KR102054761B1 - 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자 - Google Patents

갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자를 분리하여 그 기능을 확인하고, 알파리놀레산(ALA)을 함유하는 들깨 등 유지작물에 이용할 경우, EPA 또는 DHA과 같은 오메가-3의 고도불포화지방산을 생성하기 위한 대사공학기술에 적용될 수 있다.

Description

갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자 {Delta-4 desaturase gene from Berryteuthis magister}
본 발명은 신규한 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)는 오메가-3, 오메가-6 로 크게 구분된다. PUFAs는 한쪽 말단이 carboxyl기 또다른 말단은 methyl기로 이루어진 탄소원자로 연결된 긴 사슬로 구성되어있다.오메가-3 지방산은 methyl기 말단으로부터 3번째 탄소위치에 이중결합이있는 지방산으로써, 때때로 “n-3s”로 표시하기도하며 아마씨, 물고기 등에 존재한다.
오메가-3 지방산에 여러종류가 해당하나, 현재까지 대부분의 연구는 3종의 지방산 즉,(ALA(alpha-linolenic acid), EPA(eicosapentaenoic acid, DHA(docosahexaenoic acid)에 집중하고 있는 실정이다. ALA가 18 개의 탄소원자로 이루어진 반면, EPA와 DHA는 각각 20 및 22개의 탄소 원자로 구성되어 장쇄형 오메가 3(long-chain omega-3s) 지방산으로 분류되고 있다(‘12, GOED).
PUFAs 는 탄소원자의 수 와 이중결합의 수에 의하여 분류된다. ALA (Alpha-linolenic acid)는 3개의 이중결합을 포함한 18개의 탄소로 이루어진 오메가-3 지방산이므로 C18:3n-3로 표기하고, 또한 EPA (eicosapentaenoic acid)는 C20:5n-3로 DHA(docosahexaenoic acid)는 C22:6n-3로 각각 표기한다.오메가-6 지방산은 지방산의 methyl기 말단으로부터 6번째 탄소에 이중결합을 가진다. Linoleicacid (C18:2n-6)와 arachidonic acid (C20:4n-6)등이 중요 오메가6 지방산에 해당한다.
인간은 methyl기로부터 9번째 탄소이후부터 이중결합을 형성할 수 있다.따라서 ALA(C18:3n-3)와 linoleic(C18:2n-6)는 필수 지방산으로 음식물을 통해 반드시 습취 하여야 한다(Jones PJH and Papamandjaris).
ALA는 주로 간에서 EPA 또는 DHA로 전환 될수 있으나, 전환율은 15%이하에 불과하여 (Harris WS), 음식물을 통해서 EPA 와 DHA를 습취해야만, 체내에서 이들 지방산을 유지시킬수 있다. ALA는 아마, 콩, 유채 등의 식물성기름에 존재한다(Harris WS). DHA와 EPA는 물고기, 물고기 기름, 크릴(부유성 갑각류) 기름 등에 존재하나, 근원적으로는 물고기에 의해서가 아니라 미세조류에 의 합성되는 것이다. 즉, 물고기가 미세조류인 식물성 플랑크톤을 습취함으로써 오메가3를 축적 하게된다 (Harris WS 등).
체내에서의 오메가3는 세포벽 의 막을 형성하는 인지질 의 요소를 이루는 중요한 기능을 한다. 특히 DHA는 망막, 뇌, 정자(sperm) 등에 고 함량 존재한다(SanGiovanni JP 등).또한 세포막에서 구조적 역할 뿐만 아니라 오메가-3는 인체의 에너지원이 되며, eicosanpids (signaling 물질)형성에 이용된다. Eicosanoids는 지방산과 유사한 화학구조와 유사한 신호 물질이다. 이들은 인체의 심혈관(catdiovascular), 폐(pulmonary), 면역(immune)그리고 내분비기관(endocrine systems) 등에 광범위한 기능을 한다(Jones PJH 등).
현재까지는 불포화지방산 합성을 위한 효모, 박테리아에서 분리된 불포화효소의 염기서열 등의 기능 분석이 다수 있었으나, 다른 생물로부터 유래한 불포화지방산 합성효소에 대한 연구가 전혀 이루어지지 않고 있다.
