JP2000279182A - フラボン合成酵素をコードする遺伝子 - Google Patents
フラボン合成酵素をコードする遺伝子Info
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Abstract
ができる新規な酵素の提供。 【解決手段】 例えばキンギョソウやトレニアから得ら
れる、フラバノンを直接にフラボンに転換することがで
きる酵素をコードするDNA 及びその使用に関し、このDN
A 及びそれによりコードされる酵素のアミノ酸配列は、
例えば配列番号:1及び2並びに3及び4により示され
る。この遺伝子を植物に導入することにより、例えばそ
の植物の花の色を変えることができる。
Description
色、紫外線からの保護、微生物との共生などに影響をお
よぼすフラボンの生合成を、遺伝子工学の技術を用い
て、制御、利用することに関するものである。より詳し
くはフラバノンからフラボンを合成する活性を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子およびその利用に関するも
のである。
花色の花々は人々の心に潤いを与えるものの1つであ
る。また、人口増加に伴ない必要な食料増産のための1
つの手段として、微生物との共生促進による植物の成長
促進や、窒素固定を行なう根粒菌の増加、その結果とし
て生じる土壌窒素含量増加による植物生産性の向上が考
えられる。より環境にやさしい農業を実現するために
は、無農薬、減農薬が好まれ、上記のような生物学的手
段による土壌の改良や、植物自身の抗菌性の向上が必要
とされる。またオゾン層破壊から植物を保護する手段と
して紫外線に対する防御機能の高い植物が期待されてい
る。
った一群の化合物の総称で、植物細胞に広く分布してい
る。フラボノイドの機能としては、昆虫などのポリネー
ターを呼んだり、紫外線から植物体を保護したり、土壌
微生物との相互作用にかかわったりすることが知られて
いる(BioEssays, 16 (1994) Koes et al., p.123 ;Tr
ends in Plant Science, 1 (1997) Shirley, B.W., p.3
77 )。
科においては、根粒菌との共生の初期過程にかかわるな
ど、微生物との相互作用を行なう上で重要である(Plan
t Cell, 7 (1995) Dixon and Paiva, p.1085; Annu. R
ev. Phytopathol., 33 (1995) Spaink, p.345 )。ま
た、花弁におけるフラボンは、昆虫に認識される役割
や、アントシアニンと複合体を形成するコピグメントと
して、働いている(現代化学、(1998年5 月)本田と斉
藤、p.25; Prog. Chem. Org. Natl. Prod., 52 (1987)
Goto,T., p.114 )。フラボンは、アントシアニンと複
合体を形成すると、アントシアニンの吸収極大値を長波
長側にシフトさせる、すなわち青くすることが知られて
いる。
研究されており(Plant Cell, 7 (1995) Holton and Co
rnish, p.1071 )、例えばアントシアニジン3‐グルコ
シドやフラボノールの生合成にかかわる酵素の遺伝子は
すべて単離されている。しかしながら、フラボンの生合
成にかかわる遺伝子はいまだに単離されていない。フラ
ボンを合成する酵素には、2 ‐オキソグルタール酸に依
存するジオキシゲナーゼファミリーに属する酵素(フラ
ボン合成酵素I)とチトクロームP450ファミリーに属する
モノオキシゲナーゼ酵素(フラボン合成酵素II) がある
ことが知られている。これらの酵素は構造においてもホ
モロジーがなく、全く別の酵素である。
に依存性のジオキシゲナーゼが、フラバノンの一種であ
るナリンゲニンからフラボンの一種であるアピゲニンを
生成する反応を触媒すると報告されている(Z.Naturfor
sch., 36c (1981) Britsch et al., p.742; Arch. Bio
chem. Biophys., 282 (1990) Britsch, p.152)。もう一
種のフラボン合成酵素IIは、キンギョソウ(Z.Naturfor
sch., 36c (1981) Stotz and Forkmann, p.737)及びダ
イズ(Z.Naturforsch., 42c (1987) Kochs andGrisebac
h, p.343 ; Planta, 171 (1987) Kochs et al., p.519
)での存在が知られている。また、近年ガーベラで遺
伝子座と花弁のフラボン合成酵素II活性に相関があるこ
とが報告されている(Phytochemistry, 49 (1998) Mart
ens andForkmann, p.1953)。しかし、これらのフラボ
ン合成酵素I あるいはIIの遺伝子が単離されたり、フラ
ボン合成酵素IIが純粋に精製された例はない。
の培養細胞をエリシター処理した際に誘導されるリコジ
オン合成活性を持つチトクロームP450タンパク質の性質
が調べられている。このタンパク質によって5-デオキシ
フラバノンであるリクイリチゲニンの2位が水酸化さ
れ、続いて非酵素的なヘミアセタール開環が起こり、リ
コジオンを生成すると考えられた(Plant Physiol., 10
5 (1994) Otani et al.,p.1427 )。リコジオン合成酵
素をクローニングするために、エリシター処理したカン
ゾウ培養細胞からcDNAライブラリーが作製され、チトク
ロームP450をコードする遺伝子断片が8種クローニング
されている(Plant Science, 126 (1997)Akashi et a
