WO2000044907A1 - Gene codant pour une flavone synthase - Google Patents

Description

明 細 書 フ ラボン合成酵素をコー ドする遺伝子 発明の分野

本発明は植物において、 花色、 紫外線からの保護、 微生物との共 生などに影響をおよぼすフ ラボンの生合成を、 遺伝子工学の技術を 用いて、 制御、 利用するこ とに関する ものである。 より詳しく はフ ラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質をコ一 ド する遺伝子およびその利用に関する ものである。 背景技術

精神的豊かさが求められる今日、 多様な花色の花々は人々の心に 潤いを与える ものの 1 つである。 また、 人口増加に伴ない必要な食 料増産のための 1 つの手段と して、 微生物との共生促進による植物 の成長促進や、 窒素固定を行なう根粒菌の増加、 その結果と して生 じる土壌窒素含量増加による植物生産性の向上が考えられる。 より 環境にやさ しい農業を実現するためには、 無農薬、 減農薬が好まれ 、 上記のような生物学的手段による土壌の改良や、 植物自身の抗菌 性の向上が必要とされる。 またオゾン層破壊から植物を保護する手 段と して紫外線に対する防御機能の高い植物が期待されている。

フラボノ ィ ドは、 C6- C3- C6の炭素骨格を持った一群の化合物の総 称で、 植物細胞に広く 分布している。 フラボノ ィ ドの機能と しては 、 昆虫などのポ リネーターを呼んだり、 紫外線から植物体を保護し たり、 土壌微生物との相互作用にかかわつたりするこ とが知られて いる （BioEssays, 16 (1994) Koes et al. , .123 ； Trends in P lant Science, 1 (1997) Shirley, B. W.， p.377 ) 。 フラボノ ィ ドのうちフラボンは、 特にマメ科においては、 根粒菌 との共生の初期過程にかかわるなど、 微生物との相互作用を行なう 上で重要である （Plant Cell, 7 (1995) Dixon and Paiva, p.1085 ； Annu. Rev. Phytopathol. , 33 (1995) Spaink, p.345 ) 。 また 、 花弁におけるフラボンは、 昆虫に認識される役割や、 アン ト シァ ニンと複合体を形成するコ ピグメ ン ト と して、 働いている （現代化 学、 （ 1998年 5 月） 本田と斉藤、 ρ· 25 ; Prog. Chem. Org. Natl. Prod.， 52 (1987) Goto, T. , p.114 ) 。 フラボンは、 アン ト シァニ ンと複合体を形成すると、 アン ト シァニンの吸収極大値を長波長側 にシフ 卜させる、 すなわち青く するこ とが知られている。

フラボノ ィ ドの生合成経路についてはよ く研究されており （Plan t Cell, 7 (1995) Holton and Cornish, p.1071 ) 、 例えばァン ト シァニジン 3 - ダルコシ ドゃフラボノ ールの生合成にかかわる酵素 の遺伝子はすべて単離されている。 しかしながら、 フラボンの生合 成にかかわる遺伝子はいまだに単離されていない。 フラボンを合成 する酵素には、 2 - ォキソグルタール酸に依存するジォキシゲナ一 ゼフ ア ミ リ ーに属する酵素 （フラボン合成酵素 I)とチ 卜 ク ローム P4 50フ ア ミ リ ーに属するモノォキシゲナーゼ酵素 （フラボン合成酵素 II) があることが知られている。 これらの酵素は構造においてもホ モロ ジ一がなく、 全く別の酵素である。

パセ リ においては、 2-ォキソグルタール酸に依存性のジォキシゲ ナーゼ力'、 フラバノ ンの一種であるナリ ンゲニンからフラボンの一 種であるァピゲニンを生成する反応を触媒すると報告されている （ Z. Naturf orsch. , 36c (1981) Britsch et al.， p.742 ； Arch. Bio chem. Biophys. , 282 (1990) Britsch, p.152)。 もう一種のフラボ ン合成酵素 IIは、 キンギヨ ソゥ （Z. Naturforsch.， 36c (1981) Sto tz and Forkmann, p.737) 及びダイズ (Z. Naturforsch. , 42c (198 7) Kochs and Gr isebach, p.343 ； Planta, 171 (1987) Kochs et al. , .519 ) での存在が知られている。 また、 近年ガーベラで遺 伝子座と花弁のフラボン合成酵素 II活性に相関があることが報告さ れている (Phy tochemistry, 49 (1998) Martens and Forkmann, p. 1953) 。 しかし、 これらのフラボン合成酵素 I あるいは Πの遺伝子 が単離されたり、 フラボン合成酵素 I Iが純粋に精製された例はない o

マメ科カ ンゾゥ （Glycyrrhiza echinata) の培養細胞をエリ シタ 一処理した際に誘導される リ コ ジオン合成活性を持つチ ト ク ローム P450タ ンパク質の性質が調べられている。 このタ ンパク質によ って 5 -デ才キシフラバノ ンである リ クイ リ チゲニンの 2位が水酸化され 、 続いて非酵素的なへミ アセタール開環が起こ り、 リ コジオンを生 成すると考えられた （Plant Physiol. , 105 (1994) Otani et al. , p.1427 ：) 。 リ コ ジォン合成酵素をク ロ一ニングするために、 ェリ シ夕一処理したカ ンゾゥ培養細胞から cDNAラィブラ リ 一が作製され 、 チ ト ク ローム P450をコー ドする遺伝子断片が 8種ク ローニングさ れている （Plant Science, 126 (1997) Akashi et al. , .39 ) 。

このうち当時機能が未知であつたチ ト ク ローム P450をコ一ドする 2種類の完全長 cDNAが取得された。 すなわち、 CYPGe- 3 (チ ト ク 口 ーム P450番号 CYP81E1 ) 及び CYPGe- 5 (チ ト ク ローム P450番号 CYP9 3B1 、 以下 CYP93B1 と表記） である （Plant Physiol. , 115 (1997)

