KR100783521B1 - 벼로부터 유래한 플라본 합성효소, 그의 유전자 및 그들의제조방법과 이들을 이용하여 미생물로부터 아피제닌을 대량생산하는 방법 - Google Patents

벼로부터 유래한 플라본 합성효소, 그의 유전자 및 그들의제조방법과 이들을 이용하여 미생물로부터 아피제닌을 대량생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 (Oriza sativa)로부터 분리한 플라본 합성효소 (flavone synthase; FNS), 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 상기 플라본 합성효소를 발현하는 미생물을 이용한 아피제닌 (apigenin)의 생산 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 나린제닌 (naringenin)으로부터 아피제닌을 생산하는 플라본 합성효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법, 상기 플라본 합성효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 대장균, 그리고 상기 형질전환 대장균을 이용하여 아피제닌을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 플라본 합성효소 유전자 등을 이용한 아피제닌의 생산 방법은 기질로부터 부가가치가 높은 대사산물을 대량 얻을 수 있는 매우 경제적이고 효과적인 방법으로 산업적으로 널리 적용될 수 있다.
플라본 합성효소, 플라본 합성효소 유전자, 아피제닌, 나린제닌, 아피제닌의 대량 생산방법

Description

벼로부터 유래한 플라본 합성효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 이들을 이용하여 미생물로부터 아피제닌을 대량 생산하는 방법 {Flavone synthase derived from Oriza sativa, flavone synthase gene, methods for preparing the same and process for producing apigenin in microorganism by using the same}
도 1 은 본 발명의 플라본 합성효소에 의하여 기질인 나린제닌으로부터 아피제닌이 합성되는 과정을 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 벼 (Oriza sativa)로부터 분리한 플라본 합성효소 (flavone synthase; 이하, "FNS"라고 약칭함), 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 상기 플라본 합성효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 대장균, 그리고 상기 형질전환 대장균을 이용한 나린제닌 (naringenin)으로부터 아피제닌 (apigenin)의 대량 생산방법에 관한 것이다.
플라본 합성효소 (flavone synthase)는 C2와 C3 위치에 이중결합을 이루게 하여 플라바논 (flavanone)으로부터 플라본을 합성하는 단백질 효소이다. 이 플라본 합성효소는 플라본의 일종인 아피제닌 (apigenin)을 생산하는 데 관여하고, 이로 인해 과일과 야채 등에는 아피제닌이 풍부하게 된다.
아피제닌은 세포의 사멸 (apoptosis)을 유도하여 암세포의 발현을 억제하는 기능을 가지는 대사산물이다. 또한 이는 항산화 활성 (antioxidant activity) 및 항바이러스 활성을 나타내는데, 특히 헤르페스 감염증의 치료에 사용되는 항바이러스 제제인 어사이클로비르 (acyclovir)의 항바이러스 활성을 증가시키고 면역결핍 바이러스 (HIV-1)의 활동 (activation)을 막는 작용을 한다.
그러나 아피제닌은 그 생산 비용이 많이 들고 그 가격이 매우 높은 단점이 있었다. 실제로 아피제닌의 전구체가 되는 기질인 나린제닌 (naringenin)은 1 g 에 가격이 불과 5.00 달러이지만, 최종적으로 합성된 아피제닌은 1 g 에 가격이 80.00 달러에 이르는 굉장히 값비싼 의약품이 된다. 그 이유는 플라바논의 C2와 C3 위치에 이중 결합을 형성시키는 과정이 화학적으로 매우 어려운 방법이기 때문이다. 따라서, 아피제닌을 유전자 재조합 기술 또는 생물전환 공정을 이용하여 저렴한 기질로부터 대량 생산하는 것은 경제적 가치가 높아 산업적으로 매우 필요하다.
더 나아가 이러한 기술은 생물학적 방법으로 합성하는 의약품들의 개발이나 대장균에서의 플라보노이드 경로 시스템 (flavonoid pathway system)에 관한 새로운 모델을 제시할 수 있어 학문적으로도 매우 큰 의미를 가진다.