l., p.39 )。
ームP450をコードする2種類の完全長cDNAが取得され
た。すなわち、CYPGe-3 (チトクロームP450番号CYP81E
1 )及びCYPGe-5 (チトクロームP450番号CYP93B1 、以
下CYP93B1 と表記)である(Plant Physiol., 115 (199
7) Akashi et al., p.1288)。さらに、昆虫の培養細胞
を用いる系でCYP93B1 cDNAを発現させることにより、こ
の遺伝子に由来する蛋白質はフラバノンの1種であるリ
クイリチゲニンからリコジオンを、また同じくフラバノ
ンの1種ナリンゲニンから2−ヒドロキシナリンゲニン
を合成する反応を触媒することが示された。
温、2 時間)の酸処理で、フラボンの一種であるアピゲ
ニンに転換された。また、エリオジクチオールは、CYP9
3B1を発現している酵母のミクロソームと反応させ、そ
の後酸処理を行うことによってフラボンの一種であるル
テオリンに変換された。したがってこのチトクロームP4
50遺伝子はフラバノン‐2 ‐水酸化酵素活性の機能をコ
ードしていることが明らかになった(FEBS Lett., 431
(1998) Akashi et al., p.287 )。この場合、ナリンゲ
ニンからアピゲニンを生産するためにはCYP93B1 に加え
て、さらに別の未知の酵素が必要であり、計2種の酵素
が必要と考えられた。
ラバノン(たとえば、ナリンゲニン)から直接フラボン
(たとえば、アピゲニン)を合成する活性を有する酵素
の遺伝子は、いまだに得られていない。よって、植物体
において多様な作用を有するフラボンであるにもかかわ
らず、植物体内においてその生合成を制御し、花色をは
じめとするフラボンがかかわる生体機能を改変する技術
はこれまで報告されていなかった。フラバノンからフラ
ボンへの合成を一種の酵素で行なうことができるような
酵素を見出しその遺伝子を取得し、たとえばその遺伝子
を植物に導入することは、フラバノンからフラボンへの
合成に関わる2種の酵素の遺伝子を植物に導入するより
は、実際的であり、産業上有用である。
合成酵素遺伝子、好ましくはフラボン合成酵素II遺伝
子、より好ましくはフラバノンから直接フラボンを合成
する活性を有するフラボン合成酵素の遺伝子を得ること
を課題とした。得られるフラボン合成酵素の遺伝子を植
物に導入し、過剰発現させることで、花色を変化させる
ことが可能である。
花弁において、フラボン合成酵素遺伝子の発現をアンチ
センス法やコサプレッション法で抑制することで花色を
変化させることも期待できる。さらに、フラボンのもつ
抗菌作用や土壌微生物との相互作用への影響に着目し、
適当な器官においてフラボン合成酵素の遺伝子を発現さ
せることによって、植物の抗菌性の上昇や根圏微生物と
の共生促進によるマメ科植物の窒素固定能の向上、紫外
線や光に対する防御効果などが期待される。
ノンから直接フラボンを合成することができるタンパク
質をコードする遺伝子を提供する。この遺伝子は、具体
的には、フラバノンからフラボンを単独の酵素による反
応で合成することができるフラボン合成酵素II(以下、
フラボン合成酵素IIと称する)をコードする遺伝子であ
る。
2,4又は8のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、
フラバノンからフラボンを合成する活性を有するP450タ
ンパク質をコードする遺伝子、あるいはそれらのアミノ
酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失
及び/または他のアミノ酸による置換によって修飾され
ているアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを
合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
提供する。本発明はまた、配列番号:2,4又は8のい
ずれかに記載のアミノ酸配列に対して55% 以上の相同性
を示すアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを
合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を
提供する。
のいずれかに記載の塩基配列の一部または全部に対し
て、5 x SSC、50℃の条件下でハイブリダイズして得ら
れる、フラバノンからフラボンを合成する活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさ
らに、前記いずれかの遺伝子を含んでなるベクター、特
に発現ベクターを提供する。
転換された宿主を提供する。本発明はさらに、上記いず
れかの遺伝子によってコードされるタンパク質を提供す
る。本発明はさらに、上記の宿主を培養し、又は生育さ
せ、そして当該宿主からフラボンを合成する活性を有す
るタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク
質の製造方法を提供する。
入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の
子孫またはそれらの組織、例えば切り花を提供する。本
発明はまた、前記の遺伝子を用いてフラボノイド成分と
量を変更する方法;前記の遺伝子を用いてフラボン量を
変化させる方法;前記の遺伝子を用いて花の色を変える
方法;前記の遺伝子を用いて花の色を青くする方法;前
記の遺伝子を用いて花の色を赤くする方法;前記の遺伝
子を用いて植物の光感受性を改変する方法;並びに前記
の遺伝子を用いて植物と微生物の相互作用を制御する方
