KR20080107004A - 식물 스트레스 저항성을 증가시키는ＣａＲｍａ１Ｈ１유전자 및 상기 유전자가 도입된 형질전환식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학적 또는 비생물학적 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 고추 유래의 CaRma1H1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 단백질의 효소활성, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 유전자를 이용하여 식물체의 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다. 본 발명에서 분리된 CaRma1H1 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 CaRma1H1 단백질은 식물의 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다.

고추, 스트레스 저항성, CaRma1H1, 형질전환, 유비퀴티네이션

Description

식물 스트레스 저항성을 증가시키는 ＣａＲｍａ１Ｈ１유전자 및 상기 유전자가 도입된 형질전환 식물체{CaRma1H1 gene increasing plant stress resistance and transgenic plants transformed by CaRma1H1 gene}

도 1은 CaRma1H1 유전자의 시퀀스 분석을 나타낸 것이다. CaRma1H1 유전자는 1369개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 코딩되는 영역은 회색선과 같다.

도 2는 CaRma1H1 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 252개의 아미노산으로 구성된 단백질로서 애기장대와 유사도가 높은 단백질과 비교분석을 나타낸 결과이다. 일치하는 아미노산은 회색으로 나타낸 것이고 링 핑거 도메인은 적색으로 표시하였다.

도 3은 비생물학적 스트레스 조건에서 CaRma1H1 유전자의 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 CaRma1H1 단백질의 효소활성 분석을 나타낸 것이다. CaRma1H1 단백질에 MBP(maltose binding protein)를 붙인 다음 오토 유비퀴티네이션을 수행한 것으로, UBA1, UBC8, 유비퀴틴, CaRma1H1을 넣어주고 시간의 흐름에 따라 단백질 변화를 확 인하기 위해서 MBP의 특이적인 항체를 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

(a) 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 2 mM 디티오트레이톨(DTT), 300 ng/μl 유비퀴틴, 25 μM MG132, 500 ng UBA1, 500 ng UBC8, MBP-CaRma1H1 500 ng을 각각의 튜브에 넣어준 후 30℃ 배양기에서 배양하고, 5, 10, 20, 40, 60분 후 각각 2X 시료 완충용액을 30 μl 넣어준 후 100℃에서 5분간 끓이고 anti-MBP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다.

(b), (a)와 같은 조성에서 E1인 UBA1, E2인 UBC8, 그리고 유비퀴틴을 하나씩 제거한 후 anti-MBP항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다.

(C) C3HC4 타입의 링 핑거 도메인을 가지는 CaRma1H1 단백질에서 시스틴과 히스티딘 중 한 개씩 돌연변이를 주었을 때, 효소활성이 나타나지 않는 것을 anti-MBP 웨스턴 블롯을 이용하여 분석한 결과이다.

(d) CaRma1H1 단백질의 도메인을 도식적으로 표시한 것이다. 58, 61, 89, 115번째 아미노산을 각각 해당하는 아미노산으로 바꾸어 주었다.

도 5는 35S:CaRma1H1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대의 표현형을 분석한 결과이다. 4주 동안 키운 야생형 애기장대(WT)와 35S:CaRma1H1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대를 14일간 물을 주지 않은 후에 다시 물을 공급하고 5일이 경과한 후 식물을 관찰한 것이다.

도 6은 35S:CaRma1H1 재조합 벡터로 형질전환된 애기장대와 야생종과의 건조스트레스에 대한 통계처리를 나타낸 것이다. (a) 3주간 성장시킨 다음 식물체에 11일 동안 물을 주지 않고 방치하고, 다시 물을 공급하여 3일이 경과한 후의 식물의 표형형을 관찰한 것이다. (b) 각 형질전환체의 CaRma1H1 유전자 과발현 정도를 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다. (c) 형질전환 식물체와 야생종과의 생존율을 상대적으로 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명은 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 고추 유래의 CaRma1H1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 단백질의 효소활성, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 유전자를 이용하여 식물체의 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법, 상기 방법에 의해 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

모든 살아있는 유기체는 일생동안 생물적, 비생물적 스트레스에 지속적으로 노출되어 있다. 동물은 위험에 노출되어질 경우 피할 수 있지만, 식물은 고착성 생물체로 다양한 스트레스에 대해 동물보다 더 많은 영향을 받게 된다. 그러므로 식물은 자신을 보호하기 위해 비생물적 스트레스 (예를 들면, 수분, 온도, 빛, 염도, 금속과 토질)와 생물적 스트레스 (예를 들면, 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 포식동물)를 빠르게 감지하고 반응해야 한다. 식물은 환경 스트레스 및 방어/스트레스 감응을 위한 정교한 네트워크를 가지고 발달되어졌다 (Yang Y. et al., 1997, 11:1621-1639). 그러므로 식물은 움직일 수 없기 때문에, 환경 자극을 빠르게 인식하고 반응하는 메카니즘을 가지게 되었다.

