KR20160140476A

KR20160140476A - 잔디의 착색에 관여하는 안토시아닌 생합성 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160140476A
Application number: KR1020160065187A
Authority: KR
Inventors: 허진회; 안종화; 장호성
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2016-12-07
Also published as: KR101829803B1

Abstract

본 발명은 잔디의 착색에 관여하는 안토시아닌 생합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 잔디 유래 안토시아닌 생합성 효소를 코딩하는 유전자 ZjDFR1 및 ZjANS1가 안토시아닌 생합성에 관여하므로 식물체에서 상기 유전자의 발현 조절을 통하여 착색 또는 비착색 잔디를 개발하는 데 이용할 수 있다.

Description

잔디의 착색에 관여하는 안토시아닌 생합성 유전자 및 이의 용도 {Anthocyanin biosynthesis genes involved in pigmentation of zoysiagrass and uses thereof}

본 발명은 잔디의 착색에 관여하는 안토시아닌 생합성 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

조이시아속 잔디(Zoysiagrass, Zoysia sp.)는 터프그래스(turfgrass)의 가장 중요한 종 중의 하나이고, 전 세계적인 온난기후 뿐만 아니라 한국, 일본 및 중국 동부를 포함하는 극동 아시아에서 널리 재배된다. 최근 조이시아속 잔디의 재배 지역은 가뭄 저항성과 같은 특별한 특성 및 교통 재해로부터 빠르게 회복되는 능력에 기인하여 미국 및 다른 나라에 빠르게 확산되고 있다. 더욱이 이는 사실상 모든 기후와 척박한 토양에서 잘 자라는 특색으로 인해 골프 코스, 운동경기장, 대로변, 집 정원 및 강둑 등에 널리 사용된다. 이들의 시장 규모가 빠르게 증가함에 따라 소비자들은 병원균, 제조제 및 환경 스트레스에 대한 증가된 저항성을 지닌 새로운 다양한 것들을 요구한다. 최근까지는 고전적인 품종 개량 방법이 터프그래스 내에서 이러한 새로운 특색을 발달시키기 위해 이용되어왔다. 그러나 점점 더 많은 실험실과 연구소들은 분자생물학적 방법을 이용함으로써 예측 가능한 방법으로 유용한 특색을 발달시키거나 변형시키는 것이 가능하기 때문에 터프그래스를 유전적으로 설계하는데 이러한 방법을 적용하도록 노력하고 있다.

안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 안토시아닌은 다양한 식물 종에 폭넓게 존재하며, 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있다. 안토시아닌은 꽃/종자에서 수분/종자 매개자를 끌어들이거나, 자외선 손상, 해충 및 병원균으로부터 식물 및 그의 재생기관을 보호한다.

안토시아닌의 생합성 경로는 현화식물(flowering plant)에서 잘 보존되어 있으며, 합성에 관련된 여러 가지 효소가 알려져 있다. 안토시아닌의 생합성은 칼콘 합성효소(chalcone synthase, CHS)에 의해 p-쿠마로일(coumaroyl)-CoA 및 말로닐(malonyl)-CoA의 축합으로 시작하여 테트라하이드록시칼콘(tetrahydroxychalcone)을 생성한다. 이는 칼콘 이성질화효소(chalcone isomerase, CHI) 및 플라보논 3-하이드록실라제(flavanone 3-hydroxylase, F3H)의 연속적인 활성에 의해 디하이드로플라보놀(dihydroflavonol)로 변화된다. 첫 번째로 생성된 디하이드로플라보놀이 디하이드로캠프페롤(dihydrokaempferol, DHK)이다. 이후 DHK는 플라보놀 합성효소(flavonol synthase, FLS)에 의해 캠프페롤 또는 디하이드로플라보놀 4-환원효소(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)에 의해 류코펠라르고니딘(leucopelargonidin)으로 변화된다. 또한 DHK는 플라보노이드 3'-하이드록실라제(F3'H) 또는 플라보노이드 3'5'-하이드록실라제(F3'5'H)에 의해 디하이드로퀘르세틴(dihydroquercetin, DHQ) 또는 디하이드로미리세틴(dihydromyricetin, DHM)으로 하이드록실레이트될 수 있다. DHQ 및 DHM은 FLS에 의해 그들의 각각의 플라보놀(퀘르세틴 및 미리세틴)로 더욱 변화되거나 또는 DFR에 의해 치환되어 류코안토시아니딘(류코시아니딘(leucocyanidin) 및 류코델피니딘(leucodelphinidin))을 산출한다. 이후 안토시아니딘 합성효소(anthocyanidin synthase, ANS)에 의해 류코안토시아니딘으로부터 합성된 안토시아니딘은 플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼라제(glycosyl transferase)(3GT)에 의해 글리코실레이트(glycosylate)되어 안토시아닌을 생성한다.

잔디에서의 안토시아닌 생합성 관련 유전자를 포함한 유전체 정보에 대해서 현재까지 보고된 바가 없다. 이에 본 발명에서 착색 및 비착색 잔디 품종의 유전체 분석을 통하여 2종의 잔디 유래 안토시아닌 생합성 유전자를 처음으로 분리하고 상기 유전자를 이용하여 새로운 착색 및 비착색 잔디를 개발하고자 하였다.

