CN101980595B - △4去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明所述的是Δ4去饱和酶，所述酶将全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸[“DPA”；22:5ω-3]转化成二十二碳六烯酸[“DHA”；22:6ω-3]并且具有将二十二碳四烯酸[“DTA”；22:4ω-6]转化成全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸[“DPAn-6”；22:5ω-6]的次级活性。本发明还描述了分离的核酸片段和包含此类编码Δ4去饱和酶的片段的重组构建体以及使用含油酵母中的所述Δ4去饱和酶制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。

Description

△4去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途

本专利申请要求提交于2008年4月2日，当前未决的美国临时申请61/041716的优先权，该文献以引用方式全文并入本文。

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ4脂肪酸去饱和酶的核酸片段的鉴定以及这种去饱和酶在制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。

发明背景

已经有大量文献证明了与多不饱和脂肪酸[“PUFA”]，尤其是ω-3和ω-6 PUFA相关的健康有益效果。为了寻找大规模制备ω-3和ω-6PUFA的方法，研究者已经将他们的工作转向发现基因以及了解产生脂质和脂肪酸的编码的生物合成途径。

人们正研究包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiles)和酵母在内的多种不同宿主作为商业化PUFA生产的手段。基因工程已经证明基本上能改变一些宿主，甚至那些天然生产亚油酸[“LA”；18:2ω-6]或α-亚麻酸[“ALA”；18:3ω-3]脂肪酸受限的宿主的天然能力以生产高水平的多种长链ω-3/ω-6 PUFA。不管这是天然能力还是重组技术的结果，从二十二碳五烯酸[“DPA”；22:5ω-3]生产二十二碳六烯酸[“DHA”；22:6ω-3]可能需要表达Δ4去饱和酶。更具体地讲，迄今鉴定的大多数Δ4去饱和酶具有将DPA转化成DHA的主要能力，以及将二十二碳四烯酸[“DTA”；22:4ω-6]转化成ω-6二十二碳五烯酸[“DPAn-6”；22:5ω-6]的次要活性。

基于Δ4去饱和酶在合成DPA中的作用，已经付出了相当大的努力来鉴定和表征来自多种来源的这些酶。已经在公开文献和专利文献中公开了多种Δ4去饱和酶。一些实例包括：小眼虫(Euglena gracilis)(SEQ ID NO：13；GenBank登录号AY278558；Meyer等人，Biochemistry，42(32)：9779-9788(2003))；假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)(SEQ ID NO：37；GenBank登录号AAX14506；Tonon等人，FEBS J.，272(13)：3401-3412(2005))；金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)(SEQ ID NO：14；GenBank登录号AAN75707)；破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)(GenBank登录号CAD42496；美国专利7,087,432)；聚合裂殖壶菌(Schizochytriumaggregatum)(SEQ ID NO：41；国际申请公布WO 2002/090493)；鲁兹巴夫藻(Pavlova lutheri)(SEQ ID NO：42；GenBank登录号AAQ98793)；和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)(SEQ ID NO：43；GenBank登录号AAV33631；Pereira等人，Biochem.J.，384(2)：357-366(2004)；国际申请公布WO 2002/090493)。因此，需要鉴定和分离另外的编码Δ4去饱和酶的基因，该基因将适于在多种宿主生物体中异源表达以用于产生ω-3/ω-6脂肪酸。

申请人已通过从小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594中分离编码Δ4脂肪酸去饱和酶的基因解决了所述问题。

发明简述

本文所述的是编码具有Δ4去饱和酶活性的多肽的新基因构建体，以及它们在藻类、细菌、酵母、类眼虫、原生藻菌(Stramenopiles)、真菌、植物和动物中生产多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的用途。

本文所述的是分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：

(a)编码选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的Δ4去饱和酶的分离的核苷酸序列；

(b)在如下杂交条件下与(a)杂交的分离的核苷酸序列：0.1XSSC、0.1％SDS，65℃以及用2X SSC、0.1％SDS洗涤，之后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤；和

(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核苷酸序列。

本文所述的其他分离的核酸分子包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码至少514个氨基酸的Δ4去饱和酶，所述Δ4去饱和酶基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO：2所示的序列的多肽进行比较时具有至少68％的同一性；所述第二核苷酸序列包含所述第一核苷酸序列的互补序列。

本文还描述了本文所述的核酸分子的遗传嵌合体和包含它们的转化过的宿主细胞。此外，本文还描述了生产二十二碳六烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供宿主细胞，其包含：

(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ4去饱和酶多肽基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时具有至少68％的同一性；和

(ii)全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5，ω3)的源；

b)使步骤(a)的宿主细胞在表达所述编码Δ4去饱和酶多肽的核酸片段并且将所述全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5，ω-3)转化成二十二碳六烯酸的条件下生长；和

c)任选地回收步骤(b)的二十二碳六烯酸。

同样，提供了生产全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5，ω-6)的方法，所述方法包括：

a)提供宿主细胞，其包含：

(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ4去饱和酶多肽基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时具有至少68％的同一性；和

(ii)二十二碳四烯酸源；

b)使步骤(a)的宿主细胞在表达所述编码Δ4去饱和酶多肽的核酸片段并且将所述二十二碳四烯酸转化成全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5，ω-6)的条件下生长；和

c)任选地回收步骤(b)的全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5，ω-6)。

生物保藏

下述生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来制备。

如本文所用，“ATCC”指美国典型培养物保藏中心国际寄存机构(American Type Culture Collection International Depository Authority)，位于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，U.S.A。所列出的保藏物将会被保持在指定的国际保藏机构中至少30年，并且一旦准予专利公开它就将会对公众开放。在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题发明的许可。

附图简述和序列表

根据下面的发明详述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明，下面的发明详述和附带的序列描述形成了本申请的一部分。

图1包括图1A和图1B，它们一起示出了ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径，并且当考虑下文对该途径的描述时应被视为一起。

图2包括图2A、图2B和图2C，它们一起显示小眼虫Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：13；GenBank登录号AY278558)、假微型海链藻Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：37；GenBank登录号AAX14506)、破囊壶菌属FJN-10Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：38；GenBank登录号AAZ43257)、和鲁兹巴夫藻Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：42；GenBank登录号AAQ98793)之间使用Clustal W分析(DNASTAR软件的MegAlign^TM程序)的比对。简并引物被设计以对应于加框区。

图3由图3A、图3B、图3C、图3D和图3E组成，它们一起显示小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594Δ4去饱和酶基因(命名为E1594D4；SEQ ID NO：1)和合成基因(命名为E1594D4S；SEQ ID NO：3)的DNA序列的比较，所述基因经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达。

图4提供了下列质粒的质粒图谱：(A)p1594D4S；和(B)pZKL4-220ESC4。

图5示出了解脂耶氏酵母菌株Y4184U的发育，在总的脂质级分中产生了约31％EPA。

下面的序列遵循37 C.F.R.§1.821-1.825(“对包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公开内容的专利申请的要求-序列规则”(“Requirementsfor Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization)(WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(细则5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中示出的规则。

SEQ ID NO：1-9、13-14、37-47为编码基因或蛋白质(或其部分)或质粒的ORF，如表1中所示。

表1

核酸和蛋白质SEQ ID号总汇

SEQ ID NO：10-12分别对应于SMART^TM IV寡核苷酸引物、CDSIII/3’PCR引物和5’CDSIII PCR引物，用于小型绿藻属cf_gymnastica CCMP 1594 cDNA合成。

SEQ ID NO：15-17分别对应于简并寡核苷酸引物D4-F1、D4-F2和D4-F3，所有引物均编码如在SEQ ID NO：18中示出的肽。

SEQ ID NO：19对应简并寡核苷酸引物D4-F4，其编码如在SEQ IDNO：20中示出的肽。

SEQ ID NO：21对应简并寡核苷酸引物D4-F5，其编码如在SEQ IDNO：22中示出的肽。

SEQ ID NO：23-25分别对应于简并寡核苷酸引物D4-F6、D4-F7和D4-F8，所有引物均编码如在SEQ ID NO：26中示出的肽。

SEQ ID NO：27和28对应简并寡核苷酸引物D4-R1和D4-R2，这两种引物均编码如在SEQ ID NO：29中示出的肽。

SEQ ID NO：30-34分别对应于引物1594D4-5-1、1594D4-5-2、DNRCDS 5-2、1594D4-5-4和1594D4-5-5，它们用于扩增小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594Δ4去饱和酶基因的5’编码区。

SEQ ID NO：35和36分别对应于引物1594D4-3-1和1594D4-3-2，它们用于扩增小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594Δ4去饱和酶基因的3’编码区。

发明详述

申请人已经鉴定了新型小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594Δ4去饱和酶和编码相同酶的基因，所述基因可用于操纵生物化学途径以生产有益健康的PUFA。因此本发明具有多种应用。

PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或补充剂，尤其是婴儿代乳品(formula)，用于接受静脉内营养法的患者或用来预防或治疗营养不良。作为另外一种选择，纯化的PUFA及其衍生物可掺入到烹饪油、脂肪或人造黄油中并作为消费者的一般饮食而被摄取，从而提供消费者期望的饮食补充剂。此外，PUFA还可以掺入到婴儿代乳品、营养补充剂或其他食品中，并且可用作抗炎或降胆固醇剂。任选地，该组合物可以用于药用(人药或兽药)。

定义

在本公开中，使用了大量术语和缩写。给出了如下定义。

“开放阅读框”缩写为“ORF”。

“聚合酶链反应”缩写为“PCR”。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为“ATCC”。

“多不饱和脂肪酸”缩写为“PUFA”。

“三酰基甘油”缩写为“TAG”。

“总脂肪酸”缩写为“TFA”。

“干细胞重量”缩写为“DCW”。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”不旨在限制而是通常适用于权利要求中的或本文所述的任何发明。

术语“脂肪酸”指不同链长的长链脂族酸(链烷酸)，链长为约C₁₂至C₂₂(尽管更长和更短链长的酸均是已知的)。主要的链长介于C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可用简单的记号系统“X:Y”来表示，其中X表示具体脂肪酸中碳(“C”)原子的总数，而Y表示双键的数目。另外的关于“饱和脂肪酸”与“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”与“多不饱和脂肪酸”(“PUFA”)以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)与“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间的区别的详细信息在美国专利7,238,482中有所提供。

表2提供了用于描述本文PUFA的命名。在标题为“简化符号”一栏中，ω-指代系统用于表明碳数目、双键的数目和最接近ω碳的双键位置，双键位置的计数从ω碳开始(为此ω碳的编号为1)。该表的其余部分汇总了ω-3和ω-6脂肪酸及其前体的俗名、在整个说明书中使用的缩写以及每种化合物的化学名称。