이에 본 발명자들은 두족류인 Berryteuthis magister로부터 신규 불포화효소 유전자를 분리하고, 이의 우수한 불포화지방산 합성 기능을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허정보 제 2014-0132226호
Harris WS. Omega-3 fatty acids. In: Coats PM,Betz JM, Blackman MR, rtal.,eds. Ecyclopedia of Dietary Supplements.2nd ed. London and NewYork: Informa Healthcare;2010: 577-86 Jones PJH, Papamandjaris AA. Lipid: cellular metabolism. In: Erdman JW, macdonald IA, Zeisel SH, eds. Presentknowledgein Nutrition.10th ed. Washington, DC: Wiley-Blackwell;2012:132-48. Qiu X, Hong H, Mackenzie. (2001) Identification of a Delta 4 fatty acid desaturase from Thraustochytrium sp. involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and Brassica juncea.J Biol Chem 276(34) 31561-6 Somerville C, Browse J, Jaworski JG, Ohlorogge J. Lipids plants. 2000, pp.456-517, American Society of Plant Physiologists, Rockville. Ohlrogge JB. Design of new plant products engineering of fatty acid metabolism, Plant physiology, 1994, 104:821-826. SanZGiovanni JP,Chew EY. The role of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in health and disease of the retina. Prog Retin eye Res 2005;24: 87-138. Kinney AJ, Ch Cahoon EB, Hitz WD. Manipulating desaturase activities in transgenic crop plants, Biochem Soc. Trans. 2000, 30:1099-1103. (비특허문서 8) Yilmaz JL, Lim ZL, Beqanovic M,Breazeale S, Andre C, Stymne S, Vrinten P, Senger T(2017) Determination of SubstratePreferences for Desaturases and Elongases for Production of Docosahexaenoic Acid from Oleic Acid in Engineered Canola. Lipid 52(3) 207-222
본 발명의 목적은 갈고리 흰오징어에서 분리된 델타-4 불포화효소 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자로 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 델타-4 불포화효소(Delta4 Desaturase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 DHA(docosahexaenoic acid)를 생산하는 방법을 제공한다.
인체에 유익한 생리활성 기능이 많이 알려져 있는 EPA 또는 DHA와 같은 고도 불포화지방산은 현재 고부가 건강식품으로 시판되고 있는 바, 따라서 본 발명의 활성이 우수한 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 유전자를 분리하여 이용할 경우, EPA 또는 DHA와 같은 고도 불포화지방산 생산능을 향상시킬 수 있다.
도 1은 장쇄형 오메가3 지방산(DHA) 생합성 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 DHA 생합성 효소 유전자군을 분리하기 위하여 갈고리 흰오징어의 안구조직으로부터 total RNA를 분리하고 (도 2A) cDNA를 합성한 결과를 나타낸 것이다(도 2B).
도 3은 갈고리 흰오징어의 안구조직으로부터 분리된 RNA로 합성한 cDNA를 이용하여 RNA 시퀀싱한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 갈고리 흰오징어 유래의 델타-4 불포화효소 유전자 염기서열 및 유전자 분리를 PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 델타-4 불포화효소 유전자 발현 효모 형질전환 운반체 및 상기 효모 발현 운반체 제작을 위해 제한효소 절단 부위를 삽입한 델타-4 불포화효소 유전자를 나타낸 것이다..
도 6는 pYES 및 pYES-BmD4DES 형질전환 효모의 기질 DPA(22:5)에 대한 DHA(22:6)로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 pYES 및 pYES-BmD4DES 형질전환 효모의 기질 DPA(22:5)에 대한 DHA(22:6)로의 전환의 전환비율을 분석한 것이다.
본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 델타-4 불포화효소 단백질의 범위는 갈고리 흰오징어로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 생물체내에서 DPA(docosapentaenoic acid)를 기질로 하여, 고도 불포화 지방산인 DHA(docosahexaenoic acid)로 전환시키는 활성을 의미한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래 델타-4 불포화효소(Delta4 Desaturase)를 코딩하는 유전자.를 제공한다.
상기 델타-4 불포화효소가 분리된 갈고리 흰오징어의 부위는 갈고리 흰오징어의 안구조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 갈고리 흰오징어(schoolmaster gonate squid; Berryteuthis magister)는 수심 1300m 중 500m에 40% 존재하며, 동해 심해 해역(독도 인근)인 500m 수심에서 대량 서식하는 두족류로, 심해 자원 및 식용으로의 이용 가능성으로 주목받고 있는 어종이다. 본 발명에서는 갈고리 흰오징어의 안구조직으로부터 RT-PCR방법을 이용하여 델타-4 불포화효소 유전자 클론을 선발하여 유전자의 염기서열을 결정하였다.
