CN101724637B

CN101724637B - 球等鞭金藻δ9延长酶的核苷酸序列及其应用

Info

Publication number: CN101724637B
Application number: CN2009102450365A
Authority: CN
Inventors: 李明春; 黎明; 魏东盛; 欧秀元; 邢来君
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2029-12-23
Also published as: CN101724637A

Abstract

本发明涉及一种从产DHA的球等鞭金藻中分离的编码Δ⁹延长酶的核苷酸序列及其应用。它是具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或编码具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列及其多肽。本发明包括编码Δ⁹延长酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体以及含有本发明重组表达载体的酵母细胞、霉菌细胞及其后代细胞。用上述的核苷酸序列直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ9延长酶或直接利用多肽序列产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。

Description

球等鞭金藻Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用

【技术领域】：本发明属于生物和遗传工程技术领域，涉及从一种产DHA的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)中克隆Δ⁹延长酶基因，具体讲是球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列及其应用。将该基因直接或与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码Δ9延长酶产生多不饱和脂肪酸的方法和应用。

【背景技术】：多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFAs)是指含有两个或两个以上顺式双键、碳原子数为16至22的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸是以多种形式存在于细胞中如细胞膜、储存脂、甘油三酯磷脂、鞘脂和脂蛋白等。作为生物膜结构中磷脂的重要成分之一，PUFAs的种类、数量、饱和度的改变会直接影响生物膜的刚性结构，因此影响了与刚性结构相关的各种生理功能。经过研究发现PUFAs与包括心血管疾病，糖尿病、关节炎、牛皮癣、溃疡性结肠炎在内的多种慢性疾病相关，并且可以通过影响细胞的增殖和信号传导途径来影响癌症的发生和发展情况。最近的研究表明，PUFAs还能影响骨骼的生长与修复过程。不仅如此PUFAs还能作为一种重要的生理活性物质影响胎儿的发育。因此PUFAs的生物合成以及合成途径中的一些关键酶受到广泛的关注。

PUFAs的合成主要是由碳链的延长和脱氢两个主要反应组成，合成的最初底物是饱和脂肪酸软脂酸和硬脂酸。为了适应不同的自然界环境，不同的物种在基本的合成途径基础之上又衍生出了各种不同PUFAa合成机制。除了传统的n-6和n-3两类不同的多不饱和脂肪酸途径外，在藻类等微生物中又发现了第三种分支合成途径，即Δ9延长酶途径：亚油酸(LinoleicAcid，LA，C18:2n-6，Δ9，12)或α亚麻酸(α-LinolenicAcid，ALA，C18:3n-3，)Δ9，12，15)Δ9延长酶的催化下生成二十碳二烯酸EDA(Eicosadienoic Acid，EDA，C20:2n-6，Δ11，14)和二十碳三烯酸Etr(EicosatrienoicAcid，EtrA，C20:3n-3，Δ11，14，17)，然后通过Δ8脱氢酶生成二高γ亚麻酸DGLA(Dihomo-γ-LinolenicAcid，DGLA，C20:3n-6，Δ8，11，14)和二十碳四烯酸ETA(EicosatetraenoicAcid，C20:4n-3，Δ8，11，14，17)，再进入n-6和n-3合成途径，经一系列的碳链延长和脱氢反应合成花生四烯酸(Arachidonic acid，AA.C20:4n-6，Δ5，8，11，14)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA.C20:5n-3，Δ5，8，11，14，17)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA.C22:6n-3，Δ4，5，8，11，14，17)等有生物活性的长链多不饱和脂肪酸(Long-chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs)。包括α-亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸在保健和医疗方面有很广阔的应用前景。研究不饱和脂肪酸的合成和它的生理作用成为当前的热点之一。Δ9延长酶的克隆对于PUFAs的合成和应用研究具有重要意义。

【发明内容】：本发明的目的一是提供从球等鞭金藻中分离的编码Δ⁹延长酶的核苷酸序列或其核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。从一种球等鞭金藻中克隆Δ⁹延长酶基因，具体讲是球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列及其应用。

本发明的目的之二是提供由该核苷酸序列所编码的Δ⁹延长酶多肽、或其片段、类似物或衍生物。

本发明的目的之三是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能性表达的重组表达载体。

本发明的目的之四是提供含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代。

本发明的目的之五是提供一种用含有该基因核苷酸序列、或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞、或该核苷酸序列所编码的Δ9延长酶多肽制备多不饱和脂肪酸的方法。