이에 본 발명자들은 생물 전환 과정으로 아피제닌을 대량 생산하는 기술을 개발하기 위하여 계속 노력한 결과, 벼 (Oriza sativa)로부터 플라본 합성효소 (flavone synthase) 유전자를 분리하고 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물을 제작한 다음, 이들을 이용하여 미생물에서 상기 플라본 합성효소를 대량 생산하고, 다시 이 과정을 통하여 나린제닌으로부터 아피제닌 (apigenin)을 대량 생산하며, 그 결과 얻은 아피제닌의 화학적 구조 및 약학적 활성 등이 기존 아피제닌과 일치하는 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 아피제닌을 생산하는 플라본 합성효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 이들을 이용한 아피제닌의 대량 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 (Oriza sativa)로부터 분리하고, 서열번호 3의 염기 서열을 일부 또는 전부 포함하는 플라본 합성효소 (flavone synthase; FNS) 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 상기 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;
(2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도한 다음; 및
(3) 상기 효소 단백질을 분리 정제하는; 과정으로 이루어진 플라본 합성효소의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 상기 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;
(2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도한 다음; 및
(3) 효소의 기질을 배지에 첨가하는; 과정으로 이루어진 아피제닌의 대량 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 벼 (Oriza sativa)로부터 분리한 새로운 플라본 합성효소 (flavone synthase; FNS) 유전자를 제공한다.
본 발명의 플라본 합성효소 유전자는 서열번호 3의 염기 서열을 일부 또는 전부 포함하는 것을 특징으로 한다 (서열목록 참조).
또한, 본 발명은 상기 플라본 합성효소 유전자를 얻는 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 벼로부터 분리한 RNA 로부터 얻은 역전사체를 주형으로 사용하고, 벼 유전체의 게놈 정보로 얻은 염기 서열을 기초로 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머로 중합효소 연쇄반응을 수행하는 과정으로 상기 플라본 합성효소 유전자를 얻는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 클로닝 벡 터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 기존 클로닝 벡터인 pGEM-T easy 에 상기 플라본 합성효소 유전자를 삽입한 재조합 클로닝 벡터 pGEM-T easy(flavone synthase)를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 (Oriza sativa)로부터 분리한 새로운 플라본 합성효소 (flavone synthase; FNS)를 제공한다.
본 발명의 플라본 합성효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 일부 또는 전부 포함하는 것을 특징으로 한다 (서열목록 참조).
또한, 본 발명은 상기 플라본 합성효소 유전자를 포함하고 이를 미생물에서 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 기존 발현 벡터인 pGEX 5X-3 에 상기 플라본 합성효소 유전자를 삽입한 재조합 발현 벡터 pGEX 5X-3(flavone synthase)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 미생물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터 pGEX 5X-3(flavone synthase)를 대장균 BL21 균주에 형질전환시킨 대장균 형질전환체 Escherichia coli BL21 pGEX 5X-3(flavone synthase)를 제공한다 (기탁번호 : KACC 95051P).
또한, 본 발명은 상기 플라본 합성효소를 생산하는 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (1) 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하고; (2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도한 다음; 및 (3) 단백질 친화 크로마토그래피 등으로 분리 정제하는; 과정으로 이루어진 상기 플라본 합성효소를 얻 는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 플라본 합성효소를 제조하는 과정을 통하여 형질전환 미생물에서 원료 물질을 유용한 대사산물로 전환시키는 생산방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 플라본 합성효소를 발현하는 미생물을 이용하여 기질로부터 아피제닌을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 (1) 상기 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고; (2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도한 다음; 및 (3) 상기 플라본 합성효소의 기질이 되는 나린제닌을 배지에 첨가하는; 과정으로 이루어진 미생물로부터 직접 아피제닌을 대량 생산하는 방법을 제공한다.
이 때, 상기 플라본 합성효소를 포함하는 재조합 발현 벡터로는 상기 재조합 발현 벡터 pGEX 5X-3(flavone synthase)를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 미생물로는 대장균 등을 사용하는 것이 바람직하고, 대장균 BL21 균주를 사용하는 것은 더욱 바람직하다. 또한, 상기 형질전환 미생물로는 대장균 Escherichia coli BL21 pGEX 5X-3(flavone synthase) 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
도 1 및 표 1 에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 플라본 합성효소에 의하여 기질인 나린제닌으로부터 아피제닌이 합성되는 과정을 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 프로톤 핵자기 공명분석 (NMR)을 실시한 결과, 생성물이 아피제닌과 일치하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 플라본 합성효소 유전자 등을 이용하여 아피제닌을 대량 생산하는 방법은 나린제닌으로부터 부가가치가 높은 아피제닌을 대량 얻을 수 있는 매우 경제적이고 효과적인 방법으로 널리 적용될 수 있다.