法を提供する。
ドされるフラバノン- 2- 水酸化酵素が、フラバノンを
基質として2-ヒドロキシフラバノンを生成し、この生成
物を酸処理することによってフラボンが生じる。本発明
者らは、本発明で課題とするフラボン合成酵素IIをコー
ドする遺伝子を得るには、このカンゾウ由来のcDNA、CY
P93B1を用い、例えばフラボンを多量に含む花のcDNAラ
イブラリーをスクリーニングすれば、フラバノンを基質
として直接フラボンを合成する活性を有するタンパク質
をコードするcDNAを得ることができると考えた。
キンギョソウのcDNAライブラリーをカンゾウ由来のcDN
A、CYP93B1 をプローブとしてスクリーニングし、新た
なチトクロームP450をコードするcDNAを得た(実施例1
参照)。次に、こうして得られたキンギョソウのcDNA,
ANFNS2と先のカンゾウのCYP93B1 cDNAを混合プローブと
して用い、トレニア花弁cDNAライブラリーから新たなチ
トクロームP450をコードするcDNA, TFNS5 を得た(実施
例2参照)。
フラバノンの一種であるナリンゲニンを基質として反応
させたところ、2-ヒドロキシナリンゲニンではなく、フ
ラボンであるアピゲニンが酸処理なしに生産された(実
施例3参照)。つまり、この酵素は、酸処理なしにフラ
バノンからフラボンを直接生産でき、この遺伝子は今ま
でクローニングされたことのないフラボン合成酵素IIで
あることが証明された。また、実施例1のキンギョソウ
由来のANFNS2がコードするアミノ酸配列は、TFNS5 のコ
ードするフラボン合成酵素IIと77%の高い相同性を示
し、フラボン合成酵素IIの酵素活性を示した(実施例
4)。さらにシソ由来のcDNAがコードするアミノ酸配列
もTFNS5 およびANFNS2とそれぞれ76%,75%の高い相同
性を示すことから(実施例8)、このcDNAがコードする
タンパク質もTFNS5 やANFNS2がコードするフラボン合成
酵素と同様の酵素活性をもつことが類推される。
2,4又は8のいずれかに記載するアミノ酸配列をコー
ドするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミ
ノ酸の付加、欠失および/または他のアミノ酸との置換
によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質
も、もとのタンパク質と同様の酵素活性を維持すること
が知られている。従って本発明は、フラバノンから直接
フラボンを生成する活性を維持しているタンパク質であ
る限り、配列番号:2,4又は8のいずれかに記載のア
ミノ酸配列に対して1個または複数個のアミノ酸配列の
付加、欠失および/または他のアミノ酸との置換によっ
て修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質および当
該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に属する。
いずれかに記載の塩基配列もしくはそこに記載のアミノ
酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列
の一部分に対して、例えば5xSSC 、50℃の条件下でハイ
ブリダイズし、かつフラバノンからフラボンを生成する
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するも
のである。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は
塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば
アミノ酸6個をコードする18塩基からなるDNAフラグメ
ントをプローブとした場合には50℃以下の温度が好まし
い。
て選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば
植物由来のもの、例えば、キンギョソウやトレニア、シ
ソ由来の遺伝子が挙げられるが、他の植物、例えばリン
ドウやバーベナ、キク、アイリスなどの遺伝子であって
もよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択さ
れる遺伝子はcDNAであってもよく、ゲノムDNA であって
もよい。本発明はさらに配列番号:2,4又は8のいず
れかに記載のアミノ酸配列に対して55%以上、好ましく
は70%以上、例えば80%以上、場合によっては90%以上
の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラバノン
からフラボンを合成する活性を示すタンパク質をコード
する遺伝子に関するものである。
具体的に示すように、例えばcDNAライブラリーのスクリ
ーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸
配列を有する酵素をコードするDNA は生来の塩基配列を
有するDNA を基礎として、常用の部位特定変異誘発やPC
R 法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入
したいDNA 断片を生来のcDNAまたはゲノムDNA の制限酵
素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導
入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはPC
R 法を実施し、所望の修飾を導入したDNA 断片を得る。
その後、この変異を導入したDNA 断片を目的とする酵素