表2

多不饱和脂肪酸及其前体的命名

俗名	缩写	化学名称	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	棕榈酸	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八碳烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9，12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ-亚麻酸	GLA	顺式-6，9，12-十八碳三烯酸	18:3ω-6
二十碳二烯酸	EDA	顺式-11，14-二十碳二烯酸	20:2ω-6
				二高-γ-亚麻酸	DGLA	顺式-8，11，14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
花生四烯酸	ARA	顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
				α-亚麻酸	ALA	顺式-9，12，15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
十八碳四烯酸	STA	顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
				二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11，14，17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
金松烯酸	SCI	顺式-5，11，14-二十碳三烯酸	20:3bω-6
				杜松烯酸	JUP	顺式-5，11，14，17-二十碳四烯酸	20:4bω-3
二十碳四烯酸	ETA	顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸	20:4ω-3
				二十碳五烯酸	EPA	顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸	20:5ω-3
二十二碳三烯酸	DRA	顺式-10，13，16-二十二碳三烯酸	22:3ω-6
				二十二碳四烯酸	DTA	顺式-7，10，13，16-二十二碳四烯酸	22:4ω-6
二十二碳五烯酸	DPAn-6	顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸	22:5ω-6
				二十二碳五烯酸	DPA	顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

虽然使用本文所述方法，表2列出的ω-3/ω-6 PUFA最可能在含油酵母的油级分中积聚，但是该列表不应理解为限制性的或完全的。

本文术语细胞的“总脂质级分”指细胞的所有酯化脂肪酸。可分离出在总脂质级分中的不同亚级分，包括三酰基甘油[“油”]级分、磷脂酰胆碱级分和磷脂酰乙醇胺级分，但是这并不包括所有亚级分。

术语“三酰基甘油”[“TAG”]和“油”是可互换的，它们指由酰化甘油分子的三个脂肪酰残基组成的中性脂类。TAG能够包含长链PUFA，以及较短的饱和的和不饱和的脂肪酸以及较长链的饱和脂肪酸。细胞的TAG级分也称作“油级分”，并且“油的生物合成”一般指在细胞中合成TAG。油或TAG级分是总脂质级分的亚级分，虽然它也是构成总脂质含量的主要部分，总脂质含量以含油生物细胞中的总脂肪酸重量占干细胞重量[参见下文]的百分比表示。油[“TAG”]级分中的脂肪酸组合物和总脂质级分的脂肪酸组合物一般是相似的。因此，总脂质级分中的PUFA浓度的提高或降低将对应于油[“TAG”]级分中的PUFA浓度的升高或降低，反之亦然。

术语“总脂肪酸”[“TFA”]本文指所有细胞脂肪酸的总量，所述脂肪酸在给定实例中可通过碱酯交换方法(本领域已知的方法)被衍生化成脂肪酸甲酯[“FAME”]，例如它可以是总脂质级分或油级分。因此，总脂肪酸包括来自中性和极性脂质级分的脂肪酸，包括磷脂酰胆碱级分、磷脂酰乙醇胺级分(phosphatidyletanolamine fraction)和二酰基甘油、单酰基甘油和三酰基甘油[“TAG或油”]级分，但是不包括游离脂肪酸。

术语细胞的“总脂质含量”是TFA的量度，以干细胞重量[“DCW”]百分比的形式表示。因此，总脂质含量[“TFA％DCW”]等同于例如每100毫克DCW的总脂肪酸毫克数。

脂肪酸浓度本文一般表示为TFA的重量百分比[“％TFA”]，例如每100毫克TFA的给定脂肪酸毫克数。除非在本文公开内容中另作具体说明，给定脂肪酸相对于总脂质的百分比等同于以％TFA表示的脂肪酸浓度，例如总脂质的％DHA等同于DHA％TFA。

在一些情况下，可使用细胞中给定脂肪酸占干细胞重量的百分比[“％DCW”]形式表达给定脂肪酸的含量。因此例如二十二碳六烯酸％DCW将根据下式进行测定：(二十二碳六烯酸％TFA)×(TFA％DCW)]/100。

术语“脂质分布”和“脂质组成”是可互换的，并且指在特定脂质级分(例如在总脂质级分或油[“TAG”]级分中)中包含的单种脂肪酸的量，其中所述量用TFA百分比形式表示。混合物中存在的各种脂肪酸的总量应当是100。

代谢途径或生物合成途径在生物化学意义上可以认为是发生于细胞内由酶催化的一系列化学反应，以实现细胞待使用的或待贮存的代谢产物的形成，或启动另一称作“流量产生步骤”的代谢途径。很多此类途径均很精细，并涉及对起始物质的逐步修饰以使之形成具有期望的精确化学结构的产物。

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转化成诸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA和DPAn-6之类的ω-6脂肪酸和诸如ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA之类的ω-3脂肪酸的代谢过程。文献中详细描述了该过程。参见例如国际申请公布WO2006/052870。简而言之，该过程涉及通过添加碳原子来延长碳链和通过加入双键来使分子去饱和，这通过存在于内质网膜内的一系列特异性去饱和酶和延伸酶(称为“PUFA生物合成途径酶”)进行。更具体地讲，“PUFA生物合成途径酶”指如下与PUFA生物合成相关的任何酶(以及编码该酶的基因)，包括：Δ9延伸酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、C_18/20延伸酶、C_20/22延伸酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶和/或Δ17去饱和酶。

术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指在合适条件下表达时编码催化ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或两者产生的酶的一组基因。通常，参与ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。图1示出了一条代表性途径，提供了从肉豆蔻酸经过多种中间产物向DHA的转化，演示了ω-3和ω-6脂肪酸两者是如何可以从共同来源产生。该途径自然分成两部分，使得一部分只生成ω-3脂肪酸而另一部分只生成ω-6脂肪酸。只产生ω-3脂肪酸的部分在本文中将称作ω-3脂肪酸生物合成途径，而只产生ω-6脂肪酸的部分在本文中称作ω-6脂肪酸生物合成途径。

如本文中关于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径所用的，术语“功能性的”指该途径中的一些(或全部)基因表达活性酶，导致体内催化或底物转化。应当理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不意味着上面段落中列出的所有基因都是必需的，因为许多脂肪酸产物将仅需要表达该途径中的一亚组基因。

术语“ω6去饱和酶/ω6延伸酶途径”将指最低程度包括至少一种ω6去饱和酶和至少一种C_18/20延伸酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以GLA和/或STA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。当表达其他去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA、和DHA。

术语“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”指最低程度包括至少一种Δ9延伸酶和至少一种Δ8去饱和酶的PUFA生物合成途径，从而使得能分别从LA和ALA开始，以EDA和/或ETrA作为脂肪酸中间产物来生物合成DGLA和/或ETA。当表达其他去饱和酶和延伸酶时，也可合成ARA、DTA、DPAn-6、EPA、DPA、和DHA。

术语“脂肪酸中间产物”指在脂肪酸代谢途径中产生的任何脂肪酸，其可以通过其他代谢途径酶的作用进一步转化成本途径的目的脂肪酸产物。例如，当利用Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径产生EPA时，可以产生EDA、ETrA、DGLA、ETA和ARA并被认为是“脂肪酸中间产物”，因为这些脂肪酸可通过其他代谢途径酶的作用进一步转化成EPA。

术语“去饱和酶”指多肽，其能够通过从邻接碳原子中的一个上移除氢原子、并且从而在碳原子之间导入双键来将在脂肪酸中的邻接碳原子去饱和。去饱和产生了脂肪酸或受关注的前体。尽管在整个说明书中使用ω-指代系统来指代特定的脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基端计数来表示去饱和酶的活性更方便。本文尤其关注的是Δ4去饱和酶，它催化底物脂肪酸DPA转化成DHA和/或催化底物脂肪酸DTA转化成DPAn-6。其他去饱和酶包括：1)Δ17去饱和酶，它在从分子羧基末端编号为第17和第18的碳原子之间去饱和脂肪酸，并且它例如催化底物脂肪酸ARA转化成EPA和/或催化底物脂肪酸DGLA转化成ETA；2)Δ6去饱和酶，它催化脂肪酸底物LA转化成GLA和/或催化脂肪酸底物ALA转化成STA；3)Δ12去饱和酶，它催化底物脂肪酸油酸转化成LA；4)Δ15去饱和酶，它催化脂肪酸底物LA转化成ALA和/或催化脂肪酸底物GLA转化成STA；5)Δ5去饱和酶，它催化脂肪酸底物DGLA转化成ARA和/或催化脂肪酸底物ETA转化成EPA；6)Δ8去饱和酶，它催化脂肪酸底物EDA转化成DGLA和/或催化脂肪酸底物ETrA转化成ETA；和7)Δ9去饱和酶，它催化底物脂肪酸棕榈酸转化成棕榈油酸(16:1)和/或催化底物脂肪酸硬脂酸转化成油酸。在本领域中，基于Δ15和D17去饱和酶将ω-6脂肪酸转化成它们的ω-3对应物的能力(如分别将LA转化成ALA以及将ARA转化成EPA)，偶尔也将它们称作“ω-3去饱和酶”、“ω-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。所期望的是通过用脂肪酸去饱和酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸分布的作用，从而经验性地测定特定脂肪酸去饱和酶的特异性。

术语“E1594D4”指Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：2)，它从小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594分离得到，由本文的SEQ ID NO：1编码。同样地，术语“E1594D4S”指合成Δ4去饱和酶，该酶来源于小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594，其经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达(即SEQ ID NO：3和4)。

术语“转化效率”和“底物转化百分比”指特定酶(如去饱和酶)能够将底物转化成产物的效率。转化效率根据下面的公式测量：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括中间产物和该途径中来源于它的所有产物。

术语“延伸酶”指能延长脂肪酸碳链从而产生比该延伸酶作用于其上的脂肪酸底物长2个碳原子的酸的多肽。该延长过程在与脂肪酸合酶相关的多步骤机制中发生，如Int′l专利申请公布WO 2005/047480。延伸酶体系催化反应的实例如GLA转化成DGLA、STA转化成ETA、ARA转化成DTA以及EPA转化成DPA。通常，延伸酶的底物选择性有些广泛，但由链长度和不饱和的程度及类型两者来区分。例如C_14/16延伸酶利用C₁₄底物如肉豆蔻酸；C_16/18延伸酶利用C₁₆底物如棕榈酸；C_18/20延伸酶[又称为Δ6延伸酶，两个术语可以互换使用]利用C₁₈底物如GLA、STA；以及C_20/22延伸酶[又称为C20延伸酶，两个术语可以互换使用]利用C₂₀底物如ARA、EPA。以类似方式，Δ9延伸酶能够催化LA和ALA分别转化成EDA和ETrA。

重要的是，需注意一些延伸酶具有广泛的特异性并因而单个酶可能能够催化几种延伸酶反应。例如单个酶可因此作为C_16/18延伸酶和C_18/20延伸酶。可能理想的是，通过用脂肪酸延伸酶的基因来转化合适的宿主并测定它对该宿主脂肪酸概况的作用，从而经验性地测定脂肪酸延伸酶的特异性。