한국등록특허 제1085946호에는 '들잔디 유래의 분얼유도유전자'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0544994호에는 '배추의 안토사이아니딘 합성에 관여하는 디하이드로플라보놀 환원효소를 코딩하는 유전자'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 잔디의 착색에 관여하는 안토시아닌 생합성 유전자 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 비착색 잔디에 비해 착색 잔디 품종에서 발현량이 현저하게 증가하는 2종의 안토시아닌 생합성 유전자를 발굴하여 이들 유전자가 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1)와 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1)를 각각 코딩하며 상기 단백질의 효소 활성이 안토시아닌 생합성에 작용하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1)를 제공한다.

또한, 본 발명은 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1)를 코딩하는 ZjDFR1 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1)를 코딩하는 ZjANS1 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 ZjDFR1 유전자; ZjANS1 유전자; 또는 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 ZjDFR1 유전자; ZjANS1 유전자; 또는 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ZjDFR1 유전자; ZjANS1 유전자; 또는 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 ZjDFR1 유전자; ZjANS1 유전자; 또는 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 함유하는 식물체 내의 안토시아닌 생합성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 잔디 유래 안토시아닌 생합성 효소를 코딩하는 유전자인 ZjDFR1 및 ZjANS1는 안토시아닌 생합성에 관여하므로 잔디에서 상기 유전자의 발현을 조절하여 착색 또는 비착색 잔디를 개발하는 데 이용할 수 있다.

도 1은 안양중지(AJ)(A)와 그린조아(GZ)(B) 두 품종의 포복경(화살표) 착색 및 비착색 부분을 나타낸다.
도 2는 안양중지(AJ)와 그린조아(GZ) 잔디 이삭의 발달 단계(S1-S6)에 따른 서로 다른 착색(A)과 안토시아닌의 아글리콘(aglycone) 일종인 시아니딘(cyanidin)과 페튜니딘(petunidin) 함량(B)을 비교 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 안토시아닌 생합성 경로의 개략도(A)와 잔디(Zoysia japonica Steud.)에서의 안토시아닌 생합성 경로에 관여하는 22종의 후보유전자의 디지털 발현양상을 히트맵(heatmap)(B)으로 나타낸다. *:차등발현 유전자.
도 4는 안양중지(AJ, 검정막대)와 그린조아(GZ, 흰막대) 잔디 이삭의 발달 단계(S1-S6)에 따른 안토시아닌 생합성 관련 후보유전자의 발현수준을 비교 분석한 결과를 나타낸다. 막대는 3회 반복실험에 의한 평균±SD를 나타낸다.
도 5는 안양중지(AJ, 검정막대)와 그린조아(GZ, 흰막대) 잔디 조직별(이삭(spike), 포복경(stolon), 늙은잎(old leaf), 어린잎(young leaf), 뿌리(root)) 안토시아닌 생합성 관련 후보유전자의 발현수준을 비교 분석한 결과를 나타낸다. 막대는 3회 반복실험에 의한 평균±SD를 나타낸다.
도 6은 9종의 잔디 품종의 이삭에서의 착색 양상(A)과 이들 잔디 품종에서의 ZjDFR1(B) 및 ZjANS1(C)의 발현양상을 분석한 결과를 나타낸다. 막대는 3회 반복실험에 의한 평균±SD를 나타낸다.
도 7은 9종의 잔디 품종의 포복경에서의 착색 양상(A)과 이들 잔디 품종에서의 ZjDFR1(B) 및 ZjANS1(C)의 발현양상을 분석한 결과를 나타낸다. 막대는 3회 반복실험에 의한 평균±SD를 나타낸다.
도 8은 대장균(E. coli)에 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)과 융합된 ZjDFR1 및 ZjANS1 재조합 단백질의 발현을 분석한 결과를 나타낸다. MBP, MBP-ZjDFR1 및 MBP-ZjANS1의 예상 분자량은 우측에 나타내었다. M; 사이즈 마커.
도 9는 ZjDFR1 및 ZjANS1 재조합 단백질의 촉매 작용에 의하여 생성된 류코안토시아니딘(a, 류코델피니딘(leucodelphinidin); b, 류코시아니딘(leucocyanidin); 또는 c, 류코펠라르고니딘(leucopelargonidin))과 안토시아니딘(delphinidin, cyanidin 또는 pelargonidin)를 HPLC 분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 ZjDFR1(A) 또는 ZjANS1(B)이 과발현된 T2 종자 및 T1 형질전환 식물체(OE1~OE4)의 착색을 분석한 결과를 나타낸다.
도 11은 ZjDFR1(좌) 또는 ZjANS1(우)이 과발현된 형질전환 식물체 라인(OE1~OE4)의 안토시아닌 함량을 분석한 결과를 나타낸다.
도 12는 ZjDFR1(좌) 또는 ZjANS1(우)이 과발현된 형질전환 식물체 라인(OE1~OE4)에서의 안토시아닌 생합성 관련 유전자의 발현수준을 비교분석한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1)를 제공한다.

