ES2311254T3 - Genes que codifican flavona-sintasas. - Google Patents
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Abstract
Un gen que codifica una proteína con actividad de síntesis de flavonas a partir de la flavanonas, en el que la proteína: (1) tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No. 2; o (2) tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No.
Description
Genes que codifican
flavona-sintasas.
La presente invención se refiere al control y a
la utilización de la biosíntesis de flavonas, que tienen efectos
sobre el color de las flores, la protección de los rayos
ultravioletas, la simbiosis con microorganismos, etc. en plantas,
mediante una técnica de ingeniería genética. Más específicamente,
se refiere a genes que codifican proteínas con actividad para
sintetizar flavonas a partir de flavanonas, y a su utilización.
La abundancia de los diferentes colores en las
flores es uno de los aspectos agradables de la vida que enriquece
las mentes y los corazones humanos. Se espera que aumente la
producción de alimentos para satisfacer el futuro aumento
demográfico por medio de la aceleración del crecimiento de plantas
por la simbiosis con microorganismos, o aumentando el número de
bacterias de leguminosas que fijan nitrógeno, mejorándose así la
productividad de las plantas como consecuencia del aumento del
contenido de nitrógeno en el suelo. La eliminación o la reducción
del uso de sustancias químicas agrícolas es también deseable para
lograr una agricultura más ecológica, y esto requiere la mejora del
suelo por los medios biológicos anteriormente mencionados, así como
una resistencia más alta de las plantas contra la infección
microbiana. Otro objetivo deseado es obtener plantas con altas
funciones protectoras contra los rayos ultravioletas como medio
para proteger las plantas de la destrucción de la capa de ozono.
"Flavonoide" es un término general para un
grupo de compuestos con la estructura carbonada
C6-C3-C6, y que están extensamente
distribuidos en todas las partes de las células de las plantas. Se
sabe que los flavonoides tienen funciones tales como la atracción
de insectos y otros polinizadores, la protección de la planta de los
rayos ultravioletas, y la participación en la interacción con los
microorganismos del suelo (BioEssays, 16 (1994), Koes
et al., pág. 123; Trends in Plant Science, 1
(1997), Shirley, B.W., pág. 377).
De los flavonoides, las flavonas juegan un papel
importante en la interacción de las plantas con los
microorganismos, especialmente en las legumbres, en las que
participan en las etapas iniciales de la simbiosis con las
bacterias de las leguminosas (Plant Cell, 7 (1995), Dixon y
Paiva, pág. 1085; Annu. Rev. Phytopathol., 33 (1995),
Spaink, pág. 345). Las flavonas en los pétalos desempeñan un papel
en el reconocimiento por los insectos y actúan como copigmentos que
forman complejos con las antocianinas. (Gendai Kagaku, (mayo de
1998), Honda y Saito, pág. 25; Prog. Chem. Org. Natl. Prod.,
52 (1987), Goto, T., pág. 114). Se sabe que cuando la flavona
forma un complejo con la antocianina, el máximo de la absorción de
la antocianina se desplaza hacia longitudes de onda más altas, es
decir, hacia el azul.
Las rutas de la biosíntesis para los flavonoides
han sido ampliamente estudiadas (Plant Cell, 7
(1995), Holton y Cornish, pág. 1071), y los genes para todas las
enzimas implicadas en la biosíntesis de antocianidina
3-glucósido y flavonol, por ejemplo, han sido
aislados. Sin embargo, los genes implicados en la biosíntesis de las
flavonas aún no han sido aislados. Las enzimas que sintetizan
flavonas incluyen las que pertenecen a la familia de la dioxigenasa
que depende del ácido 2-oxoglutárico (flavona
sintasa I) y las enzimas monoxigenasas que pertenecen a la familia
del citocromo P450 (flavona sintasa II). Estos grupos de enzimas
son enzimas completamente diferentes sin ninguna homología
estructural.
Se ha informado que en el perejil, la
dioxigenasa dependiente del ácido 2-oxoglutárico
cataliza una reacción que produce apigenina, una flavona, a partir
de la naringenina, una flavanona (Z. Naturforsch.,
36c (1981), Britsch et al., pág. 742; Arch.
Biochem. Biophys., 282 (1990), Britsch, pág. 152). Se
conocen otros tipos, la flavona sintasa II, que existen en el
dragón (Z. Naturforsch., 36c (1981), Stotz y Forkmann,
pág. 737) y la soja (Z. Naturforsch., 42c (1987),
Koch y Grisebach, pág. 343; Planta, 171 (1987), Koch
et al., pág. 519). Se ha publicado recientemente una
correlación entre un locus génico y la actividad de la flavona
sintasa II en los pétalos de la gerbera (Phytochemistry,
49 (1998), Martens y Forkmann, pág. 1953). Sin embargo, no
hay ninguna publicación en la que los genes para estas flavona
sintasa I y II fueran aislados o en la que la flavona sintasa II
fuera altamente purificada.
Fueron investigadas las propiedades de una
proteína citocromo P450, que tenía actividad de síntesis de
licodiona que fue inducida cuando células cultivadas de regaliz
(Glycyrrhiza echinata) fueron tratadas con un elicitor. La
proteína, según se piensa, cataliza la hidroxilación de la posición
2 de liquiritigenina que es una 5-desoxiflavanona,
seguido de la apertura del anillo hemiacetal no enzimático para
producir licodiona (Plant Physiol., 105 (1994), Otani
et al., pág. 1427). Para la clonación de licodiona sintasa,
fue preparada una genoteca de cADN a partir de células cultivadas de
Glycyrrhiza tratadas con elicitor, y fueron clonados 8 fragmentos
génicos que codificaban la citocromo P450 (Plant Science,
126 (1997), Akashi et al., pág. 39).