术语“含油的”指那些趋于以脂质形式贮存它们的能源的生物(Weete，Fungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。术语“含油酵母”指那些能制造油(即TAG)的、分类为酵母的微生物。通常，含油微生物的细胞油或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度增加直至在对数生长期晚期或稳定生长期早期它达到最高浓度，随后在稳定生长期晚期和死亡期期间逐渐下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。含油微生物积累油超过它们的干细胞重量的约25％的情形并不鲜见。含油酵母的实例包括但不限于如下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

术语“裸藻纲(Euglenophyceae)”指发现生活在淡水环境、海洋环境、土壤环境和寄生环境中的一群单细胞的无色或光合鞭毛虫[“类眼虫”]。该纲的特征为孤立的单细胞，其中大多数是自由游动的并且具有从称为储存器的前内陷长出的两条鞭毛，其中一条可能不露出。光合类眼虫含有一个至多个叶绿体，叶绿体从微小的盘状至延伸的板状或带状而不同。无色类眼虫依赖于渗透营养或吞噬营养来进行营养同化作用。已经描述了约1000种物种并将它们分为约40个属和6个目。裸藻纲的实例包括但不限于如下属：裸藻属(Euglena)、小型绿藻属(Eutreptiella)和Tetruetreptia。

如本文所用，术语“生物质”具体地讲是指耗费的或使用的酵母细胞物质，该物质由以商业显著量生产PUFA的重组生产宿主发酵产生，其中优选的生产宿主是含油酵母的重组菌株，即解脂耶氏酵母。生物质可以是以下形式：全细胞、全细胞溶解产物、匀化细胞、部分水解细胞物质、和/或部分纯化细胞物质如微生物产生的油。

如本文所用的，术语“分离的核酸片段”和“分离的核酸分子”可互换使用，并且是指单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可以退火至另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，例如cDNA、基因组DNA或RNA分子。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A  Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold SpringHarbor，NY(1989)中得到举例说明。

温度和离子强度条件确定了杂交的“严格性”。可以调节严格性条件以筛选中度相似的片段(例如来自远缘生物的同源序列)，到筛选高度相似的片段(例如从近缘生物复制功能性酶的基因)。杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤：开始采用6XSSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2X SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，最后使用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高严格性条件是最后两次洗涤是在65℃下用0.1X SSC、0.1％SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在0.1X SSC、0.1％SDS中于65℃下杂交，并用2X SSC、0.1％SDS洗涤，随后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适严格性取决于核酸的长度和互补的程度，所述长度和互补程度是本领域内所熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂交体，已经推导出了用于计算Tm的公式(请参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；并且最优选地，长度为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，可根据需要根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或者可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或者可以利用诸如BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))之类的算法通过计算机自动化序列比较和鉴定来完成。一般来讲，为了推测鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有10个或更多个邻接氨基酸或者30个或更多个核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”所包含的序列应足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本文的公开提出编码特定类眼虫蛋白的全部氨基酸和核苷酸序列。利用本文所公开的序列，技术人员现在可以利用本发明所公开序列的全部或基本部分，以用于本领域技术人员已知的目的。因此，本文公开涵盖如随附的序列表中所示的完整序列以及如上文定义的这些序列的基本部分。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，而胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此本公开涵盖与所附序列表中报道的完整序列互补的分离的核酸片段，以及那些基本相似的核酸序列。

术语“同源性”或“同源”本文互换使用。它们指这样的核酸片段，即其中一个或多个核苷酸碱基改变并不会影响该核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语也指本文所述的核酸片段的修饰(例如缺失或插入一个或多个核苷酸)，相对于初始的未经修饰的核酸片段，该修饰基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此，正如本领域技术人员应当理解的，本发明涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。

此外，技术人员认识到，本发明所涵盖的同源核苷酸序列也由它们在中等严格条件如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃下，与本文所示例的序列杂交的能力，或杂交至本文公开的核苷酸序列的任何部分以及杂交至与本文所公开的任何核苷酸序列功能相当的序列的能力所限定。

“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本文所述的是编码氨基酸序列的全部或基本部分的任何核酸片段，该氨基酸序列编码如在SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：4中示出的类眼虫多肽。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸构件装配而成。将这些寡核苷酸基本单位进行退火并随后连接以形成基因节段，该基因节段随后在酶促作用下装配而构建成完整的基因。因此，基于最优化核苷酸序列以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以最优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选的密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中序列信息可获得)的检测。例如在美国专利公开7,125,672中提供了解脂耶氏酵母的密码子使用特制。

“基因”指表达特定蛋白的核酸片段，并且可以指单独的编码区或可以包含位于编码序列之前的调控序列(5′非编码区)和之后的调控序列(3′非编码区)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物基因组内它的天然位置的天然基因。“外来”基因指通过基因转移导入到宿主生物内的基因。外来基因可包括插入到非天然生物内的天然基因、导入到天然宿主内的新位置的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。“密码子优化的基因”是其密码子使用频率经设计用以模仿宿主细胞优选的密码子使用频率的基因。

“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列(或位于它们的内含子中)，其可影响转录、RNA加工或稳定性、或者相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、增强子、静默子、5’非翻译前导序列(例如在转录起始位点和翻译启动密码子之间的序列)、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“3′非编码序列”和“转录终止子”指位于编码序列下游的DNA序列。这包括多腺苷酸化识别序列和编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常表征为影响多腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可以是源自初级转录物的转录后加工的RNA序列并被称作成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指无内含子并且可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA互补并源于mRNA的双链DNA。“有义”RNA指包含mRNA并因而能由细胞翻译成蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与全部或部分靶初级转录物或mRNA互补，并阻止靶基因表达的RNA转录物(美国专利5,107,065；国际申请公开WO 99/28508)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列互补。“功能性RNA”指反义RNA、核酶RNA或其他不被翻译但是对细胞过程有影响作用的RNA。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达，即，该编码序列受到该启动子的转录控制时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用，术语“表达”指源于核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

“转化”指将核酸分子转移至宿主生物中，导致在遗传上稳定遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，例如，或者它可以整合进宿主生物的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。

术语“质粒”和“载体”指通常携带有不属于细胞中心代谢部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组为一种独特构建体，该独特构建体能够将表达盒引入细胞中。

术语“表达盒”指包含如下编码序列的DNA片段：所选基因的编码序列和所选基因产物表达所需的位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。因此，表达盒通常由如下序列构成：(1)启动子序列；2)编码序列，即，开放阅读框[“ORF”]；和3)3′非翻译区域，即，在真核细胞中通常包含聚腺苷酸位点的终止子。表达盒通常包含于载体中以有利于克隆和转化。可以将不同表达盒转化进包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞在内的不同生物体中，只要能针对每种宿主使用正确的调控序列。

术语“同一性百分比”指两种或更多种多肽序列之间或两种或更多种多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较而确定。“同一性百分比”还表示多肽或多核苷酸序列之间的序列关联的程度，根据具体情况，它由比较序列的序列串之间的匹配百分比确定。“同一性百分比”和“相似性百分比”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于以下文献中所描述的那些：1.)Computational  Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4)Sequence  Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑.)Academic(1987)；和5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑.)Stockton：NY(1991)。

设定确定同一性百分比的优选方法来用于给出待测试序列之间的最佳匹配。用于测定同一性百分比和相似性百分比的方法在公开可获得的计算机程序中进行编辑。序列比对和同一性百分比计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENE bioinformaticscomputing suite(DNASTAR Inc.，Madison，WI))中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对采用包括几种改变形式的算法在内的“Clustal比对方法”进行，包括“Clustal V比对方法”和“Clustal W比对方法”(在Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)中有所描述)并且存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign^TM程序中。用Clustal程序比对序列后，可通过查看程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”。

就使用Clustal V比对方法的多重比对而言，预设值对应于空位罚分＝10并且空位长度罚分＝10。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5并且DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，缺口罚分＝5，窗口＝4并且DIAGONALSSAVED＝4。使用Clustal W比对方法的多重比对的预设参数对应于空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，延迟发散序列(％)＝30，DNA转换权重＝0.5，蛋白加权矩阵＝Gonnet Series，DNA加权矩阵＝IUB。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性百分比可用于从其他物种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。合适的核酸片段(即如本文公开所述的分离的多核苷酸)编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约70％同一性，优选至少约75％同一性，并且更优选至少约80％同一性的多肽。优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。最优选的是编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的核酸片段。虽然上文描述了优选的范围，但从68％至100％的任何整数氨基酸同一性可用于描述本发明，如69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

合适的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，更优选至少200个氨基酸，最优选至少250个氨基酸的多肽。

术语“基序”指进化上相关的蛋白质的比对序列中在特定位置保守的一组氨基酸。虽然同源蛋白质之间在其他位置的氨基酸可以发生变化，但在特定位置高度保守的氨基酸表明对蛋白质的结构、稳定性或活性来说是必需的氨基酸。因为它们可通过它们在蛋白质同系物家族的比对序列中的高度保守来鉴定，所以它们可用作识别标签或“签名”来确定具有新的测定序列的蛋白质是否属于以前鉴定的蛋白质家族。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序包(Wisconsin PackageVersion 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)整合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，召开年份：1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在这一描述中，除非另外指明，只要序列分析软件用于分析，分析结果都基于所用程序的“默认值”。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数集。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且已经在如下文献中有所描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.、Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene  Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

综述：脂肪酸和三酰基甘油的微生物生物合成

通常，含油微生物的脂质蓄积是响应存在于生长培养基中的总的碳氮比而触发。该过程(导致含油微生物中游离棕榈酸(16:0)的从头合成)在美国专利7,238,482中有详细描述。棕榈酸是长链饱和的和不饱和脂肪酸衍生物的前体，这些脂肪酸衍生物通过延伸酶和去饱和酶的作用形成(图1)。

TAG(脂肪酸的主要贮存单位)通过涉及如下反应的一系列反应形成：(1)一分子的酰基辅酶A和甘油-3-磷酸通过酰基转移酶酯化而生成溶血磷脂酸；(2)第二分子的酰基辅酶A通过酰基转移酶酯化而生成1，2-二酰基甘油磷酸(通常称为磷脂酸)；3)通过磷脂酸磷酸酶移除磷酸以生成1，2-二酰基甘油[“DAG”]；和4)通过酰基转移酶的作用加入第三脂肪酸以形成TAG。广谱的脂肪酸可被整合进TAG中，包括饱和的和不饱和的脂肪酸以及短链和长链的脂肪酸。

ω脂肪酸的生物合成

其中油酸转化成ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子使碳链延长和通过加入双键使分子去饱和。这需要存在于内质网膜内的一系列特殊去饱和酶和延伸酶。然而，如在图1中看到的和如下所述的，通常存在多个用于产生特定ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径。

