KR101303697B1

KR101303697B1 - 피마자 사이토크롬 ｂ5 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101303697B1
Application number: KR1020110072397A
Authority: KR
Inventors: 김현욱; 이경렬; 김종범; 노경희; 김순희
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2013-09-09
Also published as: KR20130011325A

Abstract

본 발명은 피마자의 사이토크롬(cytochrome) B5에서 분리한 유전자(CYB5-1 내지 CYB5-7)의 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진 용도에 관한 것으로서, 상기 유전자를 식물체 내로 도입하여 세포내에서 발현시킴으로써, 식물의 하이드록시 지방산 생산을 촉진시킬 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명은 피마자에서 분리한 유전자의 하이드록시 지방산 생산 촉진 용도, 상기 유전자가 도입된 형질전환 식물체 및 상기 유전자를 식물체에 도입시켜 식물의 하이드록시 지방산 생산을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자는 하이드록시 지방산을 생산하는 형질전환 식물 개발에 유용하게 사용될 수 있어, 하이드록시 지방산이 사용되는 윤활유, 페인트, 섬유소재, 의약 등의 분야에 기여할 수 있다.

Description

피마자 사이토크롬 Ｂ5 유전자 및 이의 용도 {Ricinus communis L. Cytochrome B5 Gene and Use Thereof}

본 발명은 피마자 사이토크롬 B5 유래의 신규 유전자 및 이의 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진 용도에 관한 것으로, 상기 유전자를 식물체 내로 도입하여 발현시킴으로써 식물의 하이드록시 지방산 생산을 촉진시킬 수 있다.

식물유의 주성분은 탄소사슬 16개 또는 18개의 지방산이고, 팔미트 산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 리놀렌산(linolenic acid)의 혼합물로서, 튀김이나 샐러드에 넣는 식용으로는 적합하지만 산업용으로는 적합하지 않은 단점을 가지고 있다. 현재 전 세계 식물유의 80%는 식용으로, 나머지 20%는 산업용으로 소비되고 있으며, 앞으로 식물유가 산업용으로 경제성을 갖추기 위해서는 물질이 적합하고, 가공성이 좋아야 한다. 예를 들어, 윤활유로 쓰이려면 산화가 잘 되지 않아야 하고, 점도가 높아야 하며, 페인트나 도료의 경우 쉽게 산화되어야 한다.

한편, 비경작 식물종의 종자에는 수백개의 다른 지방산이 함유되어 있는데, 이들 지방산을 일반적 식물유의 주요 구성성분인 5종류의 지방산과 구별하여 특이지방산(unusual fatty acid)이라 부른다. 이러한 특이 지방산은 산업적 이용에 적합한 적당한 탄소사슬개수, 적절한 불포화도 및 탄소에 다양한 활성을 갖는 기능기 (예: 하이드록시기(-OH), 에폭시기)에 의해 특정한 물성을 가지고 있는데, 특히 피마자의 델타 12 하이드록시 지방산(리시놀레인산; ricinoleic acid)은 종자 지방산의 90%를 차지하며, 이를 가공하여 고품질의 윤활유, 나일론, 화장품을 포함한 넓은 범위의 상업 및 공업제품에 이용되고 있다.

그러나 피마자같이 특이지방산을 생산하는 비경작 식물은 수확량이 작고, 개화가 불균일하며, 게다가 종자에 리신(ricin)이라는 독소가 있어 산업적으로 경작하기 어려운 단점을 가지고 있어서, 비경작 식물에서 특이지방산 생합성 핵산분자를 분리하여 작물에 도입하려는 생명공학적 연구 및 기법이 집중되고 있는 실정이다.

형질전환식물에서 가장 크게 지적되는 단점으로는 특이지방산의 생산효율이 매우 낮다는 것이다. 현재 산업지방산인 하이드록시 지방산을 작물에서 생산하려면, 그 합성유전자인 RcFAH12를 도입해야 하는데, RcFAH12 단독으로는 형질전환 식물의 종자오일에서는 하이드록시 지방산 생산효율이 15~17%에 불과하다. 따라서 상기 하이드록시 지방산 합성 유전자를 통한 하이드록시 지방산 생산효율을 증가시키기 위한 방안에 대한 연구가 필요한 실정이다.