の他の部分をコードするDNA 断片と連結すればよい。
らなる酵素をコードするDNA を得るには、例えば目的と
するアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長ア
ミノ酸配列をコードするDNA を所望の制限酵素により切
断し、その結果得られたDNA断片が目的とするアミノ酸
配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列
からなるDNA 断片を合成し、連結すればよい。
伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定すること
により、得られた遺伝子がフラボン合成酵素をコードす
ることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を
発現させることにより、遺伝子産物であるフラボン合成
酵素タンパク質を得ることができる。あるいはまた、配
列番号:2,4又は8のいずれかに記載のアミノ酸配列
の全部あるいは一部に対する抗体を用いても、フラボン
合成酵素のタンパク質を得ることができ、抗体を用いて
他の生物のフラボン合成酵素遺伝子をクローン化するこ
ともできる。
組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクター
によって形質転換された宿主に関するものである。宿主
としては、原核生物または真核生物を用いることができ
る。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア(Esch
erichia )属に属する細菌、例えば大腸菌(Escherichi
a coli)、バシルス(Bacillus)属微生物、例えばバシ
ルス. スブシルス(Bacillus subtilis )など常用の宿
主を用いることができる。
ば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が
使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス(Sacc
haromyces )属微生物、例えばサッカロミセス. セレビ
シエ(Saccharomyces cerevisiae)等が挙げられ、また糸
状菌としてはアスペルギルス(Aspergillus )属微生
物、例えばアスペルギルス. オリゼ(Aspergillus oryz
ae)、アスペルギルス.ニガー(Aspergillus niger
)、ペニシリウム(Penicillium )属微生物が挙げら
れる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物
細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細
胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細
胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用され
る。
き宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモー
ターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細
菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロ
モーター、例えばtrc プロモーター、tac プロモータ
ー、lac プロモーター等が使用され、酵母用プロモータ
ーとしては、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒド
ロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター等が使用さ
れ、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、
trpC等が使用される。また動物細胞宿主用プロモーター
としてはウイルス性プロモーター、例えばSV40アーリー
プロモーター、SV40レートプロモーター等が使用され
る。
等を用いて常用に従って行うことができる。また、発現
ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うこと
ができる。前記の発現ベクターによって形質転換された
宿主を培養、栽培または飼育し、培養物等から常法に従
って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等
により目的とするタンパク質を回収、精製することがで
きる。
ア及びシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合成
することができるフラボン合成酵素IIについて述べてい
るが、チトクロームP450遺伝子はスーパーファミリーを
形成しており(DNA and CellBiology, 12 (1993) Nelso
n et al., p.1)、同じファミリー内のチトクロームP45
0はアミノ酸配列で40% 以上の相同性を有し、あるいは
サブファミリー内のチトクロームP450はアミノ酸配列で
55% 以上の相同性を有し、遺伝子は互いにハイブリダイ
ズすることが知られている(Pharmacogenetics, 6 (199
6) Nelson et al., p1)。
りフラボノイド合成経路に属するフラボノイド3',5'水
酸化酵素遺伝子は、最初にペチュニアから単離されたが
