KR20230044750A - 안토시아닌 생합성 억제 유전자 BrMYBR1 및 이의 용도 - Google Patents
안토시아닌 생합성 억제 유전자 BrMYBR1 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질 및 BrMYBR1 유전자에 관한 것이다. 또한 BrMYBR1 유전자 교정을 이용한 안토시아닌 생성을 증진하기 위한 유전체 교정용 조성물, 안토시아닌 생성이 증진된 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 유전체 교정 식물체 및 이의 종자에 관한 것으로, BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 식물체에 도입하여 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 안토시아닌 생성을 억제하는 유전자 BrMYBR1를 교정하여 안토시아닌 생성이 증진된 건강기능성 채소작물의 개발에 이용이 가능하다.
따라서, 본 발명은 상기 안토시아닌 생성을 억제하는 유전자 BrMYBR1를 교정하여 안토시아닌 생성이 증진된 건강기능성 채소작물의 개발에 이용이 가능하다.
Description
본 발명은 안토시아닌 생합성 억제 유전자 BrMYBR1 및 이의 용도에 관한 것이다.
안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌의 다양한 생리활성작용이 보고되고 있다. 이러한 안토시아닌은 다양한 식물 종에 폭넓게 존재하며, 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있다. 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로부터 안토시아닌을 추출하여 여러 가지 원료로 사용되고 있다.
한편, 식물에서의 안토시아닌 생합성은 식물 자체가 가지고 있는 유전적 요인과 이것이 잘 발현되도록 하는 환경요인의 상호작용에 의해 조절된다. 안토시아닌 생합성을 조절하는 유전자로는 R2R3 MYB 타입 유전자와 bHLH(Basic helix-loop-helix) 타입 유전자가 밝혀져 있다. 이들 유전자들은 식물체의 다양한 조직에서 단독 또는 서로 복합체를 형성하여 유전자의 발현을 조절하고 있는 것으로 알려져 있다. 안토시아닌 생합성의 전사 조절자인 MYB 전사인자(transcription factor)를 암호화하는 MYB 유전자는 단일 또는 복수의 불완전한 반복으로 구성되는 구조적으로 보존된 DNA 결합 도메인이 특징인 전사인자 클래스를 가지며, R2R3 전사 인자는 두개의 반복 클래스의 DNA 결합 도메인을 지니고 있다. 전사 인자(transcriptiona factors, TFs)는 대사 경로의 억제물질 또는 활성제로서의 활성을 갖는 조절 단백질이다. 따라서 TFs는 식물 내에서 전체적인 대사 경로의 조작을 위한 강력한 도구로써 사용될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 식물체 내의 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위해 MYB 타입 안토시아닌 억제 전사인자의 유전자를 탐색하였으며, 이를 기능성 유용 물질인 안토시아닌의 생산을 위해 활용하고자 하였다.
본 발명에서 MBW 복합체를 조절하는 신규 억제조절인자로 BrMYBR1 유전자의 기능을 확인하였으며, 상기 유전자가 BrbHLH1와 상호작용하여, 음성적으로 안토시아닌 생합성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, BrMYBR1 유전자를 교정하여, 식물체내에서 안토시아닌 생성이 증진된 건강기능성 채소작물의 제조가 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 BrMYBR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 안토시아닌 생합성이 억제된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, (a) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체 (ribonucleoprotein) 또는 (b) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 코딩하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 안토시아닌 생성 증진용 재조합 벡터를 포함하는, 안토시아닌 생성을 증진하기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계를 포함하는, 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공하는 것이다.
이하 본 명세서에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각에 대한 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기에 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 명세서에서 사용되는 「포함하는」과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 문구 또는 문장에서 특별히 다르게 언급되지 않는 한, 다른 실시 예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 발명의 설명 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선을 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질을 제공한다.
본 발명에서 배추 잎의 발단단계별/조직별 유전자 발현 분석을 통해 안토시아닌 생성 관련 억제조절자로 예측되는 유전자 BrMYBR1을 초록배추에서 분리하였으며, 분리된 초록배추 품종의 BrMYBR1의 핵산 염기서열은 591bp(서열번호2)이고, 196개의 아미노산(서열번호1)으로 구성되어 있는 것을 확인하였다. 또한, MBW 복합체를 조절하는 신규 억제조절인자로 BrMYBR1 유전자의 기능을 확인하였으며, 상기 유전자가 BrbHLH1와 상호작용하여, 음성적으로 안토시아닌 생합성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, BrMYBR1가 플라보노이드 생합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 안토시아닌을 조절하는 억제인자임을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "안토시아닌(anthocyanin)"은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포 액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌의 다양한 생리활성작용, 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항 궤양기능, 항산화 기능 등이 보고되고 있다.
본 발명에서 상기 단백질은 첨부한 서열목록에 기재된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질에 한정되지 않으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 안토시아닌 생합성 억제용 단백질과 기능적 동등물일 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 구체적으로는 70%, 보다 구체적으로는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 BrMYBR1과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.
상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함된다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 BrMYBR1의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 BrMYBR1의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP(Green Fluorescent Protein)와 같은 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합 단백질 등이 이에 포함된다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명에서 용어 "상기 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자"는 상기 BrMYBR1 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가진 유전자를 의미한다. 보다 상세하게, 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자로, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 BrMYBR1 (Brassica rapa MYB Repressor 1) 유전자이며, 배추(Brassica rapa)에서 유래되었다. 또한, 본 발명에서 배추 잎의 발단단계별/조직별 유전자 발현 분석을 통해 안토시아닌 생성 관련 억제조절자로 예측되는 유전자 BrMYBR1을 초록배추에서 분리하였으며, 분리된 초록배추 품종의 BrMYBR1의 핵산 염기서열은 591bp로 서열번호 2의 염기서열을 가진다.