Rajesh Kumar† et al. A mutation in Arabidopsis cytochrome b5 reductase identified by high-throughput screening differentially affects hydroxylation and desaturation, The Plant Journal (2006) 48, 920-932

따라서 본 발명은 하이드록시 지방산 합성 유전자를 통한 하이드록시 지방산 생산효율을 증가시키는 신규 유전자를 발굴하여 이의 용도를 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 하이드록시 지방산 생산을 촉진시키는 유전자를 보유하는 발현벡터를 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 하이드록시 지방산 생산을 촉진시키는 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 하이드록시 지방산 생산을 촉진시키는 유전자를 식물체에 도입시켜 식물의 하이드록시 지방산 생산을 촉진시키는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 이를 코딩하는 유전자 및 이들의 하이드록시 지방산 생산 촉진 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 보유하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물의 생장 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 유전자는 하이드록시 지방산을 생산하는 형질전환 식물 개발에 유용하게 사용될 수 있어, 하이드록시 지방산이 사용되는 윤활유, 페인트, 섬유소재, 의약 등의 분야에 기여할 수 있다.

도 1은 7종의 피마자 RcCYB5 유전자의 단백질서열과 모델식물인 애기장대의 AtCYB5 유전자의 단백질 서열간의 상동성 분석 결과이다. a는 계통도이고, b는 상동성 정도를 나타낸다.
도 2는 피마자에서 분리한 7종의 사이토크롬 B5 유전자의 피마자 조직별 발현 분석 결과이다.
도 3은 피마자에서 분리한 7종의 사이토크롬 B5 유전자가 도입된 벡터의 모식도이다.
도 4는 피마자 사이토크롬 B5 유전자 형질전환 애기장대 종자에서의 하이드록시 지방산 생산 증진효과 검정 결과이다(제2세대).
도 5는 피마자 사이토크롬 B5 유전자 형질전환 애기장대 종자에서의 하이드록시 지방산 생산 증진효과 검정 결과이다(제3세대).

본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 하이드록시 지방산 합성 유전자를 통한 하이드록시 지방산 생산효율을 증가시키는 방법에 대해 연구하던 중, 상기 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 새로운 유전자를 찾아내고, 이를 이용하여 식물의 하이드록시 지방산 생산 효율을 증대시키는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 폴리펩티드 및 유전자는 피마자에서 유래된 유전자일 수 있으며, 피마자의 사이토크롬(cytochrome) B5 유전자 유래일수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 유전자는 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13 중 선택된 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

보다 구체적으로, 서열번호 1은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열, 서열번호 3은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열, 서열번호 5는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열, 서열번호 7은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열, 서열번호 9은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열, 서열번호 11은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열, 서열번호 13은 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 폴레펩티드를 코딩하는 핵산서열일 수 있다.

상기 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13 중 선택된 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 피마자 유래의 유전자 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 염기서열 또는 아미노산 서열은 변화되지만, 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13 중 선택된 어느 하나의 핵산서열 또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 핵산서열로 이루어진 유전자 또는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 유전자는 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13 중 선택된 어느 하나의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 발명자들은 기존에 보고된 애기장대 사이토크롬B5(CYB5) 유전자의 염기서열에서 유래된 단백질서열을 이용하여 피마자 유전자 데이터베이스에서 블라스트(BLASTP) 상동성 검사를 통하여 가장 상동성 수치가 높은(2.3e^-14이상) 7개의 유전자를 선발하였다. 아직 기능이 알려지지 않은 7종의 DNA 염기정보를 이용하여 프라이머를 제작하여 cDNA 클로닝에 사용하였고 그 후 클로닝된 7종의 피마자 사이토크롬 B5 cDNA 유전자인 RcCYB5-1(서열번호 1), RcCYB5-2(서열번호 3), RcCYB5-3(서열번호 5), RcCYB5-4(서열번호 7), RcCYB5-5(서열번호 9), RcCYB5-6(서열번호 11) 및 RcCYB5-7(서열번호 13)에 대한 각각의 염기서열 및 각각에 대응하는 아미노산 서열(차례로 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14)을 밝혔다.

