KR101278614B1 - 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자를 분리하여 그 기능을 확인하고, 리놀레산을 함유하는 들깨 등 유지작물에 이용할 경우, 고부가의 기능성 감마-리놀렌산을 생산하는 유지작물을 제공할 수 있고, 또한 EPA 또는 DHA과 같은 오메가-3의 고도불포화지방산을 생성하기 위한 대사공학기술에 적용될 수 있다.

Description

갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자 {Delta-6 desaturase gene from Muraenesox cinereus}
본 발명은 신규한 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
리놀레산과 감마-리놀렌산은 하루에 일정량을 섭취해야 하는 필수지방산이다. 인간의 몸 속에는 여러 가지 불포화지방산이 있는데 그 중의 하나가 감마-리놀렌산(GLA)이다. 이것은 체내에서 합성이 불가능한 불포화지방산으로 외부에서 식물로서 섭취해야만 하는데, 천연에서는 달맞이꽃이나 모유 등에만 극히 제한적으로 함유되어 있다. 감마-리놀렌산은 프로스타글란딘의 생체내 합성에 없어서는 안될 필수적인 물질이며, 프로스타글란딘은 혈압, 혈당, 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮추는데 효과가 있음은 이미 노벨 생리의학상을 수상한 박사들에 의해 1982년에 증명되었다. 즉, 감마-리놀렌산은 인체 내에서 식물유 성분의 필수 지방산인 리놀레산으로부터 합성되어 프로스타글란딘의 원료가 되는 것이다. 따라서, 감마-리놀렌산이 부족하면 리놀레산→감마-리놀렌산→프로스타글란딘의 흐름이 원활하게 이루어지지 않게 되고, 그 결과 혈압이나 콜레스테롤의 수치가 올라가고, 천식 증상 등의 질환이 나타날 수 있다.
감마-리놀렌산은 리놀레산이 체내에 들어가고 나서 여러 가지 화합물로 변화되어 가는 그 최초의 합성물질이다. 리놀레산에서 감마-리놀렌산으로 변화하기 위해서는 그것을 중개하는 물질(효소)이 필요한데, 그 효소를 델타-6 불포화효소 라고 한다. 델타-6 불포화효소는 사람에 따라서 기능을 못하거나 혹은 결핍될 수도 있다. 왜냐하면 이 효소는 어떤 저해인자에 의해 리놀레산이 감마-리놀렌산으로 변화하는데 방해를 받음으로 작용이 일어나지 않을 수도 있기 때문이다. 이는 아무리 리놀레산을 섭취해도 체내에서 감마-리놀렌산으로 합성되지 않을 수도 있다는 의미이다. 따라서 이러한 사람은 감마-리놀렌산이 직접 들어 있는 식물을 섭취해야 되는데, 감마-리놀렌산을 자연 그대로의 형태로 함유하고 있는 유지는 모유와 달맞이꽃의 종자유 외에 지금으로서는 발견되지 않고 있다.
리놀레산 그 자체는 인체에서 합성되지 않는 불포화 필수지방산이지만, 콩, 현미, 밀, 목화씨, 해바라기, 옥수수, 들깨 등의 식물성 유지에 풍부하게 들어있다.
지방산과 지방산 관련 공동인자는 영양과 관련된 질병에 주요한 역할을 하는 것으로 보인다. 상기 효소가 GLA가 아닌 리놀레산을 고유하게 생산하는 들깨 등의 세포 내로 전달되면, 대량의 GLA가 생산될 수 있으며, 그 결과, 콜레스테롤 수치와 혈압을 낮추고, 혈전증을 억제하고, 관절염과 다른 형태의 염증을 조절하고, 습진을 치료할 수 있는 GLA에 의한 유익한 효과를 얻을 수 있는, 고부가 가치의 유지작물의 생산이 가능하다.
현재까지는 효모, 박테리아에서 분리된 델타-6 불포화효소의 염기서열 등의 기능 분석이 다수 있었으나, 갯장어에서 분리된 델타-6 불포화효소 이외에는 다른 보고가 없었다.
국내 공개번호 10-2006-0079397
이에 본 발명은 지금까지 보고된 바 없는, 갯장어에서 분리된 델타-6 불포화효소 및 이의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 효모(Saccharomyces cerevisiae) 형질전환체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1(도 3)의 핵산서열로 이루어지는, 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2-McD6DES1에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.
a) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동 가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 델타-6 불포화효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
b) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
c) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
인체에 유익한 생리활성 기능이 많이 알려져 있는 감마-리놀렌산은 현재 고부가 건강식품으로 시판되고 있는 바, 따라서 본 발명의 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자를 분리하여 그 기능을 확인하고, 리놀레산을 함유하는 들깨 등 유지작물에 이용할 경우, 고부가의 기능성 감마-리놀렌산을 생산하는 유지작물을 제공할 수 있다.
도 1은 RT-PCR에 의한 delta-6 불포화효소 유전자의 클로닝에 관한 것이다.
도 2는 완전한 크기의 delta-6 불포화효소 유전자를 제한효소 절단으로 클로닝 확인한 것이다.
