团。National Institute of General Medical Sciences(Bethesda，MD)提供了脂质的综述，它基于脂类代谢途径研究计划(LIPID MAPS)分类体系。
术语“油”是指在25℃时为液体且通常为多不饱和的脂类物质。在含油生物中，油脂构成了总脂质的主要部分。“油脂”主要由三酰基甘油[“TAG”]组成，但还可包含其他中性脂质、磷脂和游离脂肪酸。油脂中的脂肪酸组成和总脂质的脂肪酸组成一般是相似的；因此，总脂质中的PUFA浓度的升高或降低将对应于油脂中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。
术语“三酰基甘油”[“TAG”]是指由三个脂肪酰残基酯化一个甘油分子组成的中性脂质。TAG能够包含长链PUFA和饱和脂肪酸，以及较短链的饱和的和不饱和的脂肪酸。
术语“脂肪酸”是指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为从约C12至C22，尽管更长和更短链长的酸均是已知的。主要的链长介于C16和C22之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”[“PUFA”]、以及“ω-6脂肪酸”[“ω-6”或“n-6”]与“ω-3脂肪酸”[“ω-3”或“n-3”]之间的区别的附加详细信息在美国专利7,238,482中提供，该专利以引用方式并入本文。
表2中提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始，为此ω碳的编号为1。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的通用名、在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。
表2：多不饱和脂肪酸及前体的命名法
虽然使用本文所述方法，表2列出的ω-3/ω-6PUFA最可能在含油酵母的油级分中积聚，但是该列表不应理解为限制性的或完全的。
术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成例如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和例如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献中详细描述了该过程。参见例如国际专利申请公布WO2006/052870。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使延长的分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性延伸酶和去饱和酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”是指与PUFA生物合成相关联的任何以下酶(以及编码它们的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
术语“去饱和酶”指能够通过从邻接碳原子中的其中一个上移除氢原子、并且从而在碳原子之间导入双键来去饱和脂肪酸中的邻接碳原子的多肽。去饱和产生了脂肪酸或所关注前体。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文特别关注的是：Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ4去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ15去饱和酶和Δ9去饱和酶。在本领域中，基于将ω-6脂肪酸转化为其ω-3对应物(如分别将LA转化为ALA，以及将ARA转化为EPA)的能力，Δ15和Δ17去饱和酶有时也称为“omega-3去饱和酶”、“ω-3去饱和酶”、和/或“ω-3去饱和酶”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布的作用，从而经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。
术语“延伸酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如美国专利申请公布2005/0132442和国际专利申请公布WO 2005/047480中所述。延伸酶系统催化的反应的实例为将GLA转化为DGLA，将STA转化为ETA，以及将EPA转化为DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如，C14/16延伸酶将利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16/18延伸酶将利用C16底物(如棕榈酸)，C18/20延伸酶将利用C18底物(如GLA、STA、LA、ALA)，并且C20/22延伸酶[也称为Δ5延伸酶]将利用C20底物(如ARA、EPA)。出于本文的目的，可确定两种不同类型的C18/20延伸酶：Δ6延伸酶将催化GLA和STA分别向DGLA和ETA的转化，而Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别向EDA和ETrA的转化。
重要的是，须注意一些延伸酶具有广泛的特异性并且因此单个酶可能能够催化几种延伸酶反应。例如单个酶可因此同时作为C16/18延伸酶和C18/20延伸酶。可能理想的是，通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布特征的作用，从而经验性地测定脂肪酸延伸酶的特异性。
术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下式测量：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括来源于其的途径中的中间产物和所有产物。
术语“过氧化物酶体生物发生因子蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”和“Pex蛋白”是可互换的，并且是指参与过氧化物酶体生物发生的蛋白质和/或参与细胞蛋白借助ATP水解穿越过氧化物酶体膜向内运输的过程的蛋白质。编码任何这些蛋白质的基因的缩写为“Pex基因”。Pex基因的命名法系统在Distel等人，J.Cell Biol.，第135卷，第1-3页(1996)中有所描述。迄今已经在多种真核生物中鉴定了至少32个不同的Pex基因。已经从对突变体的分析中分离了多种Pex基因，所述突变体显示具有异常的过氧化物酶体功能或结构。根据Kiel，J.A.K.W.等人的综述(Traffic，第7卷，第1291-1303页(2006))，其中对17个不同真菌菌种中的基因组序列进行了计算机模拟信息学分析(in silico analysis)，鉴定了以下Pex蛋白：Pex1p、Pex2p、Pex3p、Pex3Bp、Pex4p、Pex5p、Pex5Bp、Pex5Cp、Pex5/20p、Pex6p、Pex7p、Pex8p、Pex10p、Pex12p、Pex13p、Pex14p、Pex15p、Pex16p、Pex17p、Pex14/17p、Pex18p、Pex19p、Pex20p、Pex21p、Pex21Bp、Pex22p、Pex22p样和Pex26p。因此，本文将这些蛋白中的每一个称为“Pex蛋白”、“过氧化物酶体蛋白”或“过氧化物酶体生物发生因子蛋白”，并且每个蛋白由至少一个“Pex基因”编码。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“分离的核酸片段”本文可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序列等的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一个或多个片段构成。核苷酸(通常以它们的5’-单磷酸形式存在)通过单字母命名指代如下：“A”指腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别用于RNA或DNA)，“C”指胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”指鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”指尿苷酸，“T”指脱氧胸苷酸，“R”指嘌呤(A或G)，“Y”指嘧啶(C或T)，“K”指G或T，“H”指A或C或T，“I”指肌苷，“N”指任何核苷酸。
当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并例示于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.“Molecular  Cloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)中，该文献尤其是第11章和表11.1以引用方式并入本文。温度和离子强度条件决定杂交的“严格度”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤可确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2XSSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1XSSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
杂交需要两种核酸包含互补序列，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸杂交体的热解链温度[“Tm”或“Tm”]值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。
氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包含的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以通过推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过对所述序列的人工评估进行，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多邻接氨基酸或者三十个或更多核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如微生物菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12至15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，基于本文所述的方法，用于本领域技术人员已知的目的。
术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
术语“同源性”或“同源”可互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指核酸片段的修饰，例如缺失或插入一个或多个核苷酸，相对于初始的未经修饰的核酸片段，所述修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。