상기 BrMYBR1 유전자는 서열번호 2의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 BrMYBR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환용 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 안토시아닌 생합성을 억제시키는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 "형질전환용 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.
본 발명의 "형질전환용 재조합 벡터"는 상기 BrMYBR1 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 또는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자를 포함한다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질(遺傳形質)을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.
본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 및 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서 상기 식물체는 특별히 제한되지 않으며, 일례로서 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 식물체는 BrMYBR1 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 BrMYBR1 유전자를 도입함으로써 식물체에 존재하는 BrMYBR1의 발현을 증진시킬 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는, 안토시아닌 생합성이 억제된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "BrMYBR1 단백질", "BrMYBR1 유전자", "안토시아닌", "재조합 벡터", "형질전환", "식물체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명은 상기 BrMYBR1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 안토시아닌 생합성이 억제된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체 (ribonucleoprotein) 또는 (b) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 코딩하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 안토시아닌 생성 증진용 재조합 벡터를 포함하는, 안토시아닌 생성을 증진하기 위한 유전체 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 BrMYBR1의 유전자교정을 통해 안토시아닌 생성 억제 인자로서의 기능이 상실된 것을 확인하여, BrMYBR1이 안토시아닌의 생성을 억제하는 전사인자임을 확인하였고 상기 유전자의 발현을 억제하여 작물내의 항산화 기능성 안토시아닌의 생성이 증진된 건강기능성 채소작물의 개발에 이용이 가능한 것을 확인하였다.
본 발명의 조성물에 있어서, 안토시아닌 생성을 증진하기 위한 유전체 교정의 표적 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자이다.
본 발명에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 (non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대 Cas (CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, 용어 "유전자 교정"은 "유전자 편집"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 짧은 단일 가닥의 RNA로, 표적 유전자를 암호화하는 염기서열 중 표적 DNA에 특이적인 RNA를 포함하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 엔도뉴클레아제(특히, RNA-가이드 뉴클레아제)와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태를 말하나, 엔도뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 가이드 핵산은 바람직하게는 단일 사슬 가이드 RNA(single guide RNA, sgRNA) 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 29 내지 31의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로서, 구체적으로 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)이다.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질은 Cas9 (CRISPR associated protein 9), Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN (Transcription activator-like effector nuclease), ZFN (Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 상기 유전자 정보는 공지된 서열을 그대로 사용할 수도 있고, 형질도입되는 대상(유기체)의 코돈에 최적화된 서열을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM (Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명에 따른 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.
본 발명의 유전체 교정용 조성물에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체 형태로 직접 숙주세포 내로 형질도입될 수 있거나, 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터의 형태로 제조되어 숙주세포 내로 형질도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는 상기 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 삽입하고 이를 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 포함하는 모든 플라스미드일 수 있다. 상기 플라스미드는 목적 유전자 발현을 위한 요소(elements)를 포함하는 것으로, 복제원점(replication origin), 프로모터, 작동 유전자(operator), 전사 종결 서열(terminator) 등을 포함할 수 있고, 숙주 세포의 게놈 내로의 도입을 위한 적절한 효소 부위 (예컨대, 제한 효소 부위) 및/또는 임의로 숙주 세포 내로의 성공적인 도입을 확인하기 위한 선별 마커 및/또는 단백질로의 번역을 위한 리보좀 결합 부위(ribosome binding site; RBS) 및/또는 전사 조절 인자 등을 추가로 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계를 포함하는, 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질은 전술한 것과 같다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물체에 도입하는 것은, (a) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체 (ribonucleoprotein) 또는 (b) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 코딩하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 안토시아닌 생성 증진용 재조합 벡터를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296:72-74; Negrutiuet al., 1987, Plant Mol. Biol. 8:363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol.3:1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202:179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al., 1987, Nature 327:70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 박테리아에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.
또한, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질이 도입되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 소포자, 난세포, 종자 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 유전체가 교정된 식물세포로부터 유전체가 교정된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 교정된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체는 안토시아닌 생성에 관여하는 BrMYBR1 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 교정한 것으로, 배추 유래 BrMYBR1 유전자가 녹-아웃되어, 유전체를 교정하지 않은 배추 식물체에 비해 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 유전체가 교정된 식물체 뿐만 아니라 식물체의 유전체가 교정된 종자를 제공할 수 있다.
본 발명은 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질 및 BrMYBR1 유전자에 관한 것이다. 또한 BrMYBR1 유전자 교정을 이용한 안토시아닌 생성을 증진하기 위한 유전체 교정용 조성물, 안토시아닌 생성이 증진된 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 유전체 교정 식물체 및 이의 종자에 관한 것으로, BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 식물체에 도입하여 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 안토시아닌 생성을 억제하는 유전자 BrMYBR1를 교정하여 안토시아닌 생성이 증진된 건강기능성 채소작물의 개발에 이용이 가능하다.
도 1은 초록배추, 빨강배추의 발달단계별 사진 및 안토시아닌 함량 측정 결과이다. (A) 초록배추 품종과 빨강배추 품종의 발달단계별 안쪽 잎(Inner leaf, IL), 바깥 잎(Outer leaf, OL) (B) 배추 2 품종(G:초록배추, R:빨강배추)의 발달단계별 안쪽 잎(IL), 바깥 잎(OL)에서 안토시아닌 함량 측정 결과이다.
