FLAVONSYNTHASE I ENZYME UND DEREN VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft genetische Sequenzen, die für Enzyme des Flavonoidstoffwechsels kodieren, speziell für die Flavonsynthase I (FNS I) oder Derivate hiervon und deren Verwendung zur gezielten Veränderung der Blütenfarbe, zur Veränderung des Flavonoid- und Flavongehaltes bzw. -musters in Blättern, Blüten und anderen Geweben von Pflanzen und anderen Organismen und darüberhinaus die Verwendung in verschiedenen Expressionssystemen zur Synthese von natürlichen, funktionellen Flavonen für medizinische, kosmetische oder ähnliche Anwendungen, z.B. zur Krebstherapie.
Flavonoide und deren Funktion in der Pflanze
Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Pflanzenpigmente, die in ver- schiedenen Geweben, wie z.B. Blüten, Blättern oder Wurzeln nachgewiesen wurden. Darüber hinaus gehören sie zu den am besten charakterisierten sekundären Metaboliten in Pflanzen. Mehr als 6400 verschiedene Flavonoide sind bislang charakterisiert worden. Sie sind in verschiedene Unterklassen (z.B. Flavone, Flavonole oder Anthocyane), basierend auf dem Grad der Oxidation des zentralen C-Ringes, eingeteilt worden. Jeder Typ kann darüberhinaus durch Hydroxylierung, Acylierung und Glykosylierung modifiziert werden (Heller und Forkmann, 1994; Harbome and Williams, 2001). Aufgrund der unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Moleküle besitzen die Unterklassen zum Teil sehr verschiedene biologische Funktionen.
Die Akkumulation bestimmter Flavonoide in einer Pflanzenzelle ist abhängig von der Verfügbarkeit der jeweiligen Enzyme, wobei die Verfügbarkeit der Enzyme letztendlich von der Expression des entsprechenden Gens abhängt. Die Regulierung der Expression von Flavo- noidbiosynthese-Genen wird im wesentlichen von der Pflanzenart, dem Entwicklungsstadium und den Umweltbedingungen bestimmt.
Flavonoide spielen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Pflanze eine wichtige Rolle. So wurde z.B. gezeigt, daß bestimmte Flavonole für das Pollenschlauchwachstum erforderlich
sind. Wird die Akkumulation der Flavonole durch eine Blockierung des Biosyntheseweges unterdrückt, erhält man sterile Pollen (Taylor and Jorgensen, 1992). Sowohl biotische als auch abiotische Signale können während der Interaktion der Pflanze mit ihrer Umwelt zu einer Flavonoidakkumulation führen. So führt z.B. eine UV-Bestrahlung zu einer Akkumulation von Flavonolen und Flavonen. Dies wird durch die Induktion der Transkription der jeweiligen Flavonoidbiosynthese-Gene in verschiedenen Arten erreicht (Kubasek et.al., 1992). Aber auch andere Streßfaktoren wie Verwundung, extreme Temperaturschwankungen und Wasserstreß können die Flavonoidakkumulation und/oder Genexpression in verschiedenen Arten induzieren (Hrazdina, 1982). Bei der Interaktion von Pflanzen mit anderen Organismen wird den Flavonoiden eine doppelte Funktion zugeordnet. Zum einen besitzen die Flavonoide als phenolische Verbindungen eine Wirkung als Phytoalexin gegen verschiedene Pathogene und als Abschreckung gegen Fraßfeinde (Harborne und Grayer, 1994), zum anderen sind sie verantwortlich für die Kommunikation zwischen Pflanzen aus der Familie der Leguminosen und bestimmten Mikroorganismen. Flavonoide dienen hierbei als Signalstoffe für Stickstoff- fixierende Bakterien, in denen daraufhin Gene exprimiert werden, die für die Symbiose mit der Pflanze erforderlich sind (Redmond et.al., 1986). In Blüten, Blättern und Früchten sind Flavonoide, besonders die farbigen Anthocyane, aber auch Chalkone, Aurone, Flavone und Flavonole, für die Farbgebung und für die Muster der verschiedenen sekundären Inhaltsstoffe verantwortlich. Letzteres ist zusammen mit anderen Merkmalen, wie z.B. dem Duft, wichtig für die Erkennung durch verschiedene Tiere, aber auch für den Menschen, der die Pflanze als Schmuck oder zur Ernährung verwendet (Harborne und Grayer, 1994). Außerdem beeinflussen bestimmte Flavonoide, wie z.B. das Flavon Apigenin und das Flavonol Quercetin, den Auxin Transport innerhalb der Pflanze (Jacobs und Rubery, 1988).