Akashi et al. , p.1288) 。 さ らに、 昆虫の培養細胞を用いる系で CYP93B1 cDNAを発現させることにより、 この遺伝子に由来する蛋白 質はフ ラノく'ノ ンの 1種である リ クイ リ チゲニンから リ コ ジオンを、 また同じ く フラバノ ンの 1 種ナリ ンゲニンから 2 — ヒ ドロキシナリ ンゲニンを合成する反応を触媒するこ とが示された。

2-ヒ ド口キンナ リ ンゲニンは 10% 塩酸 （室温、 2 時間） の酸処理 で、 フラボンの一種であるァピゲニンに転換された。 また、 エ リオ ジクチオールは、 CYP93 B 1 を発現している酵母の ミ ク ロソ一ムと反 応させ、 その後酸処理を行う こ とによってフラボンの一種であるル テオリ ンに変換された。 したがつてこのチ ト ク ローム P450遺伝子は フラバノ ン - 2 - 水酸化酵素活性の機能をコ一ドしていることが明 らかになつた （FEB S Le t t . , 43 1 ( 1 998 ) Akas h i e t a l .， p. 287 ) 。 この場合、 ナリ ンゲニンからァ ピゲニンを生産するためには CYP9 3B 1 に加えて、 さ らに別の未知の酵素が必要であり、 計 2種の酵素 が必要と考えられた。

しかしながら、 酸処理を行う こ となく 、 フラバノ ン （たとえば、 ナリ ンゲニン） から直接フラボン （たとえば、 ァピゲニン） を合成 する活性を有する酵素の遺伝子は、 いまだに得られていない。 よつ て、 植物体において多様な作用を有するフ ラボンであるにもかかわ らず、 植物体内においてその生合成を制御し、 花色をはじめとする フラボンがかかわる生体機能を改変する技術はこれまで報告されて いなかった。 フラバノ ンからフラボンへの合成を一種の酵素で行な う ことができるよ うな酵素を見出 しその遺伝子を取得し、 たとえば その遺伝子を植物に導入するこ とは、 フラバノ ンからフラボンへの 合成に関わる 2種の酵素の遺伝子を植物に導入するより は、 実際的 であり、 産業上有用である。 発明の開示

本発明では、 フラボン合成酵素遺伝子、 好ま し く はフラボン合成 酵素 I I遺伝子、 より好ま し く はフラバノ ンから直接フラボンを合成 する活性を有するフラボン合成酵素の遺伝子を得るこ とを課題と し た。 得られるフラボン合成酵素の遺伝子を植物に導入し、 過剰発現 させることで、 花色を変化させる こ とが可能である。 また、 従来フラボンを多量に含有する花の花弁において、 フラボ ン合成酵素遺伝子の発現をアンチセ ンス法やコサプレツ シ ョ ン法で 抑制するこ とで花色を変化させるこ と も期待できる。 さ らに、 フラ ボンのもつ抗菌作用や土壌微生物との相互作用への影響に着目 し、 適当な器官においてフラボン合成酵素の遺伝子を発現させることに よって、 植物の抗菌性の上昇や根圏微生物との共生促進によるマメ 科植物の窒素固定能の向上、 紫外線や光に対する防御効果などが期 待される。

従って本発明は、 フラバノ ンから直接フラボンを合成するこ と力く できるタ ンパク質をコー ドする遺伝子を提供する。 この遺伝子は、 具体的には、 フラバノ ンからフラボンを単独の酵素による反応で合 成することができるフラボン合成酵素 I I (以下、 フラボン合成酵素 I Iと称する） をコー ドする遺伝子である。

より具体的には、 本発明は、 配列番号 ： 2， 4又は 8 のいずれか に記載のァ ミ ノ酸配列を有し、 フラバノ ンからフラボンを合成する 活性を有する P450タ ンパク質をコー ドする遺伝子、 あるいはそれら のァ ミ ノ酸配列に対して 1 個又は複数個のァ ミ ノ酸の付加、 欠失及 びノまたは他のァ ミ ノ酸による置換によつて修飾されているァ ミ ノ 酸配列を有し、 フラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質をコー ドする遺伝子を提供する。

本発明はまた、 配列番号 ： 2 , 4又は 8 のいずれかに記載のァ ミ ノ酸配列に対して 55 !¾ 以上の相同性を示すァ ミ ノ酸配列を有し、 フ ラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質をコー ド する遺伝子を提供する。

本発明はさ らに、 配列番号 ： 1， 3又は 7のいずれかに記載の塩 基配列の一部または全部に対して、 5 X SSC、 50°Cの条件下でハイ ブリ ダィズして得られる、 フラバノ ンからフラボンを合成する活性 を有するタ ンパク質をコー ドする遺伝子を提供する。

本発明はさ らに、 前記いずれかの遺伝子を含んでなるベクター、 特に発現ベク ターを提供する。

本発明はまた、 上記のベクターにより形質転換された宿主を提供 する。

本発明はさ らに、 上記いずれかの遺伝子によってコー ドされるタ ンパク質を提供する。

本発明はさ らに、 上記の宿主を培養し、 又は生育させ、 そ して当 該宿主からフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質を採取する ことを特徴とする当該タ ンパク質の製造方法を提供する。

本発明はまた、 前記いずれかの遺伝子が導入された植物も し く は これと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織、 例えば 切り花を提供する。

本発明はまた、 前記の遺伝子を用いてフラボノ ィ ド成分と量を変 更する方法 ； 前記の遺伝子を用いてフラボン量を変化させる方法 ； 前記の遺伝子を用いて花の色を変える方法 ； 前記の遺伝子を用いて 花の色を青く する方法 ； 前記の遺伝子を用いて花の色を赤く する方 法 ； 前記の遺伝子を用いて植物の光感受性を改変する方法 ； 並びに 前記の遺伝子を用いて植物と微生物の相互作用を制御する方法を提 供する。 図面の簡単な説明

図 1 は CYP 93 B 1 及び TFNS 5 にコ一 ドされるタ ンパク質によって、 ナ リ ンゲニンを基質と して生じる生成物の H P L C分析の結果を 示すグラ フである。