한편, 유비퀴틴은 모든 진핵생물에서 발현되는 단백질로 76개의 아미노산으로 이루어져 있으며 다른 단백질에 공유결합이 되는 특성을 가지고 있어 유비퀴티네이션이라고 한다. 유비퀴티네이션이 되는 기질 단백질은 매우 다양하여 세포 내의 거의 모든 생리활동이 유비퀴티네이션에 연관이 있으며, 많은 질병이 이러한 결합이 잘 이루어지지 않아 일어난다. 유비퀴틴은 그 기질로 유비퀴틴 스스로를 가지며, 이것은 공유결합으로 서로 연결된 유비퀴틴 사슬을 형성할 수 있다. 따라서 세포 내에서 유비퀴틴 단위체 및 하나의 유비퀴틴이 공유결합된 단백질, 유비퀴틴 사슬이 결합된 단백질, 그리고 유비퀴틴 사슬등의 형태가 존재한다. 유비퀴티네이션은 E1-E2-E3 연쇄 효소 반응에 의해 이루어지는데, 각각 유비퀴틴 활성화, 유비퀴틴 결합 - 유비퀴틴 연결의 반응이다. 유비퀴티네이션은 식물 뿐만이 아니라 모든 고등 생명체가 가지는 하나의 메카니즘으로써, 다양한 기능을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다. 특히 비생물학적 스트레스에 관여하는 유전자는 거의 알려진 바가 없다.

국내 자생식물과 같은 중요한 식물 자원에서 분리된 유용 유전자의 특허와 상품화 는 생명공학 분야의 많은 부분을 차지하고 있으며, 식물의 스트레스 조절에 관여하는 유전자의 발현억제 및 과다발현 식물체의 개발은 다양한 신기능 자생식물체 (노화지연 식물, 고추의 색깔이나 크기변화, 다양한 외부 스트레스에 저항하는 식물, 뿌리 길이변화식물 등)의 생산과 산업화라는 가능성에 대한 기대가 증가되어지고 있다. 더 나아가 농업적으로 중요한 다양한 작물에도 적용되어 그 생산성 향상에 기여할 수 있을 것이다. 이러한 식물의 환경 스트레스에 대한 연구가 활발하게 진행 중이며, 한국공개특허 제2006-80235호에는 식물에서 스트레스 내성을 향상시키는 방법 및 이들의 방법이 기재되어 있다.

이에 본 발명자들은 식물의 생물학적 또는 비생물학적 스트레스 저항성을 연구하던 중, 고추 유래의 CaRma1H1 유전자를 분리하고, CaRma1H1 유전자가 식물체의 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 고추 유래의 CaRma1H1 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaRma1H1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 CaRma1H1 단백질의 효소 활성을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 고추 유래의 CaRma1H1 단백질을 제공한다.

본 발명에서는 고추 유래의 새로운 유전자 CaRma1H1를 규명하고, 또한, 본 발명에서는 상기 단백질이 링 핑거 도메인이 잘 보존되어져 있는 것을 의미하는 CaRma1H1 (Capsicum annuum Ring finger protein with Membrane Anchor1 Homolog1)으로 명명 하였다.

본 발명에 따른 CaRma1H1 단백질의 범위는 고추로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 과발현시 식물의 스트레스 저항성을 증가시키는 활성을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 스트레스는 건조, 저온, 상처, 자스몬산(JA), 살리실산(SA), 과산화수소, 키토산, NaCl, 카드뮴, 자외선 조사, 단백질 인산화효소 저해제 또는 오존일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 CaRma1H1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 CaRma1H1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상 기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화 하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질 전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 CaRma1H1 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 스트레스는 건조, 저온, 염, 자스몬산(JA), 살리실산(SA), 과산화수소, 키토산, NaCl, 카드뮴, 자외선 조사, 단백질 인산화효소 저해제 또는 오존일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

식물체에서 CaRma1H1 유전자를 과발현시키는 방법으로는 CaRma1H1 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 CaRma1H1 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 CaRma1H1 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다. 상기에서 "유전자의 과발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 CaRma1H1 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체 내로 CaRma1H1 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 CaRma1H1 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환하는 방법이 있 다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다. 또한, 단자엽 식물이나 목본 식물체에서 CaRma1H1 유전자를 과발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 스트레스 저항성이 증가될 수 있는 식물체로는 고추, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명에 따른 스트레스 저항성이 증가된 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 CaRma1H1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다. 즉, CaRma1H1 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다. 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다. 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 스트레스 저항성이 증가된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

재료 및 방법

1. cDNA 클론 제조

본 발명에서는 DD-PCR을 통하여 얻은 수분 스트레스 유도된 CaRma1H1 유전자의 단편 클론의 전체길이 cDNA를 얻기 위하여 Lamda ZapII 고추잎 cDNA 라이버러리를 CaRma1H1 유전자의 단편 클론을 이용하여 스크리닝 하였다.