도 2는 초록배추, 빨강배추의 발달단계별/조직별 안토시아닌 생성 관련 주요 전사인자군을 나타낸 것이다(G:초록배추, R:빨강배추)
도 3은 초록배추, 빨강배추의 발달단계별/조직별 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현분석 결과이다(G:초록배추, R:빨강배추).
도 4는 다른 종의 안토시아닌 생성 관련 MYB 유전자들과 BrMYBR1 단백질 서열의 다중 염기서열 분석 결과이다.
도 5는 다른 종의 안토시아닌 생합성 MYB 유전자들과 BrMYBR1 간의 계통수 분석 결과이다.
도 6은 배추 유래 안토시아닌 생합성 관련 조절 인자들의 세포내 소기관 위치와 상호작용을 확인한 것이다. (위) 세포내 소기관 확인을 위한 운반체 모식도를 나타내며, (아래) 세포내 소기관내 위치를 확인한 것이다.
도 7은 배추 유래 안토시아닌 생합성 조절 인자들의 상호작용을 확인한 것이다. (A) 효모세포내의 pGADT7 및 pGBKT7 운반체의 도입을 확인한 것이다. (B) 효모세포내에서 배추 유래의 MYB, bHLH 단백질군들 간의 상호작용을 분석한 것이다.
도 8은 식물체 임시발현을 통한 음성조절자의 식물체내의 기능을 확인한 것이다. (A) 담배 잎에 임시발현을 통한 색소축적 표현형을 나타낸 것이다. (B) 담배 잎의 임시발현을 통한 안토시아닌 함량비교를 나타낸 것이다 (BrMB:BrMYBA+BrbHLH 동시발현).
도 9는 담배 임시발현을 통한 식물체내 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 변화를 분석한 것이다.
도 10은 서열번호 29의 sgRNA를 이용하여 안토시아닌 색소 생성 억제인자의 유전자교정을 통한 표현형을 확인한 것이다. (A) 조직배양을 통해 육성한 유전자교정 되지 않은 배추의 잎 (B) BrMYBR1 유전자가 교정된 배추의 잎을 나타낸 것이다.
도 2는 초록배추, 빨강배추의 발달단계별/조직별 안토시아닌 생성 관련 주요 전사인자군을 나타낸 것이다(G:초록배추, R:빨강배추)
도 3은 초록배추, 빨강배추의 발달단계별/조직별 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현분석 결과이다(G:초록배추, R:빨강배추).
도 4는 다른 종의 안토시아닌 생성 관련 MYB 유전자들과 BrMYBR1 단백질 서열의 다중 염기서열 분석 결과이다.
도 5는 다른 종의 안토시아닌 생합성 MYB 유전자들과 BrMYBR1 간의 계통수 분석 결과이다.
도 6은 배추 유래 안토시아닌 생합성 관련 조절 인자들의 세포내 소기관 위치와 상호작용을 확인한 것이다. (위) 세포내 소기관 확인을 위한 운반체 모식도를 나타내며, (아래) 세포내 소기관내 위치를 확인한 것이다.
도 7은 배추 유래 안토시아닌 생합성 조절 인자들의 상호작용을 확인한 것이다. (A) 효모세포내의 pGADT7 및 pGBKT7 운반체의 도입을 확인한 것이다. (B) 효모세포내에서 배추 유래의 MYB, bHLH 단백질군들 간의 상호작용을 분석한 것이다.
도 8은 식물체 임시발현을 통한 음성조절자의 식물체내의 기능을 확인한 것이다. (A) 담배 잎에 임시발현을 통한 색소축적 표현형을 나타낸 것이다. (B) 담배 잎의 임시발현을 통한 안토시아닌 함량비교를 나타낸 것이다 (BrMB:BrMYBA+BrbHLH 동시발현).
도 9는 담배 임시발현을 통한 식물체내 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 변화를 분석한 것이다.
도 10은 서열번호 29의 sgRNA를 이용하여 안토시아닌 색소 생성 억제인자의 유전자교정을 통한 표현형을 확인한 것이다. (A) 조직배양을 통해 육성한 유전자교정 되지 않은 배추의 잎 (B) BrMYBR1 유전자가 교정된 배추의 잎을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1. 초록배추, 빨강배추의 발달 단계 및 잎 조직 별 안토시아닌 함량 측정
녹색의 잎을 가지는 초록배추와 유식물체 단계에서부터 적색을 나타내는 빨강배추 품종을 각 식물의 발달 단계별, 잎 조직별로 표현형을 관찰하고 샘플링을 수행하였다.
도 1은 초록배추, 빨강배추의 발달단계별 사진 및 안토시아닌 함량 측정 결과이다. 생육초기인 파종 후 15일에도 초록배추와는 달리 빨강배추의 잎에서는 빨간 색소의 축적이 확인되었고, 파종 후 50일, 70일에도 빨강배추의 잎에서만 빨간색소의 축적이 확인되었다(도 1A). 각 발달 단계별 및 배추 잎 조직별로 안토시아닌 함량을 추출하여 확인해 본 결과, 육안으로 관찰된 결과와 유사한 안토시아닌 결과가 관찰되었으며, 빨강배추는 어린 유식물 시기에서부터 수확기에 이르기까지 안토시아닌 함량이 높았다, 특히 안쪽 잎(Inner leaf, IL) 보다는 바깥쪽 잎(Outer leaf, OL)에서 안토시아닌이 더 많이 축적된 것이 확인되었다(도 1B). 배추 잎의 표현형 및 안토시아닌 함량의 결과를 바탕으로, 빨강배추의 색소는 안토시아닌 축적에 의한 것이라는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 안토시아닌 생성 관련 주요 전사인자군 발현 분석
안토시아닌 생합성은 R2R3 MYB 유전자, basic helix-loop helix (bHLH), WD40 repeat (WDR)으로 구성되는 MBW 복합체에 의해 조절된다고 보고되어 있다. MBW 복합체를 이루는 구성 중 MYB 유전자군은 안토시아닌의 축적을 조절하는 양상에 따라 활성조절인자와 억제조절인자로 구분되어진다.