A partir de estos fragmentos fueron obtenidas
dos secuencias de cADN diferentes de cadena entera, cada una
codificando una citocromo P450, que habían sido desconocidas hasta
aquel tiempo. Específicamente, eran CYPGe-3 (la
citocromo P450 Nº CYP81E1) y CYPGE-5 (la citocromo
P450 Nº CYP93B1, en lo sucesivo en este documento indicada como la
CYP93B1) (Plant Physiol., 115 (1997), Akashi et
al., pág. 1288). Mediante la expresión posterior del cADN de
CYP93B1 en un sistema que usaba células de insecto cultivadas, se
mostró que la proteína derivada del gen catalizaba la reacción que
sintetizaba la licodiona a partir de liquiritigenina, una flavanona,
y 2-hidroxinaringenina a partir de naringenina,
también una flavanona.
La 2-hidroxinaringenina fue
convertida a apigenina, una flavona, por tratamiento ácido con
ácido clorhídrico del 10% (temperatura ambiente, 2 horas). También,
el eriodictiol fue convertida a luteolina, una flavona, por la
reacción de eriodictiol con microsomas de levadura que expresaba
CYP93B1 seguido de tratamiento ácido. Por lo tanto, fue demostrado
que el gen de citocromo P450 codifica la función de la actividad de
la flavanona 2-hidroxilasa (FEBS Lett.,
431 (1998), Akashi et al., pág. 287). En esta
invención, la producción de apigenina a partir de la naringenina
requirió CYP93B1 así como otra enzima desconocida, de modo que fue
concluido que un total de dos enzimas eran necesarias.
Sin embargo, ningún gen ha sido identificado aún
para enzimas con actividad de síntesis de flavonas (tal como la
apigenina) directamente a partir de flavanonas (tal como la
naringenina) sin tratamiento ácido. Así, a pesar del hecho de que
las flavonas tienen numerosas funciones en plantas, ninguna técnica
ha sido publicada aún que controle su biosíntesis en plantas, y que
mejore las biofunciones en las que las flavonas están implicadas,
tal como el color de la flor. El descubrimiento de una enzima que
por sí misma pueda lograr la síntesis de flavonas a partir de
flavanonas y la adquisición de su gen, y la introducción de tal gen
en plantas, sería más práctico e industrialmente aplicable que la
introducción en una planta de genes para dos enzimas implicadas en
la síntesis de flavonas a partir de flavanonas.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar genes para flavona sintasas con actividad de síntesis
de flavonas directamente a partir de flavanonas. Los genes de
flavona sintasa obtenidos pueden ser introducidos en plantas y ser
sobreexpresados para cambiar los colores de la flor.
Además, en los pétalos de las flores que
contienen de forma natural grandes cantidades de flavonas, se
espera que el control de la expresión de los genes de la flavona
sintasa por un método antisentido o un método de cosupresión también
pueda cambiar los colores de la flor. También, la expresión de los
genes de flavona sintasa en los órganos apropiados, a la luz de la
actividad antibacteriana de las flavonas y su interacción con los
microorganismos del suelo, causará un aumento de las propiedades
antibacterianas de las plantas y mejorará la capacidad de fijar
nitrógeno de las legumbres debido a la simbiosis promovida con los
microorganismos de la rizosfera, así como un efecto protector contra
los rayos ultravioletas y la luz.
La presente invención, por lo tanto, proporciona
un gen según se define en las reivindicaciones que codifica una
proteína que puedan sintetizar flavonas directamente a partir de
flavanonas. El gen es, específicamente, un gen que codifican la
flavona sintasa II que pueden sintetizar flavonas a partir de
flavanonas por una reacción monoenzimática (denominada en este
documento en adelante "flavona sintasa II").
Más específicamente, la presente invención
proporciona un gen que codifica una proteína P450 que tiene la
secuencia de aminoácidos SEQ. ID. No. 2 del Listado de Secuencias y
que posee actividad para sintetizar flavonas a partir de
flavanonas.
La invención además proporciona un gen según se
define en las reivindicaciones que codifica proteínas que tienen
secuencias de aminoácidos con una identidad de al menos el 70%
respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ. ID. No. 2
del Listado de Secuencias y que posee actividad para sintetizar
flavonas a partir de flavanonas.
La invención además proporciona un gen según se
define en las reivindicaciones que codifica proteínas que poseen la
actividad de sintetizar flavonas a partir de flavononas.
La invención proporciona incluso además un
vector según se define en las reivindicaciones, particularmente un
vector de expresión, que contiene cualquiera de los genes
anteriormente mencionados.
La invención proporciona incluso además un
huésped según se define en las reivindicaciones transformado con el
vector anteriormente mencionado.
La invención proporciona incluso además una
proteína según se define en las reivindicaciones codificada por
cualquiera de los genes anteriormente mencionados.
La invención proporciona incluso además un
procedimiento según se define en las reivindicaciones para producir
la proteína anteriormente mencionada que se caracteriza por
cultivar o hacer crecer el huésped anteriormente mencionado y
recuperar la proteína con actividad para sintetizar la flavona a
partir del huésped.
La invención proporciona incluso además una
planta según se define en las reivindicaciones en la que han sido
introducidos cualquiera de los genes anteriormente mencionados, o
progenies de la planta o su tejido, tales como flores cortadas, que
exhiben las mismas propiedades.