즉 150 mm LB 플레이트에 재조합 파지를 감염시킨 E. coli XL1-Blue MRF' 숙주 세포를 도말한 후 플라크가 형성되면 LB 플레이트를 4℃에서 2시간 이상 방치시켰다. Hybond-N+ membrane (Amersham)에 플라크를 옮긴 후, 막을 1.5 M NaCl과 0.5 M NaOH가 포함된 용액에서 변성시킨 다음, 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0)로 이루어진 용액에서 중화시키고 0.2 M Tris-HCl (pH 7.5)과 2 X SSC 용액에서 세척한 다음 건조시켰다. 그런 다음 막을 80℃에서 2시간 동안 방치하여 DNA를 막에 cross-link 시킨 후 ³²P로 표지된 pCaRma1H1 프로브로 혼성화하였다 (5 x Dendardt's, 6 x SSPE, 0.5% SDS, 55℃, 14시간). 혼성화 후 나일론 막은 세척용액(1 x SSPE, 0.1% SDS)으로 60℃에서 25분간 3회를 반복하여 씻어 주었다. 세척된 막은 X-ray 필름과 intensifying screen을 사용하여 -70℃에서 2-7일 감광시켰고 이후 현상하였다.

UniZAP XR 벡터로부터 재조합 DNA를 포함한 상태로 pBluescript 파지미드를 분리해 내기 위하여, ExAssist helper phage/SOLR cell을 이용한 시스템을 사용하였다. 2차 스크리닝까지 끝낸 single phage stock (> 1X10⁵ phage particle)과 XL1-Blue MRF' (OD₆₀₀=1), ExAssist helper phage(> 1X10⁵ phage particle)를 섞어서 37℃에서 15분간 배양한 후 LB 배지에서 4시간 이상 흔들어주면서 배양하여 단일 클론 침출이 일어나게 하였고, 70℃에서 15분간 처리한 후 원심분리하여 파지미드가 존재하는 상등액을 취하였다. 일정량을 SOLR 세포 (OD₆₀₀=1) 200 μl와 혼합하여 37℃에서 15분간 배양하고, LB/Amp 고체 배지에 50 ml씩 도포하여 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 생성된 콜로니에서 플라스미드를 분리하여 삽입된 DNA의 크기를 확인하고 대장균(E. coli (DH5α strain))에 형질전환 시켰다.

Sequenase Ver. 2.0 (USB)를 사용하여 dideoxy chain termination방법으로 시퀀싱을 수행하였다. 플라스미드 DNA를 알칼리로 변성시킨 후 DNA 시퀀싱 프라이머를 결합시키고 (35S)-dATP로 라벨링한 후 ddNTP를 첨가하여 37℃에서 종결 반응을 수행하였다. 반응산물을 6% 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 수행한 후 X-ray 필름에서 감광시켜 염기 서열을 판독하였다.

2. 고추 유래의 게놈 DNA 추출

본 발명에서는 약 4주된 고추 잎을 재료로 하여 genomic DNA를 분리하였다. 고추 잎을 막자 사발에 넣고 파쇄 후 1g 당 3 ml의 추출 완충용액 (8.0 M urea, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 20 mM EDTA, 250 mM NaCl, 2% (w/v) 사르코실, 5% (v/v) 페놀 및 20 mM 2-머르캅토에탄올)를 혼합하였다. 일련의 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 (25:24:1, v/v) 과정 후 에탄올 침전 방법에 의해 DNA를 농축시켰다. 펠렛을 10 mM Tris-Cl (pH 7.5)와 1 mM EDTA에 녹이고 1.5 g mL^-1의 염화세슘을 가한다음 200,000 g에서 24시간 동안 원심분리 하였다. DNA 수거후 물-포화된 1-부탄올을 이용하여 에틸브로마이드를 제거하고, 에탄올 침전 과정을 거쳐 10 mM Tris-Cl (pH 7.5)과 1 mM EDTA에 녹였다.