此外，技术人员认识到，同源核酸序列也由它们在中等严格条件(如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与其功能相当的序列的能力所限定。可调节严格条件以筛选中度相似的片段。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少两倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的序列通常彼此具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多并包括100％的序列同一性(即完全互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针将会选择性杂交至其靶序列的条件。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。作为另一种选择，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度少于约1000个核苷酸，任选长度少于500个核苷酸。
通常，严格条件将是如下那些条件：在pH 7.0至8.3下盐浓度低于约1.5M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃，而对于长的探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60℃。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。示例性的低严格条件包括在37℃下于含有30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，以及在50至55℃下用1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)洗涤。示例性的中等严格条件包括在37℃下于40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55至60℃下用0.5X至1X SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃下于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60至65℃下用0.1X SSC洗涤。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。
特异性通常取决于杂交后洗涤，最终洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。就DNA-DNA杂交体而言，热解链温度Tm可以用Meinkoth等人，Anal.Biochem.，第138卷，第267-284页(1984)中的方程式估算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是以碱基对表示的杂交体的长度。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。每出现1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm杂交和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，极严格条件可采用在比Tm低1、2、3或4℃的温度下杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比Tm低6、7、8、9或10℃的温度下杂交和/或洗涤；并且，低严格条件可采用在比Tm低11、12、13、14、15或20℃的温度下杂交和/或洗涤；利用所述方程式、杂交和洗涤组合物以及所期望的Tm，本领域的普通技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经在本质上进行了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度以便能使用更高的温度。对核酸杂交的详尽指导可在见于下列文献：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocolsin Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York(1995)。杂交和/或洗涤条件可进行至少10、30、60、90、120或240分钟。
术语“同一性百分比”指两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，它通过序列比较进行测定。“同一性百分比”也指多肽或多核苷酸序列间的序列关联程度，看情况通过比较序列间的匹配百分比进行测定。可通过已知方法容易地计算“同一性百分比”和“相似性百分比”，包括但不限于在以下文献中描述的那些方法：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，OxfordUniversity：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome  Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic：NY(1993)；3)Computer  Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humania：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinje，G.，Ed.)Academic(1987)；以及5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)，Stockton：NY(1991)。
设定确定同一性百分比的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。用于测定同一性百分比和相似性百分比的方法在公开可获得的计算机程序中进行编辑。序列比对和百分比同一性可使用LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlignTM程序进行计算。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”(描述于Higgins和Sharp，CABIOS，第5卷，第151-153页(1989)；Higgins，D.G.等人(Comput.Appl.Biosci.，第8卷，第189-191页(1992))并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlignTM(8.0.2版)程序中。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。
就多重比对而言，使用Clustal V比对方法，预设值对应于空位罚分＝10以及空位长度罚分＝10。使用Clustal V方法进行的成对比对和蛋白序列同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALS SAVED＝5。就核酸而言，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4，DIAGONALS SAVED＝4。使用Clustal W比对方法进行多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，Delay Divergent Seqs(％)＝30，DNA转移权重＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet Series，DNA权重矩阵＝IUB。
“BLASTN比对方法”是由美国国立生物技术信息中心[“NCBI”]提供的算法，采用默认参数比较核苷酸序列，而“BLASTP比对方法”是由NCBI提供的算法，采用默认参数比较蛋白质序列。
本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的核酸片段，即编码在本文所述方法和宿主细胞中的多肽的分离多核苷酸，编码至少约70-85％相同的多肽，而较优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列至少约85-95％相同的氨基酸序列。虽然上文描述了优选的范围，同一性百分比的可用实例包括50％至100％之间的任何整数百分比，例如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。该分离核苷酸片段的任何全长或部分互补的序列也是有用的。
合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员将充分意识到：特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。
“合成基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位装配而成。将这些寡核苷酸基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如，在美国专利7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用谱。
“基因”指能够表达特定蛋白的核酸片段，并且其可单独指编码区或可包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指非天然基因的任何基因，包含非天然一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“经密码子最优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。
“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、增强子、静默子、5’非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译启动密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“3′非编码序列”和“转录终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录所产生的产物。当RNA转录物与DNA序列拷贝完全互补时，它指初级转录物，或者它可为来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，并且将其称为成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子的RNA，它可以由细胞翻译成蛋白质。“cDNA”指与mRNA互补并来源于其的双链DNA。“有义”RNA指RNA转录物，它包括mRNA并能被细胞翻译成蛋白。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补的RNA转录物，并且它阻止靶基因的表达(美国专利5,107,065；国际专利申请公布WO 99/28508)。
术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它可操作地连接编码序列。即，编码序列处于启动子的转录控制下。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。
术语“重组”是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段而实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。