상기 선발된 7종의 피마자 사이트크롬 B5 유전자로 식물 형질전환용 발현벡터를 제작하여 아그로박테리움에 도입하였다. 하이드록시 지방산 합성유전자인 FAH12가 도입된 애기장대(CL37 애기장대)에 꽃기관 침지방법으로 상기 아그로박테리움을 감염시켜 형질전환체를 획득한 후, 이의 종자에서 하이드록시 지방산 생산 정도를 조사하였다. 그 결과, 하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 상기 선발된 7종의 피마자 사이토크롬 B5 유전자가 도입되는 경우, CL37의 평균 하이드록시 지방산 분율인 17%보다 증가된 분율을 가지는 종자가 얻어졌다. 이를 통하여 본 발명에 따른 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13 중 선택된 어느 하나의 핵산서열로 이루어진 피마자 유래의 유전자가 식물체 내로 도입되어 발현됨으로써, 하이드록시 지방산 생산을 촉진시키는 효과가 있음을 알 수 있다.

이에 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 유전자는 피마자에서 유래된 유전자일 수 있으며, 피마자의 사이토크롬(cytochrome) B5 유전자일수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 '하이드록시 지방산'이란 하이드록시기(-OH)가 존재하는 지방산을 의미하며, '식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진'이란 식물체 내에서 상기 하이드록시 지방산의 생산이 증가하도록 유도하는 것을 의미한다.

또한 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 보유하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 유전자는 피마자에서 유래된 유전자일 수 있으며, 피마자의 사이토크롬(cytochrome) B5 유전자 유래일수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 따른 상기 유전자가 삽입된 형질전환 벡터는 pMDC 벡터이며, 이는 도 3에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 형질전환 벡터는 도 3에 기재된 벡터에 한정되지 않고, 식물의 형질전환에 유용한 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서 “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 일실시예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 FAE1, CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

또한 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 유전자의 도입은 상기 유전자를 보유하는 벡터로 식물체를 형질전환함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 상기 형질전환 식물체는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 발현한다.

본 발명에서 상기 식물체는 예를 들어 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 피마자, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알팔파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 식물의 형질전환은 유전자를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서 식물체의 형질전환은 아그로박테리움이나 바이러스 벡터 등을 이용한 통상의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 7종의 선발된 피마자 사이토크롬 B5 유전자를 보유하는 벡터로 아그로박테리움 속 미생물을 형질전환시킨 다음, 상기 형질전환된 아그로박테리움 속 미생물을 대상 식물의 조직 등에 감염시켜 형질전환된 식물을 수득할 수 있다. 이외에도 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70) 등의 방법을 이용할 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 형질전환을 포함한다.

또한 본 발명은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 식물체는 하이드록시 지방산 합성 유전자가 도입된 것일 수 있으며, 이러한 하이드록시 지방산 합성 유전자는 FAH12 (fatty acid hydorxylase 12)인 것이 바람직하다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 상기 -유전자의 도입은 상기 유전자를 보유하는 벡터로 식물체를 형질전환함으로써 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명에 따라 상기 유전자를 식물체 내에 도입시킴으로써, 전술한 바와 같이 하이드록시 지방산 생산 효율이 증가된 식물을 제조할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 피마자에서 7종의 사이토크롬B5 cDNA 유전자 분석