3. 식물 성장조건 및 시료채취

4 ℃에 보관되어 있는 고추 (Capsicum annuum L. cv. Pukang) 씨앗을 30% 락스와 0.025%의 트리톤 X-100에 20분간 살균 처리한 후 물로 10번 이상 씻어 주었다. 처리된 씨는 3% 수크로스, B5 비타민 (12 mg/ L), 0.8% 아가로 구성되어 있는 MS 배지에 vertical로 심은 후 약 2주간 생장 챔버 (16시간 광조건/ 8시간 암조건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다. Green whole plant를 재료로 사용한 경우는 씨앗을 흐르는 물에서 하루 동안 담근 후 버마큘라이트와 흙을 1:1의 비율로 혼합하여 넣은 화분에 심어서 약 3주간 생장챔버 (16시간 광조건/ 8시간 암조건)에서 키운 식물을 재료로 하여 수행하였다. 에틸렌 처리를 위하여 각 처리구들은 공기 혹은 20 ppm의 에틸렌이 포함되어 있는 3 L의 병에서 특정 시간동안 유지시켰다.

4. 스트레스(염, 저온, 건조, 상처) 처리

본 발명에서는 CaRma1H1 유전자의 스트레스 저항성을 확인하기 위해, 건조 스트레스는 배지에서 2주간 키운 고추유묘를 공기 중에 노출시킨 후 물 함량이 5%, 10% 감소되는 시점에서 잎, 뿌리 조직을 샘플링하였다. 염 스트레스는 4주간 키운 고추 식물의 뿌리에 300 mM의 염화나트륨을 처리한 후 2시간, 5시간이 경과한 후 뿌리 조직만 샘플링하였다. 저온 스트레스는 배지에서 2주간 키운 고추유묘를 4도가 유지되는 인큐베이터에서 3시간, 6시간 동안 배양하고 잎과 뿌리 조직을 샘플링하고, 상처 처리의 경우는 2주간 키운 고추식물의 잎 조직에 칼로 상처를 내고 30분, 1시간, 2시간 후에 샘플링하였다.

다양한 스트레스를 처리한 고추 조직을 액체 질소를 사용하여 막자 사발에서 갈아 가루로 만든 다음 1 g 당 2 ml의 추출 완충액 (4 M 구아니딘-HCl 20 mM, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 0.5% 사르코실, pH 9)과 β-머르캅토에탄올을 이용하여 추출한 후 코니칼 튜브로 옮긴 다음 이를 동량의 PCI (페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알콜 = 25 : 24 : 1)와 혼합하여 5분간 흔들어 준 다음 3,500 rpm에서 25분간 원심분리 하였다 (한일 원심 분리기, HA-1000-3). 원심분리 후 상층의 유기 용매층을 제거하고, 동량의 PCI를 혼합하여 흔든 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 수행하고, 이 때 형성된 아래의 수용액 층을 2회 에탄올 침전 및 1회 LiCl 침전 방법을 사용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Beckman DU 650 분광광도계를 사용하여 정량한 후 각 30 μg의 RNA를 1% 아가로스 겔 (1.85% 포름알데히드)상에서 전기영동 하였다. 전기 영동한 겔은 트랜스-백 (Trans-vac, Hoefer Scientific Instruments, CA, USA)을 이용하여 N+ 나이론 막 (Amersham, USA)으로 옮겨졌으며, 이 나이론 막은 ³²P로 표지된 CaRma1H1 유전자를 프로브로 혼성화 시켰다 (5 x Dendardt, 6 x SSPE, 0.5% SDS, 62℃, 14시간). 혼성화 후 나일론 막은 세척 용액 (1 x SSPE, 0.1% SDS)으로 65℃에서 25분간 3회를 반복하여 씻어 주었다. 세척된 막은 X-ray 필름과 증폭 스크린을 사용하여 -70℃에서 2-7일 감광시키고 현상하였다.

5. 정량적인 역전사효소 ( RT )- PCR

형질전환 식물체와 야생종의 잎으로부터 전체 RNA를 추출하여 올리고 dT 프라이머와 MMLV 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 합성하였다. PCR 수행을 위해 주형으로 20 ng의 cDNA를 사용하였으며 두 종류의 프라이머를 각각 10 pmole씩, 10 x Taq 폴리머라제 완충용액 5 ml, dNTP 혼합액 (각 1.25 mM) 8 ml, 그리고 1 unit의 Taq DNA 폴리머라제를 넣어 총 부피를 50 ml로 만들었다.

Perkin Elmer DNA 써멀 사이클러로 PCR을 수행하였다. 먼저 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 30분, 52℃에서 30분, 72℃에서 1분을 반복하는 것을 25회 수행하였고 25회 반복이 끝난 후 72℃에서 5분간 추가로 중합반응을 수행한 다음 -20℃에 냉동 보관하였다. PCR에 사용된 CaRma1H1, 유비퀴틴 유전자의 프라이머는 아래와 같다.