La invención proporciona incluso además un
método según se define en las reivindicaciones para cambiar las
cantidades y las composiciones del flavonoide usando los genes
anteriormente mencionados; un método según se define en las
reivindicaciones para cambiar las cantidades de flavonas usando los
genes anteriormente mencionados; un método según se define en las
reivindicaciones para cambiar los colores de las flores usando los
genes anteriormente mencionados; un método según se define en las
reivindicaciones para volver más azul el color de las flores usando
los genes anteriormente mencionados; un método según se define en
las reivindicaciones para volver más rojo el color de las flores
usando los genes anteriormente mencionados; un método según se
define en las reivindicaciones para modificar la fotosensibilidad de
las plantas usando los genes anteriormente mencionados; y un método
según se define en las reivindicaciones para controlar la
interacción entre las plantas y los microbios usando los genes
anteriormente mencionados.
La Figura 1 es un cromatograma que muestra los
resultados del análisis HPLC de los productos obtenidos a partir de
un sustrato, la naringenina, usando las proteínas codificadas por
CYP93B1 y TFNS5.
A y B: Obtenido añadiendo una fracción de
enzimas a granel de levadura que expresa CYP93B 1.
C y D: Obtenido añadiendo una fracción de
enzimas a granel de levadura que expresa TFNS5.
A y C: Productos directos obtenidos por la
adición de la fracción de enzimas.
B: Productos obtenidos por tratamiento ácido
después de reacción de A.
D: Productos obtenidos por tratamiento ácido
después de reacción de C.
La flavanona 2-hidroxilasa
codificada por el gen de CYP93B 1 de Glycyrrhiza produce
2-hidroxiflavanonas a partir de flavanonas como los
sustratos, y los productos se convierten en flavonas por
tratamiento ácido. Los presentes inventores vieron que seria
posible obtener un gen que codificara una flavona sintasa II, que
era un objeto de la invención, usando el cADN derivado de
Glycyrrhiza, CYP93B 1 para seleccionar de una genoteca de
cADN de, por ejemplo, una flor que contiene una gran cantidad de
flavonas, para así obtener el cADN que codificara proteínas con
actividad de síntesis de flavonas directamente a partir de
flavanonas como sustratos.
De acuerdo con la invención, una genoteca de
cADN de dragón que contiene una gran cantidad de flavonas se
rastrea usando el cADN derivado de Glycyrrhiza, CYP93B1 como
una sonda, para obtener el cADN que codifica una nueva citocromo
P450 (véase el Ejemplo 1). El cADN de dragón, ANFNS2, obtenido de
esta manera y el cADN de CYP93B1 de Glycyrrhiza entonces fue
usado como una sonda mezclada para obtener TFNS5, un cADN que
codifica una nueva citocromo P450, a partir de una genoteca cADN de
pétalos de flor de torenia (véase el Ejemplo 2).
El cADN derivado de torenia fue expresado en
levadura y se hizo reaccionar con naringenina, una flavanona, como
un sustrato que no causó la producción de
2-hidroxinaringenina, sino más bien de la flavona
apigenina, sin tratamiento ácido (véase el Ejemplo 3). En otras
palabras, esta enzima produjo directamente flavonas a partir de
flavanonas sin tratamiento ácido, y se confirmó que su gen era una
flavona sintasa II que nunca había sido clonada. La secuencia de
aminoácidos codificada por el ANFNS2 derivado de dragón del Ejemplo
1 exhibió una alta identidad del 77% con la flavona sintasa II
codificada por TFNS5, y exhibió actividad enzimática de flavona
sintasa II (Ejemplo 4). Además, como una secuencia de aminoácidos
codificada por cADN derivado de perilla también exhibió una alta
identidad del 76% y 75% con TFNS5 y ANFNS2, respectivamente
(Ejemplo 8), se especula que la proteína codificada por este cADN
también posee la misma actividad enzimática que las flavona sintasas
codificadas por TFNS5 y ANFNS2.
El gen de la presente invención pueden ser, por
ejemplo, uno que codifica la secuencia de aminoácidos incluida en
SEQ. ID. No. 2 del Listado de Secuencias. Sin embargo, se sabe que
las proteínas cuyas secuencias de aminoácidos son modificadas por
adiciones o deleciones de múltiples aminoácidos y/o sustituciones
con aminoácidos diferentes pueden mantener la misma actividad
enzimática que la proteína original.
La presente invención también se refiere a un
gen que tiene las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nº. 1 y las
secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias aminoácidos
de citadas en la presente memoria.
La invención también se refiere a genes que
codifican proteínas que tienen secuencias de aminoácidos con
identidad de preferiblemente al menos el 70%, como el 80% o mayor y
hasta el 90% o mayor, con la secuencia de aminoácidos incluida en
SEQ ID Nº 2 del Listado de Secuencias, y que posee una actividad de
síntesis de flavonas a partir de flavanonas.
Un gen con la secuencia de nucleótidos natural
puede ser obtenido rastreando una genoteca de cADN, por ejemplo,
como se demuestra detalladamente en los ejemplos. El ADN que
codifica las enzimas con secuencias de aminoácidos modificadas
puede ser sintetizado usando mutagénesis dirigida común o un método
PCR, usando el ADN con una secuencia de nucleótidos natural como
material de partida. Por ejemplo, un fragmento de ADN en el que una
modificación deba ser introducida puede ser obtenido por
tratamientos con enzimas de restricción del cADN natural o del ADN
genómico y luego puede usarse como plantilla para la mutagénesis
dirigida o la PCR utilizando un cebador que tenga la mutación
deseada introducida en el mismo, para obtener un fragmento de ADN
que tenga la modificación deseada introducida en el mismo. Los
fragmentos de ADN introducidos por mutación entonces pueden ser
unidos a un fragmento de ADN que codifica otra parte de una enzima
objetivo.
De forma alternativa, para obtener el ADN que
codifica una enzima que consiste en una secuencia de aminoácidos
acortada, por ejemplo, el ADN que codifica una secuencia de
aminoácidos que es más larga que la secuencia de aminoácidos
objetivo, tal como la secuencia de aminoácidos de longitud
completa, puede ser cortado con las endonucleasas de restricción
deseadas, y si el fragmento de ADN obtenido así no codifica la
secuencia de aminoácidos objetivo entera, puede ser unido con el ADN
sintetizado que comprende el resto de la secuencia.