如本文所用，术语“表达”指源于核酸片段的正义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。因此，如本文所用，术语“表达”也指产生功能性终产物(例如mRNA或蛋白[前体或成熟体])。
“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因的”、“重组的”、“转化的”或“转化体”生物。
术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。
术语“表达盒”是指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的DNA片段。一般来讲，表达盒将包含所选基因的编码序列和所选基因产物的表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由下列组成：1)启动子序列；2)编码序列，即开放阅读框[“ORF”]；和3)3′非翻译区，即终止子，所述非翻译区在真核生物中通常包含多聚腺苷酸化位点。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。
术语“重组构建体”、“表达构建体”和“构建体”本文可互换使用。重组构建体包括核酸片段的人工组合，例如天然条件下不一起存在的调控序列和编码序列。例如重组构造可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可独自使用或与载体组合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员熟知的将要用于转化宿主细胞的方法。例如可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、筛选和繁殖包含本文所述的任何分离的核酸片段的宿主细胞，必须存在于载体上的遗传因子。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBOJ.，第4卷，第2411-2418页(1985)；DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics，第218卷：第78-86页(1989))，因此，必须筛选多次事件以获得显示期望表达水平和模式的品系。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1)GCG程序软件包(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，第215卷：第403-410页(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议日期1992年，111-20。编辑：Suhai、Sandor。Plenum：New York，NY)。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。
本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.Experiments with Gene  Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular  Biology，由Greene Publishing Assoc.和Wilev-Interscience，Hoboken，NJ(1987)出版。
编码丙二酰-CoA合成酶的基因存在于多种生物体中，例如根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、固氮根瘤菌属(Azorhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、硝化杆菌属(Nitrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、寡养菌属(Oligotropha)、甲基杆菌属(Methylobacterium)和黄色杆菌属(Xanthobacter)。参见，例如实施例1、表3中对应的SEQ ID NO：8-22提供的那些。丙二酰-CoA合成酶的主要作用为将底物丙二酸和CoA转化成丙二酰-CoA，进而丙二酰-CoA可用于生成脂肪酸。
已经开展很多表征丙二酰-CoA合成酶的研究。例如，通过NMR光谱学、定点诱变和比较建模方法确定的三叶草根瘤菌丙二酰-CoA合成酶的活性位点和底物结合，揭示了涉及折叠蛋白质结构的细节，并且基于其在生成反应中间体丙二酰-AMP中的作用，提供了支持第206位组氨酸残基(His206)对酶功能的重要性的证据(Jung，J.W.等人，Protein Sci.，第9卷，第1294-1303页(2000))。酶具有若干个AMP结合基序，如Jung等人所著文章的图3A中突出显示的。关于慢生大豆根瘤菌USDA 110丙二酰-CoA合成酶的类似分析已由Koo，H.M.和Y.S.Kim开展(Arch.Biochem.Biophys.，第378卷第1期，第167-174页(2000))。
表3中的丙二酰-CoA合成酶序列、或它们的部分可用于在相同或其他物种中使用序列分析软件搜索丙二酰-CoA合成酶同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。使用软件算法，如具有低复杂度滤波器和以下参数的BLASTP比对方法：期望值＝10，矩阵＝Blosum 62(Altschul等人，Nucleic Acids Res.，第25卷，第3389-3402页(1997))，该方法是用于将表3中的任何丙二酰-CoA合成酶蛋白对核酸或蛋白序列数据库进行比较并从而鉴定在优选生物中的相似已知序列的熟知方法。
使用软件算法搜索已知序列的数据库尤其适于与公开可获得的丙二酰-CoA合成酶序列(例如表3中描述的那些)相比具有相对较低同一性百分比的同源物的分离。可以预见与公开可获得的丙二酰-CoA合成酶序列相比具有至少约70％-85％同一性的丙二酰-CoA合成酶同源物的分离相对容易。此外，那些至少约85％-90％相同的序列将尤其适于分离，那些至少约90％-95％相同的序列将最容易分离。
一些丙二酰-CoA合成酶同源物也可使用丙二酰-CoA合成酶特有的基序分离。例如，熟知的是，丙二酰-CoA合成酶都具有AMP结合基序。该“保守结构域”区域对应于一组在特定位点高度保守的氨基酸，并且可能代表对蛋白结构、稳定性或活性来说必需的丙二酰-CoA合成酶蛋白区域。基序通过它们在蛋白同源物家族的比对序列中的高度保守性进行鉴定。作为独有的“标记”，它们能决定具有新测定序列的蛋白是否属于以前鉴定过的蛋白家族。这些基序用作快速鉴定新型丙二酰-CoA合成酶基因的诊断工具。
作为另外一种选择，公开可获得的丙二酰-CoA合成酶序列或它们的基序可以是用于鉴定同源物的杂交试剂。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有所关注基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是可杂交的。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基没有与正确的互补碱基配对。
杂交方法是已知的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在正确浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交均会发生。混合物中的探针或靶标的浓度决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂，如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾或三氟乙酸铯。如果需要，能将甲酰胺加入杂交混合物，通常为30-50％(v/v)[“按体积计”]。
可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5％至2％wt/vol[“重量体积比”]的甘氨酸。可以包含其他添加剂，例如包括极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。
核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。
本文所述或公开文献中的任何丙二酰-CoA合成酶核酸片段，或任何鉴定的同源物，可用于从相同或其他物种中分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法例如核酸扩增技术的各种应用，例如，聚合酶链反应[“PCR”](美国专利4,683,202)；连接酶链反应[“LCR”](Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第82卷，第1074页(1985))；或链置换扩增[“SDA”](Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第89卷，第392页(1992))；和3)文库构建和互补筛选方法。
例如，编码蛋白或多肽的基因类似于公开可获得的丙二酰-CoA合成酶基因或它们的基序，可使用所有或部分那些公开可获得的核酸片段作为DNA杂交探针，以使用熟知的方法筛选来自任何期望的生物的文库而直接分离该基因。基于公开可获得核酸序列的特异性，寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计并合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。此外，能设计特异性引物并用于扩增部分或全长公开可获得的序列或它们的基序。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。
通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotides as specific hybridization probesin the Diagnosis of Genetic Disorders”，Human Genetic Diseases：APractical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)第33-50页，IRL：Herndon，VA；Rychlik，W.，Methods in Molecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)第15卷，第31-39页，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。
通常，可以将可获得的丙二酰-CoA合成酶序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。也可以对克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一个引物的序列来源于可获得的核酸片段或它们的基序。其他引物序列利用mRNA前体编码基因3′末端存在的多腺苷酸片。
第二个引物序列也可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第85卷，第8998页(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可以从能利用可获得的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(例如BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第86卷，第5673页(1989)；Loh等人，Science，第243卷，第217页(1989))。