A及び B ： CYP 93 B 1 を発現している酵母の粗酵素画分を添加した もの C及び D ： TFNS5 を発現している酵母の粗酵素画分を添加したも の

A及び C ： 酵素画分添加による直接の生成物

B ： Aの反応後、 酸処理を行った場合の生成物

D ： Cの反応後、 酸処理を行った場合の生成物 発明の実施の形態

力 ンゾゥの CYP93B 1 遺伝子にコー ドされるフラバノ ン- 2 - 水酸 化酵素が、 フラバノ ンを基質と して 2-ヒ ドロキシフラバノ ンを生成 し、 この生成物を酸処理することによってフラボンが生じる。 本発 明者らは、 本発明で課題とするフ ラ ボン合成酵素 Πをコー ドする遺 伝子を得るには、 このカ ンゾゥ由来の cDNA、 CYP93B 1 を用い、 例え ばフラボンを多量に含む花の cDNAライブラ リ ーをスク リ ーニングす れば、 フラバノ ンを基質と して直接フラボンを合成する活性を有す るタ ンパク質をコー ドする cDNAを得るこ とができると考えた。

本発明においては、 フラボンを多量に含むキンギヨ ソゥの cDNAラ イブラ リ ーをカ ンゾゥ由来の cDNA、 CYP93 B 1 をプローブと してスク リ 一ニングし、 新たなチ ト ク ローム P450をコー ドする cDNAを得た （ 実施例 1 参照） 。 次に、 こ う して得られたキンギヨ ソゥの cDNA, AN FNS2と先のカ ンゾゥの CYP93B 1 cDNAを混合プロ一ブと して用い、 ト レニァ花弁 cDNAライブラ リ ーから新たなチ ト ク ローム P450をコー ド する cDNA， TFNS5 を得た （実施例 2参照） 。

この ト レニァ由来の cDNAを酵母で発現し、 フラバノ ンの一種であ るナ リ ンゲニンを基質と して反応させたと ころ、 2 -ヒ ドロキシナ リ ンゲニンではな く 、 フラボンであるァピゲニンが酸処理な しに生産 された （実施例 3 参照） 。 つま り、 この酵素は、 酸処理なしにフ ラ バノ ンからフラボンを直接生産でき、 この遺伝子は今までク ロー二 ングされたことのないフラボン合成酵素 Hであることが証明された 。 また、 実施例 1 のキンギヨ ソゥ由来の ANFNS2がコー ドするァ ミ ノ 酸配列は、 TFNS5 のコ一 ドするフ ラボン合成酵素 I Iと 77 %の高い相 同性を示し、 フラボン合成酵素 I Iの酵素活性を示した （実施例 4 ) 。 さ らにシ ソ由来の cDNAがコ一 ドするァ ミ ノ酸配歹リも TFNS5 および ANFNS2とそれぞれ 76 % , 75 %の高い相同性を示すこ とから （実施例 8 ) 、 この cDNAがコー ドするタ ンパク質も TFNS5 や ANFNS2がコー ド するフラボン合成酵素と同様の酵素活性をもつこ とが類推される。 本発明の遺伝子と しては、 例えば配列表 ： 2 , 4又は 8 のいずれ かに記載するア ミ ノ酸配列をコー ドする ものが挙げられる。 しかし ながら、 複数個のア ミ ノ酸の付加、 欠失および または他のア ミ ノ 酸との置換によって修飾されたア ミ ノ酸配列を有するタ ンパク質も 、 もとのタ ンパク質と同様の酵素活性を維持するこ とが知られてい る。 従つて本発明は、 フラバノ ンから直接フラボンを生成する活性 を維持しているタ ンパク質である限り、 配列番号 ： 2， 4又は 8 の いずれかに記載のア ミ ノ酸配列に対して 1 個または複数個のア ミ ノ 酸配列の付加、 欠失および /または他のァ ミ ノ酸との置換によって 修飾されたア ミ ノ酸配列を有するタ ンパク質および当該タ ンパク質 をコー ドする遺伝子も本発明に属する。

本発明はまた、 配列番号 ： 1， 3又は 7のいずれかに記載の塩基 配列も し く はそこに記載のァ ミ ノ酸配列をコ一 ドする塩基配列、 ま たはそれらの塩基配列の一部分に対して、 例えば 5xSSC 、 50°Cの条 件下でハィブリ ダイズし、 かつフラバノ ンからフラボンを生成する 活性を有するタ ンパク質をコ一 ドする遺伝子に関する ものである。 なお、 適切なハイブリ ダィゼーシ ョ ン温度は塩基配列やその塩基配 列の長さによって異なり、 例えばァ ミ ノ酸 6個をコ一 ドする 18塩基 からなる DNA フラグメ ン トをプローブと した場合には 50°C以下の温 度が好ま しい。

このようなハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンによって選択される遺伝子と しては、 天然由来のもの、 例えば植物由来のもの、 例えば、 キンギ ョ ソゥや ト レニァ、 シソ由来の遺伝子が挙げられるが、 他の植物、 例えばリ ン ドウやバーべナ、 キク、 アイ リ スなどの遺伝子であって もよい。 また、 ハイブリ ダィゼ一シ ヨ ンによって選択される遺伝子 は cDNAであってもよ く 、 ゲノ ム DNA であってもよい。

本発明はさ らに配列番号 ： 2 ， 4又は 8 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列に対して 55 %以上、 好ま し く は 70 %以上、 例えば 80 %以上 、 場合によっては 90 %以上の相同性を有するア ミ ノ酸配列を有し、 かつフラバノ ンからフラボンを合成する活性を示すタ ンパク質をコ 一ドする遺伝子に関する ものである。