CaRma1H1 정방향 프라이머: 5’-ATGGAAGTCAATGAACGATG-3’ (서열번호 3 )

CaRma1H1 역방향 프라이머: 5’-CTGCTGTTGATAACCTCGTC -3’ (서열번호 4)

유비퀴틴 정방향 프라이머: 5’-ATGCAGATCTTTGTTAAGACTCTC-3’ (서열번호 5)

유비퀴틴 역방향 프라이머: 5’-TCAACCACCACGGAGCCTGA-3’ (서열번호 6)

6. CaRma1H1 벡터 구축물의 설계

본 발명에서는 말토오즈에 결합하는 단백질과 CaRma1H1을 융합시켜 발현시킬 플라스미드를 재조합하기 위해, CaRma1H1의 코딩 부분의 5’ 그리고 3’쪽에 EcoRI 제한효소에 해당하는 시퀀스를 붙여놓은 프라이머 세트(5’-gaattcatgaatcaagatatggcc-3’ (서열번호 7), 5’-gaattctcaaaacaagattagac-3’ (서열번호 8))를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물과 pMAL-X 벡터(New England Biolabs, Beverly, MA)를 EcoRI 제한효소로 자른 다음 T4 DNA 라이가제(New England Bio Lab) 효소를 이용하여 라이게이션(ligation) 하였다. 재조합된 MBP-CaRma1H1을 대장균 BL21-CodonPlus (DE3) RIL(스트라테이진)에 발현시킨 후, 아밀로즈 컬럼 크로마토그래피를 이용해 정제시켰다. 단백질은 표준 단백질로 BSA를 이용해 정량하였다.

또한 본 발명에서는 CaRma1H1 단백질의 효소활성 특이성을 확인하기 위해 링 도 메인 부근의 중요한 아미노산을 QuikChange 현장에서 유도된 돌연변이 시스템 (스트라테이진, USA)을 이용하여 수행하였다. 원하는 부위에 점 돌연변이를 정방향과 역방향 올리고뉴클레오티드를 겹치게 만든 다음, 12 사이클의 증폭과정을 거쳐 DpnI 제한효소로 1시간 동안 자른 후, DH5a 대장균에 형질전환시키고 시퀀싱 분석을 통 해 돌연변이가 제대로 이루어진 것을 확인하였다. 이렇게 만들어진 돌연변이 CaRma1H1은 각각 CaRma1H1 H58A, CaRma1H1 C61S, CaRma1H1 C89S, CaRma1H1 K115R 이라고 명명하였다. 본 발명에 사용된 벡터의 프라이머 시퀀스는 아래와 같다.

CaRma1H1 H58A 정방향 프라이머

5'-TAACTTTATGCGGTGCTCTTTACTGCTGGC-3' (서열번호 9)

CaRma1H1 H58A 역방향 프라이머

5'-GCCAGCAGTAAAGAGCACCGCATAAAGTTA-3' (서열번호 10)

CaRma1H1 C61S 정방향 프라이머

5'-GCGGTCATCTTTACAGCTGGCCTTGCATT-3' (서열번호 11)

CaRma1H1 C61S 역방향 프라이머

5'-AATGCAAGGCCAGCTGTAAAGATGACCGC-3' (서열번호 12)

CaRma1H1 C89S 정방향 프라이머

5'-CGCAATGCCCTGTTAGCAAGGCTGAAGTC-3' (서열번호 13)

CaRma1H1 C89S 역방향 프라이머

5'-GACTTCAGCCTTGCTAACAGGGCATTGCG-3' (서열번호 14)

CaRma1H1 K115R 정방향 프라이머

5'-CCATCCGAAGAAAGGGCTCCGAATCTTGG-3' (서열번호 15)

CaRma1H1 K115R 역방향 프라이머

5'-CCAAGATTCGGAGCCCTTCCTTCGGATGG-3' (서열번호 16)

또한, 본 발명에서는 형질전환체 제작을 위하여 CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터를 포함하고 있는 바이너리 벡터인 pBI121을 애기장대의 형질전환을 위해 사용하였다. 형질전환을 하기 위하여 pCaRma1H1 cDNA를 주형으로 하여 high fidelity EX-tag polymerase(Takara, Kyoto, Japan)를 이용한 PCR을 수행하였다. 그 결과 단백질의 번역부위를 완전히 포함하고 있는 cDNA 조각을 얻을 수 있었으며 이를 EcoRI, BamH1 제한효소로 자른 뒤 pBI121 벡터로 도입하였다.