具体地讲，图1描述了下文所述的途径。所有途径都需要最初通过Δ12去饱和酶将油酸转化成亚油酸[“LA”](第一种ω-6脂肪酸)。然后，利用“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”并将LA用作底物来如下形成长链ω-6和ω-3脂肪酸：1)通过Δ9延伸酶将LA转化成二十碳二烯酸[“EDA”]；2)通过Δ8去饱和酶将EDA转化成二高-γ-亚麻酸[“DGLA”]；3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转化成花生四烯酸[“ARA”]；4)通过C_20/22延伸酶将ARA转化成二十二碳四烯酸[“DTA”]；和5)通过Δ4去饱和酶将DTA转化成二十二碳五烯酸[“DPAn-6”]。作为另外一种选择，“Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径”能够如下使用α-亚麻酸[“ALA”]作底物生产长链ω-3脂肪酸：1)通过Δ15去饱和酶将LA转化成ALA(第一个ω-3脂肪酸)；2)通过Δ9延伸酶将ALA转化成二十碳三烯酸[“ETrA”]；3)通过Δ8去饱和酶将ETrA转化成二十碳四烯酸[“ETA”]；4)通过Δ5去饱和酶将ETA转化成二十碳五烯酸[“EPA”]；5)通过C_20/22延伸酶将EPA转化成二十二碳五烯酸[“DPA”]；和6)通过Δ4去饱和酶将DPA转化成二十二碳六烯酸[“DHA”]。任选地，ω-6脂肪酸可转化成ω-3脂肪酸；例如，ETA和EPA通过Δ17去饱和酶活性分别从DGLA和ARA生成。

ω-3/ω-6脂肪酸的生物合成替代途径利用Δ6去饱和酶和C_18/20延伸酶，即，“Δ6去饱和酶/Δ6延伸酶途径”。更具体地讲，通过Δ6去饱和酶可将LA和ALA分别转化成γ-亚麻酸[“GLA”]和十八碳四烯酸[“STA”]。然后，C_18/20延伸酶将GLA转化成DGLA和/或将STA转化成ETA。随后如上所述形成下游PUFA。

预期需要在特定宿主生物中表达用以产生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能将取决于宿主细胞(及其天然的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和所需的终产物。本领域技术人员将能够鉴定多种编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的候选基因。可用的去饱和酶和延伸酶序列可源自任何来源，例如，分离自天然来源如细菌、藻类、真菌、卵菌、酵母、原生藻菌、植物、动物等、经由半合成途径产生或从头合成。尽管导入宿主的去饱和酶和延伸酶基因的具体来源不是关键的，但选择具有去饱和酶或延伸酶活性的特定多肽的考虑事项包括：1)多肽的底物特异性和活性；2)多肽或其组件是否为限速酶；3)去饱和酶或延伸酶是否是合成期望的PUFA所必需的；4)多肽所需的辅因子；和/或5)多肽在其产生后是否被修饰，例如，通过激酶或异戊烯转移酶修饰。表达的多肽优选具有与它在宿主细胞中的位置的生化环境相容的参数。参见美国专利7,238,482。

考虑每种特定的去饱和酶和/或延伸酶的转化效率也可以是有用的。更具体地讲，由于每种酶极少能以100％的效率将底物转化成产物，宿主细胞内所产生的未纯化的油的最终脂质分布通常是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多种上游PUFA中间产物组成的多种PUFA的混合物。因此，当使期望的脂肪酸的生物合成最优化时，每种酶的转化效率也是要考虑的变量。

考虑到上述各个考虑事项，具有合适去饱和酶和延伸酶活性(如Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C_20/22延伸酶)的候选基因可根据可公开获得的文献(如GenBank)、专利文献和对具有产生PUFA能力的生物的实验分析来鉴定。这些基因将适用于导入到特定的宿主生物中，以使该生物能合成PUFA或增强生物的PUFA合成。

新型小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594 Δ4去饱和酶的序列鉴 定

本公开涉及分离自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，它编码Δ4去饱和酶(SEQ ID NO：2)。本文将该序列命名为“E1594D4”。

使用Clustal W比对方法将E1594D4核苷酸碱基和推断出的氨基酸序列与公开数据库比较，结果显示最相似的已知序列与本文报道的E1594D4氨基酸序列在514个氨基酸的长度上为约68％相同(描述于Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992)；存在于LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)的MegAlign^TM版本6.1程序中)。更优选的氨基酸片段与本文中的序列具有至少约70％-80％的同一性，其中具有至少约80％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。类似地，优选的对应ORF的编码E1594D4的核酸序列是编码活性蛋白质的那些并且其与本文所报道的E1594D4核酸序列具有至少约70％-80％同一性，其中具有至少约80％-90％同一性的那些序列尤其适合，而具有至少约90％-95％同一性的那些序列是最优选的。

在另一个实施方案中，E1594D4去饱和酶序列可经密码子最优化以在特定宿主生物中表达。如本领域所熟知的，这可以成为进一步优化酶在候选宿主中的表达的有用手段，因为使用宿主优选的密码子可以显著提高编码该多肽的外源基因的表达。通常，宿主优选的密码子可在所关注的具体宿主物种中通过检查蛋白质(优选那些最大量表达的蛋白质)中的密码子使用以及确定哪些密码子的使用频率最高来测定。然后，可利用宿主物种中优选的密码子整个或部分地合成具有例如去饱和酶活性的所关注的多肽的编码序列。

因此，E1594D4经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达。基于先前对解脂耶氏酵母密码子使用概况的确定、对那些优选的密码子的鉴定以及对‘ATG’起始密码子周围的共有序列的确定(参见美国专利7,238,482和美国专利7,125,672)，这是可能的。本文将密码子优化的合成基因命名为“E1594D4S”，它在野生型E1594D4的氨基酸残基1和2之间插入了一个附加的氨基酸；因此E1594D4S的总长度为1548个核苷酸(SEQ ID NO：3)，而如SEQ ID NO：4所示的蛋白长度为515个氨基酸。

基于野生型E1594D4序列，本领域的技术人员应当能够利用本文中的教导内容来产生多种适用于在候选宿主(即除解脂耶氏酵母之外的宿主)中最佳表达的其他经密码子最优化的Δ4去饱和酶蛋白。因此本文公开涉及来源于野生型E1594D4的任何密码子优化的Δ4去饱和酶蛋白，即，由SEQ ID NO：2编码的蛋白。这包括但不限于在SEQ IDNO：3中示出的核苷酸序列，该核苷酸序列编码经密码子最优化以用于在解脂耶氏酵母中表达的合成的Δ4饱和酶蛋白(即，如在SEQ ID NO：4中示出的E1594D4S)。

同源物的鉴定和分离

可使用任何本发明的去饱和酶序列(即E1594D4、E1594D4S)或它们的部分在相同或其他细菌、藻类、真菌、卵菌、酵母、原生藻菌、类眼虫、植物或动物物种中使用序列分析软件搜索Δ4去饱和酶同源物。通常，这种计算机软件通过将同源程度赋予多种置换、缺失和其他修饰来匹配相似的序列。

备选地，任何本发明的去饱和酶序列或其部分也可以用作杂交试剂用以鉴定Δ4同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有所关注的基因或基因片段的样品及特定的杂交方法。本发明的探针通常是与待检测核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。尽管探针的长度可在5个碱基到数万个碱基之间变化，但通常约15个碱基到约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全互补。杂交确实可以在并不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区内的一定比率的碱基未与适当的互补碱基配对。

杂交方法是有严格规定的。通常探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这涉及在适当浓度和温度条件下在存在无机或有机盐时使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使探针和样品核酸之间的任何可能的杂交均可发生。混合物中的探针或标记的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。任选地，可以加入离液剂(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯)。如果需要，可以将甲酰胺加入到杂交混合物中，通常为30-50％(v/v)。

可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20％至60％体积，优选30％体积的极性有机溶剂。通常的杂交溶液采用约30-50％v/v甲酰胺、约0.15至1M氯化钠、约0.05至0.1M缓冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05至0.2％的去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM的EDTA、FICOLL(PharmaciaInc.)(约300-500千道尔顿)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500千道尔顿)和血清白蛋白。一般的杂交溶液还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)，以及任选约0.5至2％重量/体积的甘氨酸。还可以包含其他添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂(如聚乙二醇)、阴离子聚合物(如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯)和阴离子糖类聚合物(如硫酸葡聚糖)在内的体积排阻剂。

核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。

在另外的实施方案中，本文描述的任何Δ4去饱和酶核酸片段(或其鉴定的任何同源物)都可用于从相同的或其他细菌、藻类、真菌、卵菌、酵母、原生藻菌、类眼虫、植物或动物物种中分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性的方案分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性的方案实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，例如核酸扩增技术的多种应用，如聚合酶链反应[“PCR”](美国专利4,683,202)；连接酶链反应[“LCR”](Tabor，S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985))；或链置换扩增[“SDA”]，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))；和3)文库构建和互补筛选方法。

例如，编码与本文所述的Δ4去饱和酶类似的蛋白或多肽的基因可通过使用所有或部分核酸片段作为DNA杂交探针，使用熟知的方法来筛选来自任何期望生物的文库而得以直接分离，其中将优选生产DPAn-6或DHA的那些生物。基于核酸序列的特异性，寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直接用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。此外，能设计特异性引物并用于扩增部分或全长Δ4去饱和酶序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针以在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。

通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于期望的检测条件，应当设计引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是常见且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotides as specific hybridization probesin the Diagnosis of Genetic Disorders”，Human Genetic Diseases：APractical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)第33-50页，IRL：Herndon，VA；以及Rychlik，W.，Methods in Molecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)第15卷，第31-39页，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。

通常，可以将Δ4去饱和酶序列的两个短片段在PCR规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。也可以对克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一个引物的序列来源于公开的核酸片段。其他引物序列利用mRNA前体编码真核基因3′末端存在的多腺苷酸片。

作为另一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))，通过用PCR扩增在转录物内单个点与3′或5′端之间的区域的拷贝来产生cDNA。以3′和5′方向取向的引物可用公开的序列设计。使用可商业获得的3′RACE或5′RACE体系(例如Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性的3′或5′cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等人，Science，243：217(1989))。

作为另外一种选择，任何本文所述的Δ4去饱和酶核酸片段(或其鉴定的任何同源物)都可用于产生新的和改良的脂肪酸去饱和酶。如本领域所熟知的，体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组(geneshuffling)”法或其他手段可用于获得天然存在的去饱和酶基因的突变。此外改良的脂肪酸可以通过结构域交换合成，其中将本文所述的任何Δ4去饱和酶核酸片段的功能结构域与备选的去饱和酶基因的功能结构域交换，从而产生新的蛋白质。

用于产生多种ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法

期望在合适的启动子控制下编码本文所描述的Δ4去饱和酶(即E1594D4、E1594D4S或其他突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)的嵌合基因的导入将导致DPAn-6和/或DHA分别在转化的宿主生物内的产生增加。同样，本文所述的是用于直接产生PUFA的方法，其包括将脂肪酸底物(即DTA或DPA)暴露给本文所描述的去饱和酶(例如E1594D4、E1594D4S)，以便该底物转化成期望的脂肪酸产物(即分别是DPAn-6或DHA)。