生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、 例えば cDNAライブラ リ ーのスク リ ーニングによって得られる。 また 、 修飾されたァ ミ ノ酸配列を有する酵素をコ一ドする DNA は生来の 塩基配列を有する DNA を基礎と して、 常用の部位特定変異誘発や PC R 法を用いて合成するこ とができる。 例えば修飾を導入したい DNA 断片を生来の cDNAまたはゲノ ム DNA の制限酵素処理によって得、 こ れを铸型にして、 所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特 異的変異誘発または PCR 法を実施し、 所望の修飾を導入した DNA 断 片を得る。 その後、 この変異を導入した DNA 断片を目的とする酵素 の他の部分をコ一 ドする DNA 断片と連結すればよい。

あるいはまた、 短縮されたァ ミ ノ酸配列からなる酵素をコ一 ドす る DNA を得るには、 例えば目的とするア ミ ノ酸配列より長いア ミ ノ 酸配列、 例えば全長ア ミ ノ酸配列をコー ドする DNA を所望の制限酵 素により切断し、 その結果得られた DNA 断片が目的とするア ミ ノ酸 配列の全体をコ一 ドしていない場合は、 不足部分の配列からなる DN A 断片を合成し、 連結すればよい。

得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用いて発 現させ、 酵素活性を測定するこ とにより、 得られた遺伝子がフラボ ン合成酵素をコー ドすることを確認する こ とができる。 さ らに、 当 該遺伝子を発現させることにより、 遺伝子産物であるフラボン合成 酵素タ ンパク質を得ることができる。 あるいはまた、 配列番号 ： 2 ， 4又は 8のいずれかに記載のァ ミ ノ酸配列の全部あるいは一部に 対する扰体を用いても、 フラボン合成酵素のタ ンパク質を得るこ と ができ、 抗体を用いて他の生物のフラボン合成酵素遺伝子をク ロー ン化するこ と もでき る。

従って本発明はまた、 前述の遺伝子を含む組換えベク ター、 特に 発現べク タ一、 及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関 する ものである。 宿主と しては、 原核生物または真核生物を用いる こ とができる。 原核生物と しては細菌、 例えばェシ ヱ リ ヒア （ Esch eric ia ) 属に属する細菌、 例えば大腸菌 （Escherichia col i) 、 バシルス （Bacillus) 属微生物、 例えばバシルス. スブシルス （Ba ci 1 lus subtil is ) など常用の宿主を用いることができる。

真核性宿主と しては、 下等真核生物、 例えば真核性微生物、 例え ば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。 酵母と しては例えば サッカロ ミ セス （Saccharomyces ) 属微生物、 例えばサッカロ ミ セ ス， セ レ ビシェ（Saccharomyces cerev i s i ae)等力く挙げられ、 また糸 状菌と してはァスペルギルス （Aspergillus ) 属微生物、 例えばァ スぺノレギノレス · 才 リ ゼ （Aspergillus oryzae) 、 ァスぺノレギノレス. ニガ一 (Aspergillus niger ) 、 ぺニシ リ ウム ( Peni c i 11 i um ) '属 微生物が挙げられる。 さ らに動物細胞または植物細胞が使用でき、 動物細胞と しては、 マウス、 ハムスター、 サル、 ヒ ト等の細胞系が 使用される。 さ らに昆虫細胞、 例えばカイ コ細胞、 またはカイ コの 成虫それ自体も宿主と して使用される。

本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存し て発現制御領域、 例えばプロモータ一および夕一 ミ ネ一ター、 複製 起点等を含有する。 細菌用発現べク タ一のプロモーターと しては、 常用のプロモータ一、 例えば trc プロモータ一、 tac プロモーター 、 lac プロモーター等が使用され、 酵母用プロモーターと しては、 例えばグリ セルアルデヒ ド 3 リ ン酸デヒ ドロゲナーゼプロモータ一 、 PH05プロモーター等が使用され、 糸状菌用プロモータ一と しては 例えばア ミ ラーゼ、 trpC等が使用される。 また動物細胞宿主用プロ モーターと してはウィルス性プロモーター、 例えば SV40アー リ 一プ 口モータ一、 SV40レー トプロモーター等が使用される。

発現ベク ターの作製は制限酵素、 リガーゼ等を用いて常用に従つ て行う こ とができる。 また、 発現ベクターによる宿主の形質転換も 常法に従って行う ことができる。

前記の発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、 栽培ま たは飼育し、 培養物等から常法に従って、 例えば、 濾過、 遠心分離 、 細胞の破砕、 ゲル濾過ク ロマ トグラフ ィ ー、 イオン交換ク ロマ ト グラフ ィ 一等により 目的とするタ ンパク質を回収、 精製することが できる。

本明細書においてはキンギヨ ソゥ、 ト レニァ及びシソ由来の、 フ ラバノ ンから直接フラボンを合成するこ とができるフラボン合成酵 素 IIについて述べている力く、 チ ト クローム P450遺伝子はスーパ一フ ア ミ リ ーを形成しており （DNA and Cell Biology, 12 (1993) Nels on et al.， p.1) 、 同じフ ア ミ リ ー内のチ 卜 ク ロ一ム P450はァ ミ ノ 酸配列で 40% 以上の相同性を有し、 あるいはサブフ ァ ミ リ ー内のチ ト ク 口一ム P450はァ ミ ノ酸配列で 55% 以上の相同性を有し、 遺伝子 は互いにハイブリ ダイズするこ とが知られている （Pharmacogenet i cs, 6 (1996) Nelson et al. , pi) 。

たとえば、 チ ト ク ローム P450の一種でやはり フラボノ ィ ド合成経 路に属するフラボノ ィ ド 3'， 5'水酸化酵素遺伝子は、 最初にペチュ ニァから単離されたが （Nature, 366 (1993) Hoi ton et al. , p.27 6 ) 、 ペチュニアのフ ラ ボノ ィ ド 3'， 5'水酸化酵素遺伝子をプロ一 ブに用いて、 リ ン ドウ （Plant Cell Physiol. , 37 (1996) Tanaka et al. , p.711 ) 、 トノレコギキ ヨ ウ、 ベルフラ ワー （W093/18155 ( 1993) Kikuchi et al. ) 、 ラベンダー、 ト レニァ、 バ一べナ （植物 の化学調節、 33 (1998) 田中ら、 p.55) のフラボノ ィ ド 3'， 5'水酸 化酵素遺伝子が容易に単離されている。