7. 아그로박테리움으로 CaRma1H1 형질전환

제작된 구축물은 아그로박테리움(GV3101)에 전기천공법을 이용하여 형질전환 하였으며 유전자의 존재 유무는 PCR을 이용하여 확인하였다. 약 4주된 애기장대(columbia [Col-0])의 지상 부위를 0.05% 실웨트가 포함된 MS 배지에 1분 30초간 담구는 방법으로 형질 전환 시켰다(clough and Bent, 1998, Plant J 16; 735-743). 약 3주간 23 ℃의 생장 챔버에서 배양하고, 씨를 받은 후(T1), 25 ㎍/㎖ 의 카나마이신과 250 ㎍/㎖의 카르베니실린이 포함된 배지에서 살아남는 개체들을 골라 형질전환 유전자의 존재 여부를 RT-PCR 및 노던 블롯을 통해 검증하였다.

8. CaRma1H1 단백질의 효소활성 분석

본 발명에서는 CaRma1H1 단백질의 효소활성분석을 위해 pMAL C2 벡터에 CaRma1H1 유전자의 ORF를 말토오즈 결합 단백질(maltose binding protein) 프레임에 맞게 서브클로닝을 수행하였다. 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 2 mM ATP, 2 mM 디티오트레이톨(DTT), 300 ng/μl 유비퀴틴, 25 μM MG132, 500 ng UBA1, 500 ng UBC8, MBP-CaRma1H1 500 ng을 각각의 튜브에 넣어준 후 30℃ 배양기에서 배양 하였다. 5, 10, 20, 40, 60 분 후 각각 2X 샘플 완충용액을 30 μl 넣어준 다음 100 ℃에서 5분간 끓이고 anti-MBP(New England Bio Labs) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

실시예 1: CaRma1H1 유전자의 특성 및 기능적 분석

고추 (Capsicum annuum L.CV Bukang)에서 분리한 유전자로 코딩되는 단백질이 링 핑거 도메인이 잘 보존되어져 있는 것을 의미하는 CaRma1H1 (Capsicum annuum Ring finger protein with Membrane Anchor1 Homolog1)으로 명명하였다.

본 발명에서 분리된 CaRma1H1 유전자 cDNA(서열번호 1)는 1369bp 길이로 252개의 아미노산 폴리펩티드로 구성되어져 있으며, CaRma1H1 유전자의 아미노산 서열(서열번호 2)과 애기장대 At4g28270은 30%, AtRma1은 34%, At4g27470은 29%의 유사도를 보이는 것을 확인하였다.

실시예 2: 다양한 스트레스에 대한 CaRma1H1 유전자의 발현양상 분석

본 발명에서는 비생물학적 스트레스 처리에 따른 CaRma1H1 유전자의 발현을 확인하기 위해 건조, 염, 저온, 상처 등의 다양한 환경 스트레스 조건(NaCl 300 mM, 건조조건: 고추유묘의 물 함량이 5%, 10% 되었을 때의 시점, 저온 : 4℃)에서 고추의 잎과 뿌리에서 CaRma1H1 유전자의 발현 정도를 노던 블롯으로 분석하였다. 본 발명에서 상기 유전자와 비교하기 위해 사용된 CaRCI 유전자는 애기장대의 RCI2a와 유사도가 높은 유전자로써 염 스트레스에 의해 발현이 유도되는 유전자로 잘 알려져 있으며, CaPINII 유전자는 단백질가수분해효소 저해제 II와 유사도가 높은 고추 유전자로써, 에틸렌 및 상처스트레스에 의해서 발현이 아주 잘 유도되는 마커유전자로 알려져 있다. CaRma1H1 유전자의 발현양상을 확인한 결과 도 3에서 알 수 있듯이, 저온 스트레스를 처리한 경우(4℃) 잎에서 CaRma1H1 유전자의 발현이 3시간이 경과한 후 현저하게 증가되어지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 뿌리에서도 시간이 경과함에 따라 CaRma1H1 유전자의 발현이 증가되어지는 것을 관찰할 수 있었다. 염을 처리했을 때는 2시간이 경과했을 때 뿌리에서 현저하게 발현이 증가되어지다가 시간이 경과함에 따라 발현량이 감소되어지는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 건조 스트레스를 처리한 경우 상기 유전자의 발현은 물 함량이 5%, 10% 감소되어짐에 따라 뚜렷한 변화는 나타내지 않았지만, 수분함량이 감소되었을 때 CaRma1H1 유전자의 발현량이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 상처를 처리했을 때는 30분이 경과했을 때 다소 발현량이 증가되어졌으나 시간이 경과함에 따라 감소되어지는 양상을 확인할 수 있었다.