Los genes así obtenidos pueden ser expresados en
un sistema de expresión usando E. coli o una levadura y su
actividad enzimática puede ser medida para confirmar que el gen
obtenido codifica a la flavona sintasa. Expresando el gen, es
también posible obtener la proteína flavona sintasa como producto
génico. De forma alternativa, es también posible obtener una
proteína flavona sintasa incluso usando anticuerpos para una
secuencia de aminoácidos parcial o completa incluida en SEQ. ID. No.
2, y tales anticuerpos pueden ser usados para la donación de un gen
de flavona sintasa en otro organismo.
Por consiguiente, la invención también se
refiere a vectores recombinantes, y especialmente a vectores de
expresión, que contiene el gen anteriormente mencionados, y a
huéspedes transformados por estos vectores. Los huéspedes usados
pueden ser organismos procariotas o eucariotas. Los ejemplos de
organismos procariotas que pueden ser usados comúnmente como
huéspedes incluyen a las bacterias que pertenece al género
Escherichia, tales como Escherichia coli, y los
microorganismos que pertenecen al género Bacillus, tales
como Bacillus subtilis.
Los ejemplos de huéspedes eucariotas que pueden
ser usados incluyen organismos eucariotas inferiores, por ejemplo,
microorganismos eucariotas, por ejemplo, Eumycota tales como
levadura y hongos filamentosos. Como levaduras pueden mencionarse
los microorganismos que pertenecen al género Saccharomyces,
tal como Saccharomyces cerevisiae, y como hongos
filamentosos pueden mencionarse microorganismos que pertenecen al
género Aspergillus, tales como Aspergillus oryzae y
Aspergillus niger y microorganismos que pertenecen al género
Penicillium. También pueden ser usadas células de animal y
células de planta, siendo las células de animal líneas celulares de
ratones, hámsteres, monos o seres humanos. Las células de insecto,
tales como células de gusano de seda, o los propios gusanos de seda
adultos, también pueden ser usados.
Los vectores de expresión de la invención
incluirán regiones reguladoras de la expresión tales como un
promotor y un terminador, un origen de replicación, etc.,
dependiendo del tipo de huéspedes en los que deban ser
introducidos. Los ejemplos de promotores para los vectores de
expresión bacterianos que pueden ser usados incluyen a promotores
convencionales tales como el promotor trc, el promotor tac, el
promotor lac, etc., los ejemplos de los promotores de levadura que
pueden ser usados incluyen al promotor de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, el promotor PH05, etc., y los ejemplos de los
promotores de hongos filamentosos que pueden ser usados incluyen al
promotor de amilasa, trpC, etc. Los ejemplos de promotores huésped
de células de animal que pueden ser usados incluyen a promotores
virales tales como el el promotor temprano SV40, tardío SV40,
etc.
El vector de expresión puede prepararse de
acuerdo con un método convencional usando endonucleasas de
restricción, ligasas y otras similares. La transformación de un
huésped con un vector de expresión también puede ser llevada a cabo
de acuerdo con métodos convencionales.
Los huéspedes transformados por el vector de
expresión pueden ser cultivados pueden hacerse crecer y la proteína
objetivo puede ser recuperada y purificada a partir del producto
cultivado, etc., de acuerdo con métodos convencionales tales como
filtración, separación centrífuga, trituración de células,
cromatografía de filtración de gel, cromatografía de intercambio
iónico y otros similares.
La presente memoria descriptiva en todas partes
habla de flavona sintasas II derivadas de dragón, torenia y perilla
que son capaces de sintetizar flavonas directamente a partir de
flavanonas, y también se sabe que los genes de citocromo P450
constituyen una superfamilia (DNA and Cell Biology,
12 (1993), Nelson et al., pág. 1) y que las proteínas
de citocromo P450 dentro de la misma familia tienen un 40% o mayor
identidad en sus secuencias de aminoácidos mientras que las
proteínas citocromo P450 dentro de una subfamilia tiene 55% o una
mayor identidad en sus secuencias de aminoácidos, y que sus genes se
hibridan entre sí (Pharmacogenetics, 6 (1996), Nelson
et al., pág. 1).
Por ejemplo, un gen para la flavonoide
3',5'-hidroxilasa, que era un tipo de citocromo
P450 y que participaba en la ruta de síntesis de los flavonoides,
fue aislado primero a partir de petunias (Nature, 366
(1993), Holton et al., pág. 276), y el gen de flavonoide
3',5'-hidroxilasa de petunia fue usado como una
sonda para aislar fácilmente un gen de flavonoide
3',5'-hidroxilasa de genciana (Plant Cell
Physiol., 37 (1996), Tanaka et al., pág. 711),
genciana de pradera, campanilla (documento WO93/18155 (1993),
Kikuchi et al.), lavanda, torenia y verbena (Shokubutsu no
Kagaku Chosetsu, 33 (1998), Tanaka et al., pág.
55).
Así, una parte o todo de cualquiera de los genes
de flavona sintasa II de la invención derivada de dragón, que es
capaz de sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas,
pueden ser usados como sonda, para obtener los genes de la flavona
sintasa II capaces de sintetizar flavonas directamente a partir de
flavanonas, a partir de diferentes especies de plantas. Además,
purificando las enzimas de la flavona sintasa II derivadas de
dragón, torenia o perilla descritas en esta memoria descriptiva que
pueden sintetizar flavonas directamente a partir de flavanonas, y
obteniendo los anticuerpos contra las enzimas por métodos
convencionales, es posible obtener diferentes proteínas flavona
sintasa II que reaccionen con los anticuerpos y obtener los genes
que codifican para aquellas proteínas.