本发明第一方面是，提供了SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或核苷酸序列的片段、类似物和衍生物。

本发明分离的Δ⁹延长酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列，与选自下组的一种核苷酸序列有至少65％的同源性：1)编码SEQ ID NO：2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列。准确地，该核苷酸序列是选自下组中的一种：(a)具有SEQ ID NO：1序列中1-1653的序列：和(b)具有SEQ ID NO：1中45-830的序列。

本发明的第二方面是，提供分离的上述核苷酸序列所编码的多肽，该多肽包含：具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的多肽、或其片段、或其保守性变异多肽、或其衍生类似物。更准确地，该多肽是具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸变异不超过30％的衍生物。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物)细胞中产生。

本发明的第三方面是，提供了含有上述核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体；所述的重组表达载体具体是pYES2.0-ASE或pX952A。

本发明的第四方面是，提供了一种用含有该基因核苷酸序列、或者该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的质粒或病毒重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞、或用该核苷酸序列所编码的Δ⁹延长酶多肽制备不饱和脂肪酸的方法。这些宿主细胞包括细菌、真菌、酵母、霉菌、高等植物、昆虫或哺乳动物等细胞。

本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明所涉及的技术术语的含义：

“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。

“分离的核苷酸序列”是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。

“球等鞭金藻Δ9延长酶的核苷酸序列”是指包括编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶多肽的核苷酸序列和包括附加编码和/或非编码的核苷酸序列。

“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核苷酸序列。

非编码的衍生物还表示可用于抑制所述新型蛋白生物合成的反义DNA。所述的反义DNA属于本发明的无功能衍生物。如不具备酶促活性的衍生物。可用本领域的技术人员熟知生产无功能衍生物的其它方法有共抑制，核糖酶和内含子的使用。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，优选是至少20-30个核苷酸，特别优选是至少50-60个核苷酸，非常特别的优选是至少100个核苷酸以上。核苷酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码的核苷酸序列。

本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：(1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的核苷酸序列；和(2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序列片段。

本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。

本发明还提供了一种新的多肽序列-球等鞭金藻Δ⁹延长酶多肽的氨基酸序列，是由SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列组成。发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生。

本发明也涉及含有编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列和外源性调节序列元件结合进行功能性表达的重组表达载体。

术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。能够影响基因表达产物的序列元件包括有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的P_L启动子：真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10-300bp，作用于启动子以增强基因的转录。如腺病毒增强子。

本发明还涉及用含有本发明编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列的重组载体或直接用编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列经基因工程产生的宿主细胞。本发明中，编码球等鞭金藻Δ⁹延长酶的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。宿主细胞的代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。也可用MgCl₂，电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。

本发明还涉及用上述转基因宿主细胞生产多不饱和脂肪酸，根据宿主细胞，用本领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100^℃，优选10-60^℃，同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、氨基酸，或盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、镁盐，如果需要的话还有维生素。在此期间培养基的pH可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，捣碎或直接使用，通过本领域技术人员熟知的方法从细胞中提取脂肪酸。

本发明还涉及一种制备不饱和脂肪酸的方法，该方法是这样实现的，将具有饱和或不饱和脂肪酸甘油三酯与SEQ ID NO：2序列编码的酶一起培养。该方法优选是在由能够摄取或释放还原性等同物的化合物存在条件下进行的。然后，可以从甘油三酯中释放脂肪酸。上述方法优选可以合成通过9位延长、合成具有11位双键的脂肪酸。

本发明还涉及用上述方法制备不饱和脂肪酸，以及将其应用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品用途。

本发明的优点和积极效果：

本发明获得了球等鞭金藻Δ⁹延长酶基因，通过与其它合成PFUAs相关基因组合并将其克隆表达特定的表达宿主中，通过基因重组和表达技术的大规模工业化生产PUFAs和/或提高食品PUFAs的含量。