基于所讨论的熟知方法中的任何一种，在选择的任何优选生物中鉴定和/或分离丙二酰-CoA合成酶基因同源物将是可能的。任何推定丙二酰-CoA合成酶基因的活性可易于通过标准生物化学检测分析法确定(如参见Kim，Y.S.和S.K.Bang.Anal Biochem.，第170卷第1期，第45-49页(1988))。
乙酰-CoA为脂肪酸从头生物合成的主要基本单位。虽然可有效代谢成乙酰-CoA的任何化合物都可作为脂肪酸的前体，但通常葡萄糖为主要碳源。葡萄糖通过糖酵解转化为丙酮酸，然后丙酮酸转运至线粒体中被丙酮酸脱氢酶转化为乙酰-CoA。由于乙酰-CoA不能直接跨越线粒体膜转运至细胞质，乙酰-CoA的两个碳与草酰乙酸缩合生成柠檬酸(由柠檬酸合成酶催化)。柠檬酸可直接转运至细胞质，在细胞质中被ATP-柠檬酸裂解酶裂解，重新生成乙酰-CoA和草酰乙酸。草酰乙酸通过转化为苹果酸再进入三羧酸循环。
丙二酰-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一关键步骤，在细胞质中进行。丙二酰-CoA通过乙酰-CoA羧化酶[“ACC”；EC 6.4.1.2]催化的乙酰-CoA羧化反应而生成。脂肪酸合成由脂肪酸合酶多酶复合体[“FAS”；EC 2.3.1.85]催化，并且通过八个二碳片段(乙酰-CoA的乙酰基)的缩合进行，形成16-碳饱和脂肪酸棕榈酸。更具体地讲，FAS催化一系列的7个反应，如下文所概述(Smith，S.，FASEB J.，第8卷第15期，第1248-1259页(1994))。首先，乙酰-CoA和丙二酰-CoA转移至FAS的酰基载体多肽[“ACP”]。然后乙酰基转移至丙二酰基，形成β-酮丁酰-ACP并且释放CO2。然后，β-酮丁酰-ACP经过还原反应(通过β-酮脂酰还原酶)和脱水作用(通过β-羟酰脱水酶)形成反式-单不饱和脂肪酰基。双键被NADPH还原，生成比最初多两个碳的饱和脂肪酰基。然后丁酰基与新的丙二酰基缩合并且重复延伸过程的能力得到再生。当脂肪酰基的长度达到16个碳时，脂肪酰基被硫酯酶活性水解，释放出游离的棕榈酸。
脂肪酸合成可用下面的反应式概括(忽略H+和水)：乙酰-CoA+7丙二酰-CoA+14NADPH→棕榈酸+7CO2+14NADP++8CoA。
棕榈酸的进一步延伸和氧化可在线粒体或内质网中进行。棕榈酸(16:0)和C2延伸形式硬脂酸(18:0)可以是不饱和至它们相应的单不饱和形式，即棕榈油酸(16:1)和油酸(18:1)。该过程在内质网膜上进行催化，并且为磷脂生物合成提供脂肪酸。棕榈酸可转运回线粒体基质或过氧化物酶体基质用于氧化反应。
三酰基甘油[“TAG”](脂肪酸的初级贮藏单位)通过一系列反应形成，这些反应涉及：1)通过酰基转移酶将一分子酰基-CoA酯化成甘油-3-磷酸以生成溶血磷脂酸；2)通过酰基转移酶将第二分子酰基-CoA酯化以生成1，2-二酰基磷酸甘油(通常鉴定为磷脂酸)；3)通过磷脂酸磷酸酶移除磷酸以生成1，2-二酰基甘油[“DAG”]；并且，4)通过酰基转移酶的作用增加第三个脂肪酸以形成TAG。
广谱的脂肪酸可被整合进TAG中，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。一些能通过酰基转移酶被引入TAG的脂肪酸的非限制性实例包括：癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、异油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、桐油酸(18:3)、γ-亚麻酸(18:3)、α-亚麻酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十碳二烯酸(20:2)、二高-γ-亚麻酸(20:3)、二十碳三烯酸(20:3)、花生四烯酸(20:4)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)、二十四烷酸(24:0)、神经酸(24:1)、蜡酸(26:0)和褐煤酸(28:0)脂肪酸。
本文描述了操纵转基因生物中丙二酸含量的方法，其中所述丙二酸包括丙二酸的电离形式及其酯和盐。该方法包括：
a)提供转基因生物，该生物用于至少一种产物的发酵，其中转基因生物包含至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因，该基因受到合适调控序列的调控；以及，
b)培养所述生物以允许所述至少一种编码丙二酰-CoA合成酶基因的表达，使得所述转基因生物产生的发酵副产物丙二酸的量与转基因或非转基因的相同生物产生的丙二酸的量相比减少前提条件是所述相同生物：
(i)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
(ii)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
在一些实施方案中，至少一个编码丙二酰-CoA合成酶的基因按照选自下列的氨基酸序列编码：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22。例如，SEQ ID NO：2的丙二酰-CoA合成酶可由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码。
优选地，至少一个编码丙二酰-CoA合成酶的序列受到至少一个强启动子的调控，并且本领域技术人员将会知道基因的表达量也可通过多拷贝表达而增加。
本文还描述了包含至少一种丙二酰-CoA合成酶蛋白的转基因生物，该蛋白可通过上文所述方法生成。更具体地讲，本说明书描述用于至少一种产物发酵的转基因生物，该生物包含至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因，该基因受到至少一种调控序列的调控；其中转基因生物产生的发酵副产物丙二酸的量与转基因或非转基因的相同生物产生的丙二酸的量相比减少，前提条件是所述相同生物：
a)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
b)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
优选地，转基因生物选自藻类、真菌、类眼虫、酵母、细菌和原生藻菌。更优选的是那些被归类为含油生物的生物，使得它们积聚占其细胞干重至少约25％的油。例如，优选的含油酵母包括来自耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属的那些。
“至少一种产物”是指在发酵作用下通过生物催化生成的任何主要受关注产物。产物可以是生物天然生成化合物，或者可以通过遗传工程操作将非天然基因导入微生物，以使这些基因在发酵期间进行功能性表达，从而获得生物非天然产生的产物。要注意的是，异源丙二酰-CoA合成酶的表达对至少一种产物的容积产量或最终滴定浓度基本无负面影响(当与相同生物中的产量比较时，无论该生物是转基因的还是非转基因的，前提条件是该生物(i)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或，(ii)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因)。
在一些实施方案中，转基因生物包含至少一种丙二酰-CoA合成酶，还包含至少一个基因突变。例如，申请人观察到解脂耶氏酵母菌株至少一种天然过氧化物酶体生物发生因子蛋白[“PEX”]被破坏有助于使多不饱和脂肪酸[“PUFA”]在总脂质级分和油级分中的产量增加，同时使副产物丙二酸产量增加。包含PEX缺陷的几个解脂耶氏酵母菌株的构建如美国专利申请12/244950中所述[E.I.du Pont deNemours & Co.。Inc.代理人档案号CL3847]；优选的缺陷存在于以下任意Pex基因中：YlPex1p(GenBank登录号CAG82178)、YlPex2p(GenBank登录号CAG77647)、YlPex3p(GenBank登录号CAG78565)、YlPex3Bp(GenBank登录号CAG83356)、YlPex4p(GenBank登录号CAG79130)、YlPex5p(GenBank登录号CAG78803)、YlPex6p(GenBank登录号CAG82306)、YlPex7p(GenBank登录号CAG78389)、YlPex8p(GenBank登录号CAG80447)、YlPex12p(GenBank登录号CAG81532)、YlPex13p(GenBank登录号CAG81789)、YlPex14p(GenBank登录号CAG79323)、YlPex16p(GenBank登录号CAG79622)、YlPex17p(GenBank登录号CAG84025)、YlPex19p(GenBank登录号AAK84827)、YlPex20p(GenBank登录号CAG79226)、YlPex22p(GenBank登录号CAG77876)和YlPex26p(GenBank登录号NC_006072，核苷酸117230-118387的反义翻译)。如实施例所述，通过异源丙二酰-CoA合成酶的表达大幅减少了这些Pex缺陷型耶氏酵母菌株中增加的丙二酸副产物，而对PUFA的产量无负面影响。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，描述了转基因耶氏酵母种宿主细胞，该宿主细胞包含：
a)至少一种基因突变，其中该突变为至少一种天然过氧化物酶体生物发生因子蛋白中的破坏；以及，
b)至少一种编码丙二酰-CoA合成酶的基因，该基因受到至少一种调控序列的调控；以及，
c)编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因。
本领域技术人员将能够鉴定转基因生物中的其他基因突变，该突变可导致在至少一种产物的发酵期间产生不可接受量的丙二酸。与转基因或非转基因的相同生物产生的丙二酸的量相比，在至少一种调控序列的调控下至少一种丙二酰-CoA合成酶基因的表达将使转基因生物产生的发酵副产物丙二酸的量减少，前提条件是所述生物：(i)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或，(ii)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
有必要构建包含编码丙二酰-CoA合成酶的开放阅读框[“ORF”]的重组构建体并将其导入用于发酵的生物体内。本领域的技术人员知道标准的来源材料，所述材料描述：1)用于构建、操作和分离高分子，例如DNA分子、质粒等的具体条件和规程；2)重组DNA片段和重组表达构建体的产生；和3)克隆的筛选和分离。参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)；Maliga等人，Methods in Plant Molecular Biology，Cold Spring Harbor，NY(1995)；Birren等人，Genome Analysis：Detecting Genes，v.1，Cold`SpringHarbor，NY(1998)；Birren等人，Genome Analysis：Analyzing DNA，v.2，Cold Spring Harbor：NY(1998)；Plant Molecular Biology：A  Laboratory Manual，Clark编辑，Springer：NY(1997)。
一般来讲，存在于构建体中的序列的具体选择取决于期望的表达产物、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。技术人员知道必须存在于质粒载体上以成功地转化、选择并增殖包含嵌合基因的宿主细胞的遗传因子。然而，通常载体或盒含有引导相关基因的转录和翻译的序列、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括控制转录起始的基因5′区(即启动子)和控制转录终止的DNA片段3′区(即终止子)。最优选两个控制区都来源于来自转化宿主细胞的基因。
