DE19918365A1 - Genetische Sequenz, die für Flavonsynthase II Enzyme kodiert, und deren Verwendung - Google Patents

Genetische Sequenz, die für Flavonsynthase II Enzyme kodiert, und deren Verwendung

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoidstoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthese II (FNS II) oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Flavongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüber hinaus die Verwendung in Expressionssystemen zur Synthese von natürlichen, funktionellen Flavonen für medizinische oder ähnliche Anwendungen, z. B. zur Krebstherapie oder Verbesserung der menschlichen Immunabwehr.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoid­ stoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthase II (FNS II) oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Fla­ vongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüberhinaus die Verwendung in Expressionssystemen zur Syn­ these von natürlichen, funktionellen Flavonen für medizinische oder ähnliche Anwendungen, z. B. zur Krebstherapie oder Verbesserung der menschlichen Immunabwehr.
Flavonoide und deren Funktion in der Pflanze
Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Pflanzenpigmente, die in ver­ schiedenen Geweben, wie z. B. Blüten, Blättern oder Wurzeln nachgewiesen wurden. Dar­ über hinaus gehören sie zu den am besten charakterisierten sekundären Metaboliten in Pflanzen. Mehr als 3000 verschiedene Flavonoide sind bislang charakterisiert worden. Sie sind in verschiedene Unterklassen (z. B. Flavone, Flavonole oder Anthocyane), basierend auf dem Grad der Oxidation des zentralen C-Ringes, eingeteilt worden. Jeder Typ kann dar­ überhinaus durch Hydroxylierung, Acylierung und Glykosylierung modifiziert werden (Heller und Forkmann, 1994). Aufgrund der unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaf­ ten der Moleküle besitzen die Unterklassen zum Teil sehr verschiedene biologische Funktio­ nen.
Die Akkumulation bestimmter Flavonoide in einer Pflanzenzelle ist abhängig von der Verfüg­ barkeit der jeweiligen Enzyme, wobei die Verfügbarkeit der Enzyme letztendlich von der Expression des entsprechenden Gens abhängt. Die Regulierung der Expression von Flavo­ noidbiosynthese-Genen wird im wesentlichen von der Pflanzenart, dem Entwicklungssta­ dium und den Umweltbedingungen bestimmt.
Flavonoide spielen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Pflanze eine wichtige Rolle. So wurde z. B. gezeigt, daß bestimmte Flavonole für das Pollenschlauchwachstum erforderlich sind. Wird die Akkumulation der Flavonole durch eine Blockierung des Biosyntheseweges unterdrückt, erhält man sterile Pollen (Taylor and Jorgensen, 1992). Sowohl biotische als auch ablotische Signale können während der Interaktion der Pflanze mit ihrer Umwelt zu einer Flavonoidakkumulation führen. So führt z. B. eine UV-Bestrahlung zu einer Akkumula­ tion von Flavonolen und Flavonen. Dies wird durch die Induktion der Transkription der jewei­ ligen Flavonoidbiosynthese-Gene in verschiedenen Arten erreicht (Kubasek et.al., 1992). Aber auch andere Streßfaktoren wie Verwundung, extreme Temperaturschwankungen und Wasserstreß können die Flavonoidakkumulation und/oder Genexpression in verschiedenen Arten induzieren (Hrazdina, 1982). Bei der Interaktion von Pflanzen mit anderen Organismen wird den Flavonoiden eine doppelte Funktion zugeordnet. Zum einen besitzen die Flavo­ noide als phenolische Verbindungen eine Wirkung als Phytoalexin gegen verschiedene Pathogene und als Abschreckung gegen Fraßfeinde (Harborne und Grayer, 1994), zum anderen sind sie verantwortlich für die Kommunikation zwischen Pflanzen aus der Familie der Leguminosen und bestimmten Mikroorganismen. Flavonoide dienen hierbei als Signal­ stoffe für Stickstoff-fixierende Bakterien, in denen daraufhin Gene exprimiert werden, die für die Symbiose mit der Pflanze erforderlich sind (Redmond et.al., 1986). In Blüten, Blättern und Früchten sind Flavonoide, besonders die farbigen Anthocyane, aber auch Chalkone, Aurone, Flavone und Flavonofe, für die Farbgebung und für die Muster der verschiedenen sekundären Inhaltsstoffe verantwortlich. Letzteres ist zusammen mit anderen Merkmalen, wie z. B. dem Duft, wichtig für die Erkennung durch verschiedene Tiere, aber auch für den Menschen, der die Pflanze als Schmuck oder zur Ernährung verwendet (Harborne und Grayer, 1994). Außerdem beeinflussen bestimmte Flavonoide, wie z. B. das Flavon Apigenin und das Flavonol Quercetin, den Auxin Transport innerhalb der Pflanze (Jacobs und Rubery, 1988).
Der Flavonoidbiosynthese-Weg (Abb. 1A)
Die Struktur der Flavonoide besteht aus zwei aromatischen Ringen (A und B) und einem zentralen Heterozyklus (C) (Abb. 1B). In der Pflanze werden sie ausgehend vom L- Phenylalanin über den Phenylpropanoid-Weg durch die enzymatische Reaktion der Phenylalanin-Ammonia-Lyase (PAL) und der Zimtsäure-4-Hydroxylase (4CL) gebildet. Aus dem hieraus resultierenden 4-Cumaroyl-CoA entsteht zusammen mit 3 Molekülen Malonyl- CoA Tetrahydroxychalkon. Diese Reaktion wird durch die Chalkonsynthase (CHS), dem Schlüsselenzym der Flavonoidbiosynthese, synthetisiert (Abb. 1A). Das Tetrahydroxychal­ kon (THC) wird normalerweise schnell zu Naringenin (NAR) durch das Enzym Chalkoniso­ merase (CHI) isomerisiert. In verschiedenen weiteren Reaktionen entstehen die Anthocyane. Flavone werden auf einem Nebenweg durch die FNS I oder die FNS II, einem Cytochrom P450-Enzym, gebildet. Diese Enzymklasse ist in der Natur weit verbreitet und verschiedene Gene für Cytochrome P450 Enzyme wurden aus Vertebraten, Insekten, Hefen, Pilzen, Bak­ terien und Pflanzen isoliert und sequenziert.
Die Flavonsynthase verwendet verschiedene Flavanone, wie z. B. NAR oder Eriodictyol (ERI) als Substrat, um die entsprechenden Flavone Apigenin (Ap) und Luteolin (Lu) zu synthetisie­ ren. Dabei wird, wie in Abb. 1B dargestellt, zwischen der C2- und der C3-Position eine Doppelbindung eingefügt. Flavone können in der Pflanze in glykolysierter oder auch methy­ lierter Form vorliegen.
In vitro wurde die Bildung von Flavonen aus Flavanonen zuerst mit Enzympräparationen von UV-bestrahlten Petrosellum crispum-Zellsuspensionskulturen beobachtet. Bei dem entspre­ chenden Enzym handelt es sich um eine lösliche 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase, die Flavonsynthase I (FNS I) genannt wurde. In den Blüten von verschiedenen Flavon-produzie­ renden Pflanzen, z. B. Sinningia cardinalis, Antirrhinum majus, Verbena Hybrida, Columnea hybrida, Chrysanthemum morifolium, Gerbera Hybriden und osmotisch induzierten Glycine max-Zellsuspensionskulturen, wird diese Reaktion jedoch von der oben bereits erwähnten FNS II katalysiert, einem NADPH-abhängigen, mikrosomalen Enzym, das zur Klasse der Cytochrom P450 gehört (Heller und Forkmann, 1994). In den Blüten von Gerbera Hybriden kontrolliert der Locus Fns die Bildung der Flavone. Eine Synthese von Flavonen kann nur in Linien mit dominantem Allel nachgewiesen werden, in homozygot rezessiven Linien ist keine FNS II-Aktivität nachweisbar (Abb. 2; Martens und Forkmann, 1998).
Drei Typen von Pigmenten sind für die Farben in Blüten verantwortlich: Betalaine, Caro­ tinoide und Flavonoide. Betalaine kommen nur in einigen wenigen Familien der Centrosper­ mae vor, wo sie für gelbe, orange, rote und violette Farben verantwortlich sind. Carotinoide ergeben orange oder gelbe Töne und sind die Hauptpigmente in den meisten orangen und gelben Blüten. Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Blüten- bzw. Pflanzenpigmente. Zu dieser Gruppe gehören die farbgebenden Anthocyane, die glykosyliert und oft acyliert in der Vakuole vorliegen. Unterschiedliche Anthocyane können dabei ver­ schiedene Farbtöne produzieren. Die Blütenfarbe wird darüber hinaus auch vom pH-Wert der Vakuole, der Komplexierung mit Metallen und dem Glykosylierungs- bzw. Acylierungs­ muster beeinflußt (Forkmann, 1991). Ein weiterer wichtiger Faktor für die Entstehung von verschiedenen Blütenfarben ist die Kopigmentierung der Anthocyane mit farblosen Flavonoi­ den, wie z. B. Flavonen oder Flavonolen oder auch Tanninen (Scott-Moncrieff, 1936). Antho­ cyane, die mit Flavonen kopigmentiert sind, können verschiedene Farben annehmen, die von der Grundstruktur des Anthocyan abhängen, und zwischen purpurrot und blau variieren können (Asen und Horowitz, 1974; Goto und Kondo, 1991). Verschiedene Flavone, wie z. B. das Isoetin, sind darüber hinaus auch als gelbe Blütenpigmente identifiziert worden (Harborne, 1978).
