JP6272485B2 - 酵素法によるレバウジオシドmの製造方法 - Google Patents
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Description
(2)2種類の制限酵素による切断、ライゲーションにより各遺伝子断片を発現ベクターpET30aに対応する制限酵素切断部位に挿入して、各遺伝子をT7プロモーターの制御下に置くステップ、
(3)組換えプラスミドを大腸菌BL21(DE3)中に導入して形質転換させ、IPTGにより標的タンパクの発現を誘導して、UGT−AまたはUGT−Bの組換え大腸菌発現菌株を得るステップ。
配列番号1および配列番号2に基づいて、UGT−A遺伝子断片を遺伝子合成し、両端にそれぞれNdeIおよびBamHI制限酵素切断部位を加え、pUC57ベクター(蘇州金唯智生物技術有限公司)にライゲーションした。UGT遺伝子断片を制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで切断し、断片を回収して精製し、T4リガーゼを加えて断片をpET30aの対応する制限酵素切断部位にライゲーションし、BL21(DE3)菌株を形質転換させた。
実施例1で作製されたUGT−Aの組換え細胞を氷浴において超音波により破砕し、破砕液を遠心分離し(8,000rpm、10min)、上清液を収集して24h凍結乾燥して、UGT−Aの凍結乾燥粉末を獲得した。
配列番号3および配列番号4に基づいて、UGT−B遺伝子断片を遺伝子合成し、両端にそれぞれNdeIおよびBamHI制限酵素切断部位を加え、pUC57ベクター(蘇州金唯智生物技術有限公司)にライゲーションした。UGT遺伝子断片を制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで切断し、断片を回収して精製し、T4リガーゼを加えて断片をpET30aの対応する制限酵素切断部位にライゲーションし、BL21(DE3)菌株を形質転換させた。
実施例3で作製されたUGT−Bの組換え細胞を氷浴において超音波により破砕し、破砕液を遠心分離し(8,000rpm、10min)、上清液を収集して24h凍結乾燥して、UGT−Bの凍結乾燥粉末を獲得した。
本実施例においては、実施例2の方法に従って作製されたUGT−Aの凍結乾燥粉末を触媒としてRebMの合成に用いた。
本実施例においては、実施例2の方法に従って作製されたUGT−Aの凍結乾燥粉末および実施例4の方法に従って作製されたUGT−Bの凍結乾燥粉末を触媒としてRebMの合成に用いた。
本実施例においては、スクロース、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来するスクロースシンターゼ(以下、AtSUS1と略称する)およびUDPからなるUDP−グルコース再生系をグルコシルドナーとして使用した。
本実施例においては、スクロース、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来するスクロースシンターゼ(以下、AtSUS1と略称する)およびUDPからなるUDP−グルコース再生系をグルコシルドナーとして使用した。
本実施例においては、実施例1で作製されたUGT−Aを含む組換え細胞を触媒としてRebMの合成に用いた。
0.05mol/Lのリン酸緩衝液(pH7.0)150mL、UDPグルコース0.51g、トルエン3mL、RebA0.145gを含有する反応系に、UGT−AおよびUGT−Bをそれぞれ含有する全細胞10gを加え、均一に混合した後に30℃の水浴に配置し、160rpmで2h撹拌して反応させた。反応終了後、反応液500μlを取って等体積の無水メタノールを加えて均一に混合し、8,000rpmで10min遠心分離し、上清液濾過膜を取った後に高速液体クロマトグラフィー(クロマトグラフィー条件:クロマトグラフィーカラム:Agilent eclipse sb−C18 4.6×250mm、検出波長:210nm、移動相:1%ギ酸水溶液:メタノール=20%:80%、流速:1.0mL/min、カラム温度:25℃)で測定した。RebAの転化率は40%以上であった。遠心分離、上清のシリカゲル樹脂による分離、結晶などの後処理により精製した後、RebM0.05gを得、純度は95%を超えた。
レバウジオシドAまたはレバウジオシドDを基質とし、グルコシルドナーの存在下で、UDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/またはUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞を触媒として、前記基質を反応させてレバウジオシドMを生成することを特徴とする、酵素法によるレバウジオシドMの製造方法。
グルコシルドナーが、UDP−グルコースまたはスクロース、スクロースシンターゼおよびUDPからなるUDP−グルコース再生系であることを特徴とする、実施形態1に記載の方法。
UDP−グルコシルトランスフェラーゼが、ステビアに由来するUGT−Aおよび/または水稲に由来するUGT−Bであることを特徴とする、実施形態1に記載の方法。
UGT−Aのアミノ酸配列が、配列番号2と少なくとも80%の同一性を有することを特徴とする、実施形態3に記載の方法。
UGT−Aのアミノ酸配列が、配列番号2と少なくとも90%の同一性を有することを特徴とする、実施形態4に記載の方法。
UGT−Bのアミノ酸配列が、配列番号4と少なくとも80%の同一性を有することを特徴とする、実施形態3に記載の方法。
UGT−Bのアミノ酸配列が、配列番号4と少なくとも90%の同一性を有することを特徴とする、実施形態6に記載の方法。
反応を温度25〜35℃およびpH6.5〜7.5の水系中で行わせることを特徴とする、実施形態1に記載の方法。
反応をpH7.0のリン酸緩衝液中で行わせることを特徴とする、実施形態8に記載の方法。
UDP−グルコシルトランスフェラーゼを含有する組換え細胞を触媒とし、反応系に体積濃度が1〜3%のトルエンをさらに含有することを特徴とする、実施形態8に記載の方法。
反応に用いられる全ての原料を反応装置に加え、均一に混合した後、設定された温度下に配置し、撹拌して反応させるように実施することを特徴とする、実施形態8に記載の方法。
組換え細胞が微生物細胞であることを特徴とする、実施形態1に記載の方法。
微生物が、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア酵母であることを特徴とする、実施形態12に記載の方法。
基質がレバウジオシドAであり、UDP−グルコシルトランスフェラーゼがステビアに由来するUGT−Aと水稲に由来するUGT−Bとの混合物であり、前記ステビアに由来するUGT−Aのアミノ酸配列が、配列番号2と少なくとも80%の同一性を有し、前記水稲に由来するUGT−Bのアミノ酸配列が、配列番号4と少なくとも80%の同一性を有することを特徴とする、実施形態1〜13のいずれか一項に記載の方法。