Der Flavonoid biosvnthese-Weq (Abb. 1A)
Die Struktur der Flavonoide besteht aus zwei aromatischen Ringen (A und B) und einem zentralen Heterozyklus (C) (Abb. 1B). In der Pflanze werden sie ausgehend vom L- Phenylalanin über den Phenylpropanoid-Weg durch die enzymatische Reaktion der Phenylalanin-Ammonia-Lyase (PAL) und der Zimtsäure-4-Hydroxylase (4CL) gebildet. Aus dem hieraus resultierenden 4-Cumaroyl-CoA entsteht zusammen mit 3 Molekülen Malonyl-CoA Tetrahydroxychalkon. Diese Reaktion wird durch die Chalkonsynthase (CHS), dem Schlüsselenzym der Flavonoidbiosynthese, synthetisiert (Abb. 1A). Das Tetrahydroxychalkon (THC) wird normalerweise schnell zu Naringenin (NAR) durch das Enzym Chalkonisomerase (CHI) isomerisiert. In verschiedenen weiteren Reaktionen entstehen die Anthocyane. Flavone werden auf einem Nebenweg durch die FNS I, einer löslichen 2-Oxoglutarat-abhängigen
Dioxygenase, oder durch die FNS II, einem membrangebundenen Cytochrom P450-Enzym, gebildet. Diese zwei Enzymklassen sind in der Natur weit verbreitet und verschiedene Gene für Dioxygenasen bzw. Cytochrom P450 Enzyme wurden aus Vertebraten, Insekten, Hefen, Pilzen, Bakterien und Pflanzen isoliert und sequenziert.
Die Flavonsynthasen verwenden verschiedene Flavanone, wie z.B. NAR oder Eriodictyol (ERI) als Substrat, um die entsprechenden Flavone Apigenin (Ap) und Luteolin (Lu) zu synthetisieren. Dabei wird, wie in Abbildung 1B dargestellt, zwischen der C2- und der C3-Position eine Doppelbindung eingefügt. Flavone können in der Pflanze in glykolysierter oder auch methylierter Form vorliegen.
In vitro wurde die Bildung von Flavonen aus Flavanonen zuerst mit Enzympräparationen von UV-bestrahlten Petroselium cr/spum-Zellsuspensionskulturen beobachtet. Bei dem entsprechenden Enzym handelt es sich, wie oben bereits erwähnt, um eine lösliche 2-Oxoglutarat- abhängige Dioxygenase, die Flavonsynthase I (FNS I) genannt wurde. In den Blüten von verschiedenen Flavon-produzierenden Pflanzen, z.B. Sinningia cardinalis, Antirrhinum majus, Verbena Hybride, Columnea hybrida, Chrysanthemum morifolium, Gerbern Hybriden und osmotisch induzierten Glycine max-Zellsuspensionskulturen, wird diese Reaktion jedoch von der ebenfalls oben bereits erwähnten FNS II katalysiert, einem NADPH-abhängigen, mikrosomalen Enzym, das zur Klasse der Cytochrom P450 gehört (Heller und Forkmann, 1994). Sequenzen, die für entsprechende Proteine in Gerbera Hybriden, Antirrhinum majus und Torenia Hybriden, konnten kürzlich mit Hilfe von Differential Display unter Verwendung von chemogenetisch definiertem Pflanzenmaterial bzw. durch Genbank Screening mit CYP93B1 isoliert werden (Martens und Forkmann, 1998, 1999; Akashi et al., 1999).