Las fuentes para genes de flavona sintasa II
pueden ser, además de dragón, torenia y perilla descritas en este
documento, también genciana, verbena, crisantemo, lirio, commelina,
centaurea, salvia, nemófila y similares.
La invención se refiere incluso además a plantas
cuyos colores sean modificados introduciendo un gen o genes para
flavona sintasas II que pueda o puedan sintetizar flavonas
directamente a partir de flavanonas, y a las progenies de las
plantas o sus tejidos, que también puedan estar en forma de flores
cortadas. Usando las flavona sintasas II o sus genes que han sido
clonados de acuerdo con la invención, es posible producir flavonas
en especies de plantas o variedades que de otra manera producirían
pocas o absolutamente ninguna flavona. Expresando el gen o los
genes de la flavona sintasa II en pétalos de flor, es posible
aumentar la cantidad de flavonas en los pétalos de flor, permitiendo
así que los colores de las flores sean modificados hacia el azul,
por ejemplo.
A la inversa, reprimiendo la síntesis de
flavonas en los pétalos de flor, es posible modificar los colores
de las flores hacia el rojo, por ejemplo. Sin embargo, las flavonas
tienen una miríada de efectos sobre los colores de las flores, y los
cambios de colores de las flores por lo tanto no están limitados
con los mencionados en este documento. Con el nivel actual de
tecnología, es posible introducir un gen en una planta y expresar el
gen en una manera constitutiva o específica de tejido, mientras que
es también posible reprimir la expresión del gen objetivo por un
método antisentido o un método de cosupresión.
Como ejemplos de plantas transformables pueden
ser mencionados rosa, crisantemo, clavel, dragón, ciclamen,
orquídea, violeta de pradera, freesia, gerbera, gladiolo,
paniculata, kalanchoe, lirio, pelargonium, geranio, petunia,
torenia, tulipán, arroz, cebada, trigo, semilla de colza, patata,
tomate, álamo, plátano, eucalipto, batata, soja, alfalfa, lupino,
grano, etc., pero no hay ninguna limitación a estos.
Como las flavonas tienen varias actividades
fisiológicas como se explica anteriormente, pueden impartir una
nueva actividad fisiológica o valor económico a las plantas. Por
ejemplo, expresando el gen para producir flavonas en las raíces, es
posible promover el crecimiento de microorganismos que son
beneficiosos para las plantas, y así promover el crecimiento de las
plantas. Es también posible sintetizar flavonas que exhiben
actividad fisiológica en seres humanos, animales o insectos.
La invención ahora será explicada con más
detalle mediante los Ejemplos siguientes. A no ser que sea
especificado de otra manera, los métodos biológicos moleculares
fueron llevados a cabo de acuerdo con "Molecular Cloning" (de
Sambrook et al., 1989).
Fue extraído ARN de aproximadamente 5 g de
brotes jóvenes de un dragón "Yellow Butterfly" (nombre
comercial de Sakatano-Tane, KK.), y fue obtenido el
ARN de polyA+ por un Oligotex. Este ARN de polyA+ fue usado como
una plantilla para preparar una genoteca de cADN usando un Kit de
Síntesis de Genoteca de cADN Lambda ZAPII (Stratagene) por el
método recomendado por Stratagene (Manual de instrucciones de
Stratagene, Revisión Nº 065001). La genoteca de cADN fue rastreada
usando el cADN de CYP93B1 de longitud completa como sonda. El
rastreo y la detección de clones positivos fueron llevados a cabo
usando un kit de marcación DIG-ADN y detección
(Boehringer) basado en el método recomendado por la misma empresa,
en condiciones pocos rigurosas.
Específicamente, un tampón de hibridación (5 x
SSC, 30% de formamida, tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0), 1%
de SDS, 2% de reactivo bloqueante (Boehringer), 0,1% de
lauroilsarcosina, 80 \mug/ml de ADN de esperma de salmón) fue
usado para la prehibridación a 42ºC durante 2 horas, después de lo
cual la sonda DIG-marcada fue añadida y la mezcla
fue guardada por la noche. La membrana fue aclarada en una solución
de aclarado 5 x SSC que contenía 1% de SDS a 65ºC durante 1,5 horas.
Un clon positivo fue obtenido, y fue denominado ANFNS1. En la
determinación de la secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de
ANFNS1 se esperaba que ANFNS1 codificara una secuencia con una alta
identidad con la flavanona 2-hidroxilasa codificada
por el CYP93B1 de regaliz, y fue asumido que codificaba una P450
con una función similar a la de la flavanona
2-hidroxilasa.
Sin embargo, una comparación con la secuencia de
aminoácidos de flavanona 2-hidroxilasa codificada
por
CYP93B1 sugirió que el cADN de ANFNS1 no era un cADN de cadena entera, careciendo de la parte correspondiente a aproximadamente 65 restos de aminoácidos de la metionina de iniciación. El cADN de ANFNS1 por lo tanto fue usado como una sonda para rastrear de nuevo la genoteca del cADN de dragón, para obtener el cADN (ANFNS2) que, según se creía, incluía la secuencia de aminoácidos de cadena entera. La proteína codificada por ANFNS2 obtenida en este documento exhibió una identidad del 53% respecto al nivel de aminoácidos con la flavanona 2-hidroxilasa codificada por regaliz CYP93B1. La secuencia de nucleótidos de ANFNS2 es la SEQ. ID. No. 1, y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de ahí es la SEQ. ID. No. 2.