본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어질 수 있고, 오픈리딩 프레임(ORF)을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 유전자에 의해 번역되는 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소 단백질은 DPA(docosapentaenoic acid)를 기질로 하여, DHA(docosahexaenoic acid)를 생성하는 효소(도 1)로서, 막-결합 부위와 지방산의 불포화를 촉매하는 활성 부위를 갖는다. 또한, 상기 유전자 서열 또는 아미노산 서열 분석 결과, 이전에 기능이 밝혀진 문어(Octopus bimaculoides) 유래 델타-4 불포화효소(‘15, Albertin CB et al., Nature)와 75%의 상동성을 나타내었다.
또한, 본 발명은 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 발현 벡터의 예로써는 대장균 발현벡터 pQE30 시리즈, 효모 발현벡터 pYES2 가 있으며, 특히 피딩 테스트(feeding test)를 위하여 숙주로서 효모를 사용하고, 갈락토스에 의해 단백질 발현을 유도할 수 있는 효모 유래의 발현벡터인 pYES2를 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서는 효모 유래의 발현벡터 pYES2를 사용하여 상기 갈고리 흰오징어 유래 델타-4 불포화효소를 코딩하는 유전자 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하였고, 상기 재조합 발현 벡터를 본 발명에서 “pYES2-BmD4DES”로 명명하였다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포 또는 형질전환체를 제공한다. 본 발명에서 상기 숙주세포는 식물세포 또는 효모 일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물세포의 예를 들면 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류로부터 유래된 식물세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 식물의 씨, 열매, 가지 또는 잎에 지방 성분을 포하하고 있는 유지식물의 세포일 수 있고, 상기 유지식물은 유채, 들깨 및 참깨로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다..
본 발명에 있어서 식물세포로의 형질전환은 유전자를 식물세포에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서 식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 BrPSR 유전자를 보유하는 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 이외에도 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) 등의 방법을 이용할 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함한다.
본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 포함될 수 있고, 세포배양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 포함할 수 있다.
여기서, '형질전환체'란 프로모터와 작동 가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.
본 발명자들은 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2-BmD4DES를 제작한 후, 이 발현벡터를 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 형질전환시켜 안정적인 효모 형질전환체를 확립하였다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 델타-4 불포화효소(Delta4 Desaturase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 DHA(docosahexaenoic acid)를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 숙주세포는 식물세포 또는 효모일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 방법을 통해서 얻어진 효모 형질전환체는 델타-4 불포화효소 단백질을 발현시켰으며, DPA(docosapentaenoic acid)를 기질로 하여, DHA(docosahexaenoic acid)으로 전환시킴을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 의하여, 갈고리 흰오징어 유래의 델타-4 불포화효소를 코딩하는 신규 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 식물체 등에 형질전환시킴으로써, 형질전환된 식물세포로부터 고부가치 있는 고도 불포화 지방산의 생산능이 우수한 농작물 소재를 제공할 수 있음을 확인하였다.
상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계에 있어서, 얻어진 본 발명의 일 실시 예에서 제조된 pYES2-BmD4DES를 효모에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection) 등이 있으며, 효모를 숙주로 하는 경우, 리튬아세테이트법(lithium acetate method)을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 갈고리 흰오징어 유래 델타4 불포화효소 유전자( BmD4DES ) 분리 및 상동성 분석
갈고리 흰오징어( Berryteuthis magister)의 안구조직으로부터 총 RNA(total RNA)를 분리하여 cDNA를 합성하고, RNA 시퀀싱을 실시하였다(도 2). 1억 2000만개 이상의 유전자 단편을 해독하였고(도 3A), 총 해독 정보량은 124억 bp 로서, 신규 유전자를 발굴하기에 충분한 양을 해독하였다(도 3B).
DHA 생합성 효소 유전자 군을 확보하기 위해서 오징어와 같은 두족류에 해당하는 문어에서 유래한 델타-4 불포화효소 유전자(D4DES) 및 아미노산 서열을 reference로하여 유전자 및 단백질 수준에서 비교 분석하여, 갈고리 흰오징어 유래 963 bp 크기의 신규 델타-4 불포화효소 유전자(BmD4DES)를 분리하였다(도 4), pGEM에 클로닝하여 염기서열 분석을 함으로써, 델타-4 불포화효소 효소유전자(D6DES)임을 확인하였다. 분리된 갈고리 흰오징어 유래 신규 BmD4DES 유전자는 상기 문어 유래 D4DES유전자와 유전자 수준에서 75% 상동성을 보였다.