【附图说明】：

图1是显示所构建的酿酒酵母重组表达载体pYASE图。

图2A是显示LA、ALA、EDA、EtrA标准物的GC图。

图2B是含pYES2空载体的转基因酿酒酵母的GC图。

图2C是含重组质粒pYASE的转基因酿酒酵母的GC图。

【具体实施方式】：

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

实施例1 从球等鞭金藻中分离Δ⁹延长酶的核苷酸序列

采用Trizol方法从培养3d的球等鞭金藻中提取总的RNA，以2μL总RNA为模板，以oligo(dT16)作为引物进行反转录反应，扩增获得cDNA。取2μL cDNA为模板进行聚合酶链式反应。根据所发表(Baoxiu Qia.et al.2002，FEBS Letters)的Δ⁹延长酶同源序列的跨膜区和组氨酸保守区II氨基酸序列设计兼并引物(引物1和引物2)，以上述cDNA为模板在T-Gradient PCR仪(Biometra公司)上进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：

引物1：5-ATG TA(TC)AC(TCAG)TA(TC)TA(TC)GG(TCAG)(CT)T-3

引物2：5-(ATCG)AG(ATCG)CC(GA)TA(GA)TA(ATCG)GT(GA)TA CAT-3

反应组分加入量终浓度

模板cDNA 2μL

缓冲液(10×)

(含20mmol/LMgCl₂) 5μL 1×

dNTP(2.5mmol/L) 4μL 0.4mmol/L

引物1(10μmol/L) 2μL 0.4μmol/L

引物2(10μmol/L) 2μL 0.4μmol/L

Taqase(5u/μL) 1μL 5u/反应

H ₂ O 34μL

总体积 50μL

扩增条件：94℃变性5min，再用94℃ 1min；55℃ 1min→72℃ 1min进行3个循环，然后94℃1min；52℃ 1min→72℃ 1min进行30个循环，最后72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约180bp的片段，用DNA凝胶回收试剂盒(鼎国生物技术有限公司产品)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T easy(Promega公司产品)中；连接产物转化到用CaCl₂法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度为60μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook，et al.，1989，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory，NewYork，p19-21]提取质粒，经EcoR I酶切和PCR扩增鉴定正确，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。测序结果显示所扩增得到的片段大小为174bp，通过其核苷酸序列和其编码的氨基酸序列在Genbank数据库中用Blast程序进行同源检索，检索结果表明与该片段已报道的Δ⁹延长酶序列十分相似，但并不完全相同，证明所扩增片段为潜在Δ⁹延长酶基因的片段。

根据所获得的部分序列设计基因特异性引物(引物3、引物4和引物5)，利用RACE(Clontech公司)的方法获得包含上述片段的基因的3`和5`末端序列。先提取细胞总RNA，，以2μL总作为模板，按照Clontech SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit提供的方法反转录得到5’RACE cDNA和3’RACE cDNA，然后以3’RACE cDNA作为模板，以试剂盒提供的UPM引物分别与引物3、4和5配对，扩增获得3’下游序列；以5’RACE cDNA作为模板，以试剂盒提供的UPM引物分别与引物6、7和8配对，扩增获得5’上游序列。

引物3：5`-GACACGGCCTGGCTGGTGCTCAAGGG-3`，(SEQ ID NO：3)

引物4：5`-GAAGAACGTCTCTTTCCTCCAGGC-3`(SEQ ID NO：4)

引物5：5`-ATGTGTATTTGGGCATCCGGCTC-3`，(SEQ ID NO：5)

模板3’RACE cDNA 3μL、缓冲液(10×) 5μL、dNTP(50×) 1μL、引物UPM(10μmol/L) 5μL、引物3/4/5(10μmol/L) 5μL、Taq酶2μL、H2O 29μL。扩增条件：先94℃ 变性5min，进入94℃ 30sec，72℃3min进行5个循环；再94℃ 30see，70℃30sec，72℃ 3min 进行5个循环，然后94℃ 30sec，68℃30sec，72℃ 3min进行25个循环，最后72℃ 10min。将PCR扩增产物稀释50倍后作为模板，以引物UPM和引物4进行PCR，94℃ 30sec，68℃30sec，72℃ 3min进行25个循环，最后72℃ 10min，再将产物稀释100倍，以引物UPM和引物5进行PCR验证，若获得特异性条带，将该带连接pGEM-T easy并转化测序，获得3’下游序列1220bp。

引物6：5`-GAGGCCGTAGTAGGTGTACATTATGGTG-3`，(SEQ ID NO：6)

引物7：5`-TATGGTGTGAATGAATGAGTTGAAAA-3`(SEQ ID NO：7)

引物8：5`-ACATGAAGATCCACACGCCCTC-3`(SEQ ID NO：8)