混合物中で、ステビアに由来するUGT−Aと水稲に由来するUGT−Bとの重量比が1:0.8〜1.2であることを特徴とする、実施形態14に記載の方法。
基質がレバウジオシドDであり、UDP−グルコシルトランスフェラーゼがステビアに由来するUGT−Aであり、前記ステビアに由来するUGT−Aのアミノ酸配列が配列番号2と少なくとも80%の同一性を有することを特徴とする、実施形態1〜13のいずれか一項に記載の方法。
Claims (17)
- レバウジオシドMの製造方法であって、
UDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/またはUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で、レバウジオシドDをグルコシルドナーと反応させて、レバウジオシドMを得る工程を含み、
前記UDP−グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
2時間の反応後に、レバウジオシドDの少なくとも40%がレバウジオシドMに転化される、方法。 - 前記グルコシルドナーが、UDP−グルコース、またはスクロース、スクロースシンターゼおよびUDPを含むUDP−グルコース再生系である、請求項1に記載の方法。
- 前記UDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/またはUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下でレバウジオシドDをグルコシルドナーと反応させる工程が、25℃〜35℃の温度および6.5〜7.5のpHにおいて水系中で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記水系がpH7.0のリン酸緩衝液を含む、請求項3に記載の方法。
- レバウジオシドDのグルコシルドナーとの反応が、前記UDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で行われ、前記水系が、1〜3体積%の濃度でトルエンをさらに含有する、請求項3に記載の方法。
- 前記組換え細胞が微生物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物が、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよびピキア酵母からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- レバウジオシドMの製造方法であって、
a.第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/または第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で、レバウジオシドAをグルコシルドナーと反応させて、レバウジオシドDを得る、および
b.第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/または第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で、レバウジオシドDをグルコシルドナーと反応させて、レバウジオシドMを得る、各工程を含み、
前記第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号4に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、および前記第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼは、配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
2時間の反応後に、レバウジオシドAの少なくとも40%がレバウジオシドMに転化される、方法。 - 前記第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび前記第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼが、1:0.8〜1:1.2の重量比で存在する、請求項8に記載の方法。
- 前記グルコシルドナーが、UDP−グルコース、またはスクロース、スクロースシンターゼおよびUDPを含むUDP−グルコース再生系である、請求項8に記載の方法。
- 前記第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/または第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下でレバウジオシドAをグルコシルドナーと反応させる工程が、25℃〜35℃の温度および6.5〜7.5のpHにおいて水系中で行われる、請求項8に記載の方法。
- 前記第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼおよび/または第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下でレバウジオシドDをグルコシルドナーと反応させる工程が、25℃〜35℃の温度および6.5〜7.5のpHにおいて水系中で行われる、請求項8に記載の方法。
- 前記水系がpH7.0のリン酸緩衝液を含む、請求項12に記載の方法。
- レバウジオシドAのグルコシルドナーとの反応が、前記第1のUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で行われ、前記水系が、1〜3体積%の濃度でトルエンをさらに含有する、請求項8に記載の方法。
- レバウジオシドDのグルコシルドナーとの反応が、前記第2のUDP−グルコシルトランスフェラーゼを含む組換え細胞の存在下で行われ、前記水系が、1〜3体積%の濃度でトルエンをさらに含有する、請求項14に記載の方法。
- 前記組換え細胞が微生物細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記微生物が、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよびピキア酵母からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
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