본 발명에서는 초록배추와 빨강배추 잎의 전사체 분석결과 안토시아닌 생성과 연관된 유전자의 발현분석을 수행하였다. 도 2는 초록배추, 빨강배추의 발달단계별/조직별 안토시아닌 생성 관련 주요 전사인자군을 나타낸 것이다(G:초록배추, R:빨강배추).
도 2에서 BrMYBR1 유전자의 발현은 안토시아닌을 생성하는 빨강배추에서는 낮은 발현을 나타내나, 안토시아닌이 거의 생성되지 않는 초록배추에서 높은 발현도를 나타내어, 안토시아닌 생성을 억제하는 유전자로 예측되었다. 안토시아닌 생성을 양성적으로 조절하는 것으로 보고된 BrMYBA의 유전자는 빨강배추에서 생육초기에는 높은 발현을 나타냈으나, 식물체가 발달함에 따라 빨강배추와 초록배추에서 발현이 증가되는 양상을 나타내었다. 또한, BrMYBA와 함께 MBW 중합체를 형성한다고 알려진 BrbHLH 전사인자는 안토시아닌의 축적양상과 일치되게 빨강배추에서만 높은 발현을 나타내었다.
실시예 3. 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현 분석
다음으로 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현을 분석하였다. 도 3은 초록배추, 빨강배추의 발달단계별/조직별 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현분석 결과이다(G:초록배추, R:빨강배추).
안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현을 확인해 본 결과, BrCHI를 제외하고 나머지 안토시아닌 생합성 유전자의 발현은 빨강배추에서 높은 발현을 나타내었다. 이러한 결과를 종합해보면, 빨강배추에는 활성형 MYB(BrMYBA)와 bHLH의 높은 발현은 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현을 유도하였으며, 초록배추에서는 억제형 MYB(BrMYBR1)의 높은 발현으로 안토시아닌 생성이 억제 조절되는 것으로 판단된다.
실시예 4. BrMYBR1의 염기서열 분석 결과
배추 잎의 발단단계별/조직별 유전자 발현 분석을 통해 안토시아닌 생성 관련 억제조절자로 예측되는 유전자 BrMYBR1을 초록배추에서 분리하여 확인하였다. Brassica rapa genome DB (http://brassicadb.org/)를 바탕으로 프라이머 BrMYBR1_F: 5'-ATGAACAAAATTAGCCACGGCGCTCT-3' (서열번호3)와 BrMYBR1_R: 5'-TCACTGAAAAAGAAGAAGTGTTTCTTGACTC-3' (서열번호4)를 제작하여 PCR에 이용하였다.
초록배추 잎에서 RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 후 주형(template)으로 사용하여서 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, 분리된 초록배추 품종의 BrMYBR1의 핵산 염기서열은 591bp(서열번호2)이고, 196개의 아미노산(서열번호1)으로 구성되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 5. 다른 종의 안토시아닌 생성 관련 MYB 유전자들과 BrMYBR1 단백질 서열의 다중 염기서열 분석
안토시아닌 생성 관련 MYB 유전자들은 N 말단 부위의 보존된 단백질 서열에 따라 R2R3 MYB, R3 MYB으로 구분된다. R3 domain은 MBW 중합체를 형성하기 위해 bHLH와 상호작용하는 서열이 존재하는 중요부위이다. R3 MYB은 R2 domain의 일부와 R3 domain을 가지는 유전자와 R3 domain만 단독으로 가지는 전사인자군으로 나뉜다. C 말단 부위에는 여러 motif들이 존재하며 다양한 기능이 보고되어 있다.
도 4에서의 C1(GIDP), C2(EAR)과 C5(TLLLFR) motif는 안토시아닌 생성 억제에 기여하는 유전자들이 공통적으로 가지는 motif로 알려져 있다. 이 중 C5 motif는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 AtMYBL2 유전자에서 알려진 motif로, 안토시아닌 생성 억제에 강하게 작용하는 것으로 알려져 있다.
안토시아닌 생성을 활성하는 MYB 유전자들은 C 말단 부위에 활성형 motif를 지니는 것으로 보고되고 있다. 이러한 안토시아닌 생성 관련 MYB 유전자는 N 말단 부위의 보존된 domain과 C 말단 부위의 각각 motif의 존재 여부에 따라 R3 MYB 억제형, R2R3 MYB 억제형과 R2R3 MYB 활성형으로 분류된다. R3 억제형 MYB 중 R3 domain만 단독으로 가지는 유전자들은 안토시아닌 생성 억제에 관여하는 motif를 가진다고 보고되지 않았으나, 안토시아닌 생합성을 억제하는 것으로 보고되고 있다.
도 4는 다른 종의 안토시아닌 생성 관련 MYB 유전자들과 BrMYBR1 단백질 서열의 다중 염기서열 분석 결과이다.