본 발명에 따른 ZjDFR1 단백질의 범위는 잔디(Zoysia japonica Steud.)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 안토시아닌 생합성 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 ZjDFR1 단백질의 단편, 유도체(derivative) 및 유사체(analogues)를 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1)를 제공한다. 본 발명에 따른 ZjANS1 단백질의 범위는 잔디(Zoysia japonica Steud.)로부터 분리된 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 단백질의 기능적 동등물에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1)를 코딩하는 ZjDFR1 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 ZjDFR1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1)을 코딩하는 ZjANS1 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 ZjANS1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 또는 합성 DNA를 포함한다. 바람직하게는, 상기 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있으며, 상동체의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서(enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터는 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 숙주세포 내로 운반될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 숙주세포 내로 벡터를 주입할 수 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자는 각각 서열번호 1과 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 둘다 식물세포에 형질전환시키는 경우에 상기 2개의 유전자를 하나의 벡터에 재조합할 수도 있고, 각각의 벡터에 재조합할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 경우에 숙주세포는 바람직하게는 조이시아나속 잔디(Zoysia sp .) 식물세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 ZjDFR1 유전자; ZjANS1 유전자; 또는 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 과발현하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

전술한 바와 같이, 상기 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자는 각각 서열번호 1과 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에 이용되는 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더 바람직하게는 조이시아속 잔디(Zoysia sp .) 식물일 수 있으며, 더욱 더 바람직하게는 잔디(Zoysia japonica Steud.)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 ZjDFR1 유전자; ZjANS1 유전자; 또는 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자;를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 안토시아닌 생합성 증가용 조성물을 제공한다. 예를 들어, ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 비착색 잔디에 형질전환시켜 상기 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 과발현시킴으로써 식물체 내 안토시아닌 생합성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 재료

안양중지와 그린조아는 FnP(Fungi and Plant, 대한민국)로부터 제공받았다. 2종의 잔디 품종은 26℃(16시간)/22℃(8시간), 60%의 습도 조건에서 재배하였다. 다른 7종의 잔디 품종은 서울대학교 농장에서 재배된 것을 제공받아 실험에 사용하였다.

2. RNA -시퀀싱

안양중지와 그린조아 잔디 품종의 성숙한 이삭(S5 또는 S6 단계; 도 2)에서 전체 RNA를 추출하여 RNA-시퀀싱을 수행하였다. RNA-시퀀싱은 Illumina HiSeq 2000 시퀀서를 이용하여 101bp paired-end 방식으로 수행하였다(서울대학교 NICEM(National Instrument Center for Environmental Management)).

3. 신규 전사체 어셈블리( assembly )

신규 전사체는 다양한 어셈블러를 이용하여 어셈블리하였다. CLC Genomics workbench(버전 3.7.1), Vetvet(버전 1.1.04)-Oases(버전 0.1.21), Trinity (20110519 release 버전)의 어셈블러를 이용하여 각각 multi-kmer 또는 single-kmer 방식으로 수행하였다. CD-EST-HIT을 이용한 클러스터링과 블라스트(blast)를 이용한 셀렉션 과정을 거쳐 최종적인 전사체 데이터베이스를 확보하였다.

4. qRT - PCR 분석

1~2㎍의 RNA는 RNase-Free DNase Set(QIAGEN)을 이용하여 contaminating DNA를 제거하고 SuperScript II RT Kit(Life Technologies)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Rotor-Gene Q real-time PCR system(QIAGEN)을 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. QuantiFast SYBR Green PCR master mix(Qiagen)을 이용하여 PCR 증폭(amplification)을 수행하였고 잔디의 베타-액틴(β-actin)을 대조구(control)로 하여 발현양상을 비교하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머는 표 1과 같다.

본 발명의 qRT-PCR에 사용된 프라이머 서열

유전자	정방향 프라이머	서열번호	역방향 프라이머	서열번호
ZjPAL1	CGAATGTTATTGCCGTCCTT	5	GGTGAGGTGGTCGGTGTACT	6
ZjPAL2	CCTAAGCAGGACAGGTACGC	7	GTTGTCGTTGACGGAGTTGA	8
ZjPAL3	CTACAACAACGGGCTGACCT	9	GAGCTCGGAGCAGTAGGATG	10
ZjCHS1	CCGACTGGAACTCCATCTTC	11	TCCTTGTCGAGCTTGACCTT	12
ZjCHS2	CAGAGGAGGGCATCAAGTTC	13	GCTCCTTCATCAGCTTCCTG	14
ZjCHI1	AGGATGCTTGCTGACTCCAT	15	AGCAACACAAGCACAACCTG	16
ZjCHI2	GAACAGGAGGACACCAAAGG	17	TGGTTTGGTTCCCTCAAAAG	18
ZjCHI3	GCTGCTGCATTCTATGTGGA	19	CCGGTGCTTTAAAAATGGAG	20
ZjCHI4	GCCGAGAAGGTGACTGAGAA	21	CTTGAACGCCTCCTTGAACT	22
ZjF3H1	ATGTCGAACCGGAGCTTATC	23	CACGGGGTACGAGAAGTAGG	24
ZjF3H2	GGATTCTTCCAGGTGCTGAA	25	GTCGTCGGAGTAGAGCTTGG	26
ZjF3'H	CCCACTAGAGTTCCGACCAG	27	CGCACCAAACGGAATAAGAT	28
ZjF3'5'H	ATGTCCAGCTTCTCCTCGC	29	TCAGGCCGCAGCGTAG	30
ZjDFR1	GCCTGGACCTTATCAGCATC	31	AACTGCACCTGCTTGAGGAT	32
ZjDFR2	GTCCTCGCTAACTGCGATTC	33	GAAACGGGTTCTTCTTGCAC	34
ZjDFR3	TGGATGGAGCAAAGGATAGG	35	GTGATAGAAGGGCGAAGCAG	36
ZjANS1	CTTCGACCTTTTGGCTGAAC	37	ACTGCGGCTGATCCTTCTT	38
ZjANS2	GGATTTCGTCCCTGGTTACA	39	ATATAAGAGGGCGGCAGGTT	40
ZjANS3	GACCTGGTGAAATTCGAGGA	41	CTCTGAACGATTCGGGATGT	42
ZjUFGT1	GCTTGGCATCTATGGAGGAG	43	TGTCGAATCACCCACAGAAA	44
ZjUFGT2	GCTTGGCATCTATAGAGCAG	45	TGTCGGATTACCCACAAAAA	46
ZjFLS	CACTGGTACGACGCCAAGTA	47	CCTTGTACTCCCCGTTGCT	48
ZjMYB1	TGCGCTGGATCAACTATCTG	49	GATCAAGGACCACCTGTTGC	50
ZjMYB1	CTGCGGTGGATCAACTACCT	51	ACCATTTGTTGCCGACTAGG	52