更具体地讲，本文提供了在宿主细胞中生产DHA的方法，其中宿主细胞包含：

(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少68％的同一性；和

(ii)DPA源；

其中使宿主细胞在使得Δ4去饱和酶被表达并且DPA被转化为DHA的条件下生长，并且其中DHA被任选地回收。

本领域中的技术人员将认识到，Δ4去饱和酶的广的底物范围可另外允许利用该酶将DTA转化成DPAn-6。因此，本文还描述了生产DPAn-6的方法，其中所述宿主细胞包含：

(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其中基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列的多肽进行比较时，该去饱和酶多肽具有至少68％的同一性；和

(ii)DTA源；

其中使宿主细胞在使得Δ4去饱和酶被表达并且DTA被转化为DPAn-6的条件下生长，并且其中DPAn-6被任选地回收。

在上述方法中，用作底物的DTA或DPA源可由宿主天然地或转基因地生产，或者底物可外源提供。具体地讲，预期可以将本文描述的Δ4去饱和酶(如E1594D4、E1594D4S或其他突变酶、经密码子最优化的酶或它们的同源物)与另外的编码PUFA生物合成途径的酶(如Δ6去饱和酶、C_18/20延伸酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延伸酶、C_16/18延伸酶、Δ9延伸酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶和/或C_20/22延伸酶)的基因结合表达以导致产生DPAn-6和/或DHA。包含于具体表达盒中的具体基因将取决于宿主细胞(和它的PFUA概况和/或去饱和酶/延伸酶概况)、底物的可利用性和期望的终产物。

在备选的实施方案中，基于本文描述的完整序列、那些完整序列的互补序列、那些序列的基本部分、源于那些序列的经密码子最优化的去饱和酶以及那些与其基本同源的序列，破坏宿主生物内的天然Δ4去饱和酶可能是有用的。

表达系统、表达盒和载体

本文描述的基因和基因产物可以在异源宿主细胞中表达。在重组宿主中的表达可用于产生多种PUFA途径中间产物，或者可用于调节宿主中已经存在的PUFA途径，用以合成迄今为止用该宿主不能合成的新产物。

含有引导外来蛋白质高水平表达的调控序列的表达系统和表达载体是熟知的。这些表达系统和表达载体的任一种均可用于构建用于产生本发明序列的任何基因产物的嵌合基因。然后可以将这些嵌合基因通过转化导入合适的宿主细胞中以提供所编码的酶的高水平表达。

可用于转化合适的宿主细胞的载体(如构建体、质粒)和DNA表达盒是熟知的。存在于构建体中的序列的具体选择取决于所需的表达产物(同上)、宿主细胞的性质以及提出的相对于未转化细胞分离转化细胞的手段。然而，通常载体含有至少一个表达盒、选择标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的表达盒包含基因控制转录起始的5′区即启动子、基因编码序列和控制转录终止的DNA片段3′区即终止子。最优选的是，这两个控制区都来源于来自转化的宿主细胞的基因，尽管应该了解这种控制区不必源自选作生产宿主的特定物种的天然基因。

转录控制区或用于驱动Δ4去饱和酶ORF在期望宿主细胞中表达的启动子有多种，并且是熟知的。这些控制区可包含启动子、增强子、静默子、内含子序列、3’UTR和/或5′UTR区域、以及蛋白和/或RNA稳定元件。此类元件的长度和特异性可以不同。事实上能够引导这些基因在所选宿主细胞中表达的任何启动子(即天然的、合成的或嵌合的启动子)均是适用的，但来自宿主物种的转录和翻译区是尤其有用的。在宿主细胞中的表达能够以诱导型或组成型的方式发生。诱导型表达通过诱导可操作地连接至所关注的基因的调控型启动子的活性发生，而组成型表达通过利用可操作地连接至所关注的基因的组成型启动子发生。

当宿主细胞是例如酵母时，酵母细胞中的功能性转录和翻译区域尤其从宿主菌种中提供。用于在解脂耶氏酵母中使用的优选转录起始调节区参见国际申请公布WO 2006/052870。可以使用许多调控序列的任意一种，这取决于是期望组成型转录还是诱导型转录、启动子在表达所关注的ORF中的效率、构建的容易性等。

必须在重组构建体中提供编码转录终止信号的3′非编码序列，即，“终止区”，该序列可以来自从中获取初始区的基因或不同基因的3′区域。大量的终止区是已知的并且当用于与它们源自的属和物种相同和不同的属和物种两者时，其在多种宿主中发挥的功能令人满意。终止区的选择通常更多是为了方便而不是因为任何特殊的性质。终止控制区也可以源于优选宿主天然的多种基因。3′-区也可以是合成的，因为本领域的技术人员可利用可获得的信息来设计和合成用作转录终止子的3′-区序列。终止区可以是非必需的，但是是高度优选的。

仅仅将一个基因如去饱和酶基因插入克隆载体不确保其以期望的速率、浓度、量等表达。根据对高表达率的需要，通过操作许多控制转录、RNA稳定性、翻译、蛋白质稳定性和位置、氧限制和从宿主细胞分泌的不同遗传元件，已经建立了许多专用的表达载体。一些操纵特征包括：相关转录启动子和终止子序列的性质、克隆基因的拷贝数(其中可通过增加质粒拷贝数或将克隆基因多次整合到基因组中将附加的拷贝在单个表达构建体中克隆和/或将附加的拷贝导入宿主细胞中)、基因是质粒传染的还是整合到宿主细胞基因组中的、合成外来蛋白的最终细胞位置、蛋白在宿主生物中的翻译效率和正确折叠、克隆基因的mRNA和蛋白在宿主细胞中的内部稳定性、以及在克隆基因中的密码子使用使得其频率接近宿主细胞中的优选密码子使用频率。这些特征中的每一个可用于本文所述的方法和宿主细胞以进一步优化Δ4去饱和酶的表达。

宿主细胞的转化

在制备重组构建体如包含嵌合基因的构建体后(所述嵌合基因包含启动子、ORF和终止子)，将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中或者将其直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组中随机地发生或者可以通过使用这样的构建体来靶向，即该构建体含有足以靶向宿主基因座中的重组的与宿主基因组同源的区。如果构建体靶向内源性基因座，则转录和翻译调控区的全部或某些可以由内源性基因座提供。

当两个或更多个基因从独立的复制载体表达时，每个载体可具有不同的选择手段并且应当缺乏与其他构建体的同源性以便维持稳定表达和防止元件在构建体之间重配(reassortment)。可用实验方法确定对调控区、选择手段和所引入的构建体的增殖方法的正确选择，以便所有导入的基因均以需要的水平表达从而提供期望产品的合成。

包含所关注的基因的构建体可以通过任何标准技术导入宿主细胞中。这些技术包括转化(如醋酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、基因枪轰击(bolistic impact)、电穿孔、显微注射、真空过滤或将所关注的基因引入到宿主细胞中的任何其他方法。

为方便起见，已经通过任何方法被操纵以摄取DNA序列(如表达盒)的宿主细胞在本文中将称为“转化的”或“重组的”。转化的宿主将具有至少一个拷贝的表达盒，而且可以具有两个或更多个拷贝，这取决于该表达盒是整合进扩增基因组内还是存在于具有多拷贝数的染色体外元件上。转化的宿主细胞可以通过多种选择技术来鉴定，如美国专利7,238,482和美国专利7,259,255中所述的技术。

转化后，适合于Δ4去饱和酶(以及任选在宿主细胞中共表达的其他PUFA酶)的底物可以由宿主自然产生或转基因产生，或者它们可以从外源提供。

ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程

有关本发明的Δ4去饱和酶序列的知识将可用于操纵多种宿主细胞中的ω-3和/或ω-6脂肪酸的生物合成。这种操纵可能需要直接在PUFA生物合成途径中进行代谢工程改造或需要另外对为PUFA生物合成途径贡献碳的途径进行操纵。

可用于上调期望的生化途径和下调不期望的生化途径的技术是本领域熟知的。例如，与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生化途径或干扰特定PUFA终产物产生的天然PUFA生物合成途径中的酶，可以通过基因破坏来去除或通过其他手段(如反义mRNA和锌指靶向技术(zinc-finger targeting technologies))来下调。

以下讨论改变PUFA生物合成途径从而分别提高GLA、ARA、EPA或DHA含量的方法，以及在TAG生物合成途径和TAG降解途径中的所期望的操纵：分别是国际申请公布WO 2006/033723，国际申请公布WO 2006/055322[美国专利申请公布2006-0094092-A1]，国际申请公布WO 2006/052870[美国专利申请公布2006-0115881-A1]和国际申请公布WO 2006/052871[美国专利申请公布2006-0110806-A1]。

用于Δ4去饱和酶的重组表达的优选宿主

多种真核生物适于作宿主，从而生成包含如本文所述的Δ4去饱和酶的转化体宿主生物。这些宿主可包括在多种原料上生长的宿主，所述原料包括单一或多种碳水化合物、脂肪酸、有机酸、油、甘油和醇、和/或广范围的温度和pH值的烃。基于申请人的受让人的需要，最初分离本文所述的基因用于在含油酵母(并且尤其是解脂耶氏酵母)中表达；然而预期的是，由于转录、翻译和蛋白质生物合成结构是高度保守的，因此任何细菌、酵母、藻类、原生藻菌、卵菌、类眼虫和/或真菌均将是用于表达本发明的核酸片段的合适微生物宿主。

优选的宿主是含油生物，例如含油酵母。这些含油生物天然能够合成并积聚油，其中总油含量可占细胞干重的约25％以上，更优选占细胞干重的约30％以上，而最优选占细胞干重的约40％以上。多种藻类、藓、真菌、酵母和原生藻菌被天然地归类为含油生物。通常鉴定为含油酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属。更具体地讲，示例性的油合成酵母包括：圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyii)、产油油脂酵母(L.Lipoferus)、拉可夫氏假丝酵母(Candida revkaufi)、铁红假丝酵母(C.Pulcherrima)、热带假丝酵母(C.Tropicalis)、产朊假丝酵母(Trichosporon pullans)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮状丝孢酵母(T.cutaneum)、胶粘红酵母(Rhodotorula glutinus)、牧草红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(以前归类为解脂假丝酵母(Candida lipolytica))。

最优选的是含油酵母解脂耶氏酵母；而且，在其他实施方案中，最优选的是命名为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。

涉及转化解脂耶氏酵母的具体教导内容包括美国专利4,880,741、美国专利5,071,764、以及Chen，D.C.等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，48(2)：232-235(1997))。应用于在解脂耶氏酵母中工程化ARA、EPA和DHA的特定教导分别在国际申请公布WO 2006/055322、国际申请公布WO 2006/052870和国际申请公布WO 2006/052871中提供。在含油酵母(即解脂耶氏酵母)中合成和转化包含Δ4去饱和酶的表达载体的详细方法在国际申请公布WO 2006/052871中提供。

在解脂耶氏酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合进宿主基因组中。当期望高水平表达基因时，整合到基因组中的多个位点中可为尤其有用的，如整合到Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(GenBank登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登录号XP_503244；或Aco3：GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(国际申请公布WO2004/104167)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)、Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)、SCP2基因座(GenBank登录号AJ431362)、Pex3基因座(GenBank登录号CAG78565)、Pex16基因座(GenBank登录号CAG79622)和/或Pex10基因座(GenBank登录号CAG81606)中。