기존에 보고된 애기장대 사이토크롬B5(CYB5) 유전자의 염기서열에서 유래된 단백질서열을 이용하여 피마자 유전자 데이터베이스에서 블라스트(BLASTP) 상동성 검사를 통하여 가장 상동성 수치가 높은(2.3e^- ¹⁴이상) 7개의 유전자 염기서열 정보를 얻었다. 아직 기능이 알려지지 않은 7종의 DNA 염기정보를 이용하여 프라이머를 제작하여 cDNA 클로닝에 사용하였다. 피마자 잎, 종자, 꽃으로부터 RNA를 분리한 후, 역전사효소(Reverse transcriptase) 반응으로 1^st strand cDNA를 합성하였다. 합성된 1^st strand cDNA 피마자 유전자 집단에 제작된 프라이머 (표1)와 함께 KOD+ DNA polymerase 이용 PCR 증폭하여 얻은 cDNA 단편을 pENTR/D-TOPO벡터에 삽입한 후 클로닝하였다.

클로닝된 7종의 피마자 사이토크롬 B5 cDNA 유전자인 RcCYB5-1(서열번호 1), RcCYB5-2(서열번호 3), RcCYB5-3(서열번호 5), RcCYB5-4(서열번호 7), RcCYB5-5(서열번호 9), RcCYB5-6(서열번호 11), RcCYB5-7(서열번호 13)에 대해 각각 핵산서열을 결정하였다.

cDNA 클로닝에 사용한 프라이머 염기서열은 아래 표 1과 같다.

유전자이름	정방향 프라이머	역방향 프라이머
RcCYB5-1	5'-CACCATGGGTGGTCAAGGAAAGGTT-3'	5'-TTATGCTTCAGCTGATTTGGTGTA-3'
RcCYB5-2	5'-CACCATGAGTGGTGAAGGCAAAGTT-3'	5'-TCACAAAGGCGGCCTATATTCTTT-3'
RcCYB5-3	5'-CACCATGGCTTCAGATCCAAAGATA-3'	5'-CTACTCTTTCTTGGTGTAGTGTCG-3'
RcCYB5-4	5'-CACCATGGCTTCAGAACCCAAAATC-3'	5'-CTAATCCTTCTTCATGACGGATCG-3'
RcCYB5-5	5'-CACCATGTCAGAAGTCGCTCAGCAC-3'	5'-CTACTTCTTCCGCAAGTACAAGAA-3'
RcCYB5-6	5'-CACCATGGTTATAGCTGTGGTGGCA-3'	5'-TTACTGCTCTAGATCTCCAATGTA-3'
RcCYB5-7	5'-CACCATGGTGCTTACTAATTTCAAT-3'	5'-TCAAAGGCACTCATCTCCAATTTG-3'

상기 7종 유전자의 핵산서열과 코딩하는 아미노산 서열은 다음과 같다.

(1) RcCYB5 -1- 핵산서열 (서열번호 1)

ATGGGTGGTCAAGGAAAGGTTTATACTTTGGCTGATGTCTCTGAACACAACAGTCCTAAAGACTGCTGGCTTGTTATTGAGGGAAAGGTATATGATGTGACAAAATTCTTGGAAGACCATCCTGGTGGTGATGAGGTTTTATTGTCCGCCACAGGGAAGGATGCAACCGATGATTTTGAGGATGTTGGACACAGTAGCAGTGCAAGAGCAATGATGGATGAATTCTATGTCGGCGAGATTGATACATCAACTATTCCTACGAAGAAGGCATATACTCCTCCTAAGCAGCCTCACTACAACCAAGACAAGACACCTGAGTTCATTATCAAGCTCCTCCAATTCGTAGTTCCACTGCTAATCTTAGGTTTGGCTGTTGGTATCCGCTTCTACACCAAATCAGCTGAAGCATAA

(2) RcCYB5 -1- 아미노산서열 (서열번호 2)

MGGQGKVYTLADVSEHNSPKDCWLVIEGKVYDVTKFLEDHPGGDEVLLSATGKDATDDFEDVGHSSSARAMMDEFYVGEIDTSTIPTKKAYTPPKQPHYNQDKTPEFIIKLLQFVVPLLILGLAVGIRFYTKSAEA

(3) RcCYB5 -2- 핵산서열 (서열번호 3)