用于驱动在期望宿主细胞中的异源基因或部分异源基因表达的启动控制区或启动子有多种，并且为人们所熟知。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3’UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的长度和特异性可以不同。实际上能够引导这些基因在所选宿主细胞中的表达的任何启动子(即，天然的、合成的、或嵌合的启动子)都是适用的。在宿主细胞中的表达能够以诱导型或组成型的方式发生。诱导型表达通过诱导可操作地连接至所关注丙二酰-CoA合成酶基因的可调控启动子的活性发生。组成型表达通过利用可操作地连接至所关注基因的组成型启动子发生。
当宿主细胞是例如酵母时，提供了酵母细胞中的功能性转录和翻译区域，尤其是从宿主菌种提供。参见对应于针对用于解脂耶氏酵母中的优选的转录起始调节区的国际专利申请公布WO 2006/052870。可以使用许多调控序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等。
必须在重组构建体中提供编码转录终止信号的3′非编码序列，即，“终止区”，该序列可以来自从中获取初始区的基因或不同基因的3′区域。大量的终止区是已知的并且当用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时，其在多种宿主中发挥的功能令人满意。选择终止区更多的是从方便的角度出发而不是为了任何特性。终止区也可以源于优选宿主的多种天然基因。
尤其有用的酵母终止区是来源于酵母基因，尤其是糖酵母属、裂殖糖酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属或克鲁维酵母属的终止区。编码γ-干扰素和α-2干扰素的哺乳动物基因的3′区域也已知能在酵母中起作用。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止区可以是非必需的，但是是高度优选的。
载体除了上述调控元件之外还可包含选择性的和/或可评分的标记。优选地，标记基因是抗生素抗性基因，使得用抗生素处理细胞引起未转化细胞的生长抑制或死亡，但不抑制转化细胞的生长。为了选择酵母转化体，可使用在酵母中发挥功能的任何标记，使之具有对卡那霉素、潮霉素、和氨基配醣物G418的抗性并能够在缺乏尿嘧啶、赖氨酸、组氨酸、或亮氨酸的培养基上生长的标记是尤其有用的。
仅仅将基因插入克隆载体不确保它能以期望的速率、浓度、量等表达。根据对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从宿主细胞分泌的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。一些操纵特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质，所克隆基因的拷贝数目以及该基因是质粒携带的还是整合进了宿主细胞的基因组中，所合成的外来蛋白质的最终细胞定位，蛋白质在宿主生物内的翻译和正确折叠的效率，所克隆基因的mRNA和蛋白质在宿主细胞内的固有稳定性和所克隆基因中的密码子使用，以使得其频率与宿主细胞的优选密码子使用频率接近。这些性质每种均可被用于本文所述的方法和宿主细胞中，以进一步优化丙二酰-CoA合成酶基因的表达。
构建了包含至少一种含有启动子、丙二酰-CoA合成酶ORF和终止子的嵌合基因的重组构建体之后，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或者使其直接整合进宿主细胞的基因组。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。
当两个或更多个基因从独立的复制载体表达时，每个载体可具有不同的选择手段并且应当缺乏与其他构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因都以需要的水平表达从而提供所需产品的合成。
包含所关注基因的构建体可以通过任何标准技术导入到宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化(Methods in Enzymology，第194卷，第186-187页(1991)))、原生质体融合、基因枪轰击、电穿孔、显微注射、真空过滤或将所关注的基因引入宿主细胞中的任何其他方法。
为方便起见，已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。转化的宿主将具有至少一个表达构建体的拷贝，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该基因是整合进基因组内、被扩增还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。
转化宿主细胞能通过选择导入构建体上包含的标记进行鉴定。作为另外一种选择，分离的标记构建体可用期望的构建体进行共转化，该方法与多种将多个DNA分子导入宿主细胞的转化技术一样。
典型地，就转化的宿主在选择性培养基上生长的能力对它们进行选择，所述选择性培养基可掺入了抗生素或缺少未被转化的宿主生长所必需的因子，例如营养物质或生长因子。导入的标记基因可赋予抗生素抗性，或编码必需的生长因子或酶，从而当在转化宿主中表达时允许在选择培养基上生长。转化宿主的选择也能发生在表达标记蛋白能被直接地或间接地检测出来时。标记蛋白可单独表达或融合到另一种蛋白中进行表达。能对表达标记蛋白或标记物的细胞进行选择，例如通过视觉检测或通过例如使用抗体分选或批选荧光活化细胞的技术。
无论选择哪种宿主或表达构建体，必须筛选多个转化体以获取显示期望的表达水平、调节和模式的菌株或品系，因为不同的独立转化事件导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.，第4卷，第2411-2418页(1985)；DeAlmeida等人，Mol.Gen.Genetics，第218卷，第78-86页(1989))。此类筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，第98卷，第503页(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，第618卷第1-2期，第133-145页(1993))、蛋白质表达的Western分析和/或ELISA分析、发酵液的表型分析或离子色谱分析以检测有机酸含量的任何变化而实现。
如本公开的方法中所描述的那样，多种真核生物适于作为包含异源丙二酰-CoA合成酶的转基因生物。可在发酵罐中培养的多种真菌、藻类、卵菌、酵母、原生藻菌、细菌和/或类眼虫都可用作宿主。
在一些情况下，含油生物是优选的。含油生物能够天然合成和积聚油，通常积聚超过它们细胞干重约25％的油。将多种藻类、藓、真菌、酵母、原生藻菌和植物被天然地归类为含油生物。在替代实施方案中，能对非含油生物进行基因修饰，使之变成含油的，例如酵母如啤酒糖酵母。
更优选的含油微生物包括那些藻类、原生藻菌和真菌生物，它们天然生产ω-3/ω-6PUFA。例如，ARA、EPA和/或DHA经由小环藻属(Cyclotella sp.)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、腐霉属(Pythium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)和被孢霉属(Mortierella)生产。Mackenzie等人(Appl.Environ.Microbiol.，第66卷，第4655页(2000))描述了转化高山被孢霉的方法。类似地，用于转化破囊壶菌目微生物(如破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法在美国专利7,001,772中公开。
更优选的为含油酵母，包括天然产生和经遗传工程改造产生ω-3/ω-6PUFA的那些(见下文)。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyii)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candidarevkaufi)、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorulaglutinus)、牧草红酵母(R.graminis)、和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。
最优选的含油酵母为解脂耶氏酵母；并且，在另一个实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，第82卷，第1期，第43-49页(2002))。
关于解脂耶氏酵母转化的特定教导包括美国专利4,880,741和美国专利5,071,764以及Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，第48卷第2期，第232-235页(1997))，而合适的选择技术在美国专利7,238,482、美国专利7,259,255和国际专利申请公布WO2006/052870中有所描述。
在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合进宿主基因组中。当期望基因的高水平表达时，整合进基因组中的多个位置是特别有效的，例如整合进Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(GenBank登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登录号XP_503244或Aco3：GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(美国专利7,214,491)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)、Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)、SCP2基因座(GenBank登录号AJ431362)、Pex3基因座(GenBank登录号CAG78565)、Pex16基因座(GenBank登录号CAG79622)和/或Pex10基因座(GenBank登录号CAG81606)中。
用于解脂耶氏酵母中的优选的选择方法包括对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性，以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。5-氟乳清酸[5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物或“5-FOA”]也可用于选择酵母Ura-突变体。该化合物对具有编码乳清酸苷5′-单磷酸脱羧酶[OMP脱羧酶]的功能性URA3基因的酵母细胞有毒性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura-突变型酵母菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，“Yeast 2-HybridSystem”，Oxford University：New York，第7卷，第109-147页，1997；也可参见国际专利申请公布WO 2006/052870，用于5-FOA在耶氏酵母属中的应用)。