优选的用于解脂耶氏酵母的选择方法是对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。5-氟乳清酸[5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”]可用于选择酵母Ura^-突变体。该化合物对具有编码乳清酸苷5′-单磷酸脱羧酶[OMP脱羧酶]的功能性URA3基因的酵母细胞有毒性；因此，基于这种毒性，5-FOA特别可用于选择和鉴定Ura^-突变型酵母菌株(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，OxfordUniversity：New York，第7卷，第109-147页，1997；也参见国际申请公布WO 2006/052870，用于5-FOA在耶氏酵母属中的应用)。

其他微生物宿主包括含油的细菌、藻类、类眼虫、原生藻菌和其他真菌；并且在这个广泛的微生物宿主组中，特别要关注的是天然生产ω-3/ω-6脂肪酸的微生物。例如，ARA、EPA和/或DHA经由小环藻属(Cyclotella sp.)、菱形藻属(Nitzschia sp.)、腐霉属(Pythium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)和被孢霉属(Mortierella)生产。因此例如转化高山被孢霉(Mortierellaalpine)，该生物商业上用于生产ARA，它具有在诱导型或调节型启动子控制下的任何本发明的Δ4去饱和酶基因(除Δ17去饱和酶和C_20/22延伸酶外)，可产生能够合成DHA的转化生物。高山被孢霉(M.alpina)的转化方法由Mackenzie等人描述(Appl.Environ.Microbiol.，66：4655(2000))。类似地，用于转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物(例如破囊壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium))的方法在美国专利7,001,772中公开。

在另一个实施方案中，宿主可为植物或其他动物。例如使用能易于进行工程化以生产PUFA的油料种子植物，所述植物包括：大豆(Glycine和Soja sp.)、玉米(Zea mays)、亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、报春花、油菜、玉米、棉花、红花(Carthamus sp.)和向日葵(Helianthus sp.)。参见例如美国专利申请公布2007-0237876A1。

不管选择的宿主或表达构建体，必须筛选多个转化体以获取显示期望的表达水平、调节和模式的菌株或植物品系。这种筛选可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的Western和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析来完成。

ω脂肪酸产生的发酵工艺

使转化的宿主细胞在优化去饱和酶嵌合基因的表达并且产生最大且最经济产量的期望PUFA的条件下生长。通常，可通过改变碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳氮比、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的时长、油积聚期的时长以及细胞收获的时间和方法来优化培养基条件。使所关注的含油酵母如解脂耶氏酵母通常在复合培养基如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉汤培养基(YPD)或缺乏生长所必需的成分并由此强迫选择所需表达盒的确定成分的极限培养基(如Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生长。

用于本文所述方法和宿主细胞的发酵培养基必须包含合适的碳源如在美国专利7,238,482中提出的碳源。合适的碳源涵盖多种来源，优选糖、甘油和/或脂肪酸。最优选的碳源是葡萄糖和/或包含介于10-22个碳之间的脂肪酸。

氮可以由无机源(如(NH₄)₂SO₄)或有机源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合适的碳源和氮源之外，发酵培养基还必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液、维生素和本领域技术人员已知的适合含油宿主生长并促进PUFA产生的酶促途径的其他组分。要特别注意促进脂质和PUFA合成的几种金属离子(如Fe⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²、Mg⁺²)(Nakahara，T.等人，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，第61-97页(1992))。

用于本文所述方法和宿主细胞的优选生长培养基是常规的商业制备培养基，如酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base，DIFCOLaboratories，Detroit，MI)。也可以使用其他确定成分的生长培养基或合成的生长培养基，适于转化宿主细胞生长的培养基对微生物学或发酵科学来说是已知的。适于发酵的pH范围通常介于约pH 4.0至pH 8.0之间，其中优选将pH 5.5至pH 7.5作为初始生长条件的范围。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，其中优选为微氧条件。

通常，在含油酵母细胞中积聚高水平的PUFA和TAG需要一个两阶段过程，因为代谢状态必须在生长和脂肪的合成/贮存之间达到“平衡”。因此，最优选两阶段发酵过程是在含油酵母中生产包含PUFA的油所必需的。这种方法在美国专利7,238,482中有所描述，其也描述了多种合适的发酵工艺设计(即分批式、补料分批式和连续式)和生长过程中的注意事项。

PUFA的纯化和处理

包括PUFA在内的脂肪酸可以游离脂肪酸或酯化形式如酰基甘油、磷脂、硫脂或糖脂形式存在于宿主微生物中。这些脂肪酸可通过本领域熟知的多种方法从宿主细胞中提取。关于酵母脂质的提取技术、质量分析和可接受标准的一篇综述是Z.Jacobs(Critical Reviews inBiotechnology，12(5/6)：463-491(1992))的综述。有关下游加工的简述也可从A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.，45：271-312(1997))中查到。

一般来讲，用于纯化脂肪酸(包括PUFA)的手段可包括用有机溶剂萃取(例如，美国专利6,797,303和美国专利5,648,564)、超声处理、超临界流体萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段(例如挤压)，或它们的组合。参见美国专利7,238,482。

PFUA在食物、保健食品、药物和动物饲料中的用途

市场包含许多种掺入了ω-3和/或ω-6脂肪酸(尤其是ALA、GLA、ARA、EPA、DPA和DHA)的食物和饲料产品。可以预期，通过本文所述方法和宿主细胞制备的包含长链PUFA的含油酵母生物质、包含PUFA的部分纯化生物质、包含PUFA的纯化油、和/或纯化的PUFA赋予健康有益效果，通过加入这些物质改善了对食物或饲料的摄取。举例来说，可将这些油加到食物类似物、饮料、肉产品、谷类产品、烘焙食品、小吃食品和乳制品中。参见美国专利公布2006-0094092。

这些组合物通过加入到医疗食品(包括医疗营养物质、饮食补充剂、婴儿代乳品和药品)中可赋予健康有益效果。技术人员将会知道加到食品、饲料、饮食补充剂、营养物质、药品、和其他可摄取的产品中以赋予健康有益效果的油的量。本领域描述了摄取这些油获得的健康有益效果，它是技术人员已知的并进行了持续的研究。本文所指的量是“有效”量，除了其他方面的原因，它取决于摄入的包含这些油的产品的性质以及它们旨在治疗的病症。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不完全限定其所有可能的变型。

一般方法

实施例中使用的标准的重组DNA技术和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有描述：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.的Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及3)Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

适用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是本领域熟知的。适用于下面实施例的技术可在以下文献中查到：Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.BriggsPhillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或Thomas D.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)。用于微生物细胞的生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均获自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。通常于37℃下在Luria Bertani(LB)平板上培养大肠杆菌(E.coli)菌株。

一般的分子克隆根据标准方法(Sambrook等人，同上)来完成。DNA序列是在ABI自动测序仪上采用染料终止剂技术(美国专利5,366,860；EP 272,007)使用载体和插入特异性引物的组合来产生的。序列编辑是在Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)中进行的。所有序列在两个方向上覆盖至少两次。除非另外指明，使用DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)来比较基因序列。

缩写的含义如下：“sec”表示秒，“min”表示分钟，“h”表示小时，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmol”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，并且“kB”表示千碱基对。

表达盒的命名

表达盒的结构通过简单的记号系统“X::Y::Z”表示，其中X描述启动子片段，Y描述基因片段，而Z描述终止子片段，它们均彼此可操作地连接。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根据下面所示的配方的数种培养基中于28-30℃下培育。根据标准方法，按需要通过将20g/L琼脂添加到每种液体培养基中来制备琼脂平板。

YPD琼脂培养基(每升)：10g酵母提取物[Difco]；20g细菌用蛋白胨[Difco]；以及20g葡萄糖。

极限培养基(MM)(每升)：20g/L葡萄糖；1.7g无氨基酸的酵母氮源基本培养基；1.0g脯氨酸；并且pH为6.1(未调节)。

高糖培养基(HGM)(每升)：80葡萄糖；2.58g KH₂PO₄；5.36gK₂HPO₄；pH7.5(不需调节)。

解脂耶氏酵母的转化根据Chen，D.C.等人(Appl.MicrobiolBiotechnol.，48(2)：232-235(1997))的方法完成，除非另外说明。简而言之，将耶氏酵母划线到YPD平板上，并在30℃下生长大约18小时。从平板上刮掉几大环量的细胞并将其重悬浮于含有下面成分的1mL转化缓冲液中：2.25mL 50％PEG，平均分子量为3350；0.125mL 2M醋酸锂，pH6.0；以及0.125mL 2M DTT。然后，将大约500ng线性化的质粒DNA在100μL重悬浮的细胞中孵育，并将其在39℃下维持1小时，每间隔15分钟进行涡旋混合。将细胞铺在选择培养基平板上并在30℃下保持2至3天。

分离解脂耶氏酵母菌株Y4184U

解脂耶氏酵母菌株Y4184经由表达Δ9延伸酶/Δ8去饱和酶途径，相对于总脂质产生EPA，该菌株如国际申请公布WO 2008/073367的实施例7所述生成。简而言之，如图5所示，菌株Y4184来源于解脂耶氏酵母ATCC #20362，经由构建菌株Y2224(FOA抗性突变体，来自野生型耶氏酵母属菌株ATCC #20362的Ura3基因的自发突变)、菌株Y4001(产生Leu-表型17％的EDA)、菌株Y4001U1(Leu-和Ura-)、菌株Y4036(产生Leu-表型18％的DGLA)、菌株Y4036U(Leu-和Ura-)、菌株Y4069(产生Ura-表型的12％的ARA)、菌株Y4084(产生14％的EPA)、菌株Y4084U1(Ura-)、菌株Y4127(产生18％的EPA并以保藏号ATCC PTA-8802在2007年11月29日保藏于美国典型培养物保藏中心)、菌株Y4127U2(Ura-)、菌株Y4158(产生25％的EPA)、菌株Y4158U1(产生Ura-)和菌株Y4184(产生相对于总TFA的30.7％的EPA)。