模板5’RACE cDNA 3μL、缓冲液(10×) 5μL、dNTP(50×) 1μL、引物UPM(10μmol/L) 5μL、引物6/7/8(10μmol/L) 5μL、Taq酶2μL、H2O 29μL。扩增条件：先94℃ 变性5min，进入94℃ 30sec，72℃ 3min进行5个循环；再94℃ 30sec，70℃30sec，72℃ 3min进行5个循环，然后94℃ 30sec，68℃30sec，72℃ 3min进行25个循环，最后72℃ 10min。将PCR扩增产物稀释50倍后作为模板，以引物UPM和引物7进行PCR，94℃ 30sec，68℃30sec，72℃ 3min进行25个循环，最后72℃ 10min，再将产物稀释100倍，以引物UPM和引物8进行PCR验证，若获得特异性条带，将该带连接pGEM-T easy并转化测序，获得5’上游序列561bp。

用序列分析软件DNAstar将三个片段进行拼接并进行分析，得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其中45-830bp(ATG----TAG)为潜在的开放阅读框，编码262个氨基酸。根据两个末端序列，设计基因特异性引物(引物9和引物10)按上述条件PCR扩增、测序，所得结果和拼接结果一致。

引物9：5`-ATGGCGACGGAGGCGACCGCATC-3`(SEQ ID NO：9)；

引物10：5`-TGATGGAAGCCAATGAACAAGATTTC-3`(SEQ ID NO：10)；

实施例2：所分离核苷酸序列的同源性搜索

将分离的Δ9延长酶的核苷酸序列在Genbank上进行同源性搜索，与已经报道的Δ9延长酶(BaoxiuQia.et al.2002，FEBS Letters)的核苷酸序列(AF390174)相似性最高，达氨基酸相似性最高，达92％。这说明本发明的新的核苷酸序列所编码的酶具有Δ⁹延长酶的功能。

实施例3：酿酒酵母重组表达载体的构建

根据SEQ ID NO：1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物(引物11和引物12)分离其潜在开放阅读框序列：

引物11：5-TTGGATCCAACACAATGGCGACGGAGGCGACCGC-3`(SEQ ID NO：11)；

引物12：5`-AAGCATGCTTACTACAGGGCCTTGCCTCCCT-3`(SEQ ID NO：12)；

此两个引物的5`端黑体分别含有BamH I和Sph I酶切位点。所用的扩增条件和反应组分同上，扩增产物的测序结果显示和SEQ ID NO：1所示40-830bp的序列一致。然后取50μL PCR产物和1μLpYES2.0分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在16℃水浴锅中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图2，所构建的含有Δ⁹延长酶基因的酵母表达质粒命名为pYASE。该质粒是由pYES2.0(Invitrogen公司)和引物11和引物12的PCR产物构建而成。

实施例4：重组表达载体转化酿酒酵母细胞

挑取酿酒酵母菌株INVSc1单菌落于10ml YEPD液体培养基中、30℃摇床过夜培养，检测菌液的OD₆₀₀值，取适量菌液稀释于50ml，使OD₆₀₀为0.4；继续培养2到4h后，2500rpm离心沉淀细胞，以40ml 1×TE重悬菌体，2500rpm离心沉淀细胞，以2ml 1×LiAc/0.5×TE悬浮细胞，并在室温下放置10min，此细胞即为感受态细胞；取100μl制备好的酵母感受态细胞，加入1μg重组质粒pYASE和100μg变性鲑精DNA，混匀，加入700μl 1×LiAc/40％PEG-4000/1×TE并混匀，于30℃温育30min；然后，加入88μl DMSO混匀，于42℃水浴中热激7min；离心10s沉淀细胞，加入1ml 1×TE悬浮细胞并再次离心沉淀细胞，最后加入100μl重悬细胞，全铺于SC-Ura(无尿嘧啶)选择培养基平板，置30℃培养48-72h，筛选出重组转化子。