Ein wichtiges Ziel in der gartenbaulichen Pflanzenzüchtung ist die Entwicklung von neuen Sorten bei blühenden Zierpflanzen. Klassische Züchtungsmethoden wurden in der Vergan­ genheit teilweise erfolgreich zur Etablierung für eine Reihe von verschiedenen Farben bei vielen wirtschaftlich wichtigen Zierpflanzen eingesetzt. Jedoch schränkt der Genpool der einzelnen Arten die Möglichkeiten für solche Ansätze auf natürliche Art und Weise ein. Aus diesem Grund gibt es bis heute nur wenige Arten, die das gesamte Farbspektrum besitzen. Außerdem kann durch die klassischen Züchtungsmethoden keine präzise Veränderung erzielt werden. Da der ästhetische Wert einer Blüte von verschiedenen Faktoren wie z. B. Form, Duft und Farbe bestimmt wird und eine Veränderung eines dieser Faktoren durch Kreuzung in der Regel nur auf Kosten von ähnlichen, anderen sichtbaren Merkmalen erzielt oder nur mit sehr hohem zeitlichen und finanziellen Aufwand erreicht werden kann, muß ein effektiverer Weg zu neuen Sorten genutzt werden. Die Möglichkeit, gezielt Blütenfarben von Pflanzen zu verändern, bringt eindeutige Vorteile gegenüber anderen Methoden. Dies ist besonders in einem Bereich wichtig, der einen hohen Produkt-Turnover besitzt und wo Neu­ heit ein wichtiger Marktfaktor ist. Zum Beispiel würde die Entwicklung von blaublühenden Sorten bei den Hauptschnittblumen-Arten wie Rosen, Chrysanthemen, Nelken, Lilien, Tulpen und Gerbera einen wesentlichen Marktvorteil auf dem Schnittblumenmarkt, aber auch auf dem Topfpflanzenmarkt mit sich bringen. Die Möglichkeit der Kontrolle der Synthese von Kopigmenten, z. B. Flavone, in Pflanzen ist eine nützliche Anwendung bei der gezielten Ver­ änderung der Blütenfarben. Außerdem kann diese Anwendung neben den Blüten auch auf Früchte und andere Nutzpflanzen, z. B. auf Obst- und Gemüsepflanzen, und auf Blätter, z. B. bei Zierpflanzen, übertragen werden.
Neben ihrem Beitrag zur Blütenfarbe besitzen die Flavonoide, speziell die Flavone, noch weitere biologische Eigenschaften und Wirkungen. Sie wurden z. B. bei einigen Pflanzen als Fraßstimulanz für monophage und oligophage Insekten gefunden (Harborne und Grayer, 1994). In den meisten Fällen zeigen die Glykoside dabei eine bei weitem größere Wirkung als die entsprechenden Aglyka, was vermutlich auf die bessere Löslichkeit der Glykoside zurückzuführen ist. Außerdem können die Insekten zwischen verschiedenen Zuckerresten unterscheiden, wodurch eine weitere Differenzierung der aktiven Komponenten gegeben ist. Auch die Grundstruktur der Aglyka kann zu unterschiedlichen Wirkungen führen. Im Ver­ gleich zu vielen anderen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen haben die Flavonoide bzw. die Flavone offensichtlich keine sehr toxische Wirkung auf Insekten. Trotzdem gibt es einige Flavone, die schon bei geringen Konzentrationen als Abschreckung für Fraßinsekten fungie­ ren oder das Wachstum der Tiere erheblich hemmen können. Ein Einfluß der Glykosylie­ rungsart konnte hier nicht gezeigt werden, wohl aber der der Hydroxylierung bzw. Methoxy­ lierung des Flavons (Harborne und Grayer, 1994).
Verschiedene Flavone stimulieren darüber hinaus auch Schmetterlinge zur Eiablage auf bestimmten Pflanzen. Es wurde gezeigt, daß die Tiere erst nach dem Erkennen des Stimu­ lus ihre Eier abfegen. Zu solchen stimulierenden Substanzen gehören z. B. die Flavone Vicenin-2 und verschiedene Luteolin-Derivate. Unterbindet man die Synthese dieser Stoffe in den jeweiligen Wirtspflanzen, können Eiablagen der Schmetterlinge und damit Fraßschä­ den durch deren Raupen verhindert werden.
Durch die Ausnutzung natürlicher chemischer Abwehrmechanismen der Pflanzen können Probleme, die die Verwendung von synthetischen Insektiziden mit sich bringt, wie z. B. die Umweltbelastung, die durch Reste der eingesetzten Stoffe in der Frucht und im Boden auf­ treten, vermieden werden. Außerdem wird eine Resistenzbildung, wie sie bei den meisten synthetischen Pestiziden beobachtet wird, umgangen oder zumindestens verzögert und es werden die zum Teil erheblichen Kosten für Mittel und Ausbringung eingespart.
Eine weitere wichtige biologische Eigenschaft der Flavonoide betrifft die Aktivierung der Nodulationsgene in verschiedenen Rhizobium-Arten. Diese Bakterien infizieren Legumino­ sen und bilden Stickstoff-fixierende Wurzelknöllchen. Die von der Wirtspflanze produzierten Flavonoide fungieren dabei als "Signalstoff", wodurch die Bakterien den Infektionsprozeß einleiten. Zu diesen pflanzenspezifischen, aktiven Verbindungen gehören auch verschiedene Flavone, wie z. B. Apigenin, Luteolin und 7,4'-Dihydroxyflavon (Firmin et.al., 1986; Redmond et.al., 1986). Wird die Flavonproduktion und deren Abgabe durch die Wurzel bzw. das Fla­ vonmuster in diesem Gewebe verändert, kann eine Verbesserung der Stickstoff-Fixierung oder aber eventuell eine Etablierung dieses Mechanismus bei nicht Leguminosen Pflanzen erreicht werden.
Durch Ausnutzung dieser natürlichen Symbiosemechanismen kann die Stickstoff-Düngung und damit die Belastung der Umwelt durch die Auswaschung der Nährstoffe reduziert wer­ den. Zudem werden Kosten für die Düngermittel und deren Ausbringung eingespart.
Innerhalb der Pflanze beeinflussen verschiedene natürlich vorkommende Flavonoide, wie z. B. das Flavon Apigenin oder die Flavonole Kaempferol und Quereetin, den Auxin-Trans­ port in unterschiedlichen Pflanzengeweben und Transportsystemen. Sie verhalten sich dabei ähnlich wie synthetische Transportinhibitoren. Auxine beeinflussen als pflanzeneigene Wachstumsregulatoren die Zellstreckung, Zellteilung, Apikaldominanz, Wurzel- und Sproß­ neubildung sowie die Parthenokarpie. Eine induzierte, veränderte Flavonoidkonzentration (endogene Veränderung und/oder exogene Applikation) kann somit über die Interaktion mit Auxinen das Wachstum von Pflanzen erheblich beeinflussen. Dadurch können synthetische Wuchshemmstoffe ersetzt werden.
Flavonoide besitzen als bioaktive Substanzen darüber hinaus auch eine nicht unbedeutende Rolle bei der menschlichen und tierischen Ernährung. Sie kommen in Früchten, Gemüsen, Nüssen, Samen, Stengeln, aber auch in Tee und Wein vor. Schon seit längerem werden den Flavonoiden, auch verschiedenen Flavonen, antiallergische, entzündungshemmende, antivi­ rale, proliferationsreduzierende und anticanzerogene Eigenschaften zugesprochen. Aber auch ein Einfluß auf den menschlichen und tierischen Stoffwechsel und das hochkomplexe Immunsystem wird beschrieben. Die Flavonoide bzw. Flavone beeinflussen in diesem Zusammenhang eine große Anzahl verschiedener Enzyme (z. B. die Hyaluronidase- oder Aldose-Reduktase), sie besitzen wichtige, enzyminduzierende und antioxidative Eigenschaf­ ten, können freie Radikale abfangen, chelatieren verschiedene Metallkationen und beein­ flussen auch die zelluläre Proteinphosphorylierung (Middleton und Kandaswami, 1994).
Die Verbesserung von Nutzpflanzen, die für die Ernährung von Mensch und Tier aufgrund ihres Gehalts an gesundheitsfördernden Flavonoiden wichtig sind, durch die gezielte Verän­ derung des Gehalts oder Musters der entsprechenden Verbindungen, leistet einen erhebli­ chen Beitrag zur gesunden Ernährung von Mensch und Tier.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren bereitzustellen, um gezielt die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen zu verän­ dern und zu steuern, um z. B. die Blütenfarbe einer Pflanze zu verändern oder die Resi­ stenzeigenschaften und Symbiosefähigkeit einer Pflanze zu verbessern.
Weiterhin war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel und Verfahren bereitzustel­ len, die zur gezielten Synthese von definierten Flavonen verwendet werden können. Derartig gewonnene Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Patentansprüche gelöst.
Die Erfindung betrifft daher eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Flavonsynthase II (FNS II) kodiert. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder einen Teil hiervon. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleinsäure­ sequenz oder einem Teil hiervon hybridisiert und/oder mindestens eine 40%ige, besser eine mindestens 45%ige, noch besser eine mindestens 55%ige oder am besten mindestens eine 65-70%ige Homologie oder am besten eine Homologie größer als 85% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Berei­ chen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz besitzt. Bevorzugt kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Protein oder Polypeptid mit der bio­ logischen Aktivität einer Flavonsynthase. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist bezogen auf eine Nukleinsäurese­ quenz gemäß der vorhergehenden Ausführungsformen. In einer bevorzugten Ausführungs­ form ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz DNA oder RNA und ist abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, wie z. B. aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfin­ dungsgemäße Nukleinsäuresequenz eine rekombinante Nukleinsäuresequenz. Des weiteren betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die zu der Flavonsynthase II (FNS II)-kodie­ renden Sequenz komplementär ist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung, die eine für Flavonsynthase II (FNS II) oder für ein funktionelles Derivat dieses Enzyms kodierende Nukleinsäure oder eine komplementäre Nukleinsäure umfaßt. Mit dem Begriff "FNS II Enzym" sind Enzyme des Flavonoidbiosyntheseweges gemeint, die Flavanone wie Narin­ genin und Eriodictyol oder auch andere Verbindungen aus dieser Klasse als Substrat für die Synthese der entsprechenden Flavone verwenden.
Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die aus dem natürlichen Umfeld isoliert oder chemisch synthetisiert wurde. Insbesondere bevorzugt sind Nukleinsäuremoleküle, die in vitro gebildet oder erhalten werden, einschließlich genomischer DNA-Fragmente, rekom­ binanter und synthetischer Moleküle und Nukleinsäuren in Kombination mit heterologen Nukleinsäuren. Dies umfaßt auch genomische DNA oder cDNA oder Teile davon, die die FNS II oder Teile davon in reverser Orientierung zum entsprechenden oder einem anderen Promotor kodieren. Weiter eingeschlossen sind natürlich vorkommende, nahe verwandte Nukleinsäuresequenzen.
Der Begriff "Nukleinsäuresequenz, kodierend eine Flavonsynthase II", wird hierbei in der allgemeinsten Form gebraucht und umfaßt jede aufeinanderfolgende Reihe von Nukleotid­ basen, die direkt oder über eine komplementäre Reihe von Basen eine Aminosäuresequenz einer FNS II bestimmt.
Ein Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz der Flavonsynthase II meint eine vollständige (full length) FNS II oder eine aktive, unvollständige Form derselben.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die als genetische Proben oder als "Antisense"-Moleküle zur Regulierung der Expression des entsprechenden Gens in Pflanzen oder anderen Organismen verwendet werden können. Ein "Antisense- Molekül", wie es hier beschrieben ist, umfaßt auch ein Genkonstrukt, das aus einem struktu­ rellen, genomischen oder einem cDNA-Gen oder einem Teil hiervon in reverser Orientierung in Bezug auf seinen oder einen anderen Promotor besteht.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz, die für die FNS II oder für verschiedene funktionelle Derivate dieser kodiert, zur Reduzierung der Aktivität von endoge­ ner FNS II verwendet, oder alternativ wird eine Nukleinsäuresequenz, die dieses Enzym oder verschiedene Derivate oder Teile davon kodiert, in Antisense-Orientierung verwendet, um die Aktivität der FNS II zu reduzieren. Darüber hinaus ist es aber auch möglich, daß ein Antisense-Transkript der FNS II oder ein Fragment oder ein Teil der FNS II (z. B. ein Oligo­ nukleotid-Molekül) eine Duplex mit allen oder Teilen der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingeht und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindert. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Ribozymen, um spezielle Nukleinsäuresequenzen zu inaktivieren.
Hier erwähnte Änderungen der FNS II-Aktivität betreffen eine Erhöhung oder Reduzierung der Aktivität von bis zu 30% oder besser von 30 bis 50% oder noch besser 50 bis 75% bzw. am besten von 75% oder noch höher bzw. niedriger zum normalen, endogenen oder existie­ renden Wert der Aktivität. Die Höhe der Aktivität kann leicht mit der bei Martens und Fork­ mann (1998) beschriebenen Methode getestet werden (siehe Beispiel 3).
Bei der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäure kann es sich auch um eine Ribonu­ kleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure handeln, die als einzelsträngiges oder doppel­ strängiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen kann. Üblicherweise liegt das Nukleinsäuremolekül als cDNA vor. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch andere Nukleinsäuremoleküle, die unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hochstringenten Bedingungen mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder speziell mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz oder einem Teil oder einem Bereich davon hybridisieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder ein Molekül, das mindestens eine 40%ige, besser eine mindestens 45%ige, noch bes­ ser eine mindestens 55%ige oder am besten mindestens eine 65-70%ige oder am besten eine Ähnlichkeit höher als 85% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäure­ sequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz besitzt und wobei die Nukleinsäure kodierend oder komplementär zu einer Sequenz ist, die ein Enzym kodiert, das FNS II-Aktivi­ tät besitzt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter Nukleinsäuremoleküle in der Form von Oligo­ nukleotid-Primern oder kompetente Proben zur Hybridisierung mit einem Teil der oben betrachteten Nukleinsäuremoleküle und spezielle mit dem in SEQ ID NO: 1 dargestellten. Die Hybridisierung kann unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hochstringen­ ten Bedingung erfolgen. Bevorzugterweise entspricht der Teil dem 5'- oder 3'-Ende des Gens. Aus Zweckmäßigkeit wird das 5'-Ende hier definiert als der Bereich hauptsächlich zwischen dem Startcodon der strukturellen, genetischen Sequenz bis zum mittleren Bereich des Gens. Das 3'-Ende wird hier betrachtet als der Bereich, der die strukturelle genetische Sequenz zwischen dem mittleren Bereich des Gens und dem Stopcodon definiert. Es ist daher klar, daß Oligonukleotide oder Proben mit dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende oder mit einem Bereich gemeinsam zu beiden, dem 5'- oder 3'-Ende, hybridisieren können. Die vor­ liegende Erfindung umfaßt alle solche Proben. Bevorzugte Oligonukleotide sind in Beispiel 4 dargestellt.
Die Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann das vollständige Enzym oder einen Teil oder ein Derivat kodieren. Mit "Derivat" ist eine einzelne oder multiple Aminosäuresubsti­ tution, -deletion und/oder -addition in Bezug zum natürlich vorkommenden Enzym gemeint, wobei vorzugsweise die Flavonsynthase II-Aktivität erhalten bleibt. In diesem Zusammen­ hang umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure die natürlich vorkommende Nukleotidse­ quenz, die für die FNS II kodiert und einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung oder ihre komplementäre Form kann auch einen Teil der FNS II kodieren, entweder aktiv oder inaktiv. Solch ein Nukleinsäuremolekül kann als Oligonukleotid-Probe, als Primer für die Polyme­ rasekettenreaktion, in verschiedenen mutagenen Techniken oder zur Erstellung von Anti­ sense-Molekülen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine erfindungs­ gemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante DNA-Molekül ein Vektor oder ein Vektor mit einem Promotor. In einer besonders bevorzug­ ten Ausführungsform ist der Promotor zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure fähig. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einer von beiden Orientie­ rungen in Kombination mit einem Vektormolekül, z. B. einem Expressionsvektor, vorliegen. Der Begriff "Vektormolekül" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um jegliche intermediären Vehikel für das Nukleinsäuremolekül einzuschließen, die es z. B. er­ möglichen, die Nukleinsäure in Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, zu transferieren und/oder sie in ein Genom zu integrieren. Bevorzugt werden diese Vektormoleküle oder Teile davon zur Integration in ein Pflanzengenom verwendet. Solche Vektormoleküle können in prokaryotischen Zellen und/oder in eukaryotischen Zellen repliziert und/oder exprimiert werden. Ein intermediäres Vehikel kann z. B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuß, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA-Viren angepaßt sein. Das intermediäre Vehikel und/oder das darin enthal­ tene Nukleinsäuremolekül kann stabil im Pflanzengenom integriert werden. Das Nukleinsäu­ remolekül kann zusätzlich auch noch eine Promotor-Sequenz beinhalten, die zur Einleitung der Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, insbesondere einer Pflanzenzelle, geeignet ist. Das Nukleinsäuremolekül und der Promotor können ebenfalls durch verschie­ dene Verfahren (siehe oben) in die Zelle eingeführt werden.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die diese erfindungsgemäßen DNA-Moleküle enthal­ ten. Die Wirtszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, insbesondere Hefezellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polypeptid, das durch eine erfindungsgemäße Nuklein­ säure kodiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypep­ tid mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einen Teil hiervon oder Deri­ vate davon. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, wie z. B. aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningie Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden). In einer besonders bevorzugten Aus­ führungsform besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid Flavonsynthase II-Aktivität.
Derivate im Sinne dieser Erfindung sind Aminosäure-Insertionsderivate, Deletionsderivate und/oder Substitutionsaminosäure-Varianten der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2.
Aminosäure-Insertionsderivate der erfindungsgemäßen FNS II umfassen sowohl Amino- und Carboxylenverschmelzungen als auch Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäu­ ren innerhalb der Sequenz. Insertionsaminosäure-Sequenzvarianten sind solche, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Stelle in das Protein eingefügt worden sind, obgleich eine zufällige Insertion mit einem geeigneten Screening des Produkts auch möglich ist. Deletionsvarianten sind charakterisiert durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz. Substitutionsaminosäure-Varianten sind solche, bei denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an dieser Stelle eingefügt worden ist. Typische Substitutionen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1 Geeignete Reste für eine Aminosäure Substitution
Original Aminosäure
Exemplarische Substitution durch
Aln Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Im allgemeinen werden Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, sehr umfangreiche Seitenket­ ten und ähnliches. Substitutionen von Aminosäuren betreffen in der Regel nur einen Rest, wohingegen Insertionen normalerweise einen Bereich von 1 bis 10 Aminosäureresten und Deletionen einen Bereich von 1 bis 20 Resten betreffen. Deletionen und Insertionen werden bevorzugt an nebeneinanderliegenden Paaren durchgeführt, z. B. eine Deletion von zwei Resten oder eine Insertion von zwei Resten.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten erfindungsgemäßer Derivate können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z. B. durch Solid Phase Synthesis und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DNA-Manipulationen hergestellt werden.
Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA durchzuführen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und schließen z. B. M13-Mutagenese ein. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z. B. in Sambrook et.al. (1989) ausführlich beschrieben.
Andere Beispiele von rekombinanten oder synthetischen Mutanten und Derivaten der erfin­ dungsgemäßen FNS II schließen einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assoziiert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide, ein.