도 3은 갯장어(Muraenesox cinereus) 유래의 delta-6 불포화효소1 유전자 염기서열과 추정 아미노산 서열에 관한 것이다.
도 4는 효모 발현 벡터내의 delta-6 불포화효소 유전자의 제한효소 절단으로 클로닝 확인한 것이다.
도 5는 Delta-6 불포화효소 유전자 발현 효모 형질전환 운반체 확인한 것이다.
도 6은 pYES2와 pYES2-McD6DES1 형질전환 효모의 기질 LA에 대한 GLA로의 전환을 분석한 지방산 가스크로마토그래피이다.
도 7은 pYES2와 pYES2-McD6DES1 형질전환 효모의 기질 LA와 ALA에 대한 GLA와 STA로의 전환 확인한 것이다.
도 8은 pYES2와 pYES2-McD6DES1 형질전환 효모의 기질 LA와 ALA에 대한 GLA와 STA로의 전환비율 분석 및 확인한 것이다.
본 발명은 서열번호 1(도 3)의 핵산서열로 이루어지는, 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 갯장어의 부위는 이에 제한되지 않으나, 갯장어의 간인 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 갯장어(Muraenesox cinereus)는 뱀장어목 갯장어과에 속하는 물고기로 깊이 20~100m 정도의 모래 바닥이나 암초 근처에서 생활한다. 다른 장어류와 같이 영양소가 풍부한 보양음식으로 알려져 있다. 본 발명에서는 이에 제한 되지 않으나, 갯장어의 간일 수 있다. 즉, 본 발명에서는 갯장어의 간에서 RT-PCR방법을 이용하여 델타-6 불포화효소 유전자 클론을 선발하여 유전자의 핵산서열을 결정하였다.
즉, 본 발명의 일측면에 따르면, 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자 및 그 핵산서열이 제공되는 것이다.
본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1(도 3)의 핵산서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 오픈리딩 프레임(ORF)을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 유전자에 의해 번역되는 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 단백질은 리놀레산(18:2)(LA)을 기질로 하여, 감마-리놀렌산(18:3)(GLA) 산물을 생성하는 효소로서, 막-결합 부위와 지방산의 불포화를 촉매하는 활성 부위를 갖는다. 또한, 아미노산 서열 분석 결과(도 3), 참다랑어 유래 델타-6 불포화효소와 79%, 날새기 유래 델타-6 불포화효소와 80%의 상동성을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
또한, 본 발명은 상기 유전자로 형질전환된 생물체를 제공한다. 본 발명에서 상기 생물체는 식물체, 효모 등 일 수 있다.
상기 식물체의 예를 들면 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 식물의 형질전환은 유전자를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서 식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 BrPSR 유전자를 보유하는 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 이외에도 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) 등의 방법을 이용할 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함한다.
본 발명의 상기 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 발현 벡터의 예로써는 대장균 발현벡터 pQE30 시리즈, 효모 발현벡터 pYES2 가 있으며, 특히 피딩 테스트(feeding test)를 위하여 숙주로서 효모를 사용하고, 갈락토스에 의해 단백질 발현을 유도할 수 있는 효모 유래의 발현벡터인 pYES2를 사용할 수 있다.
본 발명에서는 상기 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2-McD6DES1를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(transformants)가 제공된다.
본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 포함될 수 있고, 세포배양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 포함할 수 있다.
여기서, '형질전환체'란 프로모터와 작동 가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.
본 발명자들은 본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2-McD6DES 를 제작한 후, 이 발현벡터를 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 형질전환시켜 안정적인 효모 형질전환체를 확립하였다.
이렇게 얻어진 효모 형질전환체는 델타-6 불포화효소 단백질을 발현하여, 18:2(Δ9, 12)인 리놀레산의 C6위치에 정확히 불포화 형성을 촉매하여 감마-리놀렌산을 생성한다.
따라서, 본 발명에 의하면, 갯장어 유래의 델타-6 불포화효소를 코딩하는 신규 유전자를 대량 제공함으로써, 이를 리놀레산이 풍부한 들깨 등 유지작물에 이용할 수 있게 되어, 감마-리놀렌산의 공급원이 되는 고부가의 농작물 소재를 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 형질전환체의 제조방법은 다음 단계들을 포함할 수 있다.
a)프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동 가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열 또는 그것의 일부로 이루어지는 델타-6 불포화효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
b) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
c) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
상기 발현벡터를 제조하는 단계 a)에 있어서, 갯장어 간에서 특이적으로 발현되는 유전자 풀(pool)을 얻기 위하여, cDNA 라이브러리(cDNA library)를 제작한 후, ESTs 분석을 실시하고, 이를 통하여 갯장어 유래 델타-6 불포화효소 유전자의 부분 단편을 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 이 클론의 유전자 단편을 3'-연장 및 5'-연장함으로써 전장(full length) DNA를 획득하고, 얻어진 전장 DNA를 효모 유래 발현벡터인 pYES2에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pYES2-McD6DES 를 제작할 수 있다.