5. 5'-/3'- RACE 및 TAIL ( theraml asymmetric interlaced )- PCR

전장(full-length)의 ZjDFR1과 ZjANS1 염기서열을 얻기 위하여 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit(Clontech Laboratories)을 이용하여 콘티그 밖의 지역을 확인하였다. 전사 개시부위 업스트림의 조절 부위의 서열을 위해서 TAIL-PCR를 수행하였다.

6. ZjDFR1 과 ZjANS 재조합 단백질 제조

대장균(E. coli)에서 재조합 단백질을 발현시키기 위해 ZjDFR1과 ZjANS1을 클로닝하였다. 우선 ZjDFR1과 ZjANS1 단백질을 암호화하는 유전자를 pLM302 벡터에 클로닝하고 이를 대장균(E. coli) Rosetta2(DE3) 균주(strain)에 형질전환(transformation)하였다. 단백질은 0.1mM IPTG를 처리하고 16시간 동안 발현 유도시켰다. 원심분리를 수행하여 세포를 모으고 펠렛(pellet)을 10 mL의 용해완충액(lysis buffer)(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.1mM DTT(dithiothreitol), 0.1mM PMSF)에 재현탁(resuspension)시켰다. 초음파분해(Sonication)와 원심분리를 수행하여 상청액을 인 비트로(in vitro) 분석에 사용하였다.

7. ZjDFR1 과 ZjANS1 재조합 단백질의 인 비트로( in vitro ) 분석

인 비트로(in vitro) 분석에는 나린제닌(naringenin, NRG)과 세 가지의 디하이드로플라보놀(dihydroflavonol)(dihydromyricetin, DHM;dihydroquercetin, DHQ; dihydrokaempferol, DHK)이 기질로 사용되었다. 이들은 각각 메탄올에 1mg/mL의 농도로 녹여 실험에 사용되었다. ZjDFR1 효소 활성 반응의 경우, 각각의 기질(10㎍)을 ZjDFR1의 대장균 추출액(100㎍)와 30℃에서 30분간 반응완충액(100mM Tris-HCl, pH 7.0, 1mM NADPH)에서 반응시켰다. 반응은 1 mL의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 첨가하여 정지시키고 질소기체(nitrogen gas)를 이용하여 건조시켰다. 이는 메탄올에 녹여 HPLC 분석을 수행하였다. ZjANS1 효소 활성 반응의 경우, 위와 똑같은 절차를 걸쳐 ZjDFR1과 ZjANS1을 동시에 30℃에서 4시간 처리하여 반응을 진행하였다.

HPLC를 이용한 인 비트로 분석 결과를 확인하기 위하여 샘플은 Inno C18 컬럼을 이용하여 UltiMate 3000 HPLC System(Thermo scientific)에서 280nm의 파장에서 분석을 수행하였다.

8. 애기장대 형질전환체 분석

ZjDFR1과 ZjANS1의 코딩 서열(coding sequence)을 PCR로 증폭하기 위하여 각각 SalI과 SacI(ZjDFR1), KpnI과 XbaI(ZjANS1) 제한효소가 포함된 프라이머를 제작하였다(표 2).

프라이머 명칭	서열(5'->3')	서열번호
DFR1_SalI_F	GTCGACATGGGGGAGGTGGT	53
DFR1_SacI_R	GAGCTCCACATGCTCCCTTCTAA	54
ANS_KpnI_F	GGTACCATGTCATCTTCGACGG	55
ANS_XbaI_R	TCTAGAGTTGGTTTTCGGTGATG	56

PCR은 95℃ 10초, 60℃ 5초, 72℃ 90초로 30 사이클 간 수행하였다. PCR 산물은 35S:HA:NOS 터미네이터 카세트(terminator cassette)가 포함된 pBI101 벡터에 삽입되었다. 삽입된 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 균주에 삽입시켰다. 플로랄-딥(Floral-dip) 방법을 이용하여 tt3 및 tt18 애기장대 돌연변이체(mutant plant)에 형질전환 하였다(Clough and Bent, 1998, Plant J. 16:735-743). 카나마이신 배지에서 선발된 T1 식물체는 토양으로 이식하였다.

축합형 타닌(condensed tannin)의 일종인 프로안토시아니딘(Proanthocyanidins)의 함량 분석을 위해 DMACA(dimethylaminocinnaldehyde)를 이용하여 애기장대 T2 종자를 1주일간 염색하고 70% 에탄올으로 세척한 후 분석을 수행하였다.