用于耶氏酵母的备选的优选选择方法依赖于用于解脂耶氏酵母的基于磺酰脲(氯嘧磺隆；E.I.DuPont de Nemours & Co.，Inc.，Wilmington，DE)抗性的显性非抗生素标记。更具体地讲，该标记基因是具有单个氨基酸改变(即W497L)的天然乙酰羟酸合酶(“AHAS”或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，从而赋予了磺酰脲除草剂抗性(国际专利申请公布WO 2006/052870)。AHAS是用于生物合成支链氨基酸(即缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的途径中的第一常用酶，并且它是磺酰脲和咪唑啉酮除草剂的靶标。
转基因生物在优化至少一种产物生成，同时控制丙二酸生成的条件下生长。这将在发酵期间保持发酵废汽中最佳pH范围的同时，减少生物体内碳和能量的浪费以及需要中和的副产物有机酸的量。最理想的情况是，包含异源丙二酰-CoA合成酶的生物的发酵将降低至少一种产物的制造总成本。
通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物质生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法优化培养基条件。例如，通常使所关注的含油酵母，例如解脂耶氏酵母，在复合培养基，例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基[“YPD”]、最低限定培养基、或缺乏生长所必需的成分并强迫选择所需表达盒的最低限定培养基(如酵母氮源基础(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生长。
用于本文所述方法和转基因生物的发酵培养基必须包含合适的碳源，例如在美国专利7,238,482中提出的碳源。合适的碳源包括各种来源，其中糖(例如葡萄糖、果糖、甘油)和/或脂肪酸为优选的。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。
氮可以由无机源(如(NH4)2SO4)或有机源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合生物生长并促进至少一种产物产生的酶促途径的其他组分。
预期多种发酵过程设计(如分批、补料分批或连续)可用于至少一种产物的生成。分批发酵过程是密闭系统，其中培养基组成在过程开始时是固定的并且除了在过程中补加维持pH和氧含量所需的那些以外，不再补加其他添加物。因此，在培养过程开始时在培养基内接种所需的生物，并且在不向培养基中加入附加的原料(即碳源和氮源)的情况下使之进行生长或代谢活动。在分批过程中，系统中的代谢产物和生物质组成持续改变直至培养结束时。在典型的分批过程中，细胞生长从静态停滞期上升至高生长对数期，最终达到稳定期，此时生长速率减缓或停止。如果不加以处理，处于稳定期的细胞将最终死亡。
标准分批过程的变型是补料分批过程，其中在整个发酵过程的进程中碳源持续加入发酵罐中。补料分批过程也适用于本文。当分解代谢物阻遏易于抑制细胞代谢的时候或希望在任何时间点培养基中都具有有限量的碳源的情况下，补料分批过程是有效的。补料分批式系统中的碳源浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气(如CO2)的分压进行估算。分批培养和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock，Biotechnology：A Textbook of Industrial  Microbiology，第2版，(1989)Sinauer Associates：Sunderland，MA；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，第36卷，第227页(1992)。
作为另外一种选择，当将确定成分的培养基连续加入生物反应器，并同时移去等量培养物体积以用于产物回收时，将出现连续发酵过程。连续培养一般使细胞以恒定的细胞密度维持在对数生长期。连续或半连续培养方法允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或任何数目的因素。例如，一种方法可限制碳源并且允许所有其他参数缓和代谢。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长，且因此细胞生长速率必须针对由于培养基取出造成的细胞丧失进行平衡。对于连续培养过程调节营养物质和生长因子的方法以及用于使产物形成速率达到最大的技术，是工业微生物学领域众所周知的，并且各种方法由Brock，同上所详述。
优选实施方案的描述
其中油酸(18:1)转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊延伸酶和去饱和酶。然而，如在图3中看到的和如下所述的，通常存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。
具体地讲，图3描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一个ω-6脂肪酸)。然后使用“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”并用LA作为底物，如下形成长链ω-6脂肪酸：1)通过Δ6去饱和酶将LA转化成γ-亚麻酸[“GLA”]；2)通过C18/20延伸酶将GLA转化成二高γ-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；以及，5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。
作为另外一种选择，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”可使用α-亚麻酸[“ALA”]作为底物按照如下方式生产长链ω-3脂肪酸：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；2)通过Δ6去饱和酶将ALA转化成十八碳四烯酸[“STA”]；3)通过C18/20延伸酶将STA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；以及，6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化为二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸。例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。
ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途径利用Δ9延伸酶和Δ8去饱和酶，即“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”。更具体地讲，LA和ALA可通过Δ9延伸酶分别转化成EDA和ETrA。Δ8去饱和酶然后将EDA转化成DGLA和/或将ETrA转化成ETA。随后如上所述形成下游PUFA。
本文转基因生物优选地天然或经由基因工程技术具有生产PUFA的能力。虽然多种微生物能够在常见的细胞代谢过程中合成PUFA(包括ω-3/ω-6脂肪酸)，并且它们中的一些能进行商业培养，但是这些生物很少生产或不生产具有期望的油含量的油和用于药物、膳食替代品、医疗食品、营养补充剂、其他食物产品、工业油脂化学制品或其他终端产品中的组合物。因此，越来越着重于工程化微生物以生产“设计”的脂质和油的能力，其中脂肪酸含量和组成通过基因工程进行详细指定。在此基础上，期望宿主可能包含编码功能性PUFA生物合成途径的异源基因，但这是非必需的。
如果宿主生物不天然生产期望的PUFA或具有期望的脂质分布，本领域的技术人员熟悉将编码用于PUFA生物合成的合适酶的一个或多个表达盒导入所选的宿主生物所必需的构思和技术。文献为技术人员提供了多个教导，用于将此类表达盒导入多种宿主生物。将使用宿主生物解脂耶氏酵母的一些文献提供如下：美国专利7,238,482、美国专利7,465,564、美国专利7,550,286、美国专利7,588,931、美国专利申请公布2006-0115881-A1和美国专利申请公布2009-0093543-A1。该列表是非穷举的并且不应理解为限制性的。
简而言之，多种ω-3/ω-6PUFA产品能在它们转化成TAG之前被生产出来，这取决于脂肪酸底物和存在于或被转化到宿主细胞中的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的特定基因。同样地，期望的脂肪酸产品的生产可能直接发生或间接发生。当不经过任何中间步骤或中间途径将脂肪酸底物直接转化成期望的脂肪酸产品时，直接生产发生。当编码PUFA生物合成途径的多个基因可被组合使用，使得一系列反应发生以生产期望的PUFA时，间接生产发生。具体地讲，可期望用包含Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶、C18/20延伸酶、Δ5去饱和酶和Δ17去饱和酶的表达盒转化含油酵母以过剩生产EPA。参见美国专利7,238,482和国际专利申请公布WO 2006/052870。为本领域的技术人员熟知的是可将编码PUFA生物合成途径酶的基因的多种其他组合用于在含油生物中表达(参见图3)。包含于具体表达盒中的具体基因取决于宿主生物、它的PFUA分布和/或去饱和酶/延伸酶分布、底物的可利用性和期望的终产物。
许多候选基因具有期望的去饱和酶和/或延伸酶活性，它们能根据公开可获得的文献进行鉴定，如GenBank、专利文献、和对具有生产PUFA能力的生物进行的实验分析。可用的去饱和酶和延伸酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源如细菌、藻类、真菌、卵菌、酵母、植物、动物等、经由半合成途径产生或从头合成。鉴定这些候选基因后，选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑因素包括：1)多肽的底物特异性；2)是否多肽或其组分是限速酶；3)是否去饱和酶或延伸酶是合成期望PUFA必需的；4)多肽所需的辅因子；5)是否在多肽产生后对其进行修饰，例如通过激酶或异戊烯转移酶进行修饰；和/或，6)多肽在其生成后是否在细胞中合适的物理位置。
表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数。参见美国专利7,238,482。考虑每种特定的去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也可以是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞内所产生的未纯化的油的最终脂质分布通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当使期望的脂肪酸的生物合成最优化时，每种酶的转化效率也是要考虑的变量。
通常，在含油酵母细胞中积聚显著量的PUFA和TAG需要一个两阶段过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”(参见美国专利7,238,482)。在该方法中，发酵的第一阶段致力于生产并积聚细胞质，特征在于快速的细胞生长和细胞分裂。在发酵的第二阶段，优选的是在培养物中形成氮限制条件以促进脂质的高水平积聚。通常，碳/氮比例大于约40，优选地大于约50，并且更优选地大于约60。该氮限制的效果为减少AMP在细胞中的有效浓度，从而降低线粒体NAD依赖性异柠檬酸脱氢酶的活性。当这种情况发生时，柠檬酸将积聚，从而在细胞质中形成丰富的乙酰-CoA并引发脂肪酸合成。因此这一阶段特征在于细胞分裂的终止以及随后的脂肪酸合成和油积聚。