よって、 本発明に係るキンギヨ ソゥ、 ト レニァあるいはシ ソ由来 の、 フラバノ ンから直接フラボンを合成することができるフラボン 合成酵素 II遺伝子の一部または全部をプローブと して用いるこ とに よって、 別種の植物から、 フラバノ ンから直接フラボンを合成する こ とができるフラボン合成酵素 IIの遺伝子を得るこ とができる。 ま た、 本明細書において示したキンギヨ ソゥ、 ト レニァまたはシソ由 来の、 フラバノ ンから直接フラボンを合成するこ とができるフラボ ン合成酵素 Πを精製し、 常法に従って当該酵素に対する抗体を得る こ とにより、 その抗体と反応する別のフラボン合成酵素 IIのタ ンパ ク質を得、 当該タ ンパク質をコー ドする遺伝子を得るこ とができる o

従って、 本発明はキンギヨ ソゥ、 ト レニァあるいはシ ソ由来の、 フラバノ ンから直接フラボンを合成することができるフラボン合成 酵素 IIの遺伝子のみに限定される ものではなく 、 広く 他の植物由来 の、 フラバノ ンから直接フラボンを合成するこ とができるフラボン 合成酵素 IIに関する ものである。 このようなフラボン合成酵素 II遺 伝子の起源と しては、 こ こで述べたキンギヨ ソゥ、 ト レニァ及びシ ソ以外にも、 リ ン ドウ、 バーべナ、 キク、 アイ リ ス、 シ ソ、 ツユク サ、 ャグルマギク、 サルビア、 ネモフ イ ラなどがあるが、 本発明の 範囲はこれらの植物に限定される ものではない。

さ らに本発明は、 フラバノ ンから直接フラボンを合成することが できるフラボン合成酵素 I Iの遺伝子を導入することにより、 色合い が調節された植物も し く はその子孫又はこれらの組織に関する もの であり、 その形態は切り花であってもよい。 本発明でク ローニング したフラボン合成酵素 I Iあるいはその遺伝子を用いると、 フラボン を全く 、 あるいはわずかしか生産していない植物種、 あるいは品種 においてフラボンを生産することができる。 花弁において本フラボ ン合成酵素 I I遺伝子を発現させるこ とによって、 花弁においてフラ ボンの量を増やすことができ、 その結果、 たとえば花の色を青い方 向に改変できる。

また、 花弁においてフラボンの合成を抑制すれば、 花の色をたと えば赤い方向に改変することができる。 ただし、 フラボンが花色に およぼす効果は多彩であり花の色の変化はこ こ に述べたものに限定 される ものではない。 現在の技術水準をもってすれば、 植物に遺伝 子を導入し、 その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させる ことは可能である し、 またアンチセ ンス法やコサプレツ シ ョ ン法に よって目的の遺伝子の発現を抑制すること も可能である。

形質転換可能な植物の例と しては、 バラ、 キク、 カーネーショ ン 、 キンギヨ ソゥ、 シクラメ ン、 ラ ン、 トルコギキヨ ウ、 フ リ ージア 、 ガーベラ、 グラ ジオラス、 カス ミ ソゥ、 カラ ンコェ、 ユリ、 ペラ ルゴ二ゥム、 ゼラニゥム、 ペチュニア、 ト レニァ、 チュー リ ップ、 イネ、 ォォムギ、 コムギ、 ナタネ、 ポテ ト、 トマ ト、 ポプラ、 バナ ナ、 ユーカ リ 、 サツマィ モ、 タイ ズ、 アルフ ァノレフ ァ、 ノレ一ピン、 ト ゥモロコシなどがあげられるがこれらに限定される ものではない o

また、 フラボンは前述のようにさまざまな生理活性を有するので 、 植物に新しい生理活性や経済的価値を付与する ことができる。 例 えば根において本遺伝子を発現させフラボンを生産すれば、 植物に と って有益な微生物の増殖を促すこ とができ、 植物の生育を促進す ることができる。 また、 ヒ トゃ動物、 昆虫に対し生理活性を示すフ ラボン類を合成させるこ と もできる。 実施例

以下実施例に従って、 発明の詳細を述べる。 分子生物学的手法は と く に断らない限り、 Molecular Cloning (Sambrook et al. , 198 9 ) に依った。

実施例 1 ， キ ンギヨ ソゥ フラ ボン合成酵素 II遺伝子のク ロ一ニン キンギヨ ソゥ、 エローバタフライ （販売名 ： 株式会社サカタのタ ネ） の若いつぼみ約 5 gから RNA を抽出 し、 オ リ ゴテッ クスにより ポ リ A + RNA を得た。 このポ リ A + RNA を錶型と し、 ラムダ ZAP II cDNA ライブラ リ 一合成キッ 卜 （Stratagene社） を用いて、 Stratagene社 の推奨する方法 (Stratagene社 Instruction Manual, Revision # 065001) により cDNAライブラ リ 一を作製した。 この cDNAライブラ リ —を CYP93B1 の cDNA全長をプローブと してスク リ ーニングした。 ス ク リ ーニングならびに陽性ク ロー ンの検出は、 DIG-DNA 標識検出キ ッ ト （ベ一 リ ンガー社） を用いて、 同社が推奨する方法を基本と し 、 下記のような低ス ト リ ンジヱ ン 卜な条件で行った。

すなわち、 ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンバ ッ フ ァ ー （ 5 X SSC, 30 ホ ルムア ミ ド、 50 mM リ ン酸ナ ト リ ウ ムノく ッ フ ァ ー （pH 7.0) 、 1¾ S DS、 2%ブロ ッキング試薬 （ベー リ ンガ一社） 、 0.1%ラウロイルサル コ シ ン、 80 / g/mlサケ精子 DNA ) を用い、 42°Cで 2 時間プレハイブ リ ダィゼ一シ ヨ ンを行った後、 D I G 標識したプローブを加え、 さ ら に一晩保持した。 メ ンブレ ンは 1% SDSを含む 5 X SSC洗浄液中、 65 °Cで 1.5 時間洗浄した。 1 個の陽性ク ローンが得られ、 ANFNS1と命 名した。 ANFNSlの 5'末端の塩基配列を決定したところ ANFNSlは力 ン ゾゥ CYP93B1 のコ一 ドするフラバノ ン - 2 水酸化酵素と高い相同 性を有する配列をコー ドしており、 フラバノ ン - 2 - 水酸化酵素と 類似の機能をもつ P450をコー ドするものと推測された。