상기 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 b)에 있어서, 얻어진 pYES2-McD6DES 를 효모에 도입하는 방법은 당업자에게 공지이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection) 등이 있으며, 효모를 숙주로 하는 경우, 리튬아세테이법(lithium acetate method)을 포함할 수 있다.
상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계 c)에 있어서, 선별방법은 숙주세포의 우라실(uracil) 영양 요구성을 이용하여 선별할 수 있는 데, 즉 선별마커로서 우라실 생합성 유전자를 포함하는 상기 발현벡터 pYES2-McD6DES 가 도입된 숙주세포만이 우라실 결핍 배지에서 생존함을 이용하여 선별할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 >
1. McD6DES 유전자 분리 및 상동성 분석
갯장어( Muraenesox cinereus)의 간으로부터 mRNA를 분리하여 primer를 이용하여 PCR 합성을 하였다. pGEM에 클로닝하여 염기서열 분석을 함으로써, 델타-6 불포화효소 효소유전자(D6DES)임을 확인하였다(도 1, 도 2, 도 3).
2. McD6DES1 유전자의 효모 발현운반체 제작 및 형질전환 확인
델타-6 불포화효소 유전자(McD6DES1)의 전체 오픈리딩 프레임 (open reading frame, ORF)을 효모 (M. cinereus) 발현 운반체인 pYES2의 제한효소 HindIII와 XhoI 사이트에 삽입하여 발현운반체를 제작하였다(도 4). 제작된 운반체는 lithium acetate법을 이용하여 S. cerevisiae에 형질 전환되고 uracil이 결핍된 최소배지에서 선발되었다. 선발된 클론은 PCR을 통하여 대조군인 벡터만 있는 pYES2와 비교하여 삽입된 McD6DES1 유전자가 있음을 확인하였고 (도 5), 이 클론들을 다시 E. coli에 역 형질 전환하여 올바른 클론임을 확인하였다.
델타-6 불포화효소 유전자가 삽입된 효모 (pYES2-McD6DES)를 이용하여 유전자의 기능을 확인하기 위하여 uracil 결핍 최소 배지, raffinose/galactose를 첨가한 배지에 형질전환 효모를 28℃에서 seed culture 하였다. Seed culture한 효모를 새로운 배지에 최종농도 A600=0.5가 되도록 접종하고 기질 리놀렐산(LA, C18:2 △9,12 )와 알파-리놀렌산(ALA, C18:3, △,9,12,15)을 각각 최종농도 0.5 mM 되게 넣어주고, 기질이 배지에 잘 융합하도록 0.1%(v/v) tergitol NP-40을 첨가하였다. 배양은 20℃에서 3일간, 15℃에서 3일간 각각 배양하여 유전자의 발현을 통한 기질의 새로운 산물로의 전환을 유도하였다. 대조구는 pYES2 운반체만 형질전환된 효모를 이용하였다. 델타-6 불포화효소 유전자 산물의 활성을 통해 넣어준 기질 LA와 ALA의 카르복실기로부터 6번째 탄소에 새로이 이중결합을 형성한 생성물인 감마-리놀렌산(GLA, C18:3 △6 ,9,12)와 스테리도닉산 (stearidonic acid, STA, C18:4 △6,9,12,15)로 각각 전환하는지의 여부를 확인하기 위하여 가스크로마토그래피 분석을 하였다.
시험결과 기질로 사용된 LA는 GLA로 14% 전환되었고, 오메가-3 지방산인 ALA는 STA로 46% 전환됨을 확인하였다 (제 6도, 제 7도, 제 8도). 전환율은 ([생성량]/[기질 양+생성량])*100의 공식에 의해 계산했다. 그러므로 갯장어(M. cinereus) 로부터 분리된 델타-6 불포화효소 유전자는 오메가-3 지방산의 탄소6번 위치에 상당히 특이적으로 불포화결합을 형성하는데 관여함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 갯장어에서 분리된 델타-6 불포화효소 유전자 산물은 감마-리놀렌산을 생합성 할 수 있음을 알 수 있고, 또한 EPA 또는 DHA과 같은 오메가-3의 고도불포화지방산을 생성하기 위한 대사공학기술에 적용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 핵산서열로 이루어지며, 리놀렌산을 감마-리놀렌산으로 전환시키고 알파-리놀렌산을 스테리도닉산으로 전환시키는 갯장어 유래 델타-6 불포화효소를 코딩하는 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 갯장어는 갯장어의 간인 것을 특징으로 하는 유전자.
  3. 제 1항의 유전자로 형질전환된 생물체.
  4. 제 1항의 유전자를 포함하는 발현벡터 pYES2-McD6DES1.
  5. 제 4항의 발현벡터로 형질전환된 효모.
  6. 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법:
    a) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동 가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지며, 리놀렌산을 감마-리놀렌산으로 전환시키고 알파-리놀렌산을 스테리도닉산으로 전환시키는 델타-6 불포화효소를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
    b) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및
    c) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모인 것을 특징으로 하는 형질전환체의 제조방법.
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