실시예 1. 착색이 서로 다른 두 잔디 품종에서의 착색 성분 분석

안양중지(Anyang-Jungji, AJ)와 그린조아(Greenzoa, GZ) 두 품종은 형태학적으로 매우 유사한 잔디 품종이나 이삭(spike)과 포복경(stolon)에서는 서로 다른 착색을 보이는 특징을 가진다(도 1). 두 품종의 서로 다른 착색 특성에 대하여 연구하기 위해 우선 이삭을 발달단계에 따라 총 6단계로 나누어 분석을 수행하였다. 각 단계별 샘플에서 색소를 뽑아 HPLC 분석을 수행한 결과 안양중지에서 시아니딘(cyanidin)과 페튜니딘(petunidin)이 착색의 주 성분임을 확인한 반면, 그린조아에서는 상기 화합물이 확인되지 않았다(도 2).

실시예 2. 착색이 서로 다른 두 잔디 품종에서의 차등발현유전자 확인

잔디는 유전체 정보가 거의 알려지지 않은 작물 중 하나로 유전자 관련 연구를 하기에 제약이 많다. 이러한 제약을 극복하기 위하여 잔디 이삭의 RNA-seq을 통한 신규 전사체 분석을 수행하여 안토시아닌 생합성과 관련된 후보유전자를 선발하였다(도 3A). 총 22종의 안토시아닌 생합성 관련 후보유전자를 선발하였고 안양중지와 그린조아에서의 이들 유전자 발현양상을 비교하였다. 그린조아에 비해 안양중지에서 발현이 높은 차등발현 유전자(Differentially expressed gene: DEG)를 확인해 본 결과 ZjDFR1과 ZjANS1이 확인되었다(도 3B).

전사체 분석을 통한 디지털 발현 양상은 qRT-PCR을 수행하여 발현양상을 재확인하였다. 그 결과 ZjDFR1과 ZjANS1은 이삭의 발달에 따라 안양중지에서 발현이 높은 반면 그린조아에서는 발현이 아주 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 4). 또한 안토시아닌 축적이 많은 안양중지 이삭(S5 및 S6 단계)에서 발현이 증가됨을 확인하였다(도 4).

ZjDFR1과 ZjANS1의 발현양상이 조직 특이적인 현상인지 알아보기 위하여 잔디의 여러 조직에서의 발현양상을 분석해 보았다. 안양중지와 그린조아 두 품종 간 착색의 차이를 보이는 이삭과 포복경을 비롯하여 착색의 차이를 보이지 않는 늙은 잎과 어린 잎, 뿌리에서의 발현양상을 비교분석해 본 결과 ZjDFR1과 ZjANS1은 착색의 차이가 없는 조직에서는 발현 양상의 차이가 없었으나 착색의 차이가 있는 이삭과 포복경에서는 발현의 차이가 현저하게 나타났다(도 5).

또한 ZjDFR1과 ZjANS1의 발현수준의 차이에 의한 착색의 차이가 안양중지와 그린조아에서만 일어나는 현상인지 아니면 조이시아속 잔디(Zoysia sp.)에서의 일반적인 현상인지에 대하여 알아보기 위해 착색의 차이가 있는 여러 잔디 품종에서의 발현 양상을 알아보았다.

그 결과 안양중지를 비롯한 착색 잔디의 경우 ZjDFR1과 ZjANS1의 발현수준이 높은 반면, 그린조아를 포함한 비착색 잔디에서는 그 발현수준이 낮음을 확인할 수 있었다(도 6, 7).

상기 결과를 종합해보면, ZjDFR1과 ZjANS1 유전자가 잔디 식물에서 착색 조절에서 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

실시예 3. ZjDFR1 과 ZjANS1 유전자 분리

상기 실시예 2에서의 착색 잔디와 비착색 잔디에서 차등적으로 발현하는 안토시아닌 생합성 유전자인 ZjDFR1과 ZjANS1 유전자의 전장 cDNA를 획득하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과 ZjDFR1 유전자는 1,116bp의 CDS(coding DNA sequence)(서열번호 1)의 1,458bp ORF(open reading frame)로 구성되며, 371개의 아미노산 서열(서열번호 2)로 이루어진 폴리펩티드를 코딩한다. 한편, ZjANS1 유전자는 인트론 없이 1,179bp의 ORF로 구성되며(서열번호 3), 392개의 아미노산 서열(서열번호 4)로 이루어진 폴리펩티드를 코딩한다.

실시예 4. ZjDFR1 과 ZjANS1 재조합 단백질 제조 및 효소 활성 확인

착색의 차이에 관여하는 두 개의 유전자 ZjDFR1과 ZjANS1의 기능을 확인하고자 이들 유전자를 대장균에 발현시켜 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)과 융합된 ZjDFR1 및 ZjANS1 재조합 단백질을 제조하였다(도 8).

HPLC 분석을 이용하여 상기 제조된 ZjDFR1 및 ZjANS1 재조합 단백질의 디하이드로플라보놀 4-환원효소(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)와 안토시아니딘 합성효소(anthocyanidin synthase, ANS)로서의 각각의 효소 촉매 활성을 분석하였다. 그 결과 ZjDFR1와 ZjANS1은 세 가지 디하이드로플라보놀(dihydroflavonol)(dihydromyricetin, DHM;dihydroquercetin, DHQ; dihydrokaempferol, DHK)을 기질로 하여 촉매 활성을 함으로써 류코안토시아니딘과 안토시아니딘(delphinidin, cyanidin, pelargonidin)를 생성함을 관찰하였다(도 9). 그러나 ZjDFR1과 ZjANS1은 나린제닌(naringenin, NRG)에 촉매 활성을 보이지 않았다(도 9). 이로써 ZjDFR1과 ZjANS1이 안토시아닌 생합성 효소로서 작용함을 알 수 있었다.