用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源基础(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其他确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，适于转基因生物生长的培养基对微生物学或发酵科学来说是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH 4.0至pH 8.0之间，其中优选将pH 5.5至pH 7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选微氧条件。
特别注意的是促进脂质和PUFA合成的几种金属离子，例如Fe+2、Cu+2、Mn+2、Co+2、Zn+2和Mg+2(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.SingleCell Oils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页(1992))。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能变型。
一般方法
实施例中使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述于：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)出版。
适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下述实施例的技术可在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或者Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)的描述中找到。除非另外指明，用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制性酶和材料得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCOLaboratories(Detroit，MI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。大肠杆菌(E.coli)菌株通常于37℃下在LuriaBertani(LB)平板上生长。
一般的分子克隆按照标准方法(Sambrook等人，同上)进行。使用载体和插入-特异性引物，利用末端标记技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)，在ABI自动测序仪上获得DNA序列。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。除非另外指明，使用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)比较本文的基因序列。缩写含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔每升，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对并且“kB”表示千碱基。
表达盒的命名：
表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。
解脂耶氏酵母的转化和培养
解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃下培育。
高葡萄糖培养基(HGM)(每升)：80g葡萄糖、2.58g KH2PO4和
5.36g K2HPO4，pH 7.5(不需要调节)。
发酵培养基(FM)(每升)：6.70g/L酵母氮源基础、6.00g KH2PO4、2.00g K2HPO4、1.50g MgSO4*7H2O、20g葡萄糖、和5.00g酵母提取物(BBL)。
解脂耶氏酵母的转化按照美国专利申请公布2009-0093543-A1所述进行，该专利以引用方式并入本文。
解脂耶氏酵母菌株Y4305U的分离
根据美国专利申请公布2008-0254191的一般方法所述构建菌株Y4305U，该菌株通过表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径而产生相对于总脂质一定量的EPA，该文献以引用方式并入本文。简而言之，如图4所示出，菌株Y4305U来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362，经由菌株Y2224(来源于野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因自主突变的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U1(Leu-和Ura-)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)、菌株Y4036U(Leu-和Ura-)、菌株Y4070(产生12％ARA，具有Ura-表型)、菌株Y4086(产生14％EPA)、菌株Y4086U1(Ura3-)、菌株Y4128(产生37％EPA；2007年8月23日保存于美国典型培养物保藏中心，命名为ATCC PTA-8614)、菌株Y4128U3(Ura-)、菌株Y4217(产生42％EPA)、菌株Y4217U2(Ura-)、菌株Y4259(产生46.5％EPA)、菌株Y4259U2(Ura-)和菌株Y4305(产生相对于总TFA 53.2％的EPA)而构建。
菌株Y4305的完全脂质分布如下：16:0(2.8％)、16:1(0.7％)、18:0(1.3％)、18:1(4.9％)、18:2(17.6％)、ALA(2.3％)、EDA(3.4％)、DGLA(2.0％)、ARA(0.6％)、ETA(1.7％)、和EPA(53.2％)。总脂质占细胞干重[“DCW”]的百分比为27.5％。
相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的菌株Y4305的最终基因型为SCP2-(YALI0E01298g)、YALI0C18711g-、Pex10-、YALI0F24167g-、未知1-、未知3-、未知8-、GPD::FmD12::Pex20、YAT1::FmD12::OCT、GPM/FBAIN::FmD12S::OCT、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12S::Lip2、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(3个拷贝)、GPAT::EgD9e::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBA::EgD9eS::Pex20、GPD::EgD9eS::Lip2、YAT1::EgD9eS::Lip2、YAT1::E389D9eS::OCT、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2个拷贝)、EXP1::EgD8M::Pex16、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、FBAIN::EgD5::Aco、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、EXP1::EgD5S::ACO、YAT1::RD5S::OCT、YAT1::PaD17S::Lip1、EXP1::PaD 17::Pex16、FBAINm::PaD17::Aco、YAT1::YlCPT1::ACO、GPD::YlCPT1::ACO  (其中FmD12为串珠镰孢菌(Fusariummoniliforme)Δ12去饱和酶基因[美国专利7,504,259]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰孢菌[美国专利7,504,259]；ME3S是经密码子优化的C16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)[美国专利7,470,532]；EgD9e是小眼虫(Euglena gracilis)Δ9延伸酶基因[国际专利申请公布WO2007/061742]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[国际专利申请公布WO 2007/061742]；E389D9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小型绿藻属(Eutreptiella sp.)CCMP389[国际专利申请公布WO 2007/061742]；EgD8M是合成突变型Δ8去饱和酶[国际专利申请公布WO 2008/073271]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫Δ5去饱和酶[美国专利申请公布2007-0292924]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫[美国专利申请公布2007-0292924]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属(Peridinium sp.)CCMP626[美国专利申请公布2007-0271632]；PaD17是瓜果腐霉菌(Pythiumaphanidermatum)Δ17去饱和酶[美国专利7,556,949]；PaD17S是经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[美国专利7,556,949]；以及，YlCPT1是解脂耶氏酵母二酰基甘油磷酸胆碱转移酶基因[国际专利申请公布WO 2006/052870])。
随后在菌株Y4305中将Ura3基因破坏(如美国专利申请公布2008-0254191的一般方法中所述)，使得Ura3突变基因整合进菌株Y4305的Ura3基因。在筛选转化体和分析FAME后，得出转化体#1、#6和#7在生长于MM+5-FOA平板上时，产生占总脂质37.6％、37.3％和36.5％的EPA。这三个菌株分别命名为菌株Y4305U1、Y4305U2和Y4305U3，并且共同鉴定为菌株Y4305U。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析
对于脂肪酸分析，通过离心收集细胞并如Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，第37卷，第911-917页(1959))所述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，第276卷，第1期，第38-46页(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。
为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获解脂耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5至10分钟。将甲醇钠(100μl，浓度为1％)加入样品中，然后将样品涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μl己烷后，涡旋并离心样品。移出上层并如上所述用GC进行分析。