기존에 보고된 MYB 유전자들과 BrMYBR1간의 다중염기서열 분석을 통해 BrMYBR1은 R2 domain의 일부와 R3 domain을 가지며, C1, C2 그리고 C5 motif를 가지는 R3 억제형 MYB임을 확인하였다.
실시예 6. 다른 종의 안토시아닌 생합성 MYB 유전자들과 BrMYBR1 간의 계통수 분석
다음으로 계통수 분석을 실시하였다. 도 5는 다른 종의 안토시아닌 생합성 MYB 유전자들과 BrMYBR1 간의 계통수 분석 결과이다.
안토시아닌 생성 억제 관련의 MYB 유전자들은 AtCPC/TRY-like (R3-MYB), AtMYB4-like (R2R3-MYB), FaMYB1-like (R2R3-MYB) 세 그룹으로 나뉘는 것으로 확인되었다. AtCPC/TRY-like (R3-MYB) 그룹은 R3 domain만을 단독으로 가지며, C-terminal 부위에 기능을 하는 motif를 가지지 않는다. AtMYB4-like (R2R3-MYB) 그룹은 R2, R3 domain을 가지며 C1, C2, C3와 C4 motif를 가진다. FaMYB1-like (R2R3-MYB) 그룹은 R2, R3 domain을 가지고 C1, C2 motif를 가진다.
본 발명에서 분리한 BrMYBR1은 R3 억제형 MYB에 속하지만, C1, C2와 C5 motif를 가지기 때문에 AtCPC/TRY-like (R3-MYB)그룹에는 속하지 않는 것이 계통수 분석을 통해 확인되었다(도 5). BrMYBR1은 안토시아닌 생성 억제에 관여하는 motif를 가지는 R3 억제형 MYB으로 안토시아닌 생성 억제자로 알려진 AtMYBL2와 상동성이 높았다. 따라서 BrMYBR1은 안토시아닌 생합성 과정에서 억제형 MYB으로 작용할 것이라 예측되었다.
실시예 7. 세포내 소기관내의 위치 확인
배추에서 안토시아닌 생합성 조절 관련 전사인자인 R2R3 MYB 유전자인 BrMYBA와 BrbHLH 전사인자 및 본 발명에서 초록배추에서 분리된 BrMYBR1 전사인자의 기능을 알아보고자 애기장대의 원형질체를 활용하여 세포내 위치를 확인하였다.
도 6은 배추 유래 안토시아닌 생합성 관련 조절 인자들의 세포내 소기관 위치와 상호작용을 확인한 것이다. (위) 세포내 소기관 확인을 위한 운반체 모식도를 나타내며, (아래) 세포내 소기관내 위치를 확인한 것이다.
세포내 위치를 확인하고자, 각각의 유전자를 서열번호 5~10의 프라이머로 증폭하여 infusion을 통해 p326-sGFP 운반체에 도입하였다. 세포내의 위치를 확인하고자, NLS-RFP을 공동 형질전환시켜서 세포내 위치를 확인하였다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, sGFP의 발현의 경우, 핵과 세포질 모두에서 형광이 관찰되는 반면에, BrMYBR1, BrMYBA와 BrbHLH 전사인자는 RFP 형광신호와 일치되게 핵에서만 관찰되었다. 이러한 결과는 본 발명에서 분리된 전사인자들은 핵에 위치하여 유전자의 발현을 조절한다는 것을 알 수 있었다.
p326_BrMYBR1_F: 5'-CACGGGGGACTCTAGAATGAACAAAATTAGCCA-3'(서열번호5)
p326_BrMYBR1_R: 5'-CCATGGATCCTCTAGACTGAAAAAGAAGAAGTG-3'(서열번호6)
p326_BrMYBA_F: 5'-CACGGGGGACTCTAGAATGGAGGGTTCGCCAA-3'(서열번호7)
p326_BrMYBA_R: 5'-CCATGGATCCTCTAGAATCAAGTTCCACGGTCT-3'(서열번호8)
p326_BrbHLH_F: 5'-CACGGGGGACTCTAGAATGGATGAATTAAGTAT-3'(서열번호9)
p326_BrbHLH_R: 5'-CCATGGATCCTCTAGAGAGTTTATTATTATATATG-3'(서열번호10)
실시예 8. Yeast two hybrid용 운반체 제작 및 단백질간의 상호작용 확인
배추에서 안토시아닌 생합성 조절 관련 전사인자인 R2R3 MYB 유전자인 BrMYBA와 BrbHLH 전사인자 및 본 발명에서 초록배추에서 분리된 BrMYBR1 전사인자들간의 상호작용을 확인하기 위해서 yeast two hybrid(Y2H) 분석을 수행하였다. Y2H용 분석을 위해 먼저 각각의 유전자를 배추로부터 RNA 분리하여 cDNA를 합성하여 주형(template)으로 사용하여서 서열번호 11 내지 서열번호 20의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
pGADT7_BrMYBR1_F: 5'-GGAGGCCAGTGAATTCATGAACAAAATTAGCCA-3'(서열번호11)
pGADT7_BrMYBR1_R: 5'-CACCCGGGTGGAATTCTCACTGAAAAAGAAGAA-3'(서열번호12)
pGADT7_BrMYBA_F: 5'-GGAGGCCAGTGAATTCATGGAGGGTTCGCCAA-3'(서열번호13)
pGADT7_BrMYBA_R: 5'-CACCCGGGTGGAATTCATCAAGTTCCACGGTCT-3'(서열번호14)
pGADT7_BrbHLH_F: 5'-GGAGGCCAGTGAATTCATGGATGAATTAAGTAT-3'(서열번호15)
pGADT7_BrbHLH_R:5'-CACCCGGGTGGAATTCGAGTTTATTATTATATATG-3'(서열번호16)
pGBKT7_BrMYLR1_F: 5'-CATGGAGGCCGAATTCATGAACAAAATTAGCCA-3'(서열번호17)
pGBKT7_BrMYBR1_R: 5'-GGATCCCCGGGAATTCTCACTGAAAAAGAAGAA-3'(서열번호18)
pGBKT7_BrMYBA_F: 5'-CATGGAGGCCGAATTCATGGAGGGTTCGCCAA-3'(서열번호19)
pGBKT7_BrMYBA_R: 5'-GGATCCCCGGGAATTCATCAAGTTCCACGGTCT-3'(서열번호20)
pGBKT7_BrbHLH_F: 5'-CATGGAGGCCGAATTCATGGATGAATTAAGTAT-3'(서열번호21)
pGBKT7_BrbHLH_R: 5'-GGATCCCCGGGAATTCCTAGAGTTTATTATTAT-3'(서열번호22)
각각의 PCR 산물을 GAL4 DNA activation domain을 포함하는 pGADT7운반체와 GAL4 DNA activation domain을 포함하는 pGBKT7 운반체에 infusion 반응을 통해 도입한 후, 유전자 염기서열을 분석하였다. Y2H는 Lim et al.(2021)에 서술된 방법으로 실행하였다.