ATGAGTGGTGAAGGCAAAGTTTTCACTTTGGCTCAGGTGTCTGAGCACAACAATCCAAAAGATTGTTGGCTGATCATTAATGGCAAGGTTTATGATGTGACAAAGTTTTTGGAGGACCATCCTGGTGGGGATGAGGTTTTGTTATCTGCTACAGGTAAGGATGCAACTGATGATTTTGAGGATGTTGGGCACAGCACGAGTGCTAGAGAAATGATGGATCAATACTACGTTGGAGAGATCGATCCCTCGACCATTCCTAAGAAGGCGACATATAAGCCTCCGAAGCAGCCTCACTACAATCAGGATAAGACAGCTGAGTTCATCATCAAGCTCCTGCAATTCCTGGTTCCTCTTGCTATATTGGGTTTGGCTTTTGGAATCCGCATCTATACAAAATCAACTTA

(4) RcCYB5 -2- 아미노산서열 (서열번호 4)

MSGEGKVFTLAQVSEHNNPKDCWLIINGKVYDVTKFLEDHPGGDEVLLSATGKDATDDFEDVGHSTSAREMMDQYYVGEIDPSTIPKKATYKPPKQPHYNQDKTAEFIIKLLQFLVPLAILGLAFGIRIYTKST

(5) RcCYB5 -3- 핵산서열 (서열번호 5)

ATGGCTTCAGATCCAAAGATATTAAACTTCGAAGAGGTGGCTAAACACAACAAACTCAAGGATTGCTGGCTTGTTATCTCTGGCAAGGTTTACGATGTCACCCCATTCATGGATGATCATCCTGGAGGAGATGATGTTTTACTGTCATCGACTGGGAAAGACGCAACAAATGATTTTGAAGATGTGGGTCATAGTGACTCGGCCAGAGATATGATGGAAAAATACTACATTGGTGAAATAGATTCAGCCACTATTCCGCTAAGACGCACCCACATTCCTAAACCACAAGCCAACTACAATCAAGACAAGAGTTCAGAGTTTCTAATAAAGATCTTGCAGTTTCTTGTGCCACTGTTGATCTTAGGCTTAGCCTTCGCAGTCCGACACTACACCAAGAAAGAGTAG

(6) RcCYB5 -3- 아미노산서열 (서열번호 6)

MASDPKILNFEEVAKHNKLKDCWLVISGKVYDVTPFMDDHPGGDDVLLSSTGKDATNDFEDVGHSDSARDMMEKYYIGEIDSATIPLRRTHIPKPQANYNQDKSSEFLIKILQFLVPLLILGLAFAVRHYTKKE

(7) RcCYB5 -4- 핵산서열 (서열번호 7)

ATGGCTTCAGAACCCAAAATCTATCGTTTTGATGATTTGCTTAAGCACAAGGATAGGAACGATTGCTGGCTTCTAATTCATGGAAAGGTGTATGATGTAACTCAATTTATGGAGGAACATCCTGGAGGAGATGAAGTCTTACTTGCAGCAACAGAGAAAGATGCAACTGATGATTATGAAGATATTGGGCATAGTGATGAAGCGAAAGAGATGATGCATAAGTACTATATTGGGAACATGGATATGAAAAGTATGCCACCTCCAGGATGGAATAGGTACCGGCCACCTTCAGAACATCCTAAGAACCCACACAGTTCAGTCTTAGTCAAGCTCTTACAACTGTTGTTACCCTTGCTCATTCTTGGCGCAGCAGTTGCTTTTCGATCCGTCATGAAGAAGGATTAG

(8) RcCYB5 -4- 아미노산서열 (서열번호 8)

MASEPKIYRFDDLLKHKDRNDCWLLIHGKVYDVTQFMEEHPGGDEVLLAATEKDATDDYEDIGHSDEAKEMMHKYYIGNMDMKSMPPPGWNRYRPPSEHPKNPHSSVLVKLLQLLLPLLILGAAVAFRSVMKKD

(9) RcCYB5 -5- 핵산서열 (서열번호 9)