しかし、 CYP93B1 にコー ドされるフ ラ ノくノ ン - 2 - 水酸化酵素の ア ミ ノ酸配列との比較の結果、 ANFNSlの cDNA は開始メ チォニンか ら約 65ア ミ ノ酸残基に相当する部分を欠く 、 不完全長の cDNAである と考えられた。 そこで、 ANFNSlの cDNA をプローブと して再度キン ギヨ ソゥの cDNAライブラ リ ーをスク リ 一ニングしたところ、 全長の ア ミ ノ酸配列を含むと考えられる cDNA (ANFNS2) を得た。 こ こで得 られた ANFNS2にコー ドされるタ ンパク質はカ ンゾゥの CYP93B1 にコ 一ドされるフラバノ ン - 2 - 水酸化酵素とア ミ ノ酸レベルで 53%の ホモロ ジ一を示した。 ANFNS2の塩基配列を配列番号 ： 1 に示し、 そ してそれから推察されるァ ミ ノ酸配列を配列番号 2 に示す。

実施例 2. ト レ二アフ ラ ボン合成酵素 II遺伝子のク ローニ ング ト レニァ品種 （品種名称 ： サ ンレニブ、 種苗法による品種登録出 願番号 ： 7433号、 サン ト リ ー株式会社） のつぼみ約 2gから RNA を抽 出 し、 オリ ゴテッ クスによりポ リ A + RNA を得た。 このポ リ A + RNA を 铸型と し、 ラムダ ZAPII cDNAライブラ リ ー合成キッ ト （Stratagene 社） を用いて、 実施例 1 で述べたように Stratagene社の推奨する方 法により cDNAライブラ リ 一を作製した。 この cDNAライブラ リ 一を前 述の CYP93B1 cDNAならびに ANFNSl cDNAの混液をプローブと してス ク リ 一ニ ングした。 スク リ ーニングならびに陽性ク ロー ンの検出は 、 実施例 1 で述べた緩い条件で行なった。

1種類の陽性ク ローンが得られ、 TFNS5 と命名 した。 TFNS5 cDNA の全塩基配列を決定したと ころ、 TFNS5 cDNAにコー ドされるタ ンパ ク質は、 カ ンゾゥ CYP93B 1 にコー ドされるフラバノ ン - 2 - 水酸化 酵素とア ミ ノ酸レベルで 52¾ ' の相同性を示した。 また、 この TFNS5 cDNAは、 実施例 1 で得られたキンギヨ ソゥ由来の cDNA、 ANFNS 2 に コー ドされるタンパク質とは 77%の高い相同性があつた。 決定した 塩基配列を配列番号 ： 3 に示し、 そしてそれから推察されるァ ミ ノ 酸配列を配列番号 ： 4 に示す。

実施例 3. ト レ二アフ ラボン合成酵素 II遺伝子の酵母における発

m

実施例 2で得られた ト レニァの cDNAである TFNS5 にコー ドされる タ ンパク質の酵素活性を検出するために、 以下の実験を行なった。 この遺伝子の翻訳領域の外側の一部を改変して制限酵素部位を導入 したセ ンスプライマ一 (5' -AAATAGGATCCAAGCatgGACACAGTCTTAA-3' ； 下線、 BamHI 部位 ； 小文字、 開始コ ドン） （配列番号 ： 5 ) 及び ア ンチセ ンスプライマー（5' -CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATATTGTGGCCGG G-3' ； 下線、 Xbal部位 ； 小文字、 終始コ ドン） （配列番号 ： 6 ) 、 並びに K0D ポ リ メ ラーゼ （東洋紡） を用いて PCR を行った。 PCR 条 件は 98°C 1分、 （98°C 15 秒、 55°C 10 秒、 74°C 30 秒） を 20サイ クル、 74°C 10 分である。

得られた PCR 産物は pBluescriptll SK - (Stratagene社） の EcoR V 部位に導入後、 制限酵素 BamHI と Xbalにより消化し、 酵母発現べ ク タ一PYES2 ( Invitrogen社） の BamH I - Xba Iに導入した。 得られた プラ ス ミ ドを酵母 BJ2168 (日本ジー ン社） へ導入した。 明石らの文 献に述べられた方法 （FEBS Lett. , 431 (1998) Akashi et al. , p. 287 ) で酵素活性を測定した。 すなわち、 得られた形質転換酵母を 20 ml の選択培地 (6.7 mg/ml yeast nitrogen base without ami n o acids (D if co 社） 、 20mg/ml グルコース、 30 g/mlロイ シン、 20〃 g/ml ト リ ブ トフ ァ ン、 5 mg/ml カザミ ノ酸） で、 30°C 24 時間 培養した。

酵母細胞を遠心して回収後、 その回収酵母を発現培地 （10 mg/ml 酵母エキス、 10 mg/mlぺプ ト ン、 2 〃 g/mlへミ ン、 20 mg/mlガラク トース） で 30°C、 48時間培養した。 この酵母を集菌後、 水に懸濁し 、 再び集菌する こ とにより洗浄した。 ガラスビーズを用いて 10分間 破砕し、 8， 000xg 、 10分間遠心した。 この上清をさ らに 15, OOOxgで 10分間遠心することにより粗酵素画分を得た。