(Nature, 366 (1993) Holton et al., p.276 )、ペチ
ュニアのフラボノイド3',5'水酸化酵素遺伝子をプロー
ブに用いて、リンドウ(Plant Cell Physiol., 37 (199
6) Tanaka et al., p.711 )、トルコギキョウ、ベルフ
ラワー(WO93/18155 (1993) Kikuchi et al.)、ラベン
ダー、トレニア、バーベナ(植物の化学調節、33 (199
8) 田中ら、p.55)のフラボノイド3',5'水酸化酵素遺
伝子が容易に単離されている。
ニアあるいはシソ由来の、フラバノンから直接フラボン
を合成することができるフラボン合成酵素II遺伝子の一
部または全部をプローブとして用いることによって、別
種の植物から、フラバノンから直接フラボンを合成する
ことができるフラボン合成酵素IIの遺伝子を得ることが
できる。また、本明細書において示したキンギョソウ、
トレニアまたはシソ由来の、フラバノンから直接フラボ
ンを合成することができるフラボン合成酵素IIを精製
し、常法に従って当該酵素に対する抗体を得ることによ
り、その抗体と反応する別のフラボン合成酵素IIのタン
パク質を得、当該タンパク質をコードする遺伝子を得る
ことができる。
あるいはシソ由来の、フラバノンから直接フラボンを合
成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝子のみに
限定されるものではなく、広く他の植物由来の、フラバ
ノンから直接フラボンを合成することができるフラボン
合成酵素IIに関するものである。このようなフラボン合
成酵素II遺伝子の起源としては、ここで述べたキンギョ
ソウ、トレニア及びシソ以外にも、リンドウ、バーベ
ナ、キク、アイリス、シソ、ツユクサ、ヤグルマギク、
サルビア、ネモフィラなどがあるが、本発明の範囲はこ
れらの植物に限定されるものではない。
ボンを合成することができるフラボン合成酵素IIの遺伝
子を導入することにより、色合いが調節された植物もし
くはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、そ
の形態は切り花であってもよい。本発明でクローニング
したフラボン合成酵素IIあるいはその遺伝子を用いる
と、フラボンを全く、あるいはわずかしか生産していな
い植物種、あるいは品種においてフラボンを生産するこ
とができる。花弁において本フラボン合成酵素II遺伝子
を発現させることによって、花弁においてフラボンの量
を増やすことができ、その結果、たとえば花の色を青い
方向に改変できる。
すれば、花の色をたとえば赤い方向に改変することがで
きる。ただし、フラボンが花色におよぼす効果は多彩で
あり花の色の変化はここに述べたものに限定されるもの
ではない。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝
子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に
発現させることは可能であるし、またアンチセンス法や
コサプレッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制
することも可能である。
キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラ
ン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオ
ラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウ
ム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリッ
プ、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマ
ト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、
アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどがあげら
れるがこれらに限定されるものではない。
生理活性を有するので、植物に新しい生理活性や経済的
価値を付与することができる。例えば根において本遺伝
子を発現させフラボンを生産すれば、植物にとって有益
な微生物の増殖を促すことができ、植物の生育を促進す
ることができる。また、ヒトや動物、昆虫に対し生理活
性を示すフラボン類を合成させることもできる。
分子生物学的手法はとくに断らない限り、Molecular Cl
oning (Sambrook et al., 1989 )に依った。実施例1 .キンギョソウフラボン合成酵素II遺伝子のク
ローニング キンギョソウ、エローバタフライ(販売名:株式会社サ
カタのタネ)の若いつぼみ約5gからRNA を抽出し、オ
リゴテックスによりポリA+RNA を得た。このポリA+RNA
を鋳型とし、ラムダZAPII cDNAライブラリー合成キット
(Stratagene社) を用いて、Stratagene社の推奨する方
法(Stratagene社 Instruction Manual,Revision #065
001)によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAラ
イブラリーをCYP93B1 のcDNA全長をプローブとしてスク
リーニングした。スクリーニングならびに陽性クローン
の検出は、DIG-DNA 標識検出キット(ベーリンガー社)
を用いて、同社が推奨する方法を基本とし、下記のよう
な低ストリンジェントな条件で行った。