CYP93B1 sugirió que el cADN de ANFNS1 no era un cADN de cadena entera, careciendo de la parte correspondiente a aproximadamente 65 restos de aminoácidos de la metionina de iniciación. El cADN de ANFNS1 por lo tanto fue usado como una sonda para rastrear de nuevo la genoteca del cADN de dragón, para obtener el cADN (ANFNS2) que, según se creía, incluía la secuencia de aminoácidos de cadena entera. La proteína codificada por ANFNS2 obtenida en este documento exhibió una identidad del 53% respecto al nivel de aminoácidos con la flavanona 2-hidroxilasa codificada por regaliz CYP93B1. La secuencia de nucleótidos de ANFNS2 es la SEQ. ID. No. 1, y la secuencia de aminoácidos deducida a partir de ahí es la SEQ. ID. No. 2.
Fue extraído ARN a partir de aproximadamente 2 g
de brotes de una variedad de torenia (nombre de la variedad
Sunrenive, Nº de Solicitud del Registro de Variedades: 7433 de
acuerdo con el Derecho de Semillas y Plantones, de Suntory Ltd.) y
fue obtenido el ARN de polyA+ con un Oligotex. El ARN de polyA+ fue
usado como plantilla para preparar una genoteca de cADN usando un
Kit de Síntesis de Genoteca de cADN Lambda ZAPII (Stratagene) por
el método recomendado por Stratagene como se menciona en el Ejemplo
1. La genoteca de cADN fue rastreada usando una mezcla del cADN de
CYP93B1 anteriormente mencionado y el cADN de ANFNS1 como sondas.
El rastreo y la detección de clones positivos fueron llevados a cabo
en condiciones poco rigurosas como se describe en el Ejemplo 1.
Un clon positivo fue obtenido, y fue denominado
TFNS5. Para determinar la secuencia de nucleótidos completa del
cADN de TFNS5, fue encontrado que la proteína codificada por el
cADN de TFNS5 exhibía una identidad del 52% respecto al nivel de
aminoácidos con la
flavanona-2-hidroxilasa codificada
por regaliz CYP93B1. Este cADN de TFNS5 también tenía una alta
identidad del 77% con la proteína codificada por ANFNS2, el cADN
derivado de dragón obtenido en el Ejemplo 1. La secuencia de
nucleótidos determinada es la SEQ. ID. No. 3, y la secuencia de
aminoácidos deducida a partir de ahí es la SEQ. ID. No. 4.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente experimento fue llevado a cabo para
detectar la actividad enzimática de la proteína codificada por
TFNS5, el cADN de torenia obtenido en el Ejemplo 2. Las partes del
exterior de la región traducida del gen fueron modificadas para
introducir los sitios de la enzima de restricción para preparar un
cebador sentido
(5'-AAATAGGATCCA
AGCatgGACACAGTCTTAA-3 ; subrayado = el sitio BamHI; letras minúsculas: codon de iniciación) (SEQ. ID. No. 5) y un cebador antisentido (5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGGG-3'; subrayado = el sitio XbaI; letras minúsculas: codon de terminación) (SEQ. ID. No. 6) fueron usados con la polimerasa KOD (Toyobo) para la reacción PCR. Las condiciones de la PCR fueron 98ºC durante un minuto, 20 ciclos (de 98ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 10 segundos, 74ºC durante 30 segundos), seguido de 74ºC durante 10 minutos.
AGCatgGACACAGTCTTAA-3 ; subrayado = el sitio BamHI; letras minúsculas: codon de iniciación) (SEQ. ID. No. 5) y un cebador antisentido (5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGGG-3'; subrayado = el sitio XbaI; letras minúsculas: codon de terminación) (SEQ. ID. No. 6) fueron usados con la polimerasa KOD (Toyobo) para la reacción PCR. Las condiciones de la PCR fueron 98ºC durante un minuto, 20 ciclos (de 98ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 10 segundos, 74ºC durante 30 segundos), seguido de 74ºC durante 10 minutos.
Después de la introducción del resultado del
producto de la PCR en el sitio EcoRV de pBluescriptII SK(-)
(Stratagene), fue digerido con las enzimas de restricción BamHI y
XbaI e introducido en los sitios de BamHI-XbaI del
vector de expresión de levadura pYES2 (Invitrogen). El plásmido
resultante entonces fue introducido en la levadura BJ2168 (Nihon
Gene). La actividad enzimática fue medida por el método descrito
por Akashi et al. (FEBS Lett., 431 (1998),
Akashi et al., pág. 287). Las células de levadura
transformadas fueron cultivadas en 20 ml de medio selectivo (6,7
mg/ml de base de nitrógeno de levadura sin amino-ácido (Difco), 20
mg/ml de glucosa, 30 \mug/ml de leucina, 20 \mug/ml de
triptófano y 5 mg/ml de ácido casamino), a 30ºC durante 24
horas.
Después de la recolección de las células de
levadura con centrifugación, las células de levadura cosechadas
fueron cultivadas a 30ºC durante 48 horas en un medio de expresión
(10 mg/ml de extracto de levadura, 10 mg/ml de peptona, 2 \mug/ml
de hemina, 20 mg/ml de galactosa). Después de la recuperación de
las células de levadura, fueron lavadas suspendiéndolas en agua y
recogiéndolas. Fueron usadas perlas de vidrio durante 10 minutos de
interrupción, después de lo cual las células fueron centrifugadas a
8000 g x durante 10 minutos. El sobrenadante además fue
centrifugado a 15.000 x g durante 10 minutos para obtener una
fracción de enzimas a granel.