实施例5：酵母工程菌的诱导表达

挑取实施例4中SC-Ura(无尿嘧啶)选择培养基平板上出现的阳性转化，接种于10ml SC-Ura选择培养基(含2％(w/v)的葡萄糖)，28℃摇菌过夜培养，以适宜的接种量加入含有2％(w/v)半乳糖的50ml SC-Ura培养基，使其OD600约0.4，并加入亚油酸和α亚麻酸作为底物，并加入NP-40促进底物的吸收，20℃继续培养72h；2500rpm收集菌体，用去离子水洗涤三次，50℃烘干，研碎，取100mg加入5ml 5％(w/v)的KOH-CH₃OH溶液，70℃反应2-3h；反应结束，冷却到室温，用6mol/L的盐酸调节溶液的pH值到2.0，加入4ml 14％(v/v)BF₃-CH₃OH，70℃反应1.5h，合成脂肪酸甲酯；再加入饱和的NaCl溶液10ml，剧烈震荡混匀，并转移到分液漏斗中，用8ml 1∶4的氯仿∶己烷抽提两次，合并提取液；加入适量无水Na₂SO₄干燥提取液，静置1h，去掉Na₂SO₄，把含有脂肪酸甲酯的上清液用氮气吹干，用200μL的正己烷回溶样品，后用0.45mm的微孔滤膜过滤。

实施例6：脂肪酸气相色谱分析

按如下条件进行：

仪器为岛津GC-7A，柱子：弹性石英毛细管柱，0.32×30m，固相支持物：聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethylene glycol succinate，DEGS)镀膜物：聚酰亚胺。载气：N₂，线速：8cm/s。分流比：100∶1，气化室温度：280℃，柱温：180℃，尾吹：50ml/min，检测器：氢火焰离子化检测器。以CAYMAN CHEMICAL公司生产的PUFAs甲酯化后为标准品，把上述实施例5的方法制备的脂肪酸甲酯化的样品，进行GC分析，上样量为1μL；分析软件：Anstar，分析之星色谱工作站。

色谱分析结果见附图2，附图2显示LA、ALA、EDA、EtrA标准物(2A)、含pYES2.0空载体的转基因酵母(2B)和含重组质粒pYASE的转基因酵母(2C)的气相色谱图。通过与已知的脂肪酸甲基酯标准物的保留时间进行比较鉴别出各个峰。图2C中保留时间为21.344min、23.534min对应的峰即为Δ⁹延长酶催化产生的EDA和EtrA。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>球等鞭金藻Δ9延长酶的核苷酸序列及其应用