15 / g (R， S) —ナリ ンゲニン （30〃 1 の 2-メ 卜キンエタノ ールに 溶解） 、 1 mlの粗酵素液及び 1 mMの NADPHを混合し （総反応液量 1. 05ml) 、 30°Cにて 2時間反応させた。 30 z 1 の酢酸を加えて反応を 停止した後、 1 mlの酢酸ェチルを加え、 混合した。 遠心分離後、 酢 酸ェチル層をエバポレーターで乾燥させた。 これを 100 1 のメ タ ノ ールに溶解し、 HPLCにて分析した。 分析は明石らの文献に依った 。 酸処理は、 エバポレーターで乾燥させた標品を 150 1 の 10%の 塩酸を含むエタノ ールに溶解し 30分間攪拌した。 これを 1.3 mlの水 で希釈し、 さ らに 800 p.1 の酢酸ェチルを加えて混合し、 遠心後、 酢酸ェチル層を回収した。 これを乾燥した後、 200 1 のメ タノ 一 ルに溶解し、 HPLCにて分析した。

力 ンゾゥの CYP93B1 を発現している酵母ではナリ ンゲニンから 2 — ヒ ドロキシナ リ ンゲニンが生じ、 アビゲニンは生産されていな力、 つた （図 1 、 A) 。 この反応液を酸処理するこ とによって 2 — ヒ ド 口キシナリ ンゲニンからァピゲニンがはじめて生じた （図 1 、 B ) 。 これに対して、 ト レニァ TFNS5 を発現している酵母では、 反応液 の酸処理なしに、 ナリ ンゲニンからァピゲニンが生産された （図 1 、 C ) 。 このこ とから TFNS5 はフラボン合成酵素 11をコ一 ドしてい るこ とが明らかとなつた。

実施例 4 . キンギヨ ソゥフラボン合成酵素 II遺伝子の酵母におけ る発現

ANFNS2 cDNA を BamHi と Sph Iで消化して得られる約 1400bpの DNA 断片と、 Sphlと BamHI で消化して得られる約 350bp の DNA 断片と、 BamHI と Xho Iで消化した pYES2 とをライゲ一シ ヨ ンして得られたプ ラス ミ ドを、 実施例 3 に記載と同様な方法で酵母へ導入した。 得ら れた組換え酵母を用いて、 実施例 3 に記載と同様の方法でフラボン 合成活性を測定した。 キンギヨ ソゥ由来の ANFNS2を発現している酵 母では、 酸処理無しに、 ァピゲニンが生産され、 ANFNS2はフラボン 合成酵素 I Iをコ一ドしているこ とが明らかとなつた。

実施例 5 . 植物での発現べクタ一の構築

実施例 2 で得られた ト レニァの cDNA、 TFNS5 を植物体へ導入する ため、 植物発現べクタ一を構築した。 まず、 PBE2113 -GUS (Plant Cell Physiol. , 37 (1996) Mi tsuhara et al.， p.49) を Saclで消 化後、 ブラ ンティ ングキッ 卜 （タカラ） を用いて、 平滑末端にした 後、 Xholリ ンカー （東洋紡） を揷入した。 得られたプラス ミ ドを Hi ndl I I と EcoRI で消化し、 約 3kb の DNA 断片を回収した。 この DNA 断片をバイナ リ 一ベク タ一 pBINPLUS の Hindi I I/EcoRI サイ 卜に連 結し、 PBE2113' と した。 なお、 今回用いたベク タ一 pBINPLUSは、 ァ グロパクテ リ ゥムを介した植物への遺伝子導入の際に広く用いられ ているバイナ リ ーべクタ一 Binl9 (Nucl. Acids. Res. , 12 (1984) Bevan, p.8711) を、 Engelen らの報告 (Transgenic Research, 4 (1995) van Engelen et al. , .288 ) のよう に改変して得られた ものである。

TFNS5 cDNAを BamHI /Xho I切断によって SK—ベク ターから切り出 し 、 得られた約 1.7kb フラグメ ン トを前述のバイナ リ 一ベク タ一 pBE2 113'の BamHI/XhoIサイ 卜に連結した。 このよう にして得られたコ ン ス トラ ク ト、 PSPB441 は、 ェンハ ンサ一配列を 2 回繰り返した 35S 力 リ フラワーモザイ クウィルスプロモーターの制御下（Plant Cell Physiol. , 37 (1996) Mi tsuhara et al.， p.49) 、 TFNS5 cDNAをセ ンス方向に発現させる ものである。

実施例 6. ト レニァの花色変化

ト レニァ品種 （品種名称 ： サンレニブ、 種苗法による品種登録出 願番号 ： 7433号、 サン ト リ ー株式会社） を間らの方法 （Breeding S cience, 45 (1995) Aida et al. , p.71 ) に従い、 上の実施例 5で 構築した PSPB441 で形質転換した。 得られた形質転換体の 95%以上 で、 花の色が元株の濃い紫色から薄い紫色に変化していた。 4枚の 花弁のうち、 左右の花弁の色を測定した。 元株の花弁の色はィギリ ス王立園芸協会カラーチヤ一ト （The Royal Horticultural Societ y Color Chart ) ナンバー 8 9 A であったが、 形質転換体の花弁の 代表的な色は、 82C 、 87D 、 87C 、 88D 、 91A などであった。 この 結果、 TFNS5 を植物体へ導入することにより、 花色を改変できるこ とが示された。

これら形質転換体の個体では、 フラボンの量が宿主の 5分の 1 力、 ら 1 0分の 1 に、 ア ン ト シァニ ンの量が宿主の約 3分の 1 程度に減 少していた。 また、 宿主では検出されなかったフラボン生合成の前 駆体であるフラバノ ン （ナリ ンゲニン、 エリオジクチオールおよび ペンタ ヒ ドロキシフラバノ ン） が検出された。