실시예 5. ZjDFR1 또는 ZjANS1 과발현 형질전환 식물체의 착색 및 안토시아닌 생합성 증진 확인

인 비보(In vivo)에서의 안토시아닌 관련 유전자의 발현을 알아보기 위하여 ZjDFR1 및 ZjANS1 유전자를 각각 DFR과 ANS가 결핍된 애기장대 돌연변이체(transparent testa: tt)인 tt3 및 tt18에 형질전환하였다. 형질전환 식물체에서의 안토시아닌 축적을 알아보기 위하여 DMACA를 이용한 분석을 수행하였다. tt 돌연변이체와 달리 ZjDFR1 또는 ZjANS1 유전자가 형질전환된 T2 종자에서는 프로안토시아니딘의 축적이 증진된 것을 확인하였다(도 10). 또한 ZjDFR1 또는 ZjANS1를 과발현시킨 T1 식물체의 줄기 부분에서 보라색 색소가 축적된 것을 확인하였다(도 10).

애기장대에서의 안토시아닌 관련 잔디 유전자의 발현을 알아보기 위하여 HPLC 분석을 수행하였다. 상기 실험에는 4주령 애기장대 형질전환 식물체의 지상부를 사용하였다. 특히 ZjDFR1 또는 ZjANS1이 과발현된 형질전환 식물체에서는 야생형 및 tt 돌연변이 식물체에 비해 높은 시아니딘-3-O-글루코시드(cyanidin-3-O-glucoside)가 축적된 것을 확인하였다(도 11).