<130>20091201

<160>12

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1653

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>1

gggggaaaga gggagagaga gggagggacg cgccgctcgc gacgatggcg acggaggcga 60

ccgcatctat ctgggccgca gtgagcgatc cagagatcct gatcggcaca ttctcatatt 120

tgctgctcaa gcctattctc cgcagctcgg ggctcgtcga tgagaagaag ggcgcctaca 180

ggacatcgat gatctggtac aacgtaattc tagcgctctt ctccgcaacg agcttttacg 240

tcacggcgac ggctcttgga tgggactatg gcagtggcga gtggctgcgt aggctaacgg 300

gcgacacgcc gcagccactg tttcagtgcc cgtccagagt atgggattct aaactcttcg 360

tgtggaccgc aaaggcattc tattattcca agtacgtgga ataccttgac accgcatggc 420

tggtgcttaa ggggaagaac gtctctttcc tccaggcatt ccatcacttc ggcgcgccgt 480

gggatgtgta tttgggcatc cggctccaga acgagggcgt gtggatcttc atgtttttca 540

actcattcat tcacaccata atgtacacct attacggcct cactgctgcg ggctataaga 600

tcaaggctaa gccgctcatc acagcgatgc aaataagcca attcatgggc ggcttcatcc 660

tcgtctggga ctacatcaat attccatgct tccgctctga taacggcaag gtgtttagct 720

gggtattcaa ctatgcttat gtcggcttcg tgttcttgtt gttctgccac ttcttctaca 780

aggacaacct tgcctctaag aagccagcga agggaggcaa ggccctgtag agagataggt 840

gcaacttcta gctctgcgaa acacctctga agcatgggca taggacgaat acttggcctc 900

tgagaagatg cggcattacc tcctacatgg acgcgccacg caccgaggag agtcgcgctg 960

cccctgcaac gccgcctagc ggctgaccgg ggccgggatg gtgtatccgt tgttgacgat 1020

gggccccgct tcatgtagca tattgatcga ttcgtattgc catctgtttt gagcatagca 1080

tacgccgcat cgctgaatac gttgtgcggc ttagcttgca tgtcatcggc ctgccgcatt 1140

ctctgcaggc cgtcgctacc ccgcgagcgc gttgaccttg agaatgggta cggcggcctt 1200

gagccatgcg ccgccctgtt gctggcaagg ctatttggac gagattcgac acacaccacg 1260

cagtgccaca cgctttggct ttaagaggac gcgaaagaaa tcttgttcat tggcttccat 1320

caacgatggg gtcatgcggg atgctggagc catgcgggat gcaccgccaa acgaatgacg 1380

cggctatgtg agtttcatag tgcaaggcca cgaacgttcg cagtgcttgg gaggatgcga 1440

agcgaaccac ttgtgcactc ccgacggcat gagtacgatc tgcaatcaat caatacggct 1500

atggaccatg tcaacggact cagatatatg gatcttgtgg tgttggtgga tggatggtcg 1560

tggactacgg cggcggtatg ttggtcgggg tgtcgacttt aagaaagcaa tgcacattcc 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1653

<210>2

<211>261

<212>PRT

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>2

Met Ala Thr Glu Ala Thr Ala Ser Ile Trp Ala Ala Val Ser Asp Pro

1 5 10 15

Glu Ile Leu Ile Gly Thr Phe Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Pro Ile Leu

20 25 30

Arg Ser Ser Gly Leu Val Asp Glu Lys Lys Gly Ala Tyr Arg Thr Ser

35 40 45

Met Ile Trp Tyr Asn Val Ile Leu Ala Leu Phe Ser Ala Thr Ser Phe

50 55 60

Tyr Val Thr Ala Thr Ala Leu Gly Trp Asp Tyr Gly Ser Gly Glu Trp

65 70 75 80

Leu Arg Arg Leu Thr Gly Asp Thr Pro Gln Pro Leu Phe Gln Cys Pro

85 90 95

Ser Arg Val Trp Asp Ser Lys Leu Phe Val Trp Thr Ala Lys Ala Phe

100 105 110

Tyr Tyr Ser Lys Tyr Val Glu Tyr Leu Asp Thr Ala Trp Leu Val Leu

115 120 125

Lys Gly Lys Asn Val Ser Phe Leu Gln Ala Phe His His Phe Gly Ala

130 135 140

Pro Trp Asp Val Tyr Leu Gly Ile Arg Leu Gln Asn Glu Gly Val Trp

145 150 155 160

Ile Phe Met Phe Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr Thr Tyr

165 170 175

Tyr Gly Leu Thr Ala Ala Gly Tyr Lys Ile Lys Ala Lys Pro Leu Ile

180 185 190

Thr Ala Met Gln Ile Ser Gln Phe Met Gly Gly Phe Ile Leu Val Trp

195 200 205

Asp Tyr Ile Asn Ile Pro Cys Phe Arg Ser Asp Asn Gly Lys Val Phe

210 215 220

Ser Trp Val Phe Asn Tyr Ala Tyr Val Gly Phe Val Phe Leu Leu Phe

225 230 235 240

Cys His Phe Phe Tyr Lys Asp Asn Leu Ala Ser Lys Lys Pro Ala Lys

245 250 255

Gly Gly Lys Ala Leu

260

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>3

gacacggcct ggctggtgct caaggg 26

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>4

gaagaacgtc tctttcctcc aggc 24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>5

atgtgtattt gggcatccgg ctc 23

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>6

gaggccgtag taggtgtaca ttatggtg 28

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>7

tatggtgtga atgaatgagt tgaaaa 26

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>8

acatgaagat ccacacgccc tc 22

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>9

atggcgacgg aggcgaccgc atc 23

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>10

tgatggaagc caatgaacaa gatttc 26

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>11

ttggatccaa cacaatggcg acggaggcga ccgc 34

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>球等鞭金藻(Isochrysis galbana)

<400>12

aagcatgctt actacagggc cttgcctccc t 31

Claims

1.一种产DHA的球等鞭金藻的Δ⁹延长酶的核苷酸序列，其特征在于它是：

(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或

(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.按照权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是选自：

(a)编码为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；

(b)与核苷酸序列(a)互补的核苷酸序列。

3.一种多肽，其特征在于它是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。

4.一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。

5.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自于下列一种宿主细胞：

(a)它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞

(b)它是用权利要求4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。

6.按照权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。

7.权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求3所述的氨基酸序列或权利要求4所述的重组表达载体应用于多不饱和脂肪酸的生产。