ATGTCAGAAGTCGCTCAGCACAACACCAAAGAGGATTGCTGGATTGTCATTGATGGAAAGGTATATGATGTGAGTTCATATTTGGATGAGCATCCAGGCGGGGATGACGTTGTCATTGCTGCAACTGCGAAAGATGCAACCGATGATTTTGAAGATGCTGGTCACAGCGAAGATGCAAGGGAACTTTTAAATTCCTTTTGCATTGGTGAGCTTGATGCATCTGCTCCAGCAATCCCAGAACTTGAAATTTCTACCAAGAAACAACCAGCTGCTCACGCGCTGAAGCTCAAGGACTTGACGAAGCAATATTGGACAGTTCCTGTAGCCATTGCTGGCCTCTCTGTGATGGTTGGCTTCTTGTACTTGCGGAAGAAGTAG

(10) RcCYB5 -5- 아미노산서열 (서열번호 10)

MSEVAQHNTKEDCWIVIDGKVYDVSSYLDEHPGGDDVVIAATAKDATDDFEDAGHSEDARELLNSFCIGELDASAPAIPELEISTKKQPAAHALKLKDLTKQYWTVPVAIAGLSVMVGFLYLRKK

(11) RcCYB5 -6- 핵산서열 (서열번호 11)

ATGGTTATAGCTGTGGTGGCACTAATTTTGGGCGTCTTATTGGGAGGATTCATTTTGATTCCTAGACATCTTAAATCTGCCCAAGTAGAAAAGGTCCAATCGAGGGATGGACGCAAGAAGGAATCTAAACTTTACAGTAAATCTGAAGTATCTGTGCATGATAAGAGAACTGATTGTTGGATTATTATCAAAGGAAAGGTATATGATGTTACCTCATATGTAGAAGTGCATCCTGGCGGTGATGCCATCCTAGGACATGCTGGAGGTGATGCAACTGAAGGATTTTATGGGCCACAGCATGCTTCCCTAGTCTTTGACATGGTTGATGAATTCTACATTGGAGATCTAGAGCAGTAA

(12) RcCYB5 -6- 아미노산서열 (서열번호 12)

MVIAVVALILGVLLGGFILIPRHLKSAQVEKVQSRDGRKKESKLYSKSEVSVHDKRTDCWIIIKGKVYDVTSYVEVHPGGDAILGHAGGDATEGFYGPQHASLVFDMVDEFYIGDLEQ

(13) RcCYB5 -7- 핵산서열 (서열번호 13)

ATGGTGCTTACTAATTTCAATGGCGTTGGTATCGGATTCGGTTTTGGAGTTGGCTGTGGCTTCGGCGTGGGATGGGGTTTCGGAGGCATGCCTTTGAATGTGTTGGGTCTTGGTGCAGGTGGCGGCTGTGGGGTTGGTCTAGGCCTTGGATGGGGTTTTGGCAATGCCTTTGGTAGTCAGTATAGATCAGCTAGAGTCACATTTCAGGGCATAGAATTTGATAAGAAGGAAGAAACTACTGCTGGTGGTGAGTCTAAAGATATATTGAAAAGCACACGGGAAGTACTTAACGTAACAAAATTCTTGGAAGAGCACCCAGGTGGAGAAGTGCTGATTGAGTCGGCAGGAAAGGACGCAAAAAAGGAGTTCAAGGATATTGGACACGGCAAAGCTGCCGAGAACATGCTTCTTAAGTACCTGGTGGTTGTTATAGCAGGTAACTCTTTCAAAGAGGGACATACCAACTATGCTTCTATGAAGGAGTCTTCTAAGCAAATTGGAGATGAGTGCCTTTGA

(14) RcCYB5 -7- 아미노산서열 (서열번호 14)

MVLTNFNGVGIGFGFGVGCGFGVGWGFGGMPLNVLGLGAGGGCGVGLGLGWGFGNAFGSQYRSARVTFQGIEFDKKEETTAGGESKDILKSTREVLNVTKFLEEHPGGEVLIESAGKDAKKEFKDIGHGKAAENMLLKYLVVVIAGNSFKEGHTNYASMKESSKQIGDECL