Die Begriffe "Analogon" und "Derivat" erstrecken sich auch auf alle funktionellen chemischen Äquivalente der FNS II und auch auf alle Aminosäurederivate, die oben bereits beschrieben wurden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Formen der FNS II. Die rekombinanten Formen des Enzyms bieten eine Möglichkeit, um z. B. aktivere Enzyme oder Systeme zur in vitro-Produktion verschiedener Flavone zur Verwendung in verschiedenen Bereichen, wie z. B. der Humanmedizin, zu entwickeln. Letzteres System kann unter ande­ rem in der Krebsforschung zur Anwendung kommen.
in einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet und ist gegebenenfalls regulierbar oder wird in der Pflanze entwicklungsabhängig reguliert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form ist die transgene Pflanze ausgewählt aus der Gruppe von flavonhaltigen Pflanzen, wie z. B. aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden), trägt eine endogene FNS II und enthält weiterhin eine erfindungsgemäße, nicht­ endogene FNS II-Nukleinsäüresequenz.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz, die für eine FNS II oder ein Derivat oder einen Teil dieser kodiert, in eine Pflanze in einer von beiden mögli­ chen Orientierungen eingeführt und dort exprimiert werden und dadurch die Möglichkeit bie­ ten, entweder Naringenin (NAR) und/oder andere geeignete Substrate, wenn sie in der Pflanzenzelle synthetisiert werden, umzuwandeln, was letztendlich zur Bildung von ver­ schiedenen Flavonen führt. Darüber hinaus kann die Bildung dieser Metaboliten durch Reduktion oder Eliminierung endogener oder vorhandener FNS II-Aktivität verhindert wer­ den. Die Synthese von Flavonen führt zu einer Veränderung der Blütenfarbe, bei Gerbera. Am Beispiel der für den Locus Fns heterozygoten, flavonhaltigen, orangen Sorte "Th 58" (fns+ fns) konnte in Selbstungsnachkommenschaften eine Farbvariation von dunkelrot (flavonfrei; Genotyp: fns fns) über verschiedene orangerot Töne (flavonhaltig; Genotyp: fns+ fns) bis zu einem gelborange (stark flavonhaltig; Genotyp: fns+ fns+) gezeigt werden. Dieses Experiment läßt sich beliebig auf andere für den Locus Fns heterozygote Gerbera Sorten übertragen (siehe auch Beispiel 2). Die Expression der Nukleinsäuresequenz in einer von beiden möglichen Orientierungen in der Pflanze kann konstitutiv, induzierbar oder ent­ wicklungsbezogen und auch gewebespezifisch sein. Das Wort "Expression" ist dabei in sei­ ner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um die Produktion von RNA oder von beidem, RNA und Protein, einzuschließen. Es ist auch auf eine teilweise Expression von Nukleinsäu­ remolekülen ausgedehnt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die fähig sind, FNS II oder aktive Mutanten oder Derivate zu synthetisieren. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für die besagte FNS II kodiert, unter Bedingungen, die die mögliche Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls herbeiführt, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Wachstum dieser transgenen Pflanze für eine bestimmte Zeit und unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Expression der Nukleinsäure herbeizuführen. Die transgene Pflanze kann höhere Werte einer FNS II-Aktivi­ tät im Vergleich zu dem Wert, der in vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen gemessen wird, zeigen oder die Werte können niedriger sein im Vergleich zu denen von vergleichba­ ren, nicht-transgenen Pflanzen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transge­ nen Pflanze mit reduzierter, endogener oder vorhandener FNS II-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nuklein­ säuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die eine Sequenz oder eine komplemen­ täre Sequenz der FNS II kodiert, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und, falls nötig, das Heranziehen dieser transgenen Pflanze unter geeigneten Bedingungen, um die Expression von Nukleinsäuren zu erreichen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze mit reduzierter endogener oder vorhandener FNS II-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die Veränderung des FNS II-Gens durch eine Modifikation der endogenen Sequenz über homologe Rekombination, ausgehend von einem entsprechend veränderten Gen einer FNS II oder eines Derivats oder eines Teils davon. Das Gen wird in die Pflanzen­ zelle eingeführt und eine genetisch modifizierte Pflanze wird aus der Zelle regeneriert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen, blühenden Pflanze mit veränderten Blüteneigenschaften. Dieses Verfahren umfaßt das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in eine Zelle einer geeigneten flavonfreien Pflanze, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen einer transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter Bedingungen, um die Expression der erfindungsgemäßen, eingebrachten Nukleinsäuresequenz zu erreichen. Die transgene Pflanze kann zum Beispiel ausgewählt sein aus der Gruppe von flavonhaltigen Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulcherrima), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec.), Begonia (B. spec.), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die trans­ gene Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase II fähig. Eine derartige trans­ gene Pflanze kann z. B. ausgewählt sein aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Ger­ bera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbene Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird diese endogene Flavonsynthase II bei Expres­ sion der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure coexprimiert.
In einer Ausführungsform wird die endogen vorhandene Flavonsynthase II-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Trans­ formation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ sequenz oder einer dazu komplementären Sequenz, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um die Höhe der Aktivität der endogenen oder vorhandenen FNS II zu verändern. Bevorzugterweise ist der veränderte Wert geringer als das endogene oder vorhandene Level der FNS II-Aktivität in einer vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanze. Gegebenenfalls ist für die Reduktion der endogenen FNS II-Aktivität die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz oder deren komplementären Sequenz erforderlich.
Somit kann eine Expression der eingeführten genetischen Sequenz oder ihres komplemen­ tären Analogon nötig sein, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Dies meint im wesent­ lichen eine blühende Pflanze mit veränderten Blüteneigenschaften.
In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer blühenden Pflanze, die unterschiedliche Blüteneigenschaften zeigt. Dieses Verfahren umfaßt Veränderungen des FNS II-Gens durch Modifikation der endogenen Sequenzen über homologe Rekombination eines entsprechend veränderten Gens einer FNS II oder eines Derivats oder eines Teils davon, die Einführung in die Pflanzenzelle und die Regeneration der genetisch veränderten Pflanze aus der Zelle.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann darüber hinaus entwicklungsabhängig reguliert werden. In der Regel schließt eine veränderte Infloreszenz die Produktion von schwächer gefärbten Blüten oder auch anderen Farbtönen ein, abhängig von den physiolo­ gischen Bedingungen der Empfängerpflanze. Mit "Empfängerpflanze" ist eine Pflanze gemeint, die eine meßbare Menge Substrat für das FNS II-Enzym oder die FNS II selbst produziert und die entsprechenden physiologischen Eigenschaften und Genotyp besitzt, die notwendig für die Entwicklung der gewünschten Farben sind. Dies schließt folgende Pflan­ zen ein, ist aber nicht auf diese begrenzt Gloxinie (Sinningia Hybriden), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Columnea (Columnea Hybriden), Dahlie (Dahlia variabilis), Gloxinie (Sinningia cardinalis), Streptocarpus (Streptocarpus Hybridus), Verbene (Verbene Hybrida), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Einblatt (Spathiphyllum wallisii), Petunie (Petunia Hybrida), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybriden) und Pelargonie (P. spec.).
Entsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer trans­ genen Pflanze, die meßbar ein rekombinantes Gen exprimiert, das die FNS II oder einen Teil davon kodiert oder welche eine Nukleinsäuresequenz trägt, die im wesentlichen komplemen­ tär zum gesamten oder zu einem Teil des mRNA-Moleküls ist, das, falls nötig, ohne weiteres transkribierbar ist, um die Regulation der FNS II zu bewirken. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit der isolierten Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidequenz, die für eine FNS II oder ein Derivat oder einen Teil davon kodiert, oder eine zu der kodierenden Nukleotidsequenz komplementäre Sequenz, falls erforderlich unter Bedingungen, die eine Expression der besagten isolierten Nukleinsäure erlauben, und durch Regeneration einer trarisgenen Pflanze aus einer Zelle.
Der Fachmann bemerkt sofort die Möglichkeiten der Anwendung bei der vorliegenden Erfin­ dung, wie z. B. eine Erhöhung oder Reduzierung der Expression der Enzyme, die natürli­ cherweise in einer Zielpflanze vorhanden sind. Dies führt zu verschiedenen neuen Blüten­ farbtönen, wie zum Beispiel verschiedenen Orange- oder Dunkelrot-Tönen.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf alle transgenen Pflanzen, die die gesamte oder einen Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz enthalten und/oder eine homologe oder verwandte Form dieser oder eine Antisense-Form von irgendeiner der beschriebenen aufweisen, und im einzelnen diejenigen transgenen Pflanzen, die unter­ schiedliche Blüteneigenschaften zeigen. Die transgenen Pflanzen können eingeführte Nukleinsäuremoleküle enthalten, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine FNS II oder eine komplementäre Sequenz kodiert. Im allgemeinen wird die Nukleinsäure stabil in das Pflanzengenom eingeführt, obwohl die vorliegende Erfindung auch die Einführung einer FNS II Nukleotidsequenz innerhalb einer autonom-replizierenden Nukleinsäuresequenz wie z. B. DNA- oder RNA-Viren, die fähig sind, in einer Pflanzenzelle zu replizieren, einschließt. Die Erfindung schließt darüber hinaus auch Samen der transgenen Pflanze ein, besonders, wenn sie flavonhaltig sind.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen FNS II-Gens kann die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bil­ dung von Flavonen in Pflanzen auf verschiedene Art und Weise gezielt verändert werden.
Im pflanzlichen Bereich müssen vorab zwei unterschiedliche Ausgangspunkte berücksichtigt werden. Zum einen stehen Pflanzen zur Verfügung, die natürlicherweise Flavone oder deren Glykoside bilden, wie z. B. Antirrhinum und Verbena in Blüten, Clerodendron und Citrus in Blättern, Althaea und Sophora (Leguminosae) in Wurzeln und Prunus und Pinus spec. im Hartholz (Wollenweber, 1994; Williams und Harborne, 1994). Neben dieser sehr großen Gruppe gibt es aber auch einige Pflanzen, die in bestimmten Geweben keine Flavone syn­ thetisieren. Dies ist z. B. bei einigen Blüten von wichtigen Zierpflanzen wie Pelargonium, Cyclamen und Petunia und in Apfelblättern der Fall.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine veränderte FNS II-Aktivität in Pflanzen und anderen Organismen, die sowohl durch eine Erhöhung als auch durch eine Reduzierung der natürlich vorkommenden FNS II-Aktivität mittels der Einführung der Sequenz aus der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann. Eine Reduzierung der Höhe der FNS II-Aktivität kann auch als eine Down-Regulierung beschrieben werden.