ァー(5 x SSC, 30%ホルムアミド、50 mM リン酸ナトリ
ウムバッファー(pH 7.0)、1% SDS、2%ブロッキング試
薬(ベーリンガー社)、0.1%ラウロイルサルコシン、80
μg/mlサケ精子DNA )を用い、42℃で2 時間プレハイブ
リダイゼーションを行った後、DIG 標識したプローブを
加え、さらに一晩保持した。メンブレンは1% SDSを含む
5 x SSC洗浄液中、65℃で1.5 時間洗浄した。1 個の陽
性クローンが得られ、ANFNS1と命名した。ANFNS1の5'末
端の塩基配列を決定したところANFNS1はカンゾウCYP93B
1 のコードするフラバノン‐2 ‐水酸化酵素と高い相同
性を有する配列をコードしており、フラバノン‐2 ‐水
酸化酵素と類似の機能をもつP450をコードするものと推
測された。
ン‐2 ‐水酸化酵素のアミノ酸配列との比較の結果、AN
FNS1の cDNA は開始メチオニンから約65アミノ酸残基に
相当する部分を欠く、不完全長のcDNAであると考えられ
た。そこで、ANFNS1の cDNAをプローブとして再度キン
ギョソウのcDNAライブラリーをスクリーニングしたとこ
ろ、全長のアミノ酸配列を含むと考えられるcDNA (ANFN
S2) を得た。ここで得られたANFNS2にコードされるタン
パク質はカンゾウのCYP93B1 にコードされるフラバノン
‐2 ‐水酸化酵素とアミノ酸レベルで53%のホモロジー
を示した。ANFNS2の塩基配列を配列番号:1に示し、そ
してそれから推察されるアミノ酸配列を配列番号2に示
す。
伝子のクローニング トレニア品種(品種名称:サンレニブ、種苗法による品
種登録出願番号:7433号、サントリー株式会社)のつぼ
み約2gからRNA を抽出し、オリゴテックスによりポリA+
RNA を得た。このポリA+RNA を鋳型とし、ラムダZAPII
cDNAライブラリー合成キット(Stratagene社) を用い
て、実施例1で述べたようにStratagene社の推奨する方
法によりcDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブ
ラリーを前述のCYP93B1 cDNAならびに ANFNS1 cDNAの混
液をプローブとしてスクリーニングした。スクリーニン
グならびに陽性クローンの検出は、実施例1 で述べた緩
い条件で行なった。
命名した。TFNS5 cDNAの全塩基配列を決定したところ、
TFNS5 cDNAにコードされるタンパク質は、カンゾウCYP9
3B1にコードされるフラバノン‐2 ‐水酸化酵素とアミ
ノ酸レベルで52% の相同性を示した。また、このTFNS5
cDNAは、実施例1で得られたキンギョソウ由来のcDNA、
ANFNS 2にコードされるタンパク質とは77%の高い相同
性があった。決定した塩基配列を配列番号:3に示し、
そしてそれから推察されるアミノ酸配列を配列番号:4
に示す。
伝子の酵母における発現 実施例2で得られたトレニアのcDNAであるTFNS5 にコー
ドされるタンパク質の酵素活性を検出するために、以下
の実験を行なった。この遺伝子の翻訳領域の外側の一部
を改変して制限酵素部位を導入したセンスプライマー
(5'-AAATAGGATCCAAGCatgGACACAGTCTTAA-3' ;下線、Ba
mHI 部位;小文字、開始コドン)(配列番号:5)及び
アンチセンスプライマー(5'-CCCTTCTAGAtcaAGCACCCGATA
TTGTGGCCGGG-3';下線、XbaI部位;小文字、終始コド
ン)(配列番号:6)、並びにKOD ポリメラーゼ(東洋
紡)を用いてPCR を行った。PCR 条件は98℃ 1分、(98
℃ 15秒、55℃ 10 秒、74℃ 30 秒)を20サイクル、74
℃ 10 分である。
(Stratagene社)のEcoRV 部位に導入後、制限酵素BamH
I とXbaIにより消化し、酵母発現ベクターpYES2 (Invi
trogen社) のBamHI-XbaIに導入した。得られたプラスミ
ドを酵母BJ2168(日本ジーン社)へ導入した。明石らの
文献に述べられた方法(FEBS Lett., 431 (1998) Akash
i et al., p.287 )で酵素活性を測定した。すなわち、
得られた形質転換酵母を20 ml の選択培地(6.7 mg/ml
yeast nitrogen base without amino acids (Difco
社) 、20mg/ml グルコース、30μg/mlロイシン、20μg/
mlトリプトファン、5 mg/ml カザミノ酸)で、30℃ 24
時間培養した。
を発現培地(10 mg/ml酵母エキス、10 mg/mlペプトン、
2 μg/mlヘミン、20 mg/mlガラクトース)で30℃、48時
間培養した。この酵母を集菌後、水に懸濁し、再び集菌
することにより洗浄した。ガラスビーズを用いて10分間
破砕し、8,000xg 、10分間遠心した。この上清をさらに
15,000xgで10分間遠心することにより粗酵素画分を得
た。
メトキシエタノールに溶解)、1 mlの粗酵素液及び1 mM
の NADPHを混合し(総反応液量1.05ml)、30℃にて 2時
間反応させた。30μl の酢酸を加えて反応を停止した
後、1 mlの酢酸エチルを加え、混合した。遠心分離後、
酢酸エチル層をエバポレーターで乾燥させた。これを10
0 μl のメタノールに溶解し、HPLCにて分析した。分析
は明石らの文献に依った。酸処理は、エバポレーターで
乾燥させた標品を150 μl の10%の塩酸を含むエタノー
ルに溶解し30分間攪拌した。これを1.3 mlの水で希釈
し、さらに800 μlの酢酸エチルを加えて混合し、遠心