< 실시예 2> 피마자유래 7종의 사이토크롬 B5 유전자의 단백질 상동성과 유연관계 검정

분리한 7종의 피마자 RcCYB5 유전자의 단백질서열과 모델식물인 애기장대의 AtCYB5 유전자의 단백질 서열간의 상동성을 CLUSTALW 알고리즘을 사용하여 유연관계를 분석하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1a의 계통도 분석결과 두개의 그룹으로 크게 나눌 수 있었다. 피마자의 RcCYB5-1부터 RcCYB5-5와 애기장대의 AtCYB5-1부터 AtCYB5-5의 10개의 유전자가 한 그룹으로 (A 그룹), 피마자 RcCYB5-6, RcCYB5-7과 애기장대의 RcCYB5-6가 또 하나의 그룹(B 그룹)으로 나뉘었다. 이 유전자들의 단백질서열 분석결과 A그룹의 10개 유전자는 c-terminus 말단에 세포막과 결합하는 서열을 가지고 있는 단백질로 추정되었다. 또한 다른 B 그룹은 이들보다 단백질의 크기가 크며 N-terminus부위에 세포막과 결합되는 영역이 발견되었다. 분석결과 분리된 7종의 피마자 유전자의 단백질에는 사이토크롬 B5 영역이 존재하는 것으로 인정되었다.

도 1b를 통해 볼 수 있는 상동성 분석 결과, 상기 A그룹에 속하는 피마자 사이토크롬 B5 간의 상동성은 RcCYB5-1은 RcCYB5-2와 84%, RcCYB5-3과 63%, RcCYB5-4와 51%, RcCYB5-5와 42%의 상동성을 보였다. B그룹에 속하는 피마자의 RcCYB5-6은 애기장대의 AtCYB5-6과 61%의 상동성을 보였으며, 피마자의 RcCYB5-7과는 31%의 상동성을 보였다.

분리한 피마자 사이토크롬B5들 중에 애기장대의 사이토크롬B5 유전자와 가장 높은 상동성은 83%, 가장 낮은 것은 27%의 상동성을 보여, 피마자의 7종 사이토크롬B5 유전자는 애기장대의 것과 차별성과 신규성을 보여 주었다.

< 실시예 3> 피마자 사이토크롬 B5 유전자의 피마자 조직에서의 발현 분석

피마자에서 분리한 7종의 사이토크롬 B5 유전자의 피마자 조직별 발현 분석을 RT-PCR 방법으로 수행하였다. 피마자의 Leaf (잎), Stem(줄기), Flower (꽃), Female(암꽃), Male (수꽃), Seed(종자), Seedling (유묘), Root (뿌리)의 RNA를 분리한 후 상기에서 기술한 7종 유전자의 프라이머를 사용하여 RT-PCR 하여 조직별 발현 양상을 분석하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 하이드록시 지방산 합성유전자 FAH12 유전자 발현 양상과 유사하게 7종의 피마자 RcCYB5-1~ RcCYB5-7 유전자는 분석된 모든 조직, 잎, 줄기, 꽃, 암꽃, 수꽃, 종자, 유묘, 뿌리에서 발현되었다. 정확한 발현 분석증명을 위해 피마자의 액틴 RcACT2 유전자 발현 분석을 대조구로 사용하여 RT-PCR 분석에 문제가 없음을 확인하였다.

< 실시예 4> 피마자 7종 사이토크롬 B5 유전자 식물 종자 발현 벡터의 제작

7종의 피마자 RcCYB5-1 내지 RcCYB5-7 유전자를 종자 특이적 발현을 조절하는 애기장대의 FAE1 프로모터를 함유하고 있는 식물발현벡터 pMDC-FAE1P에 각각의 피마지 사이토크롬 B5 유전자들을 LR clonase 반응을 통하여 FAE1P 프로모터와 결합된 7종의 재조합 식물발현 벡터 pFAE1P-RcCYB5-1, pFAE1P-RcCYB5-2, pFAE1P-RcCYB5-3, pFAE1P-RcCYB5-4, pFAE1P-RcCYB5-5, pFAE1P-RcCYB5-6, pFAE1P-RcCYB5-7를 제작하였다 (도 3). 제작된 식물발현벡터를 아그로박테리움 GV3101에 형질전환한 후, 그 아그로박테리움을 애기장대 식물 형질전환에 사용하였다.