Una mezcla de 15 \mug de
(R,S)-naringenina (disuelta en 30 \mul de
2-metoxietanol), 1 ml de solución de enzima a
granel y NADPH 1 mM (volumen de mezcla de reacción total: 1,05 ml)
se hizo reaccionar a 30ºC durante 2 horas. Después de la
finalización de la reacción por la adición de 30 \mul de ácido
acético, fue añadido 1 ml de acetato de etilo y fue mezclado con
esto. Después de la centrifugación, la capa de acetato de etilo fue
secada con un evaporador. El residuo fue disuelto en 100 \mul de
metanol y fue analizado por HPLC. El análisis fue llevado a cabo de
acuerdo con el método descrito por Akashi et al. El
tratamiento ácido implicó la disolución de la muestra secada por el
evaporador en 150 \mul de etanol que contenía 10% de ácido
clorhídrico, y fue agitado durante 30 minutos. Esto fue diluido con
1,3 ml de agua, fueron añadidos después 800 \mul de acetato de
etilo y fue mezclado con esto, y después de la centrifugación, la
capa de acetato de etilo fue recuperada. Esto entonces fue secado,
fue disuelto en 200 \mul de metanol y fue analizado por HPLC.
La levadura que expresa CYP93B1 de regaliz
produjo 2-hidroxinaringenina a partir de
naringenina, pero no proporcionó ninguna apigenina (Figura 1, A).
Sólo bajo el tratamiento ácido de la mezcla de reacción, la
apigenina fue proporcionada a partir de
2-hidroxinaringenina (Figura 1, B). Por el
contrario, la levadura que expresa TFNS5 de torenia proporcionó
apigenina a partir de naringenina sin tratamiento ácido de la mezcla
de reacción (Figura 1, C). Esto demostró que TFNS5 codifica una
flavona sintasa II.
Un fragmento de ADN de aproximadamente 1400 bp
obtenido digiriendo cADN de ANFNS2 con BamHI y SphI, un fragmento
de ADN de aproximadamente 350 bp obtenido digiriendo el mismo con
SphI y BamHI, y pYES2 digerido con BamHI y XhoI fue ligado para
obtener un plásmido, que entonces fue introducido en la levadura por
el mismo método que el descrito en el Ejemplo 3. Las células de
levadura recombinantes resultantes fueron usadas para medir la
actividad de síntesis de flavona por el mismo método que en el
Ejemplo 3. La levadura que expresa el ANFNS2 derivado de dragón
produjo la apigenina sin tratamiento ácido, demostrando así que
ANFNS2 codifica una flavona sintasa II.
\vskip1.000000\baselineskip
Un vector de expresión de planta fue construido
para introducir TFNS5, el cADN de torenia obtenido en el Ejemplo 2,
en plantas. Después de la digestión de pBE2113-Gus
(Plant Cell Physiol., 37 (1996), Mitsuhara et
al., pág. 49) con SacI, un kit de redondeo (Takara) fue usado
para redondear los extremos, después de lo cual fue insertado un
enlazador XhoI (Toyobo). El plásmido resultante entonces fue
digerido con HindIII y EcoRI, y fue recuperado un fragmento de ADN
de aproximadamente 3 kilobytes. El fragmento de ADN fue unido al
sitio de HindIII/EcoRI del vector binario pBINPLUS para preparar
pBE2113'. El vector pBINPLUS usado en este documento fue obtenido
modificando el vector binario Bin19 (Nucl. Acids Res.,
12 (1984), Bevan, pág. 8711), que se usa extensamente para
la introducción génica en plantas usando células de
Agrobacterium, de la manera publicada por van Engelen et
al. (Transgenic Research, 4 (1995), van Engelen
et al., pág. 288).
El cADN de TFNS5 fue cortado del vector SK(-)
por la división con BamHI/XhoI, y un fragmento de aproximadamente
1,7 kilobytes así obtenido fue ligado a los sitios de BamHI/XhoI
del vector binario anteriormente mencionado pBE2113'. La
construcción así obtenida, pSPB441, expresa el cADN de TFNS5 en la
dirección sentido en el control del promotor de virus del mosaico
de la coliflor de 35S que tiene una doble repetición de la secuencia
del potenciador (Plant cell Physiol., 37 (1996),
Mitsuhara et al., pág. 49).
\vskip1.000000\baselineskip
Una variedad de torenia (nombre de la variedad
Sunrenive, Nº de Solicitud de Registro de Variedades: 7433 de
acuerdo con el Derecho de Semillas y Plantones, de Suntory Ltd.)
fue transformada con el pSPB441 construido en el Ejemplo 5 anterior,
de acuerdo con el método de Aida et al. (Breeding
Science, 45 (1995), Aida et al., pág. 71). Más
del 95% de los transformantes obtenidos mostraron la alteración del
color de flor del púrpura oscuro de la cepa parenteral a un púrpura
claro. Los colores de los pétalos de la flor izquierdo y derecho de
cuatro pétalos de la flor fueron medidos. Aunque el color de los
pétalos de la flor de la cepa parenteral era el Número 89A de
acuerdo con la Carta de Colores de la Real Sociedad Hortícola, los
colores de los pétalos de la flor típicos de los transformantes
fueron 82C, 87, 87C, 88, 91A, etc. Estos resultados indicaron que
la introducción de TFNS5 en las plantas puede cambiar los colores de
la flor.
En los individuos transformados, la cantidad de
flavonas estaba en los rangos de 1/5 a 1/10 respecto al del
huésped, mientras que se redujo la cantidad de antocianinas a
aproximadamente 1/3 respecto a la del huésped. También se detectaron
las flavanonas (naringenina, eriodictiol y pentahidroxiflavanona)
que son las precursoras de la biosíntesis de flavona que no fueron
detectados en el huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pSPB441 fue introducido en una
variedad de petunia (nombre de la variedad: Revolution Violet Mini,
Nº de Solicitud de Registro de Variedades: 9217, de acuerdo con el
Derecho de Semillas y Plantones, de Suntory Ltd.) de acuerdo con el
método de Napoli et al. (Plant Cell, 2, (1990),
Napoli et al., pág. 279). Los cambios de colores de la flor
ocurrieron en dos de los transformantes resultantes, en los que los
colores de la flor eran más claros que los de la cepa parenteral.