도 7은 배추 유래 안토시아닌 생합성 조절 인자들의 상호작용을 확인한 것이다. (A) 효모세포내의 pGADT7 및 pGBKT7 운반체의 도입을 확인한 것이다. (B) 효모세포내에서 배추 유래의 MYB, bHLH 단백질군들 간의 상호작용을 분석한 것이다.
도 7A에서 확인된 바와 같이, 효모세포에 pGADT7와 pGBKT7운반체가 모두 도입됨을 확인하였다. 도 7B에서처럼 선발배지(SD/-LTH +10mM 3AT) 조건에서 단백질간 상호작용할 때 효모가 성장하는 것을 확인할 수 있다.
R2R3 MYB 전사인자인 BrMYBA은 bHLH 전사인자군인 BrbHLH1과 상호작용하는 것을 확인하였다. BrMYBA 단백질은 모든 pGADT7 운반체와 상호작용하는 것으로 나타나 BrMYBA 단백질이 자가활성을 나타내는 단백질임을 알 수 있었다. 또한, 억제 인자와의 상호작용을 살펴본 결과, BrMYBR1 전사인자는 BrMYBA와는 상호작용하지 않으며, BrbHLH1와 상호작용하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 BrMYBR1 전사인자는 활성형 MBW 복합체를 구성하는 BrbHLH1와 상호작용하여 음성적으로 안토시아닌 생합성을 억제하는 인자로 작용한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 9. 식물체 임시발현을 통한 억제조절자의 식물체내의 기능 확인
배추 유래의 R2R3 MYB 유전자인 BrMYBA와 BrbHLH 전사인자 및 본 발명에서 초록배추에서 분리된 BrMYBR1 전사인자들이 안토시아닌 생성에 미치는 영향을 확인하고자, 담배 잎에 임시발현 검정을 수행하였다. 식물체에서 발현하는 운반체 제작을 위하여 배추 잎에서 RNA 분리하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형(template)으로 사용하여 아래의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
pUC57mini-BrMYBR1-F: 5'-AAAGCAGGCTGAATTCATGAACAAAATTAGCCA-3' (서열번호23)
pUC57mini-BrMYBR1-R: 5'-AAAGCTGGGTGGATCCTCACTGAAAAAGAAGAA-3' (서열번호24)
pUC57mini_BrMYBA_F: 5'-AAAGCAGGCTGAATTCATGGAGGGTTCGCCAA-3' (서열번호25)
pUC57mini_BrMYBA_R: 5'-AAAGCTGGGTGGATCCATCAAGTTCCACGGTCT-3' (서열번호26)
pUC57mini_BrbHLH_F: 5'-AAAGCAGGCTGAATTCATGGATGAATTAAGTAT-3' (서열번호27)
pUC57mini_BrbHLH_R: 5'-AAAGCTGGGTGGATCCCTAGAGTTTATTATTAT-3' (서열번호28)
PCR산물은 pUC57mini운반체에 infusion 반응을 통해 도입하여 유전자의 염기서열을 분석하여 유전자 도입을 확인한 후, 식물체 발현 벡터인 pB2GW7와 LR 반응을 시켜 최종적으로 각각의 유전자가 도입된 운반체를 제작하였다.
도 8은 식물체 임시발현을 통한 음성조절자의 식물체내의 기능을 확인한 것이다. (A) 담배 잎에 임시발현을 통한 색소축적 표현형을 나타낸 것이다. (B) 담배 잎의 임시발현을 통한 안토시아닌 함량비교를 나타낸 것이다 (BrMB:BrMYBA+BrbHLH 동시발현).
도 8A에서 확인되는 바와 같이, BrMYBA와 BrbHLH을 동시 발현한 결과 담배 잎에 색소의 축적이 관찰되었다. 안토시아닌 색소 생성을 억제하는 조절인자로 예상되는 BrMYBR1의 비율을 달리하여 BrMYBA 및 BrbHLH와 동시발현 결과 색소축적이 관찰되지 않았다.