相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y4184的最终基因型是unknown 1-、unknown 2-、unknown 3-、unknown 4-、unknown 5-、unknown 6-、YAT1::ME3S::Pex16、EXP1::ME3S::Pex20(2拷贝)、GPAT::EgD9e::Lip2、FBAINm::EgD9eS::Lip2、EXP1::EgD9eS::Lip1、FBA::EgD9eS::Pex20、YAT1::EgD9eS::Lip2、GPD::EgD9eS::Lip2、GPDIN::EgD8M::Lip1、YAT1::EgD8M::Aco、EXP1::EgD8M::Pex16、FBAINm::EgD8M::Pex20、FBAIN::EgD8M::Lip1(2拷贝)、GPM/FBAIN::FmD12S::Oct、EXP1::FmD12S::Aco、YAT1::FmD12::Oct、GPD::FmD12::Pex20、EXP1::EgD5S::Pex20、YAT1::EgD5S::Aco、YAT1::Rd5S::Oct、FBAIN::EgD5::Aco、FBAINm::PaD17::Aco、EXP1::PaD17::Pex16、YAT1::PaD17S::Lip1、YAT1::Y1CPT1::Aco、GPD::Y1CPT1::Aco(其中FmD12是串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因[国际申请公布WO 2005/047485]；FmD12S是经密码子优化的Δ12去饱和酶基因，来源于串珠镰刀菌[国际申请公布WO 2005/047485]；ME3S是经密码子优化的C_16/18延伸酶基因，来源于高山被孢霉[国际申请公布WO 2007/046817]；EgD9e是小眼虫Δ9延伸酶基因[国际申请公布WO 2007/061742]；EgD9eS是经密码子优化的Δ9延伸酶基因，来源于小眼虫[国际申请公布WO 2007/061742]；EgD8M是合成突变型Δ8去饱和酶[国际申请公布WO 2008/073271]，来源于小眼虫[美国专利7,256,033]；EgD5是小眼虫Δ5去饱和酶[美国专利申请公布US2007-0292924-A1]；EgD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶基因，来源于小眼虫[美国专利申请公布2007-0292924]；RD5S是经密码子优化的Δ5去饱和酶，来源于多甲藻属CCMP626[美国专利申请公布2007-0271632]；PaD17是瓜果腐霉菌Δ17去饱和酶[国际申请公布WO2008/054565]；PaD17S是一种经密码子优化的Δ17去饱和酶，来源于瓜果腐霉菌[国际申请公布WO 2008/054565]；并且Y1CPT1是一种解脂耶氏酵母二酰基甘油胆碱磷酸转移酶基因[国际申请公布WO2006/052870])。

最后，为了破坏菌株Y4184的Ura3基因，构建体pZKUE3S(如国际申请公布WO 2008/073367的表22所述)用于将EXP1::ME3S::Pex20嵌合基因整合进菌株Y4184的Ura3基因中以分别产生菌株Y4184U1(占总脂质11.2％的EPA)、Y4184U2(占总脂质10.6％的EPA)和Y4184U4(占总脂质15.5％的EPA)(统称为Y4184U)。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

对于脂肪酸分析，将细胞通过离心收集并如Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))中所述提取脂质。通过将脂质提取物与甲醇钠进行酯交换反应而制备脂肪酸甲酯[“FAME”](Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46(1990))并随后将其用配有30m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890气相色谱仪(GC)进行分析。烘箱温度以3.5℃/分钟从170℃(保持25分钟)升到185℃。

为了进行直接的碱催化酯交换反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分钟。将甲醇钠(100μL，浓度为1％)加入样品中，然后将样品涡旋振荡20分钟。在加入3滴1M氯化钠和400μL己烷后，涡旋并离心样品。移出上层并如上所述用GC进行分析。

实施例1

小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594脂质特征、总RNA分离和 基因组DNA分离

小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594细胞(1升培养物)购自Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phytoplankton(CCMP)(Bigelow Laboratory for Ocean Sciences，West BoothbayHarbor，Maine)。将来自50mL培养物的细胞重悬在600μL溶解在甲醇中的甲醇钠中。将样品摇动20分钟，并加入50μL 1M的NaCl。混合后，加入600μL庚烷。将样品在Eppendorf微量离心管中涡旋和离心1分钟。小心地将上层与下层分离，并将其置于玻璃小瓶中用于GC分析。分析结果在下面的表3中示出。脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1(棕榈油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2、GLA、ALA、DGLA、ARA、EPA、DPA和DHA；并且将每种组合物表示为总脂肪酸的重量百分比[“TFA”]。

表3

小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594细胞的脂质特征

16:0	16:1	18:0	18:1	18:2	GLA	ALA	DGLA	ARA	EPA	DPA	DHA
												18.5	2.5	10	27.5	5	0	10.2	0.1	0.3	5.3	4.7	10.7

基于EPA、DPA和DHA的存在，推断出小型绿藻属cf_gymnasticaCCMP1594具有功能性Δ4去饱和酶，该酶能够将DPA(22:5，ω-3)转化成DHA(22:6，ω-3)。

使用trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)按照制造商规程从小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594中分离总RNA和基因组DNA。将来自1L培养物(体积～0.25mL)的细胞沉淀物重悬于0.75mL Trizol试剂中，与0.5mL 0.5mm的玻璃珠混合，并在最高设置下的Biospec微型珠粒打浆机(mini beadbeater)(Bartlesville，OK)中均化3分钟。将混合物在Eppendorf离心机中以14,000rpm离心30秒以移除碎屑和玻璃珠。用150μL 24∶1的氯仿∶异戊醇萃取上清液。将上面的水相用于RNA分离，而将下面的有机相用于DNA分离。

对于RNA分离，将水相与0.375mL异丙醇混合并让其在室温下孵育5分钟。通过在8,000rpm和4℃下离心5分钟收集沉淀的RNA。将沉淀物用0.7mL 80％的乙醇洗涤一次并风干。因此获得了720μg总RNA。

就基因组DNA分离而言，将下层有机相与75μL乙醇混合并将其在室温下孵育5分钟。然后将样品在Eppendorf离心机中以5,000rpm离心2分钟。将沉淀物用0.75mL 0.1M的柠檬酸钠在10％乙醇中洗涤两次。每次将样品在室温下于洗涤溶液中孵育15分钟，之后在4℃下于Eppendorf离心机中以5,000rpm离心5分钟。将沉淀物风干并再溶解于300μL 8mM的NaOH中。用1M HEPES将样品pH调节到7.5。然后进一步将DNA样品用Qiagen PCR纯化试剂盒，按照生产商的规程进行纯化。用这种方法从小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594中获得了45μg基因组DNA。

实施例2

小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594 cDNA合成

cDNA如下直接从小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594 mRNA合成。总RNA(2.4μg)来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594，它用作合成双链cDNA的模板。使用购自BD Bioscience Clontech(PaloAlto，CA)的Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction试剂盒。把一(1)μL总RNA样品与1μL SMART IV寡核苷酸(SEQ ID NO：10)，1μL CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：11)和2μL水混合。将混合物加热至75℃并在此温度加热5分钟，然后在冰上冷却5分钟。将2μL 5X第一链缓冲液、1μL 20mM的DTT、1μL dNTP混合物(10mM dATP、10mM dCTP、10mM dGTP和10mM dTTP)和1μL PowerScript逆转录酶加入样品中。将样品在42℃下孵育1小时。随后将所得第一链cDNA用作扩增的模板。该反应混合物含有2μL上述第一链cDNA样品、80μL水、10μL 10X Advantage 2PCR缓冲液、2μL 50X dNTP混合物(10mMdATP、12mM dCTP、10mM dGTP和10mM dTTP)、2μL 5’CDSIII PCR引物(SEQ ID NO：12)、2μL CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：11)和2μL 50X Advantage 2聚合酶混合物。使用以下条件进行PCR扩增：95℃1分钟，随后95℃10秒的20个循环，68℃6分钟。将扩增产物用Qiagen PCR纯化试剂盒按照制造商规程进行纯化。将经纯化的产物用50μL水洗脱。

实施例3

分离小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594 Δ4去饱和酶基因的编 码区的部分

本实施例描述通过使用来源于其他已知Δ4去饱和酶序列的保守区的引物来鉴定编码Δ4去饱和酶(本文命名为“E1594D4”(SEQ IDNO：1和2))的部分小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594基因。

小眼虫Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：13；GenBank登录号AY278558；Meyer等人，Biochemistry，42(32)：9779-9788(2003))、假微型海链藻Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：37；GenBank登录号AAX14506；Tonon等人，FEBS J.，272(13)：3401-3412(2005))、破囊壶菌属FJN-10Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：38；GenBank登录号AAZ43257)、和鲁兹巴夫藻(SEQ ID NO：42；GenBank登录号AAQ98793；Tonon等人，FEBS Lett.，553(3)：440-444(2003))如图2所示使用Clustal W方法进行比对(缓慢精确的Gonnet选项；Thompson等人，Nucleic Acids Res.，22：4673-4680(1994))，该方法来自DNASTAR软件的MegAlign^TM程序。基于这一比对，如表4所示设计简并引物(针对SEQ ID NO：13、37、38和42的引物位置在图2的加框区中显示)。

表4

用于扩增来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的Δ4去饱和 酶基因的简并寡核苷酸

[注意：用于SEQ ID NO：15-29的核酸简并密码如下所示：R＝A/G；Y＝C/T；H＝A/C/T；D＝A/G/T；并且N＝A/C/T/G。]

使用8种正向引物和2种反向引物的所有可能的组合，进行总共16个不同的PCR扩增反应。每个反应混合物包含1μL 1∶10稀释的小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594 cDNA(来自实施例2)，5μL各种正向和反向引物(20μm)，14μL水和25μL TaKaRa ExTaq 2X预混物(TaKaRa Bio，Mountain View，CA)。将热循环仪的条件设定为94℃1分钟，然后为30个循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃1分钟，之后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。通过在标准琼脂糖凝胶上进行电泳来分析PCR产物，并检测推定的Δ4去饱和酶片段，如下表5中所示。

表5

检测到的推定的Δ4去饱和酶片段

产物	正向引物	反向引物
			～800bp片段	D4-F3或D4-F4	D4-R1
～800bp片段	D4-F3	D4-R2
			～700bp片段	D4-F6、D4-F7或D4-F8	D4-R1或D4-R2

将上面表5中描述的片段的每一个用Qiagen PCR纯化试剂盒(Valencia，CA)纯化，克隆进pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并测序。

小型绿藻属cf_gymnastica CCMP 1594序列同一性通过执行BLAST进行测定(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))，在BLAST“nr”数据库中寻找包含的相似序列(包括所有非冗余GenBank CDS翻译、来源于3-维结构的Brookhaven Protein Data Bank的序列、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库)。采用由国家生物技术信息中心[“NCBI”]提供的BLASTN算法，分析序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。

BLAST序列分析显示引物对D4-F4/D4-R1和D4-F7/D4-R1生成的片段来自单个基因，该基因显示与来自其他生物的已知Δ4去饱和酶的广泛同源性。将序列装配到847bp的重叠群(SEQ ID NO：5)中，假定该重叠群编码来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的部分推定的Δ4去饱和酶。

实施例4

分离来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的全长Δ4去饱和 酶

基于如在SEQ ID NO：5中示出并且如实施例3所述的部分847bp的序列，设计引物以分离来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的cDNA样品的推定Δ4去饱和酶基因5’和3’末端。