実施例 7. ペチュニアでのフラボン合成酵素の発現

ペチュニア （品種名称 ： レボリ ュー シ ョ ン · バイオレッ ト ミニ、 種苗法による品種登録出願番号 ： 9217号、 サン ト リ 一株式会社） に Napoliら （Plant Cell, 2, ( 1990) Napol i et al. , .279) らの方 l 9 法により、 PSPB441 を導入した。 得られた形質転換体のう ち 2株で 、 花色の変化が認められ、 花色が薄く なつた。 元株の花色は、 ィギ リ ス王立園芸協会カラ一チヤ一 卜ナンバー 88 Aであったが、 これら の形質転換株では 87Aであった。 また、 元株ではフラボンが検出さ れなかったが、 これら形質転換体の株ではフラボンの一種であるル テオ リ ンが検出された。

実施例 8. シソ フ ラ ボン合成酵素 II遺伝子のク ロ一ニ ング

赤ジソ (Per i 1 la f rutescens) の葉カヽら Gong等の方法 (Plant Mol. Biol. , 35, ( 1997) Gong et al. , p.915) で作製した； I gtlO (Stratagene社） をベク ターにした cDNAラィブラ リ 一を実施例 1 に 記載したような方法でスク リ ーニ ングした。 得られたフ ァージク ロ —ン # 3 を Gong等の方法 （Plant Mol. Biol. , 35, ( 1997) Gong e t al. , p.915) にしたがって培養、 DNA 調製、 サブク ローニ ングを 行ない、 塩基配列を決定、 配列番号 ： 7 に示した。 この塩基配列が コー ドすると推定されるァ ミ ノ酸配列を配列番号 ： 8 に示した。 こ のア ミ ノ酸配列は、 TFNS5, ANFNS2 に対して、 それぞれ 76%、 75% の相同性を示した。 また、 CYP93B1 に対しては 52%の相同性を示し た。

実施例 9. シソフラボン合成酵素 II遺伝子の酵母での発現

実施例 8で得たフ ァージク ローン # 3 を铸型にし、 ラムダアーム プライマー （Stratagene社） を用い、 実施例 3 に述べたような方法 により PCR を行なった。 増幅された D A 断片を pBluescript KS—の EcoRV サイ 卜にサブク ローニングした。 pBluescript KS—上の Sail サイ ト側にシソフラボン合成酵素 11 cDNAの開始コ ドンがある ク ロー ンを選択し、 これを pFS3と称した。 pFS3の揷入 cDNAの塩基配列を決 定し、 PCR によるエラ一がないこ とを確認した。

PFS3を Sailと Xbalで消化して得られる約 1.8kb の DNA 断片と Xhol と Xba lで消化した pYES2 (実施例 3 ) をライゲーシ ヨ ンして得られ たプラス ミ ドを pYFS3 と し、 これを実施例 3 に述べたような方法で 酵母 B J 2168に導入した。 この組換え酵母を用いて、 フラボン合成酵 素活性を実施例 3 に述べたような方法で測定したところ、 ナリ ンゲ ニンからァ ピゲニ ンの生成が認められ、 シソフ ァ一ジク ローン # 3 の cDNAがフラボン合成酵素 I I活性をコ一ドしていることが示された

産業上の利用可能性

本発明の c DNAを適当な植物発現べクターに接続し、 植物に導入し 、 フラボン合成酵素を発現させたり、 発現を抑制することにより、 花色を改変出来るようになった。 さ らに、 花弁だけではなく植物体 全体または適当な器官において本フラボン合成酵素遺伝子を発現さ せるこ とによって、 植物の抗菌性の上昇や根圏微生物との共生促進 によるマメ科植物の窒素固定能、 植物の紫外線や光に対する防御効 果の向上などが可能となる。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . フラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質 をコ一 ドする遺伝子。

2 . 前記遺伝子がフラボン合成酵素 I Iをコー ドする遺伝子である 請求項 1 記載の遺伝子。

3 . 配列番号 ： 2， 4又は 8 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列を 有し、 フラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質 をコ一 ドする遺伝子、 あるいはそれらのア ミ ノ酸配列に対して 1 個 又は複数個のア ミ ノ酸の付加、 欠失及び/または他のア ミ ノ酸によ る置換によって修飾されているア ミ ノ酸配列を有し、 且つフラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質をコー ドする請 求項 1 又は 2 に記載の遺伝子。

4 . 配列番号 ： 2， 4又は 8 のいずれかに記載のア ミ ノ酸配列に 対して 55 % 以上の相同性を示すア ミ ノ酸配列を有し、 フラバノ ンか らフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質をコー ドする請求項 1 から 3 のいずれか 1 項に記載の遺伝子。

5 . 配列番号 ： 1， 3又は 7 のいずれかに記載の塩基配列の一部 または全部に対して、 5 X S S C 、 50 °Cの条件下でハイブリ ダィズす る、 フラバノ ンからフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質を コー ドする請求項 1 から 4 のいずれか 1 項に記載の遺伝子。

6 . 請求項 1〜 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を含んでなるベ クタ一。

7 . 請求項 6 に記載のベクタ一により形質転換された宿主。

8 . 請求項 1〜 5のいずれか 1 項に記載の遺伝子によってコ一 ド されるタ ンパク質。

9 . 請求項 7 に記載の宿主を培養し、 又は生育させ、 そして当該 宿主からフラボンを合成する活性を有するタ ンパク質を採取するこ とを特徴とする当該タ ンパク質の製造方法。

1 0 . 請求項 1 〜 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子が導入された 植物も し く はこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの 組織。

1 1 . 請求項 1 0 に記載の植物又はこれと同じ性質を有するその 子孫の切り花。

1 2 . 請求項 1 ~ 5 に記載の遺伝子を用いてフラボノ イ ド成分及 び Z又はその量を変更する方法。

1 3 . 請求項 1 〜 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を用いてフラ ボン量を変化させる方法。

1 4 . 請求項 1 〜 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を用いて花の 色を変える方法。

1 5 . 請求項 1 ~ 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を用いて花の 色を青く する方法。

1 6 . 請求項 1 〜 5のいずれか 1 項に記載の遺伝子を用いて花の 色を赤く する方法。

1 7 . 請求項 1 〜 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を用いて植物 の光感受性を改変する方法。

1 8 . 請求項 1 〜 5 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を用いて植物 と微生物の相互作用を制御する方法。