後、酢酸エチル層を回収した。これを乾燥した後、200
μl のメタノールに溶解し、HPLCにて分析した。
はナリンゲニンから2−ヒドロキシナリンゲニンが生
じ、アピゲニンは生産されていなかった(図1、A)。
この反応液を酸処理することによって2−ヒドロキシナ
リンゲニンからアピゲニンがはじめて生じた(図1、
B)。これに対して、トレニアTFNS5 を発現している酵
母では、反応液の酸処理なしに、ナリンゲニンからアピ
ゲニンが生産された(図1、C)。このことからTFNS5
はフラボン合成酵素IIをコードしていることが明らかと
なった。
II遺伝子の酵母における発現 ANFNS2 cDNA をBamHI とSphIで消化して得られる約1400
bpのDNA 断片と、SphIとBamHI で消化して得られる約35
0bp のDNA 断片と、BamHI とXhoIで消化したpYES2 とを
ライゲーションして得られたプラスミドを、実施例3に
記載と同様な方法で酵母へ導入した。得られた組換え酵
母を用いて、実施例3に記載と同様の方法でフラボン合
成活性を測定した。キンギョソウ由来のANFNS2を発現し
ている酵母では、酸処理無しに、アピゲニンが生産さ
れ、ANFNS2はフラボン合成酵素IIをコードしていること
が明らかとなった。
導入するため、植物発現ベクターを構築した。まず、pB
E2113 −GUS (Plant Cell Physiol., 37 (1996) Mitsuh
ara et al., p.49) をSacIで消化後、ブランティングキ
ット(タカラ)を用いて、平滑末端にした後、XhoIリン
カー(東洋紡)を挿入した。得られたプラスミドをHind
III とEcoRI で消化し、約3kb のDNA 断片を回収した。
このDNA断片をバイナリーベクター pBINPLUS のHindIII
/EcoRI サイトに連結し、pBE2113'とした。なお、今回
用いたベクターpBINPLUSは、アグロバクテリウムを介し
た植物への遺伝子導入の際に広く用いられているバイナ
リーベクターBin19 (Nucl. Acids. Res., 12 (1984) B
evan, p.8711)を、Engelen らの報告(TransgenicRese
arch, 4 (1995) van Engelen et al., p.288 )のよう
に改変して得られたものである。
ベクターから切り出し、得られた約1.7kb フラグメント
を前述のバイナリーベクターpBE2113'のBamHI/XhoIサイ
トに連結した。このようにして得られたコンストラク
ト、pSPB441 は、エンハンサー配列を2 回繰り返した35
S カリフラワーモザイクウイルスプロモーターの制御下
(Plant Cell Physiol., 37 (1996) Mitsuhara et al.,
p.49) 、TFNS5 cDNAをセンス方向に発現させるものであ
る。
種登録出願番号:7433号、サントリー株式会社)を間ら
の方法(Breeding Science, 45 (1995) Aida et al.,
p.71 )に従い、上の実施例5で構築したpSPB441 で形
質転換した。得られた形質転換体の95%以上で、花の色
が元株の濃い紫色から薄い紫色に変化していた。4枚の
花弁のうち、左右の花弁の色を測定した。元株の花弁の
色はイギリス王立園芸協会カラーチャート(The Royal
Horticultural Society Color Chart )ナンバー89A
であったが、形質転換体の花弁の代表的な色は、82C 、
87D、87C 、88D 、91A などであった。この結果、TFNS5
を植物体へ導入することにより、花色を改変できるこ
とが示された。
量が宿主の5分の1から10分の1に、アントシアニン
の量が宿主の約3分の1程度に減少していた。また、宿
主では検出されなかったフラボン生合成の前駆体である
フラバノン(ナリンゲニン、エリオジクチオールおよび
ペンタヒドロキシフラバノン)が検出された。
素の発現 ペチュニア(品種名称:レボリューション・バイオレッ
トミニ、種苗法による品種登録出願番号:9217号、サン
トリー株式会社)にNapoliら(Plant Cell, 2,(1990)
Napoli et al., p.279)らの方法により、pSPB441 を導
入した。得られた形質転換体のうち2株で、花色の変化
が認められ、花色が薄くなった。元株の花色は、イギリ
ス王立園芸協会カラーチャートナンバー88Aであった
が、これらの形質転換株では87Aであった。また、元株
ではフラボンが検出されなかったが、これら形質転換体
の株ではフラボンの一種であるルテオリンが検出され
た。
のクローニング 赤ジソ(Perilla frutescens)の葉からGong等の方法
(Plant Mol. Biol.,35, (1997)Gong et al., p.91
5)で作製したλgt10(Stratagene社)をベクターにし
たcDNAライブラリーを実施例1に記載したような方法で
スクリーニングした。得られたファージクローン#3を
Gong等の方法(Plant Mol. Biol., 35, (1997)Gong e
t al., p.915)にしたがって培養、DNA 調製、サブクロ
ーニングを行ない、塩基配列を決定、配列番号:7に示
した。この塩基配列がコードすると推定されるアミノ酸
配列を配列番号:8に示した。このアミノ酸配列は、TF
NS5,ANFNS2 に対して、それぞれ76%、75%の相同性を
示した。また、CYP93B1 に対しては52%の相同性を示し
た。
の酵母での発現 実施例8で得たファージクローン#3を鋳型にし、ラム
ダアームプライマー(Stratagene社)を用い、実施例3