실시예 3: CaRma1H1 단백질의 효소활성 분석

본 발명에서는 CaRma1H1 단백질의 효소활성을 분석하기 위해 UBA1, UBC8, 유비퀴틴, CaRma1H1을 넣어준 다음 5, 10, 20, 40, 60분 후 CaRma1H1 단백질의 변화를 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 측정한 결과 도 4a에서 알 수 있듯이, 시간이 경과함에 따라 초기에 비해 점점 많은 밴드가 관찰되었고, 이것은 MBP-CaRma1H1 단백질이 오토유비퀴티네이션 된 것임을 확인할 수 있었다. 따라서 CaRma1H1 단백질은 E3 라이게이즈 효소 활성을 가지는 것을 알 수 있었다. 또한 본 발명에서는 E1인 UBA1, E2인 UBC8, 그리고 유비퀴틴을 하나씩 제거한 후 CaRma1H1 단백질의 변화를 확인하였다 (도 4b 참조). 도 4c에서는 C3HC4 타입의 링 핑거 도메인을 가지는 CaRma1H1 단백질에서 단백질의 효소활성에 중요한 영향을 미치는 시스틴과 히스티딘의 기능을 확인하기 위해 이들 아미노산을 한 개씩 돌연변이를 주었을 때, 효소활성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

실시예 4: 35S: CaRma1H1 벡터로 형질전환된 애기장대의 표현형 분석

본 발명에서는 CaRma1H1 유전자의 기능적 분석을 위해 야생종 애기장대와 35S:CaRma1H1 벡터로 형질전환된 애기장대의 표현형을 관찰하였다. 도 5에서 알 수 있듯이, 4주 동안 키운 야생종 애기장대와 CaRma1H1 유전자로 형질전환된 애기장대에 물을 주지 않고 14일 동안 건조 스트레스를 준 후 다시 물을 공급하여 준 후 5일이 경과했을 때 야생종에 비해 형질전환된 애기장대의 건조 저항성이 증가된 것 을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 35S: CaRma1H1 벡터로 형질전환된 애기장대의 표현형 통계분석 및 CaRma1H1 유전자 발현분석

4개의 독립적인 형질전환 식물체 군을 이용하여 야생종과의 건조 스트레스에 대한 통계처리를 실시하였다. 3주간 성장시킨 애기장대에 11일 동안 물을 주지 않고 방치한 다음 다시 물을 공급하고 3일이 경과한 후 식물을 관찰하였다. 야생종에 비해 형질전환된 애기장대는 33%에서 91% 비율로 건조 스트레스에 대한 저항성을 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 6a, c 참조). 또한 각 형질전환체의 과발현 정도를 노던 블롯을 통해 분석한 결과 모든 라인에서 CaRma1H1 유전자가 현저하게 발현되어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 6b 참조).