이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터들 및 이들을 이용한 생산방법 등을 응용하여 다양한 생물전환 공정을 진행할 수 있다. 이 때 사용되는 기질은 상기 나린제닌을 포함하여 상기 플라본 합성효소의 작용으로 인해 유용한 대사산물로 전환되는 모든 종류의 원료 물질 등을 포함하고, 생성되는 대사산물은 상기 아피제닌을 포함하여 상기 플라본 합성효소의 작용이 필요한 모든 종류의 대사 산물을 포함할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 벼 ( Oriza sativa )로부터 유래한 플라본 합성효소 유전자의 분리
본 발명은 새로운 플라본 합성효소 (flavone synthase; FNS)의 유전자를 얻기 위하여, 20일 동안 키운 벼로부터 전체 RNA 를 분리하고, 올리고 dT (oligo dT)를 프라이머 (primer)로 사용하여 역전사 반응을 실시하였다. 그 결과 얻은 역전사체를 주형으로 사용하고, 벼 유전체 (genome)에서 얻은 염기서열을 기초로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 제작하고 이 프라이머들을 사용하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 다음과 같이 실시하였다.
먼저 상기 역전사체와 프라이머들을 Taq DNA 폴리머라제와 함께 혼합하고 중합효소 연쇄반응을 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분의 과정을 40회 반복하여 1.1 kbp 크기에 해당하는 플라본 합성효소의 구조 유전자를 대량 증폭시켰다. 여기서 증폭된 DNA 조각은 클로닝 벡터인 pGEM-T easy 로 삽입하여 재조합 클로닝 벡터 pGEM-T easy(flavone synthase)를 제작하고 그의 염기서열 및 이로부터 유추한 아미노산 서열을 결정하였다.
실시예 2. 플라본 합성효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터의 제작
본 발명은 상기 플라본 합성효소를 생산하는 재조합 발현 벡터를 제작하기 위하여, 상기 실시예 1에서 클로닝한 플라본 합성효소 유전자를 대장균 발현 벡터인 pGEX 5X-3 으로 옮겼다. 구체적으로, 대장균 발현 벡터 pGEM-T easy 에 포함된 플라본 합성효소의 유전자를 pfu Taq 폴리머라제를 사용한 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭시켰다. 여기서 얻은 PCR 산물은 제한효소 EcoR I 으로 절단하고 미리 제한효소 EcoR I 및 Sma I 으로 절단해 둔 발현 벡터 pGEX 5X-3 에 라이게이션하여 재조합 발현 벡터 pGEX 5X-3(flavone synthase)를 제작하였다. 이와 같이 얻은 플라본 합성효소의 유전자가 포함되어 있는 재조합 발현 벡터는 대장균 BL21 균주에 형질전환시켰다.
상기 대장균 형질전환체를 얻기 위하여, 앰피실린 (ampicillin)을 포함하는 LB 배지를 사용하여 대장균을 선발하고, 이 선발된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여 제한효소 EcoR I 및 Xho I 로 절단하고 중합효소 연쇄반응도 실시하여 상 기 플라본 합성효소 유전자의 유무를 확인하였다.
본 발명의 벼 (Oriza sativa)로부터 유래한 플라본 합성효소의 유전자를 포함하는 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균 균주는 Escherichia coli BL21 (flavone synthase)라고 명명하고, 농업생명공학연구원에 2006년 03월 28일자로 기탁하였다 (기탁번호 : KACC 95051P).
실시예 3. 플라본 합성효소의 발현 및 정제
(1) 플라본 합성효소 유전자의 발현
본 발명은 플라본 합성효소 유전자를 발현시키기 위하여, 실시예 2 에서 얻은 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 대장균 형질전환체를 전날 앰피실린이 들어있는 LB 배지 (LB/Amp 배지)에 2 ㎖ 접종하고, 24시간 경과한 다음 상기 2 ㎖ 배지 중 300 ㎕ 를 새로운 LB/Amp 배지 50 ㎖에 다시 접종하고 37℃에서 진탕배양기 (shaking incubator)를 사용하여 배양하였다. 그 다음, 600 ㎚ 에서 흡광도가 0.7 정도 되는 세포 밀도에 이르면 IPTG 를 0.1 mM 이 되도록 넣어주고, 28℃에서 세포를 배양하여 5시간 정도 효소 단백질의 발현을 유도하였다.
(2) 플라본 합성효소의 분리, 정제
상기 실시예에서 발현시킨 플라본 합성효소를 분리, 정제하기 위하여, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 태그 시스템 (glutathione S-transferase tagging system)을 이용하였다. 구체적으로, 효소 단백질의 발현을 유도시킨 세포 배양액을 3,200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 세포 펠렛 (pellet)을 얻어 결합 완충용액 (binding buffer) 6 ㎖에 희석시킨 다음 파쇄기 (sonicator)를 사용하여 세포를 용해시키고 이로부터 발현된 효소 단백질들을 분리하였다. 이와 같이 얻은 단백질 조추출액은 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 미리 태그되어 있는 컬럼을 이용하여 다시 순수하게 정제되었다.