实施例1
公开可获得的编码丙二酰-CoA合成酶的基因的鉴定
在三叶草根瘤菌中鉴定了编码丙二酰-CoA脱羧酶(MatA)、丙二酰-CoA合成酶(MatB)和推定二羧酸载体蛋白(MatC)的基因簇(An，J.H，& Y.S.Kim，Eur.J.Biochem.，第257卷，第395-402页(1998))。
使用编码三叶草根瘤菌丙二酰-CoA合成酶的蛋白质序列(GenBank登录号AF117694和AAC83455；SEQ ID NO：5)、美国国家生物技术信息中心[“NCBI”]的BLASTP 2.2.19(Basic LocalAlignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，Nucleic Acids Res.，第25卷，第3389-3402页(1997)；Altschul，S.F.等人，FEBS J.，第272卷，第5101-5109页(2005))进行搜索，以鉴定BLAST“nr”数据库(包括所有非冗余GenBank CDS区的翻译序列、蛋白质数据库[“PDB”]中的蛋白质序列数据库、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、蛋白质信息资源[“PIR”]中的蛋白质序列数据库和蛋白质研究基金[“PRF”]蛋白质序列数据库，不包括全基因组鸟枪法[“WGS”]计划的环境样品)中的相似序列。
概述该序列与SEQ ID NO：5的BLASTP比较结果具有最高的相似性，这根据同一性％、相似性％和预期值而被报道。将“同一性％”定义为两个蛋白间的相同氨基酸百分比。“相似性％”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。
已鉴定了大量与三叶草根瘤菌丙二酰-CoA合成酶(GenBank登录号AAC83455；SEQ ID NO：5)具有显著相似性的蛋白质。表3提供了期望值等于“0.0”的那些命中结果的部分摘要以及明确鉴定为“丙二酰-CoA合成酶”的蛋白质的注解，但这不应视为对本文公开内容的限制。表3中的蛋白质与SEQ ID NO：5具有介于64％至94％之间的同一性。
表3：一些公开可获得的编码丙二酰-CoA合成酶的基因
实施例2
在解脂耶氏酵母中的豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841密码子优化 丙二酰-CoA合成酶基因的合成
豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841的丙二酰-CoA合成酶基因的密码子使用经优化用于在解脂耶氏酵母中表达，方式类似于美国专利7,125,672中所述。
具体地讲，经密码子优化的丙二酰-CoA合成酶基因(命名为“MCS”，SEQ ID NO：3)基于豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841丙二酰-CoA合成酶基因(“rMCS”；SEQ ID NO：1和2，对应于GenBank登录号YP_766603)的编码序列，根据耶氏酵母属的密码子使用方式(美国专利7,125,672)、‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列、以及RNA稳定性的一般规则而设计(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，第265卷第1-2期，第11-23页(2001))。除了修饰翻译起始位点，还对1515bp编码区(包括终止密码子)中的233bp进行了修饰(15.4％；图1)并且优化了219个密码子(43.4％)。GC含量从野生型基因(即rMCS)中的61.4％减少到合成基因(即MCS)中的55.6％。由于耶氏酵母属不能使用‘GTG’密码子进行翻译起始，所以将翻译起始密码子‘ATG’加在rMCS基因(SEQ ID NO：1)的前面。分别将NcoI位点和NotI位点整合到MCS的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。经密码子优化的MCS基因(SEQ ID NO：3)为1518bp，编码505个氨基酸的多肽和终止密码子(SEQ ID NO：4)。设计的MCS基因由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并且克隆至pUC57(GenBank登录号Y14837)生成pMCS(SEQ IDNO：6)。
实施例3
包含合成丙二酰-CoA合成酶的构建体pZP2-MCS的建立
构建质粒pZP2-MCS(图2)，使合成的、密码子优化的来自豌豆根瘤菌蚕豆生物变种3841的丙二酰-CoA合成酶基因(实施例2)能够在含油酵母解脂耶氏酵母中表达。pZP2-MCS质粒包含下面表4中列出的组分。
表4：质粒pZP2-MCS(SEQ ID NO：7)的描述
实施例4
在解脂耶氏酵母菌株Y4305U中丙二酰-CoA合成酶基因的表达 对丙二酸的影响
将质粒pZP2-MCS用SphI和AscI消化。包含MCS基因并受FBAIN启动子调控的6.4kB线性片段，以及两侧具有解脂耶氏酵母POX2基因的5′和3′区域的解脂耶氏酵母URA3基因通过琼脂糖凝胶电泳分离，并且用Qiagen凝胶纯化试剂盒根据制造商规程纯化。纯化的DNA片段用于使用标准转化规程转化Y4305、Y4305U的Ura3-菌株(一般方法)。
检测三个Ura+转化体的脂质含量、脂肪酸分布和丙二酸产量；也用类似方法分析作为对照的菌株Y4305。简而言之，将细胞用125mL烧瓶在25mL FM培养基中培养48小时。将每种培养物(5mL)离心以收集细胞。将来自每种培养物的细胞重悬于25mL HGM培养基中，并且允许在30℃和250rpm下再生长5天。如一般方法中所述测定脂肪酸分布和总脂质含量。
为了用离子色谱法分析在培养上清液中的丙二酸浓度，将样品按下面方法制备。将1mL培养基样品13,000rpm离心10分钟。收集上清液。然后将上清液(0.5mL)移入PALL nanosep MF 0.2μm(PALLCorporation，East Hills，NY；目录号P/N ODM02C35)离心管中，并且将离心管置于微量离心机中以13,000rpm离心15分钟。然后将滤液用纳米纯水稀释，以获得介于0.001g/L至0.250g/L之间的浓度。用于分析的分析样品瓶为Agilent Technologies(Palo Alto，CA)螺旋盖样品瓶(目录号P/N 5182-0715)。
用Dionex DX600离子色谱系统和ThermoFinnigan MSQ质谱仪测定丙二酸的浓度。由Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)提供的系统的细部如下：IonPac AG11-HC 2×50mm保护柱，目录号P/N 052963；IonPac AS11-HC 2×250mm分析柱，目录号P/N 052961；ASRS Ultra-II2mm自生式抑制器，目录号P/N 061562；Chromeleon Control软件，6.80版。该方法使用两个串联的检测器对所关注化合物进行电导率和质谱分析。流动相(即KOH)的梯度浓度应用于整个分离多种有机酸的总运行时间内。梯度为通常64分钟内0.5mM至60mM KOH，以实现所有有机酸和无机阴离子的良好峰距和分辨率。电导率检测器基于由外标建立的标准校准曲线来定量测定化合物。质谱采用总离子流[“TIC”]和选择离子监测[“SIM”]模式来检测和鉴定每个化合物，并且在一些情况下，用来定量共洗脱的和不能由电导率分辨的化合物。
丙二酸在28.49分钟时洗脱。通过将峰面积与已知含量丙二酸标准品(Fluka，Aigma-Aldrich，Switzerland)的峰面积比较来进行定量。
每个菌株的总脂质(TFA％DCW)、EPA占TFA的百分比、和EPA占DCW的百分比，以及每种培养物中丙二酸的浓度在下面的表5中示出。表达经密码子优化的丙二酰-CoA合成酶的解脂耶氏酵母Y4305对照菌株和Y4305U菌株的平均脂肪酸组成和平均丙二酸浓度以粗体文本突出显示。
更具体地讲，术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中能通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是生物质或油。因此，总脂肪酸包括来自中性脂质级分(包括二酰基甘油、单酰基甘油和TAG)和来自极性脂质级分(包括磷脂酰胆碱和磷酸酰乙醇胺级分)的脂肪酸，但不包括游离脂肪酸。
虽然总脂质含量可近似以量度FAME的DCW百分比表示[“FAME％DCW”]，术语细胞“总脂质含量”是以细胞干重[“DCW”]百分比表示的TFA的量度。因此总脂质含量[“TFA％DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。
本文将总脂质中的脂肪酸浓度表示为TFA重量百分比[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非本文公开中另外具体声明，给定脂肪酸对总脂质的百分比等同于以％TFA表示的脂肪酸浓度(例如总脂质的％EPA等同于EPA％TFA)。
在一些情况下，将细胞中给定脂肪酸的含量表达为其占细胞干重的重量百分比[“％DCW”]是有用的。因此例如二十碳五烯酸％DCW将根据下式测定：[(二十碳五烯酸％TFA)*(TFA％DCW)]/100。细胞中给定脂肪酸的含量以其占细胞干重的重量百分比[“％DCW”]表示，然而它可被近似表示为：[(二十碳五烯酸％TFA)*(FAME％DCW)]/100。
表5：转化体解脂耶氏酵母菌株Y4305U中的丙二酸的浓度
如表5所示，与菌株Y4305重复培养物中的丙二酸水平相比，培养上清液中的pZP2-MCS转化体(鉴定为Y4305U-MCS-1、Y4305U-MCS-2和Y4305U-MCS-3)都显著地显示出低水平的丙二酸。脂肪酸分布和总脂质产量类似于对照Y4305细胞。丙二酰-CoA合成酶即SEQ ID NO：3的表达，使丙二酸(g/g DCW)总量降低约94％，而不影响脂肪酸分布或总脂质产量(以DCW的百分比表示)。

Claims (7)

1.用于至少一种多不饱和脂肪酸发酵的转基因解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica），所述解脂耶氏酵母包含SEQ ID NO:3所示的编码丙二酰-CoA合成酶的基因和编码功能性多不饱和脂肪酸生物合成途径的基因，所述编码丙二酰-CoA合成酶的基因受到至少一种调控序列的调控；其中所述转基因解脂耶氏酵母产生的多不饱和脂肪酸发酵副产物丙二酸的量与对照解脂耶氏酵母产生的丙二酸的量相比减少，所述对照解脂耶氏酵母除以下方面外与所述转基因解脂耶氏酵母是相同的：即，所述对照解脂耶氏酵母：
c)不包含编码丙二酰-CoA合成酶的基因；或者，
d)包含编码丙二酰-CoA合成酶但不表达的基因。
2.权利要求1的转基因解脂耶氏酵母，其中所述解脂耶氏酵母积聚占其细胞干重至少25%的量的油。
3.权利要求1的转基因解脂耶氏酵母，其中所述至少一种调控序列包括强启动子。
4.权利要求1或3的转基因解脂耶氏酵母，其中所述编码丙二酰-CoA合成酶的基因是多拷贝的。
5.权利要求1的转基因解脂耶氏酵母，其中至少一种多不饱和脂肪酸的滴度相对于所述对照解脂耶氏酵母产生的所述至少一种多不饱和脂肪酸的滴度未降低。
6.权利要求1的转基因解脂耶氏酵母，其中所述解脂耶氏酵母还包含在至少一种编码过氧化物酶体生物发生因子蛋白的天然基因中的破坏。
7.操纵转基因解脂耶氏酵母中丙二酸含量的方法，所述方法包括：
a)提供权利要求1的转基因解脂耶氏酵母；以及，
b)培养所述解脂耶氏酵母以允许所述编码丙二酰-CoA合成酶的基因的表达。
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