ZjDFR1과 ZjANS1 유전자의 발현을 분석하기 위하여 qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과 tt 변이체에서는 ZjDFR1 및 ZjANS1의 발현이 전혀 되지 않는 반면, 형질전환체의 경우 두 유전자의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 12). 이 결과를 통하여 ZjDFR1과 ZjANS1 유전자의 발현을 통하여 애기장대에서 최종적으로 안토시아닌이 축적되는 것을 확인하였고, 이를 통하여 기능이 유사한 잔디의 안토시아닌 관련 오쏘로그 유전자(orthologous gene)가 애기장대에서 DFR 및 ANS의 기능을 수행함을 확인하였다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Anthocyanin biosynthesis genes involved in pigmentation of zoysiagrass and uses thereof <130> PN16170 <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1116 <212> DNA <213> Zoysia japonica Steud. <400> 1 atgggggagg tggtggtgaa gcagggggaa gaggcgatgg aggtgaaggg accggtggtg 60 gtgaccgggg catcgggctt cgtcggctcg tggctcgtca tgaagctcct ccaggccggg 120 tacaccgtcc gcgccaccgt gcgcggcccc gcgaatgtcg ggaagacgag accgttgctg 180 gaccttcccg gagcgaagga gcggctgtcc atctataaag ccgacctgag cgacgagggc 240 agcttcgacg aggcgatcaa gggctgcacc ggcgtcttcc acgtcgccac gcccatggac 300 ttcgagtcca aggaccccga gaacgaggtg atcaagccga cggtggaagg gatgatgagc 360 atcatgcgcg cctgcaagga cgccggcacc gtgaagcgca tcgtcttcac ctcatccgcc 420 gggacagtca acatcgaggg gcggcagagg cccgtctacg accacgacaa ctggagcgat 480 atcgactttt gccgccgcgt caagatgacc ggatggatgt acttcgtgtc caagtccctg 540 gctgagaagg cggccatggc gtacgcggcg gagcacggcc tggaccttat cagcatcatc 600 ccgacgctgg tggtcggccc gttcctcagc acggccatgc cgcccagcct cgtcacagcg 660 ctggcgctcg tcacgaggaa cgagccgcac tactcgatcc tcaagcaggt gcagttcgtc 720 cacctcgacg acctctgcga cgccgagatt tacctcttcg agcacccgga cgccgcgggc 780 cgctacgtct gctcctccga cgacgccacc atccacggcc tcgcagccat gctcagggag 840 aggtaccccg agtacgacat ccccgagagc ttccctggga tcgacgacga cctcccgccg 900 gtgcacttct cgtccaagaa gctcctcgac cacgggttca ggttcaggta cacggtgcag 960 gacatgttcg acgaggccat caggacgtgc agggagaagg gcctgatccc gctcgctacg 1020 cctggaggtg acggctccat ggatgagcct ggcgagacgg gagcggcatt gggaaggatg 1080 gcccggcgat cgtcgcttag aagggagcat gtgtga 1116 <210> 2 <211> 371 <212> PRT <213> Zoysia japonica Steud. <400> 2 Met Gly Glu Val Val Val Lys Gln Gly Glu Glu Ala Met Glu Val Lys 1 5 10 15 Gly Pro Val Val Val Thr Gly Ala Ser Gly Phe Val Gly Ser Trp Leu 20 25 30 Val Met Lys Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Thr Val Arg Ala Thr Val Arg 35 40 45 Gly Pro Ala Asn Val Gly Lys Thr Arg Pro Leu Leu Asp Leu Pro Gly 50 55 60 Ala Lys Glu Arg Leu Ser Ile Tyr Lys Ala Asp Leu Ser Asp Glu Gly 65 70 75 80 Ser Phe Asp Glu Ala Ile Lys Gly Cys Thr Gly Val Phe His Val Ala 85 90 95 Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro Glu Asn Glu Val Ile Lys 100 105 110 Pro Thr Val Glu Gly Met Met Ser Ile Met Arg Ala Cys Lys Asp Ala 115 120 125 Gly Thr Val Lys Arg Ile Val Phe Thr Ser Ser Ala Gly Thr Val Asn 130 135 140 Ile Glu Gly Arg Gln Arg Pro Val Tyr Asp His Asp Asn Trp Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asp Phe Cys Arg Arg Val Lys Met Thr Gly Trp Met Tyr Phe Val 165 170 175 Ser Lys Ser Leu Ala Glu Lys Ala Ala Met Ala Tyr Ala Ala Glu His 180 185 190 Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Ile Pro Thr Leu Val Val Gly Pro Phe 195 200 205 Leu Ser Thr Ala Met Pro Pro Ser Leu Val Thr Ala Leu Ala Leu Val 210 215 220 Thr Arg Asn Glu Pro His Tyr Ser Ile Leu Lys Gln Val Gln Phe Val 225 230 235 240 His Leu Asp Asp Leu Cys Asp Ala Glu Ile Tyr Leu Phe Glu His Pro 245 250 255 Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Val Cys Ser Ser Asp Asp Ala Thr Ile His 260 265 270 Gly Leu Ala Ala Met Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Glu Tyr Asp Ile Pro 275 280 285 Glu Ser Phe Pro Gly Ile Asp Asp Asp Leu Pro Pro Val His Phe Ser 290 295 300 Ser Lys Lys Leu Leu Asp His Gly Phe Arg Phe Arg Tyr Thr Val Gln 305 310 315 320 Asp Met Phe Asp Glu Ala Ile Arg Thr Cys Arg Glu Lys Gly Leu Ile 325 330 335 Pro Leu Ala Thr Pro Gly Gly Asp Gly Ser Met Asp Glu Pro Gly Glu 340 345 350 Thr Gly Ala Ala Leu Gly Arg Met Ala Arg Arg Ser Ser Leu Arg Arg 355 360 365 Glu His Val 370 <210> 3 <211> 1179 <212> DNA <213> Zoysia japonica Steud. <400> 3 atgtcatctt cgacggtgct gcagcagccg ccggcggccg cacgcgtgga ggcgctcagc 60 ctcagcagcc tctccgctat cccgcccgag tacgtccgac ccgccgacga acgcgcgggc 120 ctcggcgacg ccttcgacct tttggctgaa caattagacg acggtccgcg gatccccgtc 180 gtcgacatct cccctttcct catgaccacc ggtggcgccg ccgacaagaa ggatcagccg 240 cagtgcgtgg atgcggtgcg cgcggcggct gcggaatggg gcgtcatgca catcgcgggc 300 cacggcatcc ccgacgagct tgtcgactgc ctccaagccg ccggcaccgc cttcttcgcg 360 ctccccatcc acgccaagga ggcctacgcc aacgaccccg ccgccggccg cctgcaaggc 420 tacggcagcc gcctcgccac caacgccagt gggcagcggg agtgggagga ctacctcttc 480 cacctcctgc accccgacgg cctcgccgac cacgccctgt ggcccgcgca cccgcccgac 540 tacgtcgcca ccacccgcga gttcggccgc cgtgtccgtg agctggcctc gaggctgctc 600 gccatcctct cgctggggct cggcctgcgc aacgagcaca agctagagga tgagctcacc 660 aataatagga ccaaggcagg agatggagat caggaggatc ttctcctcca gctcaagatc 720 aactactacc cgcggtgccc gcagccggag ctggccgtcg gtgtcgaggc ccacacggac 780 gtcagcgcgc tctccttcat cctccacaac ggcgtgccag ggctgcaggt gctccatggc 840 ggcaggtggg tgacggcgcg ctcggagccc gggaccatga tagtgcacgt tggcgacgcc 900 ctcgagatcc tcagcaatgg ccggtacacc agcgtgctgc accgcggtct cgtcaaccgc 960 gaggcggtgc gcgtttcctg ggtcgtcttc tgcgagccgc caccagacgc cgtgctcctg 1020 cggccgctac cggagctggt caccgaggag gagcccgccc ggttcacgcc gcgcacattc 1080 aaggagcacc tcgaccgcaa gctcttcaag aagcacgagc gtgacggcta caagccggac 1140 caccaagtga ttcgcgattc atcaccgaaa accaactga 1179 <210> 4 <211> 392 <212> PRT <213> Zoysia japonica Steud. <400> 4 Met Ser Ser Ser Thr Val Leu Gln Gln Pro Pro Ala Ala Ala Arg Val 1 5 10 15 Glu Ala Leu Ser Leu Ser Ser Leu Ser Ala Ile Pro Pro Glu Tyr Val 20 25 30 Arg Pro Ala Asp Glu Arg Ala Gly Leu Gly Asp Ala Phe Asp Leu Leu 35 40 45 Ala Glu Gln Leu Asp Asp Gly Pro Arg Ile Pro Val Val Asp Ile Ser 50 55 60 Pro Phe Leu Met Thr Thr Gly Gly Ala Ala Asp Lys Lys Asp Gln Pro 65 70 75 80 Gln Cys Val Asp Ala Val Arg Ala Ala Ala Ala Glu Trp Gly Val Met 85 90 95 His Ile Ala Gly His Gly Ile Pro Asp Glu Leu Val Asp Cys Leu Gln 100 105 110 Ala Ala Gly Thr Ala Phe Phe Ala Leu Pro Ile His Ala Lys Glu Ala 115 120 125 Tyr Ala Asn Asp Pro Ala Ala Gly Arg Leu Gln Gly Tyr Gly Ser Arg 130 135 140 Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gly Gln Arg Glu Trp