색소 축적을 정량화 하고자 각각 다른 조건으로 유전자를 동시 발현시킨 잎의 구역을 나누어 총 안토시아닌 함량을 측정하였다. 안토시아닌 함량 측정 결과, BrMYBA와 BrbHLH을 동시발현한 잎에서는 안토시아닌 함량이 높게 관찰되었으나, BrMYBR1을 BrMYBA 및 BrbHLH와 함께 발현시켰을 때 안토시아닌 함량이 45% 감소됨을 확인하였다. 또한, BrMYBR1의 비율이 증가됨에 따라서 안토시아닌 함량도 크게 감소되는 양상이 확인되었다(도 8B).
따라서, BrMYBR1 전사인자는 안토시아닌 생합성을 억제하는 인자로 작용한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 10. 담배임시발현 식물체에서 안토시아닌 생합성 유전자의 발현분석
다음으로, 담배 임시발현 조직에서 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현을 분석하였다.
도 9는 담배 임시발현을 통한 식물체내 안토시아닌 생합성 유전자의 발현변화를 분석한 것이다.
페닐프로파노이드 생합성 경로의 공통경로인 BrPAL, Br4CL 유전자의 발현은 별다른 차이가 나타나지 않았으나, 안토시아닌 생성이 확인된 MYBA와 BrbHLH을 동시 발현한 잎(BrMB)의 경우에는 플라보노이드 생합성 경로의 유전자들(NtCHS, NtCHI, NtF3H, NtF3'H, NtDFR, NtANS, NtUFGT)의 발현이 모두 크게 증가되었다. 따라서, 이러한 유전자들의 발현증가로 안토시아닌 축적이 증가된 것을 알 수 있었다.
안토시아닌 색소 생성을 억제하는 조절인자로 예상되는 BrMYBR1의 비율을 달리하여 BrMYBA와 BrbHLH와 동시발현한 잎조직에서는 증가되었던 플라보노이드 생합성 경로의 유전자의 발현이 크게 감소됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 BrMYBR1이 BrMYBA와 BrbHLH의 동시발현을 통해 증가되는 안토시아닌 생합성 경로의 유전자의 발현을 음성적으로 조절한다는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과를 종합해보면, yeast 2 hybrid의 결과와 마찬가지로, BrMYBR1가 안토시아닌 활성형 MBW 복합체를 구성하는 BrbHLH와 상호작용하여 활성형 MBW 복합체 형성에 영향을 줄 뿐 아니라, 플라보노이드 생합성 관련 유전자의 발현을 억제하여 안토시아닌을 조절하는 억제인자임을 알 수 있었다.
실시예 11. 담배임시발현 식물체에서 안토시아닌 생합성 유전자의 발현분석
다음으로, BrMYBR1 유전자 교정이 배추의 안토시아닌 생성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위해 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하여 형질전환 배추를 육성하였다. 식물형질전환용 벡터는 CAS9 유전자와 Hygromycin 저항성 유전자를 가지고 있는 pHAtC 벡터를 이용하였고, pHAtC 벡터에 BrMYBR1 유전자 서열을 기반으로 제작한 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31의 sgRNA를 도입하였다.
BrMYBR1 유전자 편집을 위한 sgRNA 표적 서열은 서열번호 29 내지 31과 같다.
sgRNA_BrMYBR1-(1) : 5'- GGCGCTCTCTCTCGGCCTTCCGG - 3' (서열번호 29)
sgRNA_BrMYBR1-(2) : 5'- GAATGCTGCACCGTGCCAAGAGG - 3' (서열번호 30)
sgRNA_BrMYBR1-(3) : 5'- GAGAAGAAACTCATGAAAATGGG- 3' (서열번호 31)
배추에 접종하는 형질전환 매개체로는 pHAtC 운반체가 도입된 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) GV3101을 사용하였다. 배추의 자엽이 분리되게 자른 뒤, 제작된 아그로박테리움 현탁액에 접종한 후 공동 배양배지에서 2일간 공동배양하였다. 이 후 배추의 자엽에서 캘러스가 유도되도록 식물 호르몬이 처리된 배지에서 배양하였고, shoot 유도까지 진행되어 root 유도 배지에 배양하였다.
도 10은 서열번호 29의 sgRNA를 이용하여 안토시아닌 색소 생성 억제인자의 유전자교정을 통한 표현형을 확인한 것이다. (A) 조직배양을 통해 육성한 유전자교정 되지 않은 배추의 잎 (B) BrMYBR1 유전자가 교정된 배추의 잎을 나타낸 것이다.