に述べたような方法によりPCR を行なった。増幅された
DNA 断片をpBluescript KS−のEcoRV サイトにサブクロ
ーニングした。pBluescript KS−上のSalIサイト側にシ
ソフラボン合成酵素IIcDNAの開始コドンがあるクローン
を選択し、これをpFS3と称した。pFS3の挿入cDNAの塩基
配列を決定し、PCR によるエラーがないことを確認し
た。
8kb のDNA 断片とXhoIとXbaIで消化したpYES2 (実施例
3)をライゲーションして得られたプラスミドをpYFS3
とし、これを実施例3に述べたような方法で酵母BJ2168
に導入した。この組換え酵母を用いて、フラボン合成酵
素活性を実施例3に述べたような方法で測定したとこ
ろ、ナリンゲニンからアピゲニンの生成が認められ、シ
ソファージクローン#3のcDNAがフラボン合成酵素II活
性をコードしていることが示された。
に接続し、植物に導入し、フラボン合成酵素を発現させ
たり、発現を抑制することにより、花色を改変出来るよ
うになった。さらに、花弁だけではなく植物体全体また
は適当な器官において本フラボン合成酵素遺伝子を発現
させることによって、植物の抗菌性の上昇や根圏微生物
との共生促進によるマメ科植物の窒素固定能、植物の紫
外線や光に対する防御効果の向上などが可能となる。
パク質によって、ナリンゲニンを基質として生じる生成
物のHPLC分析の結果を示すグラフである。 A及びB:CYP93B1 を発現している酵母の粗酵素画分を
添加したもの C及びD:TFNS5 を発現している酵母の粗酵素画分を添
加したもの A及びC:酵素画分添加による直接の生成物 B:Aの反応後、酸処理を行った場合の生成物 D:Cの反応後、酸処理を行った場合の生成物
Claims (18)
- 【請求項1】 フラバノンからフラボンを合成する活性
を有するタンパク質をコードする遺伝子。 - 【請求項2】 前記遺伝子がフラボン合成酵素IIをコー
ドする遺伝子である請求項1記載の遺伝子。 - 【請求項3】 配列番号:2,4又は8のいずれかに記
載のアミノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合
成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、あ
るいはそれらのアミノ酸配列に対して1個又は複数個の
アミノ酸の付加、欠失及び/または他のアミノ酸による
置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ
フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパ
ク質をコードする請求項1又は2に記載の遺伝子。 - 【請求項4】 配列番号:2,4又は8のいずれかに記
載のアミノ酸配列に対して55% 以上の相同性を示すアミ
ノ酸配列を有し、フラバノンからフラボンを合成する活
性を有するタンパク質をコードする請求項1から3のい
ずれか1項に記載の遺伝子。 - 【請求項5】 配列番号:1,3又は7のいずれかに記
載の塩基配列の一部または全部に対して、5 x SSC 、50
℃の条件下でハイブリダイズする、フラバノンからフラ
ボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする請
求項1から4のいずれか1項に記載の遺伝子。 - 【請求項6】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺
伝子を含んでなるベクター。 - 【請求項7】 請求項6に記載のベクターにより形質転
換された宿主。 - 【請求項8】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の遺
伝子によってコードされるタンパク質。 - 【請求項9】 請求項7に記載の宿主を培養し、又は生
育させ、そして当該宿主からフラボンを合成する活性を
有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タン
パク質の製造方法。 - 【請求項10】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有す
る該植物の子孫またはそれらの組織。 - 【請求項11】 請求項10に記載の植物又はこれと同
じ性質を有するその子孫の切り花。 - 【請求項12】 請求項1〜5に記載の遺伝子を用いて
フラボノイド成分及び/又はその量を変更する方法。 - 【請求項13】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子を用いてフラボン量を変化させる方法。 - 【請求項14】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子を用いて花の色を変える方法。 - 【請求項15】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子を用いて花の色を青くする方法。 - 【請求項16】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子を用いて花の色を赤くする方法。 - 【請求項17】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子を用いて植物の光感受性を改変する方法。 - 【請求項18】 請求項1〜5のいずれか1項に記載の
遺伝子を用いて植物と微生物の相互作用を制御する方
法。
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