실시예 4. 플라본 합성효소 유전자의 발현 및 효소 특성 조사
(1) 플라본 합성효소 유전자의 발현 조사
본 발명은 플라본 합성효소 유전자의 발현 정도를 조사하기 위하여, 상기 플라본 합성효소를 포함하는 대장균 형질전환체를 배양하고 IPTG 를 첨가하기 전 및 IPTG 를 첨가하여 발현 유도한 후 각 세포 파쇄액에서 얻은 단백질을 이용하여 SDS 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동을 실시하고 이로부터 플라본 합성효소가 발현되는지 여부를 확인하였다.
(2) 플라본 합성효소의 기질과의 반응 조사
본 발명은 상기에서 얻은 플라본 합성효소의 특성을 조사하기 위하여 효소 기질과의 반응을 다음과 같이 조사하였다. 먼저 정제된 단백질에 아스코베이트 (ascorbate) 100 μM, FeSO4 10 μM, 카탈라제 (catalase) 100 ㎎/㎖, 옥소글루타레이트 (oxoglutarate) 100 μM, 트리스/HCl 완충용액 (pH 8.0) 및 기질인 나린제린 (naringenin) 100 μM 을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이와 같이 얻은 반응물은 에틸 아세테이트를 사용하여 두 번 추출하고, 이 추출액을 다시 건조시킨 다음 메탄올에 녹여 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 분석하였다.
실시예 5. 유전자 재조합 방법을 이용한 대장균으로부터 아피제닌의 생산
본 발명은 플라본 합성효소 유전자를 포함하는 대장균 형질전환체를 이용하여 나린제린으로부터 아피제닌을 생산하기 위하여, 상기 실시예들의 과정에 따라 단백질의 발현을 유도하였다. 상기에서 플라본 합성효소가 발현된 세포 파쇄액은 3,200 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 세포 상등액은 버린 다음 세포 펠렛은 새로운 LB 배지에 희석하고 기질인 나린제린의 최종 농도는 60 μM, 아스코베이트의 최종 농도는 100 μM, FeSO4 의 최종 농도는 10 μM가 되도록 맞추어 28℃에서 15시간 정도 반응시켰다. 이와 같이 얻은 반응물은 동량의 에틸 아세테이트를 사용하여 두 번 추출하고, 이 추출액을 다시 진공 건조시킨 다음 메탄올에 녹여 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 분석하였다.
도 1 은 본 발명의 플라본 합성효소에 의하여 기질인 나린제닌으로부터 아피제닌이 합성되는 과정을 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
표 1 은 프로톤 핵자기 공명분석 (NMR)을 실시하여 생성물이 아피제닌의 과 일치하는 것을 보여주는 결과이다.
위치 1H 화학적 전이(Chemical shift)
아피제닌(DMSO-d6) 생성물(DMSO-d6)
3 6.68 (s) 6.73 (s)
6 6.20 (d, 2.0) 6.12 (s, br)
8 6.44 (d, 2.0) 6.40 (s, br)
2′/6′ 7.92 (d 9.0) 7.90 (d, 8.8)
3′/5′ 6.90 (d 9.0) 5.91 (d, 8.9)
상술한 바와 같이, 본 발명은 나린제닌으로부터 아피제닌을 생산하는 플라본 합성효소, 그의 유전자, 그의 염기서열 및 그들의 제조방법, 상기 플라본 합성효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 대장균 그리고 상기 형질전환 대장균을 이용하여 아피제닌을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 플라본 합성효소 유전자 등을 이용한 아피제닌을 대량 생산하는 과정은 기질로부터 부가가치가 높은 대사산물을 대량 얻을 수 있는 매우 경제적이고 효과적인 방법으로 새로운 의약품 등의 개발에 널리 적용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는, 벼 (Oriza sativa)로부터 분리한 플라본 합성효소 (flavone synthase; FNS).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항의 플라본 합성효소와 기질인 나린제닌을 반응시키는 단계를 포함하는 아피제닌 생산방법.
  7. 삭제
KR1020060040568A 2006-05-04 2006-05-04 벼로부터 유래한 플라본 합성효소, 그의 유전자 및 그들의제조방법과 이들을 이용하여 미생물로부터 아피제닌을 대량생산하는 방법 KR100783521B1 (ko)

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