In flavonhaltigen Pflanzen kann die Synthese von Flavonen mit Hilfe von geeigneten Metho­ den gezielt hoch- oder down-reguliert werden oder ganz ausgeschaltet werden. Dies hat für die Pflanze verschiedene Folgen. Grundsätzlich hat eine solche Veränderung am Biosynthe­ seweg Auswirkungen auf die gesamte Flavonoidbiosynthese, da eine ständige Konkurrenz mehrerer Enzyme (FNS II, FHT, F3'H, F3',5'H) um das Substrat (Flavanone, z. B. Narin­ genin) herrscht. Das bedeutet im einzelnen, daß z. B. eine Hochregulierung der FNS II die Synthese von Flavonoiden im späteren Biosyntheseweg (Abb. 1A) reduziert und dadurch z. B. blassere Blütenfarben erreicht werden können. Außerdem kann durch diese gezielte Erhöhung des Flavongehalts, die nur bestimmte Gewebe betreffen kann, die Resistenz­ eigenschaft und die Symbiosefähigkeit der Pflanze deutlich verbessert werden. Demgegen­ über führt eine Down Regulierung zu einer Steigerung der Synthese von anderen, eventuell für die Pflanze nützlicheren Flavonoiden. Dies kann sowohl die für den UV-Schutz wichtigen Flavonole als auch die farbgebenden Anthocyane oder resistenzinduzierenden Proantho­ cyanidine und Phytoalexine betreffen. Eine vollständige Unterdrückung der Flavonbildung führt zu einer Verstärkung der Wirkungen einer Down-Regulierung und kann mögliche Stimulanzien für Insekten entfernen und somit zur Resistenzbildung beitragen.
Eine völlige Neu-Synthese von Flavonen kann durch das gezielte Einführen der FNS II in Pflanzen ohne natürliche Aktivität erreicht werden. Abhängig von den vorhandenen Substra­ ten kann so der Flavongehalt und das Flavonmuster reguliert werden. Durch Etablierung dieses Schrittes können Blütenfarben, Resistenzeigenschaften und die Fähigkeit zur Sym­ biose mit Stickstoff-fixierenden Bakterien gezielt verändert werden. Darüber hinaus kann hurch die Öffnung eines neuen Biosyntheseweges die Bildung von für die Pflanze weniger nützlichen Flavonoiden (z. B. Fraßstimulanzien) reduziert werden oder auch die Synthese von Biflavonen, die aus Flavonen hervorgehen, etabliert werden.
Mit Hilfe dieser Ansätze können wichtige flavonhaltige oder flavonfreie Nutzpflanzen in ihrem Flavonoidmuster und -gehalt, einschließlich der Flavone, so verändert werden, daß ihre positiven Eigenschaften in Bezug auf die Biologie von Mensch und Tier optimiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur gezielten Veränderung des Fla­ vongehalts bzw. -musters in verschiedenen Pflanzengeweben (Blüten, Wurzeln, Blätter u. a.) und anderen Organismen und damit allgemein die Veränderung der Flavonoidzusammen­ setzung, speziell die Veränderung von Blütenfarben durch Kopigmentierung, von Resi­ stenzeigenschaften und der Fähigkeit der Nodulation bei Leguminosen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungs­ gemäßen Polypeptids zur Synthese von Flavonen. In geeigneten Expressionssystemen können das Enzym selbst und daraus letzendlich natürliche Flavone, ausgehend von geeig­ neten Substraten, synthetisiert werden. Eine Möglichkeit ist die Verwendung von geeigneten Expressionssystemen zur Gewinnung von gesundheitsfördernden, natürlichen Flavonen. Diese Expressionssysteme können pflanzlicher Art sein oder aus Zell- bzw. Hefekulturen bestehen. Die Expression der FNS II in Pflanzen oder in Zellkulturen kann zur direkten Gewinnung der entsprechenden Flavone verwendet werden, wobei das Hefe-Expressions­ system zur Gewinnung des intakten Enzyms bevorzugt sein kann. Mit diesem Enzym kön­ nen dann chemische oder natürliche Vorstufen (Flavanone) zum entsprechenden Flavon umgesetzt werden. Die auf diese Art synthetisierten Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.
Die vorliegende Erfindung ist ausführlich beschrieben durch die folgenden Abbildungen und Beispiele. Die vorliegende Erfindung ist anhand einer Nukleinsäuresequenz, die aus Gerbera Hybriden abgeleitet wurde, veranschaulicht. Es liegt nun nahe, daß ähnliche Sequenzen leicht aus verschiedenen anderen Quellen, wie z. B. anderen Pflanzen oder speziellen Mikroorganismen, isoliert werden können. Beispiele für andere Flavon-produzierende Pflan­ zen schließen Gloxinie (Sinningia Hybriden), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Colum­ nea (Columnea Hybriden), Dahlie (Dahlia variabilis), Gloxinie (Sinningia cardinalis), Strepto­ carpus (Streptocarpus Hybridus), Verbene (Verbena Hybrida), Chrysantheme (Chrysan­ themum indicum), Einblatt (Spathiphyllum wallisii) ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Alle diese Nukleinsäuresequenzen, die direkt oder indirekt ein Enzym des Flavonoid­ biösyntheseweges und im speziellen die FNS II kodieren, ohne Rücksicht auf deren Quelle, sind von der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
Abb. 1A-C zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Flavonoid-Biosyn­ theseweges und der chemischen Strukturen verschiedener Flavonoide.
Beteiligte Enzyme sind in Abb. 1A und 1C wie folgt abgekürzt: CHS = Chalkonsynthase; CHI = Chalkonisomerase; FHT = Flavanon 3-Hydroxylase; DFR = Dihydroflavonol 4-Reduk­ tase; ANS = Anthocyanidinsynthase; FGT = Flavonoid 3-Glukosyltransferase; FNS II = Fla­ vonsynthase II; FLS = Flavonolsynthase; F3'H = Flavonoid 3'-Hydroxylase; F3%5'H = Flavo­ noid 3',5'-Hydroxylase. Die Ebene der Flavonbildung ist in Abb. 1A besonders (++++) gekennzeichnet. In Abb. 1B ist im oberen Teil die FNS II-Reaktion in Gegenwart von NADPH mit einigen üblichen Flavanonen gezeigt. Im unteren Teil sind weitere wichtige Fla­ vonoide dargestellt. Die Abb. 1C beschreibt den Flavonoidbiosyntheseweg, wie er in Gerbera Hybriden vorkommt. Folgende Abkürzungen sind für die verschiedenen Flavonoide verwendet worden: THC = Tetrahydroxychalkon; PHC = Pentahydroxychalkon; NAR = Naringenin; ERI = Eriodictyol; Ap = Apigenin; Lu = Luteolin; DHK = Dihydrokaempferol; DHQ = Dihydroquercetin; Km = Kaempferol; Qu = Quercetin; LPg = Leucopelargonidin; LCy = Leucocyanidin; Pg = Pelargonidin; Cy = Cyanidin.
Abb. 2 zeigt die Aktivität bzw. die fehlende Aktivität der FNS II in Enzymextrakt aus Petalen verschiedener Gerbera-Linien: "Th 58" (Genotyp fns+ fns), "147-150" (fns+.) und "147-146" (fns fns). Die Linien "147-150" und "147-146" sind Selbstungsnachkommenschaf­ ten aus "Th 58". Die Aktivität der FNS II wurde durch den Umsatz von 14C-markiertem Naringenin zum entsprechenden Flavon Apigenin gemessen.
Abb. 3 zeigt die FNS II-Aktivität (∎) und die Akkumulation von Flavonen () in der Linie "Th 58" (fns+ fns) über verschiedene Entwicklungsstadien der Blüte. Die verschie­ denen Blütenstadien sind im Beispiel 2 definiert. Der Flavongehalt wurde durch Extraktion mit Ethylacetat und HPLC-Untersuchung, wie in Martens und Forkmann (1998) beschrieben, ermittelt.
Abb. 4A + B (nach Schopfer und Ebel, 1998) zeigt die bekannte Struktur der Cyto­ chrom P450-Sequenzen mit Bereichen von hoher Sequenzkonservierung. Angezeigt ist die Prolin-reiche, die Sauerstoffbindungs- und die Häm-Bindungsregion. In Abb. 4B ist die Häm- Bindungsregion im Detail dargestellt und außerdem die daraus abgeleiteten Primer für die DD-RT-PCR. Ein Satz von acht nicht-degenerierten 5'-Primern wurde entsprechend dec möglichen Nucleotidsequenz erstellt.
Abb. 5 zeigt eine schematische Darstellung der verschiedenen generierten Cyto­ chrome P450-DNA-Fragmente. Alle Klone enthalten die markierte Häm-Bindungsstelle pDDd7a: ein 358 bp langes Fragment konnte über PCR mit Hilfe der Oligo's "Decamer d7" und "Oligo A" mit einem DNA-Template, das aus einer differentiell exprimierten Bande wie­ dergewonnen wurde, generiert werden.
pTABATA: ein 1519 bp langes Fragment wurde ausgehend von cDNA aus Gerbera "Th58" über eine PCR-gestützte RACE-Methode mit den Oligo's "GSP7", "GSP8", "GSP9" und "AAP" (GIBCO-BRL) bzw. "backrace" isoliert.
pCYPFNS1: ein 1589 bp langes Fragment mit einem offenen Leserahmen wurde über PCR mit Hilfe der Oligo's "CypFNS1H" und "CypFNS1R" isoliert. Als Template wurde cDNA der Gerbera "Th58" verwendet.
Abb. 6 und 7 sind Darstellungen der Nukleinsäure bzw. der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des vollständigen Klons. Das Startkodon und die verschiedenen Stopkodons sind gesondert markiert.
Abb. 8 zeigt ein Diagramm der vorhandenen Restriktionsstelle für Standard-Restrik­ tionsenzyme.
Abb. 9 zeigt einen FNS II-Test mit Hefe-Mikrosomen. Als Substrat wurde [14C] Naringenin verwendet. Mikrosomen wurden aus transformierten (INVSc1-CypFNS1) und untransformierten Hefen (INVSc1) präpariert. Das Autoradiogramm zeigt die Umwandlung von [14C] Naringenin zum entsprechenden Flavon, dem [14C] Apigenin, mit einem Extrakt der transformierten Hefe (INVSc1-CypFNS1). Im Kontroll-Experiment (INVSc1) wurde keine Aktivität gemessen. Das Produkt wurde in vier verschiedenen Laufmitteln durch Co-Chroma­ tographie mit authentischen Apigenin identifiziert.