도 10에서 확인되는 바와 같이, 유전자교정 유무에 따른 배추 잎의 표현형을 비교한 결과 유전자교정이 이루어진 배추의 잎에서 더 많은 안토시아닌의 축적이 확인되었다(도 10). 따라서, BrMYBR1의 유전자교정을 통해 안토시아닌 생성 억제 인자로서의 기능이 상실된 것을 알 수 있었다. 이러한 실험결과를 바탕으로 BrMYBR1이 안토시아닌의 생성을 억제하는 전사인자임을 확인하였고 상기 유전자의 발현을 억제하여 작물내의 항산화 기능성 안토시아닌의 생성을 늘릴 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
<110> Hankyong national university Industry Academic Cooperation Foundation
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrMYBR1 protein
<400> 1
Met Asn Lys Ile Ser His Gly Ala Leu Ser Arg Pro Ser Gly Met Leu
1 5 10 15
His Arg Ala Lys Arg Tyr Arg Gly Arg Lys Tyr Ala Lys Pro Glu Leu
20 25 30
Lys Glu Ser Asn Phe Ser Lys Asp Glu Asp Asp Leu Ile Leu Lys Leu
35 40 45
His Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro
50 55 60
Gly Arg Thr Asp Asp Glu Val Arg Ile His Trp Glu Ser Tyr Leu Glu
65 70 75 80
Lys Lys Leu Met Lys Met Gly Ile Asp Pro Thr Asn His Arg Ile Tyr
85 90 95
His His Thr Asn Tyr Thr Ser Arg Arg Phe Ile Asn Ala Ser Tyr Lys
100 105 110
Lys His Glu Thr Asp Ile Ile Ser Asp Gln Ser Ser Ser Val Ser Glu
115 120 125
Ser Cys Asp Met Lys Leu Leu Pro Val Ser Ser Thr Asn Cys Ser Glu
130 135 140
Ala Asn Ala Ser Ser Gly Asn Ser Arg Leu Pro Asp Leu Asn Ile Gly
145 150 155 160
Leu Val Pro Ile Lys Thr Val Thr Ser Leu Pro Val Gly Ser Leu Gln
165 170 175
Glu Pro Ser Gly Ser Ser Asn His Gly Ser Thr Ser Gln Glu Thr Leu
180 185 190
Leu Leu Phe Gln
195
<210> 2
<211> 591
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrMYBR1 gene
<400> 2
atgaacaaaa ttagccacgg cgctctctct cggccttccg gaatgctgca ccgtgccaag 60
aggtatagag ggagaaagta cgcaaagcca gaacttaaag aaagcaactt ctcaaaagac 120
gaggacgatc tcatcctcaa gcttcatgca cttcttggca atagatggtc actgatagcg 180
ggaagattgc ctggacgaac cgacgacgaa gtaaggatcc attgggaaag ttacttagag 240
aagaaactca tgaaaatggg aatcgatcca actaatcatc gtatctacca tcacaccaac 300
tacacttcta gacgattcat caatgcctcg tataagaaac atgaaaccga tattattagt 360
gatcaatctt cttcggtatc tgaatcatgt gatatgaaac tattacccgt ttcaagtacc 420
aattgctctg aggctaatgc tagttctgga aacagccggt tgcctgacct caacatcggt 480
ctcgtcccga taaagaccgt gacttctttg ccagttggct cccttcaaga acctagcgga 540
tcctctaacc atggttcaac gagtcaagaa acacttcttc tttttcagtg a 591
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrMYBR1_F
<400> 3
atgaacaaaa ttagccacgg cgctct 26
<210> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BrMYBR1_R
<400> 4
tcactgaaaa agaagaagtg tttcttgact c 31
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p326_BrMYBR1_F
<400> 5
cacgggggac tctagaatga acaaaattag cca 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p326_BrMYBR1_R
<400> 6
ccatggatcc tctagactga aaaagaagaa gtg 33
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p326_BrMYBA_F
<400> 7
cacgggggac tctagaatgg agggttcgcc aa 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p326_BrMYBA_R
<400> 8
ccatggatcc tctagaatca agttccacgg tct 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p326_BrbHLH_F
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p326_BrbHLH_R
<400> 10
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cacccgggtg gaattcatca agttccacgg tct 33
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<213> Artificial Sequence
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<220>
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catggaggcc gaattcatgg atgaattaag tat 33
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<211> 33
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ggatccccgg gaattcctag agtttattat tat 33
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<213> Artificial Sequence
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aaagcaggct gaattcatga acaaaattag cca 33
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aaagcaggct gaattcatgg agggttcgcc aa 32
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC57mini_BrMYBA_R
<400> 26
aaagctgggt ggatccatca agttccacgg tct 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC57mini_BrbHLH_F
<400> 27
aaagcaggct gaattcatgg atgaattaag tat 33
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pUC57mini_BrbHLH_R
<400> 28
aaagctgggt ggatccctag agtttattat tat 33
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA_BrMYBR1-(1)
<400> 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA_BrMYBR1-(2)
<400> 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sgRNA_BrMYBR1-(3)
<400> 31
gagaagaaac tcatgaaaat ggg 23
Claims (12)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 단백질.
- 제1항의 단백질을 코딩하는 유전자.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 유전자.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자는 배추(Brassica rapa) 유래의 것인, 유전자.
- 제2항의 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
- 제2항의 유전자 또는 제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체.
- 제2항의 유전자 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 안토시아닌 생합성 억제용 BrMYBR1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는,
안토시아닌 생합성이 억제된 형질전환 식물체의 제조방법. - (a) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체 (ribonucleoprotein) 또는 (b) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 코딩하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 안토시아닌 생성 증진용 재조합 벡터를 포함하는, 안토시아닌 생성을 증진하기 위한 유전체 교정용 조성물.
- 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계를 포함하는, 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체를 제조하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물체에 도입하는 것은, (a) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체 (ribonucleoprotein) 또는 (b) 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 BrMYBR1 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 코딩하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 안토시아닌 생성 증진용 재조합 벡터를 이용하는 것인, 식물체를 제조하는 방법.
- 제10항의 방법에 의해 제조된 안토시아닌 생성이 증진된 유전체 교정 식물체.
- 제11항에 따른 식물체의 유전체가 교정된 종자.
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| KR (1) | KR20230044750A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160140476A (ko) | 2015-05-27 | 2016-12-07 | 서울대학교산학협력단 | 잔디의 착색에 관여하는 안토시아닌 생합성 유전자 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-09-27 KR KR1020210127266A patent/KR20230044750A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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