Glu Asp Tyr Leu Phe 145 150 155 160 His Leu Leu His Pro Asp Gly Leu Ala Asp His Ala Leu Trp Pro Ala 165 170 175 His Pro Pro Asp Tyr Val Ala Thr Thr Arg Glu Phe Gly Arg Arg Val 180 185 190 Arg Glu Leu Ala Ser Arg Leu Leu Ala Ile Leu Ser Leu Gly Leu Gly 195 200 205 Leu Arg Asn Glu His Lys Leu Glu Asp Glu Leu Thr Asn Asn Arg Thr 210 215 220 Lys Ala Gly Asp Gly Asp Gln Glu Asp Leu Leu Leu Gln Leu Lys Ile 225 230 235 240 Asn Tyr Tyr Pro Arg Cys Pro Gln Pro Glu Leu Ala Val Gly Val Glu 245 250 255 Ala His Thr Asp Val Ser Ala Leu Ser Phe Ile Leu His Asn Gly Val 260 265 270 Pro Gly Leu Gln Val Leu His Gly Gly Arg Trp Val Thr Ala Arg Ser 275 280 285 Glu Pro Gly Thr Met Ile Val His Val Gly Asp Ala Leu Glu Ile Leu 290 295 300 Ser Asn Gly Arg Tyr Thr Ser Val Leu His Arg Gly Leu Val Asn Arg 305 310 315 320 Glu Ala Val Arg Val Ser Trp Val Val Phe Cys Glu Pro Pro Pro Asp 325 330 335 Ala Val Leu Leu Arg Pro Leu Pro Glu Leu Val Thr Glu Glu Glu Pro 340 345 350 Ala Arg Phe Thr Pro Arg Thr Phe Lys Glu His Leu Asp Arg Lys Leu 355 360 365 Phe Lys Lys His Glu Arg Asp Gly Tyr Lys Pro Asp His Gln Val Ile 370 375 380 Arg Asp Ser Ser Pro Lys Thr Asn 385 390 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgaatgttat tgccgtcctt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtgaggtgg tcggtgtact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cctaagcagg acaggtacgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gttgtcgttg acggagttga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctacaacaac gggctgacct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gagctcggag cagtaggatg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ccgactggaa ctccatcttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tccttgtcga gcttgacctt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cagaggaggg catcaagttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctccttcat cagcttcctg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aggatgcttg ctgactccat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 agcaacacaa gcacaacctg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gaacaggagg acaccaaagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tggtttggtt ccctcaaaag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gctgctgcat tctatgtgga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccggtgcttt aaaaatggag 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gccgagaagg tgactgagaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cttgaacgcc tccttgaact 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 atgtcgaacc ggagcttatc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cacggggtac gagaagtagg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ggattcttcc aggtgctgaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gtcgtcggag tagagcttgg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 cccactagag ttccgaccag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cgcaccaaac ggaataagat 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atgtccagct tctcctcgc 19 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tcaggccgca gcgtag 16 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gcctggacct tatcagcatc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aactgcacct gcttgaggat 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gtcctcgcta actgcgattc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 gaaacgggtt cttcttgcac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tggatggagc aaaggatagg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gtgatagaag ggcgaagcag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 cttcgacctt ttggctgaac 20 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 actgcggctg atccttctt 19 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ggatttcgtc cctggttaca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 atataagagg gcggcaggtt 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gacctggtga aattcgagga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ctctgaacga ttcgggatgt 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gcttggcatc tatggaggag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 tgtcgaatca cccacagaaa 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gcttggcatc tatagagcag 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 tgtcggatta cccacaaaaa 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 cactggtacg acgccaagta 20 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ccttgtactc cccgttgct 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 tgcgctggat caactatctg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gatcaaggac cacctgttgc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ctgcggtgga tcaactacct 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 accatttgtt gccgactagg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gtcgacatgg gggaggtggt 20 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gagctccaca tgctcccttc taa 23 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 ggtaccatgt catcttcgac gg 22 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 tctagagttg gttttcggtg atg 23

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1).
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 잔디(Zoysia japonica Steud.) 유래 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1).
제1항의 디하이드로플라보놀 4-환원효소 ZjDFR1(Zoysia japonica dihydroflavonol 4-reductase1)를 코딩하는 ZjDFR1 유전자.
제2항의 안토시아니딘 합성효소 ZjANS1(Zoysia japonica anthocyanidin syntase1)를 코딩하는 ZjANS1 유전자.
제3항의 유전자; 제4항의 유전자; 또는 제3항의 유전자 및 제4항의 유전자;를 포함하는 재조합 벡터.
제5항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제3항의 유전자; 제4항의 유전자; 또는 제3항의 유전자 및 제4항의 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성을 증가시키는 방법.
제3항의 유전자; 제4항의 유전자; 또는 제3항의 유전자 및 제4항의 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 ZjDFR1 유전자 및 ZjANS1 유전자를 과발현하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제8항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 식물체 내의 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체.
제9항에 있어서, 상기 식물체는 잔디속(Zoysia sp.) 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제9항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
제3항의 유전자; 제4항의 유전자; 또는 제3항의 유전자 및 제4항의 유전자;를 유효성분으로 함유하는 식물체 내의 안토시아닌 생합성 증가용 조성물.