< 실시예 5> 피마자 사이토크롬 B5 유전자 형질전환 애기장대 종자에서의 하이드록시 지방산 생산 증진효과 검정

상기 제작된 7종의 식물발현 벡터를 갖고 있는 아그로박테리움을 사용하여 CL37 애기장대에 꽃기관 침지방법으로 형질전환하였다. CL37 애기장대는 종자의 총지방산 중 17%의 하이드록시 지방산을 생산하는 식물이다. 이 CL37 식물체에 사이토크롬 B5 유전자를 추가 형질전환 후, 이 추가 유전자가 종자의 하이드록시 지방산 생산 증가에 효과가 있는지 검정하였다.

꽃기관 침지방법으로 형질전환한 애기장대의 종자들을 수확하여 식물발현벡터에 포함되어 있는 항생제 하이그로마이신 유전자에 저항성을 보이는 형질전환 제1세대 (T1) 식물체들을 선발하였다.

형질전환된 T1식물체에서 수확된 (제2세대) T2 종자에서 지방산을 분리하여 가스크로마토그래피 (GC)를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다. RcCYB5-1 유전자가 CL37에 형질전환된 10개체, RcCYB5-2 유전자의 경우 17개체, RcCYB5-3 유전자의 경우 16개체, RcCYB5-4 유전자의 경우 16개체, RcCYB5-5 유전자의 경우 16개체, RcCYB5-6 유전자의 경우 13개체, RcCYB5-7 유전자의 경우 22개체의 독립적인 T1 식물체에서 생산된 T2 종자집단의 지방산을 형질전환에 사용한 모본 대조구인 CL37 종자와 비교 분석을 수행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 피마자 RcCYB5-1유전자를 제외하고 6종의 사이토크롬B5 유전자가 CL37 종자의 하이드록시 지방산 17.7% 보다 평균에서 모두 높은 생산을 나타내었으며, 피마자 사이토크롬 B5 유전자가 도입될 경우, CL37의 하이드록시 지방산 최고치 보다 모두 높은 식물체가 다음과 같이 선발되었다: RcCYB5-1은 최대 18.7%, RcCYB5-2는 20.7%, RcCYB5-3은 19.47%, RcCYB5-4는 19.8%, RcCYB5-5는 19.8%, RcCYB5-6은 19.4%, RcCYB5-7은 20.1%를 생산하는 효과를 보였다. 이 결과는 피마자의 7종 사이토크롬B5 유전자 모두가 하이드록시 지방산 생산에 증진 효과가 있음을 보여준다.

형질전환된 사이트로크롬 B5 유전자가 호모로 고정된 제3세대, T3 종자의 지방산을 분석하여 피마자 사이토크롬B5에 대한 하이드록시 지방산생산 증진 효과를 다시 검정하였다. 결과를 표 2 및 도 5에 나타내었다.

7종의 피마자 사이토크롬B5 유전자가 도입되어 고정된 형질전환체에서 모두 CL37 모본의 하이드록시 지방산의 생산량인 17%를 넘어선 19-20%의 생산량을 보였다. 이는 최소 6%에서 최대 13%의 하이드록시 지방산 생산 증대 효과이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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피마자 유래의 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13 중 선택된 어느 하나의 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진 방법.
제9항에 있어서, 상기 식물체는 하이드록시 지방산 합성 유전자가 도입된 것인 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진 방법.
제9항에 있어서, 유전자의 도입은 상기 유전자를 보유하는 벡터로 식물체를 형질전환함으로써 이루어지는 것인 식물의 하이드록시 지방산 생산 촉진 방법.