Abb. 10 zeigt eine Autoradiographie eines RNA Gel Blots, der mit einer 32P-markier­ ten cDNA des Inserts CypFNS1 hybridisiert wurde. Jede Spur enthält 20 µg Gesamt RNA, die wie folgt aufgetragen wurde: {1} Simm (Genotyp fns+.), {2} Delphi (fns+.), {3} T3 (fns fns), {4} 147-150 (fns+:), {5} Clivia (fns fns), {6} 147-146 (fns fns), {7} Regina (fns+.), Ger­ bera-Laub (fns fns), {9} 10er Pool (fns+.), {10} 10er Pool (fns fns).
Beispiel 1 Materialien Chemikalien, Enzyme und Radiochemikalien
Naringenin, Eriodictyol, Apigenin und Luteolin wurden bei Carl Roth (Karlsruhe, Deutsch­ land) bezogen. [14C] Naringenin wurde aus [14C] Malonyl-CoA (ARC, St. Louis, USA) und p- Cumaroyl-CoA (Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, Deutschland) nach der in Britsch et.al. (1981) beschriebenen Methode mit teilweise gereinigter Chalkonsynthase (CHS) und Chal­ konisomerase aus Petersilie Suspensionskultur hergestellt. Alle weiteren Enzyme wurden von kommerziellen Anbietern bezogen und nach deren Beschreibung verwendet.
Bakterien- und Hefestämme
Die folgenden Escherichia coli-Stämme wurden verwendet: TOP10F' und TOP10, beide von Invitrogen (Groningen, Niederlande). Außerdem wurde folgender Hefestamm verwendet:
INVSc1 (Invitrogen).
Die Klonierungsvektoren pCR2.1 und pYES2 wurden von Invitrogen bezogen.
Die Ligation von Insert und Vektor pCR2.1 bzw. die Transformation der Bakterien erfolgte nach Angaben des Herstellers.
Pflanzenmaterial
Es standen chemogenetisch definierte Gerbera-Klonsorten (Tyrach und Horn, 1997) und Selbstungsnachkommenschaften der Linie "Th58" zur Verfügung. Zusätzlich wurden die aktuellen Schnittgerbera Sorten "Regina" der Firma Terra Nigra (DeKwakel, Niederlande) und "Delphi" der Firma Florist (DeKwakel, Niederlande) miteinbezogen. Eine detailierte Beschreibung des Pflanzenmaterials ist in Tabelle 2 zu finden.
Tabelle 2
Verwendetes Pflanzenmaterial
Beispiel 2 Kultivierung der Pflanzen, Kreuzungsmethoden und Blütenstadien
Pflanzen von Gerbere Hybriden wurden unter praxisüblichen Bedingungen in einem Gewächshaus kultiviert. Die Tageslänge betrug mindestens 14 h bei einer Lichtintensität von 10 000 lux und bei 22°C.
Selbstungen der Sorte "Th58" (Genotyp fns+ fns) wurden innerhalb eines Blütenstandes oder zwischen den Blütenständen der gleichen Pflanze durchgeführt. Dieses Selbstungsexperi­ ment läßt sich mit jeder beliebigen für den Locus Fns heterozygoten Sorte oder Linie durch­ führen. Die entsprechenden chemogenetischen und biochemischen Methoden sind in Tyrach und Horn (1997) und Martens und Forkmann (1998) im Detail beschrieben. Ein kon­ trolliertes Abblühen wurde durch über die Blüten gezogene Pergamintüten erreicht. Die Bestäubungen wurden im Idealfall bis zu viermal in täglichen Abständen wiederholt. Weitere Hinweise zu Bestäubungsmethoden und Blütenbau bei Gerbera sind bei Maurer (1967) zu finden.
Gerbere Blüten wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien, die wie folgt definiert wur­ den, geerntet (nach Martens and Forkmann, 1998):
Stadium 1: Knospe geschlossen, Petalen kleiner als 5 mm.
Stadium 2: Strahlenblüten sichtbar, 5-10 mm lang.
Stadium 3: Strahlenblüten 10-15 mm lang.
Stadium 4: Beginn der Pigmentierung, Länge 15-23 mm.
Stadium 5: Ligula der Strahlenblüten pigmentiert, 23-26 mm lang.
Stadium 6: Strahlenblüten 26-35 mm lang.
Stadium 7: Infloreszenz halb geöffnet, 35-40 mm lang.
Stadium 8: Infloreszenz vollständig geöffnet, 40-50 mm lang.
Stadium 9: Strahlenblüten 50-55 mm lang.
Stadium 10: Strahlenblüten 55-60 mm lang.
Stadium 11: seneszente Infloreszenz, 55-60 mm lang.
Beispiel 3
Biochemische und enzymologische Charakterisierung der Selbstungsnachkommenschaften Zur Extraktion und Identifizierung von Flavonoiden wurden bekannte Standardmethoden verwendet (Marbry et.al., 1970; Harborne, 1967). Flavone wurden darüber hinaus unter UV- Licht (243 nm) vor und nach Bedampfung mit Ammoniak detektiert. Flavanone wurden durch Reduktion mit Natriumborhydrid und nachfolgender Behandlung mit Salzsäuredämpfen identifiziert (Eigen et.al., 1957).
Dünnschicht Chromatographie wurde auf vorbeschichteten Cellulose Platten G1440 der Firma Schleicher & Schüll (Dassel, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurden folgende Laufmittel verwendet: (1) Chloroform - Essigsäure - Wasser (10 : 9 : 1); (2) 30% Essig­ säure; (3) Essigsäure - Salzsäure - Wasser (30 : 3 : 10) und (4) tert.-Buthanol - Essigsäure - Wasser (3 : 1 : 1).
Der Flavongehalt von Knospen und Blüten während der Entwicklung wurde durch Extraktion der Pigmente mit Ethylacetat aus Petalen verschiedener Stadien bestimmt. Das Verhältnis Gewebe zu Extraktionsmittel betrug 1 : 40 (g/ml) und die Extraktionsdauer 48 Stunden bei 4°C im Dunkeln. Charakterisierung und Quantifizierung wurde mit Hilfe einer HPLC durchge­ führt. 10 µl 75% Methanol Extrakt wurden auf eine Spherisorb ODS II Säule (Partikelgröße 5 µm, 250 × 4.6 mm, Bischoff, Leonberg, Deutschland) aufgegeben und aufgetrennt (Lange et.al., 1994). Die Detektion erfolgte mit einem Dioden Array Detektor Model 168 (Beckmann, München, Deutschland).
Enzymaufarbeitungen und FNS II Tests wurden, wie in Martens und Forkmann (1998) beschrieben, durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgte mit 6.0 ml Tris-HCl Puffer (pH 7.5), der 28 mmol/l 2-Mercaptoethanol und 10 mmol/l Natriumascorbat erhielt, bei 4°C mit 1.0 g Peta­ len, 0.5 g Dowex (equilibriert mit Tris-HCl Puffer, pH 7.5) und 0.5 g Seesand. Nach dem homogenisieren in einem vorgekühlten Mörser wurde das Homogenat in Eppendorf Tubes überführt und zweimal für 5 min. bei 10.000 × g zentrifugiert. Der nun klare Überstand diente als Rohextrakt oder wurde zur Fällung von Mikrosomen mit MgCl2 nach Diesperger et.al. (1974) verwendet. Der Proteingehalt der Aufarbeitungen wurde nach der Methode von Brad­ ford (1976) bestimmt.
Der Standardtest für die FNS II enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 µl: 175 µl Tris- HCl Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; Naringenin), 2.0 nmol unmarkiertes Substrat, 10 µl 20 mmol/I NADPH und 15 µl Rohextrakt oder Mikrosomen Prä­ paration. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 µl Methanol, das eine Mischung der entsprechenden Flavonoide enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 µl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 (s.o.) chromatogra­ phiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji Photo Film Co., Tokio, Japan) und des TINA Software Packets (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) lokalisiert und quantifiziert.
In Abb. 2 sind beispielhaft die Ergebnisse der Enzymtests mit der Gerbera Sorte "Th 58" und den Linien "147-150" und "147-146" dargestellt. Die entsprechenden Genotypen sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
Beispiel 4 Synthese von Oligonukleotiden
Oligonukleotide wurden bei der Firma Metablon (Martinsried, Deutschland) synthetisiert. Folgende Oligonukleotide wurden verwendet (5'-3'):
Die drei Oligo's und acht Decamere wurden nach Schopfer und Ebel (1998) synthetisiert.
Beispiel 5 Klonierung eines P450-Fragments aus Gerbera H briden Isolierung von Gesamt RNA aus Gerbera Petalen
Gesamt RNA wurde aus Gerbere Petalen von verschiedenen definierten Genotypen (fns+. oder fris fns; Tab. 2) der Stadien 2-4, in denen die FNS II-Aktivität ansteigt (Abb. 3), nach einer bei Giuliano et.al. (1993) beschriebenen Methode isoliert. 1.2 g in flüssigem Stickstoff eingefrorenes Pflanzenmaterial wurde in einem vorgekühlten Möser zu feinem Pulver gerie­ ben und in ein ebenfalls vorgekühltes Corex-Röhrchen überführt. Das Gewebe wurde in 3 ml vorgelegtem Extraktionspuffer, bestehend aus 4 M Guanidium Thiocyanat, 0.15 M Natrium­ acetat (pH 5.3), 0.2% Natrium Sacrosinat und 0.7% β-Mercaptoethanol, und 2.4 ml Was­ ser-equilibriertem Phenol (gesättigt mit 0.1 M Citrat-Puffer, pH 4.3, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) durch kräftiges Vortexen homogenisiert. Nach der Zugabe von 0.6 ml Chloro­ form wurde das gut gemischte Homogenat für 20 min auf Eis belassen und anschließend bei 15.000 × g zentrifugiert (Sorvall RC-5B plus; SS34). Die abgenommene Oberphase wurde mit 1 Vol. Isopropanol versetzt und erneut auf Eis für 60 min inkubiert. Nach 30 min Zentrifu­ gation bei 15.000 × g (Sorvall s.o.) wurde die Oberphase verworfen und das Pellet in steri­ lem H2O vorsichtig resuspendiert. Zur Entfernung der Polysaccharide wurde die Lösung mit 100% Ethanol (20% (v/v) Endkonzentration) versetzt, 20 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 10.000 × g und 4°C zentrifugiert. Der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand wurde mit 1/3 Vol. 8 M Lithiumchlorid versetzt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde 20 min bei 15.000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die gefällte RNA wurde zweimal mit je 1 ml 80% Ethanol gewaschen und dann in 50 µl H2O resuspendiert und bei -70°C gelagert.
Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch bei einer Wellen­ länge von 260 nm (Pharmacia Biochrome 4060).
Falls erforderlich wurde zudem poly (A)+ RNA aus der Gesamt RNA durch zwei Zyklen Oligo (dT) Cellulose Chromatographie isoliert (Sambrook et.al., 1989).
Reverse Transkription von RNA
5 µg Gesamt RNA oder 500 ng poly (A)+ RNA, isoliert aus den oben beschriebenen unter­ schiedlichen Genotypen bzw. Blütenstadium, wurde in einem 25 µl Ansatz mit jeweils einem der drei Oligo (dT) Primer mittels Reverse Transkriptase (SuperScript™ II, GIBCO BRL, Paisley, Großbritanien) in cDNA umgeschrieben: Zur RNA wurde 1 µl des jeweiligen Oligo (dT) Primer (1 µM final) und Wasser bis zu einem Volumen von 17 µl gegeben. Dieser Ansatz wurde anschließend bei 70°C für 10 min. denaturiert und dann auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 4 µl 5 × SuperScript First Strand Buffer, 2 µl 100 mM Dithiothreitol, 1 µl 10 mM dNTP Mix, wurde der Ansatz bei 42°C für 2 min. vorinkubiert. Anschließend wurde 1 µl (200 U) SuperScriptTM Reverse Transkriptase direkt dazupipettiert. Die Reaktion wurde bei 42°C für 60 min. und anschließend für 15 min. bei 70°C inkubiert. Folgende cDNA's standen somit zur Verfügung: fns+ A, C oder G und entsprechend für die rezessive Linie fns- A, C oder G. Diese cDNA's wurden direkt als Template für den PCR Ansatz verwendet.
PCR-Amplifikation mit P450 spezifischen Primern
Die Amplifikation der verschiedenen cDNA's erfolgte mittels PCR, wobei neben dem Oligo (dT) Anchor Primer ein zweiter, nicht-degenerierter, P450 spezifischer Primer (Decamer 1 - 8) verwendet wurde. Der PCR Ansatz enthielt in einem Gesamtvolumen von 20 µl folgende Komponenten: 6.2 µl Wasser, 1 µl 20 × Polymerase Puffer, 2.5 mM MgCl2, 0.2 µM dNTP Mix, 1 µl 35S-ATP [1000 Ci/mmol] (ICN Pharmaceutics, Irvine, USA), 0.5 µM einen der acht Decamer Primer, 1 µM des der cDNA entsprechenden Oligo (dl) Primer 4 µl aus dem oben beschriebenen cDNA Ansatz und 0.2 µl 5 U/pl Replitherm Polymerase (Epicentre, Madison, USA). Folgende PCR-Parameter wurden verwendet: Ein Denaturierungsschritt bei 94°C für 10 min., anschließend 40 Zyklen mit 94°C für 30 sec., 40°C (Annealing) für 2 min. und 72°C (Extension) für 30 sec. und zum Abschluß eine abschließende Extension bei 72°C für 7 min. 4 µl des PCR-Produktes wurden nun mit 2 µl Formamid Ladepuffer {80% Formamid; 10 mM EDTA (pH 8.0), 1 mg/ml Xylencyanol FF und 1 mg/ml Bromphenolblau} versehen, gemischt, für 2 min. bei 95°C denaturiert und dann direkt auf Eis gestellt. Die so vorbereiteten Proben wurden auf ein 5%-iges denaturierendes Polyacrylamid Gel geladen und für 3 Stunden bei maximal 40 W getrennt. Anschließend wurde das Gel auf Whatman Papier von der Glasplatte abgezogen und in einem Geltrockner fixiert. Die Radioaktivität bzw. differenzielle Banden wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert. Differentiell expremierte Banden in einer Größenord­ nung von 300 bis 500 bp wurden mit einem scharfen Skalpell aus dem fixierten Gel mit samt dem Whatman Papier herausgeschnitten, in ein Eppendorf Tube überführt und in 100 µl Wasser für 10 min. bei Raumtemperatur rehydriert. Anschließend wurde das Tube bei 100°C für 10 min. inkubiert und 2 min. bei full speed in der Tischzentrifuge zentrifugiert, um Gel­ reste und Papier zu trennen. Der Supernatant wurde in ein neues Eppendorf Tube überführt. Nach der Zugabe von 10 µl 3 M Natriumacetat, 5 µl 10 mg/ml Glycogen als Carrier und 400 µl 100% Ethanol wurde die DNA für 60 min. bei -70°C gefällt. Die gefällte DNA wurde dann durch Zentrifugation bei 4°C und 14.000 rpm pelletiert, zweimal mit 85% eiskaltem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 10 µl Wasser resuspendiert. Die Reamplifizierung der so gewonnen cDNA erfolgte in 50 µl PCR-Ansätzen, die folgende Komponenten enthiel­ ten: 27.8 µl Wasser, 2 µl 20 × Polymerase Puffer, 4 µl 25 mM MgCl2, 3.2 µl 500 µM dNTP Mix, 4 µl 5 µM des entsprechenden Decamer Primer, 4 µl 25 µM des entsprechenden Oligo (dT) Primer, 4 µl aus der oben beschriebenen eluierten DNA und 0.5 µl 5 U/µl Replitherm Polymerase (Epicentre). Die PCR-Parameter entsprechen denen der ersten Amplifikation. Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe eines 1.5%-igen Agarose Gels aufgetrennt und die ent­ sprechenden Amplifikate in den TOPO pCR2.1 Vektor einkloniert und anschließend in TOPO 10F' one-shot Kompetentezellen (Invitrogen) nach Herstellerangaben transformiert. Plasmid Isolierung aus, über blau-weiß Screening identifizierten, transformierten Bakterien wurde mit Hilfe des Plasmid Miniprep - Quantum Prep - Kits (Bio-Rad, München, Deutschland) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die nach einem Verdau mit geeigneten Restriktionsenzy­ men (z. B. Eco RI; Boehringer Mannheim, Deutschland) und einer Auftrennung auf einem 1.5%-igem Agarosegel identifizierten Inserts mit einer Länge zwischen 300 und 500 bp, wur­ den mit dem QIAEX II Gelelutions KIT (QIAGEN, Hilden, Deutschland) aus dem Gel eluiert. Diese DNA Fragmente wurde mit dem Rediprime Labelling Kit (Amersham, Braunschweig, Deutschland) 32P-markiert und für Northern Blot Analysen verwendet. DNA Sequenzierung dieser und anderer Klone erfolgte im wesentlichen nach der von Sanger et.al (1977) beschriebenen Methode mit Hilfe des Sequenase Enzyms Version 2.1 (Amersham, Braun­ schweig, Deutschland).
Beispiel 6 Northern Blot Analyse
Gesamt-RNA wurde wie in Beispiel 5 beschrieben isoliert. 10 µg verschiedener Gesamt- RNA Proben wurden auf einem 2.2 M Formaldehyd/1.2% (w/v) Agarosegel elektrophore­ tisch getrennt. Der Laufpuffer enthielt 20 mM MOPS (pH 7.0), 5 mM Natriumacetat und 1 mM EDTA (pH 7.0). Die RNA wurde nach Herstellerangaben auf Hybond-NX Membran (Amersham) übertragen und mit einem 32P-markierten Eco RI-Eco RI pDDd7a cDNA Frag­ ment hybridisiert. Prehybridisierung (1 bis 3 Stunden bei 42°C) und Hybridisierung (16 bis 24 Stunden bei 42°C) wurde in 50% deionisiertem Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt's, 0.5% SDS durchgeführt. Denaturierte Heringsperma DNA (100 µg/ml) wurde zusammen mit der 32P-markierten Probe zum Hybridisierungsschritt zugegeben. Die Filter wurden zweimal 15 min. bei 42°C mit 2 × SSPE, 1% SDS (w/v) und dann ein- bis zweimal bei 65°C mit 1 × SSPE, 1% SDS (w/v) gewaschen. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert und quanti­ fiziert.
Northern Blot Analysen zeigten, daß das Gen, welches dem cDNA Klon pDDd7a entspricht nur in Linien mit dem Genotyp fns+. expremiert wird. In Linien mit dem rezessiven Genotyp fns fns konnte keine Hybridisierungssignal nachgewiesen werden (Abb. 10). Darüberhinaus verläuft das Expressionsmuster über die verschiedenen Blütenstadien parallel zu der in den Blüten gemessenen Enzymaktivität bzw. der Flavon Akkumulation (Martens und Forkmann, 1998).
Beispiel 7 Isolierung des full-length Klon von pDDd7a
Der cDNA Klon pDDd7a entspricht nicht einem full-length Klon, sondern nur dem Bereich von der Häm-Bindungsstelle bis zum poly (A+) Ende (3'-Ende) der Sequenz, einschließlich mehrerer Stopkodons. Um den vollständigen Klon von pDDd7a zu bekommen, wurde eine PCR gestütze RACE Methode nach Frohman et.al. (1988) mit Hilfe des 5'-RACE System, Version 2.0 (GibcoBRL) verwendet.