실시예 2. BmD4DES 유전자의 효모 발현운반체 제작 및 형질전환 확인
델타-4 불포화효소 유전자(BmD4DES)의 전체 오픈리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 효모 발현 운반체인 pYES2의 제한효소 KpnI 및 XbaI 사이트에 삽입하여 발현운반체를 제작하였다(도 5). 제작된 운반체는 lithium acetate법을 이용하여 S. cerevisiae에 형질 전환되고 uracil이 결핍된 최소배지에서 선발되었다. 선발된 클론은 PCR을 통하여 대조군인 벡터만 있는 pYES2와 비교하여 삽입된 BmD4DES 유전자가 있음을 확인하였고 (도 5), 이 클론들을 다시 E. coli에 역 형질 전환하여 올바른 클론임을 확인하였다.
실시예 3: BmD4DES 발현에 의한 고도불포화지방산 합성 확인
델타-4 불포화효소 유전자가 삽입된 효모 (pYES2-BmD4DES)를 이용하여 유전자의 기능을 확인하기 위하여 uracil결핍 최소 배지, raffinose/galactose를 첨가한 배지에 형질전환 효모를 28℃에서 seed culture하였다. Seed culture한 효모를 새로운 배지에 최종농도 OD600=0.4가 되도록 접종하고 기질 DPA (Docosapentaenoic acid, 22:5)를 최종농도 0.5 mM 되게 넣어주고, 배양은 20oC에서 3일간, 15℃에서 3일간 배양하여 유전자의 발현을 통한 기질의 새로운 산물로의 전환을 유도하였다. 대조구는 pYES2 운반체만 형질전환된 효모를 이용하였다. 델타-4 불포화효소 유전자 산물의 활성을 통해 기질인 DPA (Docosapentaenoic acid, 22:5)으로부터 BmD4DES 효소에 의해 또 하나의 이중결합이 생긴 새로운 산물인 DHA (Docosahexaenoic acid, 22:6)로 성공적으로 전환되는지의 여부를 확인하기 위하여 가스크로마토그래피 분석을 하였다(도 6).
그 결과, 전환률이 61.98% 임을 확인하였다(도 6 및 도 7). 전환율은 ([생성량]/[기질 양+생성량])*100의 공식에 의해 계산했다. 그러므로 갈고리 흰오징어로부터 분리된 델타-4 불포화효소 유전자는 DPA로부터 DHA를 합성하는데 관여함을 확인하였다. 또한 이러한 결과는 기존에 알려진 델타-4 불포화 효소의 DHA 전환률과 비교할 때 현저히 우수함을 확인하였다(표 1)
Source 전환율(DPA→DHA) 비 고
Berryteuthis magister 61.98% This work
Thraustochytrium sp 4.5% Qiu et al(2001) J Biol Chem
hraustochytrium sp 21% Senger et al(2017) Lipids
Pavlova lutheri 44% Sanger et al (2017) Lipids
따라서, 본 발명의 갈고리 흰오징어에서 분리된 델타-4 불포화효소는 DHA 생합성 할 수 있음을 알 수 있고, 또한 DHA과 같은 고도 불포화지방산을 생성하기 위한 대사공학기술에 적용될 수 있음을 확인하였다.