본 발명에서 분리된 고추 유래의 CaRma1H1 유전자 및 상기 유전자로부터 발현되는 CaRma1H1 단백질은 식물의 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> CaRma1H1 gene increasing plant stress resistance and transgenic plants transformed by CaRma1H1 gene <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1369 <212> DNA <213> Capsicum annuum <400> 1 ggcacgaggc tttgcttttc tccttctaaa gactcaatat cttacttgtg tgttagttca 60 caaacgttct tgatacaatt atactacttg ggcattagca gataatttta ttacatcatg 120 aatcaagata tggccttaga acagcttgac actaccttta acaaacacga tactccatta 180 gggaaatgga agtcaatgaa cgatgaagtt gaagagaata tttctggtgg cttcgactgt 240 aacatatgcc tggattgtgt gcacgaacct gtgataactt tatgcggtca tctttactgc 300 tggccttgca tttacaaatg gatttatttc cagagtgttt cttcagaaaa ttcggatcag 360 caacaaccgc aatgccctgt ttgcaaggct gaagtctcag aaaaaacctt gattccactc 420 tatggacgcg gtggtcaatc tacaaaacca tccgaaggaa aggctccgaa tcttggcata 480 gtgatcccac aaaggccccc tagtccaagg tgtggtggtc acttcttgtt accaactact 540 gattcaaatc catcccagct acttcaacga cgaggttatc aacagcagtc tcaaacacgt 600 caaccggctt atcagggtag ctacatgtct tcgcccatgc tcagccctgg tggtgcgact 660 gcgaatatgt tacaacactc catgattgga gaagtagcct atgcaagaat ttttggcaac 720 tcatcaacaa ctatgtatac atatccaaac tcttataatc tagcaatcag cagtagccca 780 agaatgagaa ggcaattatc acaggctgat agatcacttg gcagaatatg ttttttccta 840 ttttgttgct ttgtcacatg tctaatcttg ttttgaacac ttttttcctc ctgtcttttg 900 cttgtacttt gtacaaaaag atttggtgtt gtagtctcag taaaaaaaaa gggcagcctg 960 gtgcatctaa actcctgcta tctatgtgca gggtttcgga aagggctgga caacaacggt 1020 acgttatagt cccttatagt agataagaaa atgtacaaca gcctcggcta aatgtgtaac 1080 aaatcataga agcttttgcc tctttgattg ttgctaaaca ctcttggaat tagagtgctt 1140 tcattgaacc cttttttgat attataatct aagaaatgag gtttgaagtt ctatccatta 1200 tggtgcatag agactcatac tatgttatgt aacaatcaat ttgatatggt cgctaacaat 1260 caatttgata tggtcgcacc gtttcatttt ttctctttca tttggccttt gcttatatct 1320 aattatccct ttttatcttt tttttataaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1369 <210> 2 <211> 252 <212> PRT <213> Capsicum annuum <400> 2 Met Asn Gln Asp Met Ala Leu Glu Gln Leu Asp Thr Thr Phe Asn Lys 1 5 10 15 His Asp Thr Pro Leu Gly Lys Trp Lys Ser Met Asn Asp Glu Val Glu 20 25 30 Glu Asn Ile Ser Gly Gly Phe Asp Cys Asn Ile Cys Leu Asp Cys Val 35 40 45 His Glu Pro Val Ile Thr Leu Cys Gly His Leu Tyr Cys Trp Pro Cys 50 55 60 Ile Tyr Lys Trp Ile Tyr Phe Gln Ser Val Ser Ser Glu Asn Ser Asp 65 70 75 80 Gln Gln Gln Pro Gln Cys Pro Val Cys Lys Ala Glu Val Ser Glu Lys 85 90 95 Thr Leu Ile Pro Leu Tyr Gly Arg Gly Gly Gln Ser Thr Lys Pro Ser 100 105 110 Glu Gly Lys Ala Pro Asn Leu Gly Ile Val Ile Pro Gln Arg Pro Pro 115 120 125 Ser Pro Arg Cys Gly Gly His Phe Leu Leu Pro Thr Thr Asp Ser Asn 130 135 140 Pro Ser Gln Leu Leu Gln Arg Arg Gly Tyr Gln Gln Gln Ser Gln Thr 145 150 155 160 Arg Gln Pro Ala Tyr Gln Gly Ser Tyr Met Ser Ser Pro Met Leu Ser 165 170 175 Pro Gly Gly Ala Thr Ala Asn Met Leu Gln His Ser Met Ile Gly Glu 180 185 190 Val Ala Tyr Ala Arg Ile Phe Gly Asn Ser Ser Thr Thr Met Tyr Thr 195 200 205 Tyr Pro Asn Ser Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Ser Ser Pro Arg Met Arg 210 215 220 Arg Gln Leu Ser Gln Ala Asp Arg Ser Leu Gly Arg Ile Cys Phe Phe 225 230 235 240 Leu Phe Cys Cys Phe Val Thr Cys Leu Ile Leu Phe 245 250 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 forward primer <400> 3 atggaagtca atgaacgatg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 reverse primer <400> 4 ctgctgttga taacctcgtc 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin forward primer <400> 5 atgcagatct ttgttaagac tctc 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin reverse primer <400> 6 tcaaccacca cggagcctga 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaattcatga atcaagatat ggcc 24 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaattctcaa aacaagatta gac 23 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 H58A forward primer <400> 9 taactttatg cggtgctctt tactgctggc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 H58A reverse primer <400> 10 gccagcagta aagagcaccg cataaagtta 30 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 C61S forward primer <400> 11 gcggtcatct ttacagctgg ccttgcatt 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 C61S reverse primer <400> 12 aatgcaaggc cagctgtaaa gatgaccgc 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 C89S forward primer <400> 13 cgcaatgccc tgttagcaag gctgaagtc 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 C89S reverse primer <400> 14 gacttcagcc ttgctaacag ggcattgcg 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 K115R forward primer <400> 15 ccatccgaag aaagggctcc gaatcttgg 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaRma1H1 K115R reverse primer <400> 16 ccaagattcg gagcccttcc ttcggatgg 29

Claims (12)

1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 고추 유래의 CaRma1H1 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 상기 스트레스는 메틸 자스몬산(MeJA), 살리실산(SA), 과산화수소, 키토산, NaCl, 카드뮴, 자외선 조사, 건조, 저온, 단백질 인산화효소 저해제 또는 오존인 것을 특징으로 하는 단백질.
3. 제 1항에 있어서, E3 라이게이즈 효소활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 CaRma1H1 단백질.
4. 제 1항의 CaRma1H1 단백질을 코딩하는 유전자.
5. 제 4항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
6. 제 4항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제 6항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
8. 제 4항의 유전자를 식물체에서 과발현시킴으로써 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 스트레스는 자스몬산(JA), 살리실산(SA), 과산화수소, 키토산, NaCl, 카드뮴, 자외선 조사, 건조, 저온, 단백질 인산화효소 저해제 또는 오존인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 스트레스 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
12. 제 11항의 형질전환 식물체의 종자.

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