Zuerst wurden verschiedene genspezifische 5'-RACE Primer (GSP7-9) auf der Grundlage von pDDd7a konstruiert und zusätzlich noch der nested Amplifikationsprimer "Backrace". Mit Hilfe des GSP7 wurde Gesamt-RNA nach der in Beispiel 5 Methode in cDNA umgeschrie­ ben. Anschließend wurde das First Strand Produkt vom Überschuß an Nukleotiden und GSP7 mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstel­ lerangaben gereinigt. Durch die Terminale Transferase (TdT) wurden die gereinigte cDNA mit einem Oligo-dC Tail versehen. Der Tailing Ansatz sah wie folgt aus: 6.5 µl Wasser, 5.0 µl 5 × Tailing Puffer, 2.5 µl 2 mM dCTP und 10 µl cDNA. Dieser Mix wurde für 3 min. bei 94°C denaturiert und anschließend für 1 min. auf Eis gestellt. Durch die Zugabe von 1 µl TdT wurde die Reaktion gestartet und dann für 10 min. bei 37°C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Inkubation bei 65°C für 10 min. Die PCR-Amplifikation der dC-getail­ ten cDNA erfolgte in 0.5 ml dünnwandigen PCR-Gefäßen nach folgendem Protokoll: Einma­ lige Denaturierung bei 94°C für 2 min., anschließend 35 Zyklen bestehend aus 94°C für 1 min., 57°C für 1 min. und 72°C für 2 min. Abschließend wurde noch ein abschließender Extensionsschritt von 7 min. durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Kom­ ponenten zusammen: 31.5 µl Wasser, 5.0 µl 10 × PCR-Puffer, 3.0 µl 25 mM MgCl2, 1.0 µl 10 mM dNTP, 2.0 µl 10 µM GSP8, 2.0 µl 10µM AAP, 5.0 µl dC-tailed cDNA und 0.5 µl 5 U/µl Taq DNA Polymerase (Promega, Madison, USA). 15 µl des 5'-RACE Produktes wurden auf einem 1.5%-igem Agarosegel bei der Verwendung von geeigneten Längenstandards analy­ siert. Spezifische Einzelbanden im Bereich von ca. 1.5 kb wurden einkloniert und über Northern Blot bzw. Sequenzanalyse verifiziert.
Mit Hilfe des 5'-RACE wurde ein 1.5 kb langes spezifisches Fragment (pTABATA) amplifi­ ziert, das nur mit Gesamt-RNA aus Gerbera-Linien mit dem Genotyp fns+. hybridisiert, nicht mit RNA aus rezessiven Genotypen. Im Bereich vom genspezifischen Primer (GSP8) bis zur Häm-Bindungsstelle ist dieses neue Fragment homolog zum Fragment pDDd7a. Der Gesamt-Klon (1698 bp) besitzt einen offenen Leserahmen und zeigt auf Aminosäure Ebene eine 58%-ige Homologie zum Cytochrom P450 Klon CYP93B1 (Akashi et.al., 1998).
Beispiel 8 Expression von pCYPFNS1 in Hefe Konstruktion von pYeCYPFNS1
Ein 1.5 kb Bam HI-Eco RI Fragment, entsprechend pCYPFNS1, wurde in den mit Bam HI- Eco RI geöffneten Hefe Expressionsvektor pYES2 ligiert. Das entstandene, als pYeCYPFNS1 bezeichnete Plasmid, enthielt das pCYPFNS1 cDNA Fragment in Sense- Orientierung als Insert.
Hefe Transformation
Der Hefe Stamm INVSc1 wurde mit dem Plasmid pYeCYPFNS1 entspechend dem Proto­ koll nach Gietz et.al. (1992) transformiert. Die Selektion transformierter Hefezellen erfolgte über einen Komplementationsmarker.
Präparation von Hefemikrosomen für Flavonsynthase II Tests
Einzelne Kolonien von INVSc 1/pYeCYPFNS1 und INVSc 1, die auf Selektionsmedium SGI {20 g Glucose (w/v), 1 g Pepton (Fluka), 6.7 g Yeast Nitrogen Base without amino acids (Difco) und 20 mg L-Tryptophan (Fluka) pro Liter} herangezogen wurden, wurden anschlie­ ßend in 5 × 5 ml SGI-broth inokuliert und bei 200 rpm und 30°C für 24 Stunden inkubiert. Bei einer OD600 von 0.2-0.4 der 1 : 10 verdünnten Vorkultur erfolgte ein vollständiges Überimp­ fen in 250 ml YPGE {5 g Glucose, 10 g Pepton, 10 g Yeast Extract (Fluka) und 3 Vol.% Ethanol pro Liter}. Die Hauptkultur wurde bei 30°C und 120 rpm bebrütet. Bei einer OD600 von 0.8 bis 1.2 erfolgte die Induktion durch Zufütterung von 27 ml 200 g/l steriler Galaktose Lösung.
Nach 12 bis 15 Stunden, bei einer ODsoo von etwa 0.6 bis 1.2 der 1 : 10 verdünnten Haupt­ kultur, wurden die Hefezellen durch Zentrifugation geerntet, einmal mit TEK {50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA und 0.1 M KCl} gewaschen und in TES-B* {50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.6 mM Sorbitol und 2 mM DTT} resuspendiert. Der Aufschluß der Hefen erfolgte bei 4°C mit 15 g Glassbeads (Sigma) je Ansatz. Die Glassbeads wurden anschließend drei­ mal mit 5 ml TES-B* gewaschen und der vereinigte Überstand mit 4 M NaCl auf eine End­ konzentration von 0.15 M eingestellt. Die Mikrosomen wurden durch die Zugabe von 2.5 g PEG-4000 (Fluka) gefällt und nach einem Waschschritt mit 2 ml TES-B* in einem Potter in 2.5 ml TEG* {50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM EDTA, 2 mM DTT} homogenisiert. Das erhal­ tene Homogenat diente als mikrosomale Enyzmquelle für die FNS II Tests.
FNS II-Aktivität wurde nach der Methode von Martens und Forkmann (1998) gemessen. Der Standardtest für die Flavonsynthase 11 enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 µl : 140 µl Tris-HCl Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; [14C] Naringenin), 10 µl 20 mmol/l NADPH und 50 µl der Hefe Mikrosomen Präparation. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 µl Methanol, das eine Mischung von Naringenin und Apigenin (Produkt) enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 µl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 bis 4 (s.o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert und quantifiziert.
Der Enzymextrakt, der aus INVSc1/pYeCYPFNS1 hergestellt wurde, zeigt eine deutliche FNS II-Aktivität, wohingegen die entsprechende Fraktion aus nicht transformierten Hefen keine Aktivität zeigte (Abb. 9). Die Ergebnisse der Hefeexpression bestätigen, daß das cDNA Insert pCYPFNS1 für ein FNS II Enzym kodiert. Darüberhinaus zeigt das Ergebnis, daß die Expression des Enzyms, das durch den Gerbera cDNA Klon kodiert wird, in Hefe ausreichend ist, um die direkte Bildung von Flavonen zu erreichen. Dies legt nahe, daß nur ein einziges Enzym für die Einführung der Doppelbindung zwischen C2 und C3 erforderlich ist (Abb. 1B) und daß der cDNA Klon, der von Akashi et.al. (1998) beschrieben worden ist, keine FNS II repräsentiert, sondern vielmehr eine Flavanon 2-Hydroxylase darstellt.
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Sequenzprotokoll

Claims (25)

1. Eine Nukleinsäuresequenz kodierend eine Flavonsynthase II (FNS II), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
  • a) der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 oder einem Teil hiervon,
  • b) einer Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz (a) hybridisiert und/oder mindestens 40% Homologie zu dieser aufweist und die ein Protein oder Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Flavonsynthase II kodiert,
  • c) einer Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist, bezogen auf eine Nukleinsäurese­ quenz gemäß (a) oder (b).
2. Nukleinsäuresequenz, die zu der Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 komplemen­ tär ist.
3. Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäurese­ quenz DNA oder RNA ist.
4. Eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist aus einer Pflanze aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
5. Ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Rekombinantes DNA Molekül gemäß Anspruch 5, wobei das rekombinante DNA- Molekül ein Vektor ist oder ein Vektor mit einem Promotor.
7. Eine Wirtszelle, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 6.
8. Wirtszelle gemäß Anspruch 7, die eine bakterielle Zelle, eine Hefezelle, eine Insek­ tenzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Säugerzelle ist.
9. Polypeptid, kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
10. Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2 oder Derivate hiervon.
11. Polypeptid gemäß Anspruch 10, wobei das Polypeptid Flavonsynthase II-Aktivität besitzt.
12. Polypeptid gemäß Anspruch 11, wobei das Polypeptid abgeleitet ist aus einer Pflanze aus der Gruppe von Pflanzen, bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbene Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
13. Transgene Pflanze, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprü­ che 1 bis 4.
14. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 13, wobei die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet ist und diese Expression gegebenenfalls regulierbar ist oder entwick­ lungsbedingt reguliert wird.
15. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, ausgewählt aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbere Hybriden), Aster (Callistephus chi­ nensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer veränderten Blüten­ farbe, umfassend das Einbringen einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Zelle einer geeigneten Pflanze und der Regeneration einer transgenen Pflanze aus dieser Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze über einen geeigneten Zeitraum und unter Bedingungen, die geeignet für die Expression der eingebrachten Nukleinsäuresequenz sind.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die eingebrachte Nukleinsäuresequenz in der Pflanze exprimiert wird.
18. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die transgene Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulcherrima), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybrida), Pelargonium (P. spec.), Begonia (B. spec.), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden).
19. Verfahren gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase II (FNS II) fähig ist und diese bei Expression der eingebrachten Nukleinsäuresequenz coexprimiert wird.
20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die transgene Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Pflanzen bestehend aus Gerbera (Gerbera Hybriden), Aster (Callistephus chi­ nensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene (Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden).
21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei die endogen vorhandene Flavon­ synthase II (FNS II)-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert wird.
22. Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Synthese von Flavonen.
23. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Flavone als Medikament eingesetzt werden.
24. Verwendung gemäß Anspruch 23, wobei die Flavone in der Krebstherapie eingesetzt werden.
25. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei die Flavone als bioaktive Substanzen ein­ gesetzt werden.
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