<110> Republic of Korea <120> Delta-4 desaturase gene from Berryteuthis magister <130> P17R12C1754 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 963 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Berryteuthis magister <400> 1 atgggagcta aagtgacccg aacagatttt gagtggagtt atacccagga acctcatgcc 60 acccggagga aagaaatcat ggcgaaatat cctcaagtga agaagctgtt tggtcctgat 120 tataaaacca agtacattgt ggtggtgctg gtgctagtgc agatgatggc catgtttata 180 gtgaaggact ggtcttggcc aaacatgctc attctcgcct actgcttcgg tggggtcatt 240 aaccactcac tgtctctcgc tatccacgaa atctcccaca atctcgcctt cggaacgaga 300 cacctactcg caaaccggat cctgggcatg gtcgccaacc ttccgctcgg agtccccgta 360 tccatcacgt tcagaaaata ccacctggag caccaccgat accaagggga cgaagagaaa 420 gacgtagaca tcccgagtaa aatagaagcc gttcttttca ctcgtacggt gacgaaattc 480 atttgggtca ttttgcagcc cctgttttat agcatcaggc ccttcttcat gcgtccgaaa 540 ccattggaaa tgttggaatt gatcaacatc atcgccaatt tctcctttga tttcatcgtc 600 ttttatttat tcggtgccaa accccttctc tatatgataa gtggtacgct gcttgccaca 660 ggactacatc cgatggctgg tcactttatc tctgagcatt atatgtttaa aaaaggctac 720 gagacctact cgtactatgg tatcctgaac tacatcacat ttaatgttgg ttatcacaat 780 gaacatcatg atttcccctt cgttgctgga accaacctgc cagcgctgaa aaagatggca 840 ccagaatatt atgacgatct cccatgccat acatcgtggg tgaaggtcat ctgggatttc 900 atcacggacc ctgacattgg cccttatgcc agggtgaagc gtccagcgtc caaggcggca 960 taa 963 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Berryteuthis magister <400> 2 Met Gly Ala Lys Val Thr Arg Thr Asp Phe Glu Trp Ser Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Glu Pro His Ala Thr Arg Arg Lys Glu Ile Met Ala Lys Tyr Pro Gln 20 25 30 Val Lys Lys Leu Phe Gly Pro Asp Tyr Lys Thr Lys Tyr Ile Val Val 35 40 45 Val Leu Val Leu Val Gln Met Met Ala Met Phe Ile Val Lys Asp Trp 50 55 60 Ser Trp Pro Asn Met Leu Ile Leu Ala Tyr Cys Phe Gly Gly Val Ile 65 70 75 80 Asn His Ser Leu Ser Leu Ala Ile His Glu Ile Ser His Asn Leu Ala 85 90 95 Phe Gly Thr Arg His Leu Leu Ala Asn Arg Ile Leu Gly Met Val Ala 100 105 110 Asn Leu Pro Leu Gly Val Pro Val Ser Ile Thr Phe Arg Lys Tyr His 115 120 125 Leu Glu His His Arg Tyr Gln Gly Asp Glu Glu Lys Asp Val Asp Ile 130 135 140 Pro Ser Lys Ile Glu Ala Val Leu Phe Thr Arg Thr Val Thr Lys Phe 145 150 155 160 Ile Trp Val Ile Leu Gln Pro Leu Phe Tyr Ser Ile Arg Pro Phe Phe 165 170 175 Met Arg Pro Lys Pro Leu Glu Met Leu Glu Leu Ile Asn Ile Ile Ala 180 185 190 Asn Phe Ser Phe Asp Phe Ile Val Phe Tyr Leu Phe Gly Ala Lys Pro 195 200 205 Leu Leu Tyr Met Ile Ser Gly Thr Leu Leu Ala Thr Gly Leu His Pro 210 215 220 Met Ala Gly His Phe Ile Ser Glu His Tyr Met Phe Lys Lys Gly Tyr 225 230 235 240 Glu Thr Tyr Ser Tyr Tyr Gly Ile Leu Asn Tyr Ile Thr Phe Asn Val 245 250 255 Gly Tyr His Asn Glu His His Asp Phe Pro Phe Val Ala Gly Thr Asn 260 265 270 Leu Pro Ala Leu Lys Lys Met Ala Pro Glu Tyr Tyr Asp Asp Leu Pro 275 280 285 Cys His Thr Ser Trp Val Lys Val Ile Trp Asp Phe Ile Thr Asp Pro 290 295 300 Asp Ile Gly Pro Tyr Ala Arg Val Lys Arg Pro Ala Ser Lys Ala Ala 305 310 315 320

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래 델타-4 불포화효소(Delta4 Desaturase)를 코딩하는 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 델타-4 불포화효소는 갈고리 흰오징어 안구로부터 분리된 것인 유전자.
  3. 제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
  4. 제 3항의 발현벡터로 형질전환된 효모.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항의 유전자로부터 암호화되는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 델타-4 불포화효소 단백질.
  8. 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 갈고리 흰오징어(Berryteuthis magister) 유래의 델타-4 불포화효소(Delta4 Desaturase) 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 효모를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 효모에서 DHA(docosahexaenoic acid)를 생산하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 효모에 존재하는 DPA(docosapentaenoic acid)를 기질로 사용하는 것인, 효모에서 DHA(docosahexaenoic acid)를 생산하는 방법.
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