El color de la flor de la cepa parenteral era del Número 88A de
acuerdo con la Carta de Colores de la Real Sociedad Hortícola,
mientras que era el 87A en los transformantes. También, aunque
ninguna flavona fue detectada en la cepa parenteral, una flavona,
la luteolina, fue detectada en las cepas transformadas.
\vskip1.000000\baselineskip
El método descrito en el Ejemplo 1 fue usado
para rastrear una genoteca de cADN preparada a partir de hojas de
perilla roja (Perilla frutescens) de acuerdo con el método de
Gong et al. (Plant Mol. Biol., 35, (1997), Gong
et al., pág. 915) utilizando \lambdagt10 (Stratagene) como
vector. El cultivo, la preparación de ADN y la subclonación de los
clones del bacteriófago resultante Nº. 3 fueron llevados a cabo de
acuerdo con el método de Gong et al. (Plant Mol.
Biol., 35, (1997), Gong et al., pág. 915), y la
secuencia de nucleótidos fue determinada y catalogada como SEQ. ID.
No. 7. La secuencia de aminoácidos deducida codificada por esta
secuencia de nucleótidos fue SEQ.ID. No 8. Esta secuencia de
aminoácidos mostró una identidad del 76% y 75% con TFNS5 y ANFNS2,
respectivamente. Ésta también mostró una identidad del 52% con
CYP93B1.
\vskip1.000000\baselineskip
El clon del bacteriófago Nº 3 obtenido en el
Ejemplo 8 fue usado como una plantilla para PCR por el método
descrito en el Ejemplo 3, usando el cebador Lambda Arm
(Stratagene). El fragmento de ADN amplificado fue subclonado en el
sitio de EcoRV de pBluescript KS(-). Un clon con el codon de
iniciación del cADN de flavona sintasa II de perilla en el lado del
sitio de SalI de pBluescript KS(-) fue seleccionado, y fue
denominado pFS3. La secuencia de nucleótidos del inserto de cADN de
pFS3 fue determinada, y fue llevada a cabo la PCR para confirmar la
ausencia de errores.
Un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8
kilobytes obtenido digiriendo pFS3 con SalI y XbaI fue ligado con
pYES2 digerido con XhoI y XbaI (Ejemplo 3) para obtener un plásmido
que fue denominado pYFS3, y esto fue introducido en BJ2168 de
levadura por el método descrito en el Ejemplo 3. Cuando la actividad
de flavona sintasa de esta levadura recombinante fue medida por el
método descrito en el Ejemplo 3, se confirmó la producción de
apigenina a partir de naringenina, indicando que el cADN del clon
del bacteriófago de perilla Nº 3 codificaba una proteína con
actividad de flavona sintasa II.
\vskip1.000000\baselineskip
Es posible cambiar los colores de las flores
uniendo el cADN de la invención a un vector de expresión de planta
apropiado e introduciéndolo en plantas que expresan o inhiben la
expresión de flavona sintasas. Además, expresando los genes de
flavona sintasa no sólo en pétalos sino también en plantas enteras
o en sus órganos apropiados, es posible aumentar la resistencia
frente a microorganismos de plantas o mejorar la capacidad fijadora
del nitrógeno de legumbres promoviendo la asociación con los
microorganismos de la rizosfera, así como mejorar los efectos
protectores de las plantas contra los rayos ultravioletas y la
luz.
<110> SUNTORY LIMITED
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen que codifica para enzimas
sintetizadoras de flavonas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 993009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene actividad para convertir
directamente flavanona en flavona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 506
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Antirrhinum majus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de una
proteína que tiene actividad para convertir directamente flavanona
en flavona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1730
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Torenia hybrida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene actividad para convertir
directamente flavanona en flavona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Torenia hybrida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de una
proteína que tiene actividad para convertir directamente flavanona
en flavona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1770
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perilla frutescens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene actividad para convertir
directamente flavanona en flavona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211>
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Perilla frutescens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de una
proteína que tiene actividad para convertir directamente flavanona
en flavona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Un gen que codifica una proteína con
actividad de síntesis de flavonas a partir de la flavanonas, en el
que la proteína:
- (1)
- tiene la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No. 2; o
- (2)
- tiene una identidad de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ. ID. No. 2.
2. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es de al menos el 80%
3. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que el nivel de identidad es de al menos el 90%.
4. Un gen de acuerdo con la reivindicación 1,
que tiene una secuencia nucleotídica indicada en SEQ ID No:1.
5. Un vector que comprende un gen de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un huésped transformado que comprende un
vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una proteína codificada por un gen de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un método para producir una proteína con
actividad de síntesis de flavona, que se caracteriza por
cultivar o hacer crecer un huésped de acuerdo con la reivindicación
6 y recuperar dicha proteína de dicho huésped.
9. Una planta transgénica que comprende un gen
artificialmente introducido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, o la progenie de dicha planta o su tejido,
cuya progenie comprende dicho gen de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
10. Una flor cortada de la planta transgénica o
su progenie de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende dicho
gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11. Un método para cambiar las cantidades y/o
las composiciones de flavonoides usando un gen de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
12. Un método para cambiar la cantidad de una
flavona usando un gen de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
13. Un método para cambiar el color de una flor
usando un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
14. Un método para volver más azul el color de
una flor usando un gen de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
15. Un método para volver más rojo el color de
una flor usando un gen de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
16. Un método para cambiar la fotosensibilidad
de una planta usando un gen de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
17. Un método para controlar la interacción
entre una planta y microorganismos usando un gen de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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