分离Δ4去饱和酶5’编码区

通过巢式PCR扩增cDNA末端来分离来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的推定Δ4去饱和酶的5’区域。基于推定Δ4去饱和酶基因的部分序列，引物1594D4-5-1(SEQ ID NO：30)与来自BD-Clontech Creator^TM Smart^TM cDNA文库试剂盒的5’CDSIII PCR引物(SEQ ID NO：12)联合使用以进行第一轮扩增。反应混合物包含1μL各种引物(10μm)，1μL小型绿藻属cf_gymnastica CCMP 1594cDNA(～50ng)，22μL水和25μL TaKaRa ExTaq 2X预混物。将热循环仪的条件设定为94℃60秒，然后30次循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃30秒，之后在72℃进行5分钟最后的延伸反应。

第二轮PCR扩增使用1μL来自第一轮PCR反应的稀释产物作为模板，其中PCR产品用水进行1∶50稀释。如上所述进行扩增，不同的是使用1μL的引物1594D4-5-2(SEQ ID NO：31)和DNR CDS 5-2(SEQID NO：32)(每种引物的原液10μm)。

将来自第二轮PCR产物的359bp DNA片段克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中并测序。将片段(SEQ ID NO：6)命名为“E1594D4-5’-A”，如分析所示该片段部分地与初始E1594D4部分片段(SEQ IDNO：5)及其进一步延伸的上游部分重叠。然而在SEQ ID NO：6的延伸的359bp片段中无翻译起始密码子。基于与已知Δ4去饱和酶的序列比较，假定大约400bp从5’-末端缺失。

利用与上述那些条件相同的PCR条件，重复上文利用的获取E1594D4-5’-A片段的方法以获取E1594D4基因的附加5’区域。然而在第一轮扩增中引物1594D4-5-4(SEQ ID NO：33)置换了引物1594D4-5-1(SEQ ID NO：30)。在以1∶50稀释第一轮的产物后，使用引物1594D4-5-5(SEQ ID NO：34)替代引物1594D4-5-2(SEQ ID NO：31)进行第二轮PCR。

将第二轮PCR产物中的～400bp DNA片段克隆到pCR2.1-TOPO中并测序。序列分析显示该片段包含E1594D4基因的5’末端，包括起始密码子和9bp的5’非翻译区。将该片段命名为“1594D4-5’-B”(SEQ ID NO：7)。

分离Δ4去饱和酶3’编码区

也通过巢式PCR扩增来分离推定Δ4去饱和酶的3’区域。在第一轮中，反应混合物包含1μL各种引物1594D4-3-1(SEQ ID NO：35，10μm)和引物CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO：11，10μm)，1μL小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594cDNA(～50ng)，22μL水和25μLTaKaRa ExTaq 2X预混物。将热循环仪的条件设定为94℃60秒，然后30次循环的94℃20秒、55℃20秒和72℃30秒，之后在72℃进行7分钟最后的延伸反应。就第二轮PCR而言，反应混合物包含1μL各种引物1594D4-3-2(SEQ ID NO：36，10μm)和CDSIII/3’PCR引物(SEQID NO：11，10μm)，1μL 1∶50稀释的第一轮PCR产物，22μL水和25μLTaKaRa ExTaq 2X预混物。PCR条件与第一轮PCR使用的条件相同。

第二轮PCR产生约900bp的DNA片段。将该片段克隆到pCR2.1-TOPO中并测序。序列分析显示该片段(命名为“1594D4-3”并如SEQ ID NO：8所示)包括E1594D4基因的3’区域。

完全Δ4去饱和酶编码序列的装配和分析

通过装配E1594D4部分片段(SEQ ID NO：5)、1594D4-5’-A片段(SEQ ID NO：6)、1594D4-5’-B片段(SEQ ID NO：7)和1594D4-3’片段(SEQ ID NO：8)测定完全推定小型绿藻属cf_gymnasticaCCMP1594 Δ4去饱和酶(E1594D4)基因的cDNA序列。2070bp的cDNA序列包括9bp的5’非翻译区和516bp的3’非翻译区，将其命名为“E1594D4-cDNA”(SEQ ID NO：9)。E1594D4CDS长度为1345bp(SEQ ID NO：1)并编码514个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)。

使用NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W.和States，D.J.，NatureGenetics，3：266-272(1993))比较E1594D4序列(即SEQ ID NO：2)与包含在“nr”数据库中的所有公开可用的蛋白序列的相似性。根据百分比同一性、百分比相似性和期望值(Expectation value)，报告了BLASTX比较的结果，该结果总结了与SEQ ID NO：2具有最大相似性的序列。“百分比同一性”定义为两种蛋白质之间相同的氨基酸的百分比。“百分比相似性”定义为两种蛋白质之间相同的或保守的氨基酸的百分比。“期望值”用给定分值估计限定匹配数的匹配的统计显著性，该匹配数是在完全偶然地搜索数据库中这种大小片段时所预期的。

因此发现SEQ ID NO：2与来自假微型海链藻(Thalassiosirapseuduonana)的Δ4脂肪酸去饱和酶(SEQ ID NO：37；GenBank登录号AAX14506)的氨基酸序列具有65％的同一性和76％的相似性，期望值(Expectation value)为0.0。此外全长E1594D4基因与其他Δ4脂肪酸去饱和酶具有同一性和相似性。更具体地讲，在来自小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594(SEQ ID NO：2)、假微型海链藻(SEQ IDNO：37，同上)、小眼虫(SEQ ID NO：13；GenBank登录号AY278558)和破囊壶菌属FJN-10(SEQ ID NO：38；GenBank登录号AAZ43257)的Δ4去饱和酶蛋白之间进行成对比较的结果的百分比相似性如下表6所示，该比较使用Clustal W分析(DNASTAR软件的MegAlign^TM程序)。

表6

不同Δ4去饱和酶之间的百分比相似性

实施例5

用于解脂耶氏酵母的经密码子最优化的Δ4去饱和酶基因 [“E1594D4S”]的合成

对小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594(SEQ ID NO：1和2；“E1594D4”)的Δ4去饱和酶基因的密码子使用进行优化以在解脂耶氏酵母中表达，优化方法类似于在国际申请公布WO 2004/101753和美国专利7,125,672中描述的方法。具体地讲，基于E1594D4的Δ4去饱和酶基因的编码序列，根据耶氏酵母属密码子使用模式(命名为“E1594D4S”，SEQ ID NO：3和4)(国际申请公布WO 2004/101753)、围绕‘ATG’翻译起始密码子的共有序列、以及RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))来设计密码子优化的Δ4去饱和酶基因。修饰了1545bp的编码区的总计200bp(12.9％；图3)并且优化了191个密码子(37.1％)。GC含量从野生型基因(即E1594D4)中的56.1％减少到合成基因(即E1594D4S)中的54.6％。分别将NcoI位点和NotI位点整合到E1594D4S的翻译起始密码子的周围和终止密码子之后。为了围绕翻译起始密码子添加一个NcoI位点，E1594D4S有一个附加的丙氨酸氨基酸插入到野生型E1594D4的氨基酸残基1和2之间；因此E1594D4S的总长度为515个氨基酸(SEQ ID NO：4)。设计的E1594D4S基因(SEQ ID NO：3；在图4A中标记为“1594D4S”)由GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成并且被克隆到pUC57(GenBank登录号Y14837)中以生成p1594D4S(图4A；SEQ ID NO：39)。

实施例6

生成包含E1594D4S的构建体pZKL4-220ESC4

本实施例描述质粒pZKL4-220ESC4的构建。构建该质粒以将两个嵌合C_20/22延伸酶基因和一个嵌合E1594D4S基因整合到解脂耶氏酵母的脂肪酶4-样基因座(GenBank登录号XM_503825)中。设计该质粒以将嵌合基因整合到解脂耶氏酵母基因组中，然后允许在解脂耶氏酵母中研究来源于小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594的密码子优化的Δ4去饱和酶的功能。

质粒pZKL4-220ESC4(图4B)包含以下组分：

表7

质粒pZKL4-220ESC4(SEQ ID NO：40)的组分

实施例7

密码子优化的Δ4去饱和酶(“E1594D4S”)在解脂耶氏酵母株 Y4184U4中的表达

将包含E1594D4S的pZKL4-220ESC4质粒(实施例6)用AscI/SphI消化，然后使用标准转化程序用于转化菌株Y4184U4(一般方法)。在MM平板上选择转化株。在30℃生长4天后，采集在MM平板上生长的3个转化体并再划线接种到新MM平板上。生长之后，将这些菌株和对照菌株一一接种在30℃下的3mL液体MM中，以250rpm/min摇动2天。通过离心收集细胞，将其重悬浮于高糖培养基[“HGM”]中，然后以250rpm/min摇动5天。离心收集细胞，提取脂质，通过酯交换反应制备脂肪酸甲酯[“FAMEs”]，并随后用Hewlett-Packard 6890 GC分析。

结果如下表8所示。具体地讲，脂肪酸被鉴定为16:0(棕榈酸)、16:1、18:0(硬脂酸)、18:1(油酸)、LA、ALA、EDA、DGLA、ARA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA；并且脂肪酸组成表示为总脂肪酸的重量百分比(wt.％)[“TFA”]。

表8的GC分析显示在所有三个转化体中产生了占总脂质约2％的DHA和10.2％的DPA，但是在对照Y4184菌株中不产生这些产物。在表达E1594D4S的三个转化菌株中测定的底物转化成DHA的转化效率为约16％。根据下式测量转化效率：([产物]/[底物+产物])×100，其中‘产物’包括中间产物和该途径中来源于它的所有产物。因此该实验数据证明来源于小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594并且其经密码子最优化以在解脂耶氏酵母中表达(E1594D4S，如在SEQ ID NO：3中所示)的合成Δ4去饱和酶具有将底物DPA转化成DHA的活性。

Claims (7)

1.分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：

(a)编码SEQ ID NO：4所示的Δ4去饱和酶的分离的核苷酸序列；和

(b)与(a)完全互补的分离的核苷酸序列。

2.权利要求1的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子如SEQ IDNO：3所示。

3.编码Δ4去饱和酶SEQ ID NO：4的多肽。

4.包含权利要求1的分离的核酸分子的嵌合基因，所述分离的核酸分子可操作地连接至至少一种调控序列。

5.耶氏酵母属宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1的分离的核酸序列。

6.制备多不饱和脂肪酸的方法，所述多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸和全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸，所述方法包括：

a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含：

(i)编码SEQ ID NO：4所示的Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子；和

(ii)选自全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸和二十二碳四烯酸的源脂肪酸；

b)使步骤(a)的宿主细胞在表达编码所述Δ4去饱和酶多肽的核酸片段并且将所述源脂肪酸转化成选自二十二碳六烯酸和全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸的多不饱和脂肪酸的条件下生长，

使得当全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸是所述源脂肪酸时，则二十二碳六烯酸是所产生的多不饱和脂肪酸；并且

当二十二碳四烯酸是所述源脂肪酸时，则全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸是所产生的多不饱和脂肪酸；和

c)任选地回收步骤(b)中产生的多不饱和脂肪酸。

7.权利要求6的方法，其中：

a)所述分离的核酸分子具有SEQ ID NO：3所示的核酸序列；并且

b)所述宿主细胞是耶氏酵母属。

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