Während der letzten 25 Jahren wurden über 60 verschiedene Enzyme aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Vertebraten in die Klasse der 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen eingeordnet. Sie katalysieren dabei sehr unterschiedliche Reaktionen, wie z.B. aliphatische Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Desaturierungen oder desaturierende Zyklisierungen in unterschiedlichen Biosynthesewegen die unter anderem zu Alkaloiden, Ethylen, Gibberellinen, Penicillin und Flavonoiden führen (Prescott, J. Exp. Bot. 44, 849-861, 1993, De Carolis und De Luca, Phytochem. 36, 1094-1107, 1994, Precott, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 245-271, 1996. Die identische Art und Weise der Sauerstoffaktivierung der intermolekularen Dioxygenasen, speziell der 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen, legt die Vermutung nahe, dass ein hoher Grad an Homologie auf DNA und Polypeptidebene vorliegt. Allerdings besteht, zwischen der Polypeptidsequenz der Flavanon 3ß-hydroxylase aus Petunia-Hybriden und der
Hyoscyamin 6ß-hydroxylase aus Hyoscyamus niger nur eine Homologie von 30 % (Britsch, J. Biol. Chem. 267, 5380-5387, 1992). Die zwei Hydroxylasen Prolyl 4-Hydroxylase bzw. Lysyl- Hydroxylase und die zwei Synthasen Isopenicillin N-Synthase bzw. Desacetoxycephalosporin C Synthase besitzen sogar nur eine Homologie von etwa 20% (Myllylä, J. Biol. Chem. 266, 2805-2810, 1991 , Britsch, Eur. J. Biochem. 217, 745-754, 1993).
Bislang wurden aus dem Flavonoidbiosyntheseweg fünf 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen identifiziert. Hierzu gehören die weit verbreitete Anthocyanidinsynthase (ANS) (Menssen , EMBO J. 9, 3051-3057, 1990, Saito, Plant J. 17, 181-189, 1999), die Flavanon 3ß- hydroxylase (FHT) (Forkmann, Z. Naturforsch. 35c, 691-695, 1980, Britsch, Z. Naturforsch. 36c, 742-750, 1981 , Lukacin, Eur. J. Biochem. 249, 748-757, 1997, Lukacin, Arch. Biochem. Biophys. 375, 364-370, 2000, Lukacin, Eur. J. Biochem. 267, 853-860, 2000, Lukacin, FEBS Lett. 467, 353-358, 2000), die Flavonolsynthase (FLS) (Britsch , 1981 loc. cit., Holton, Plant J. 4, 1003-1010, 1993, Wisman, PNAS 95, 12432-12437, 1998). Eine weitere Dioxygenase katalysiert die 6-Hydroxylierung von teilweise methylierten Flavonolen (Anzelotti, Arch. Biochem. Biophys. 382, 161-172, 2000). Demgegenüber ist die Flavonsynthase I (FNS I) nur auf Mitglieder der Familie der Apiaceae begrenzt (Heskamp, Diplomarbeit Universität Freiburg, 1989, Britsch, Arch. Biochem. Biophys. 276, 348-354, 1990). Sutter (Arch. Biochem. Biophys. 170, 547-556, 1975) konnten die Enzymaktivität erstmalig in einem zellfreien Rohextrakt aus sehr jungen Primärknospen von Petersilie zeigen. Eine weitere Charakterisierung dieser Reaktion konnte aufgrund der schlechten Aktivität bzw. dem Fehlen einer geeigneten Enzymquelle nicht durchgeführt werden. Um ausreichend Pflanzenmaterial für 1 ml Rohextrakt (entsprechen 5 Standardtests) zu sammeln, waren etwa 4 Stunden erforderlich. Zudem wurde in den bis dahin verwendeten Petersilie-Zellsuspensionskulturen keine Flavonsynthase I Aktivität nachgewiesen, obwohl alle anderen bekannten Enzyme aus dem Flavonoidbiosyntheseweg nachweisbar waren (Sutter., loc. cit., 1975). Erst durch die Verwendung von UV-induzierten Zellsuspensionskulturen stand eine Enzymquelle zur Verfügung, die eine ausführliche Charakterisierung der Enzymaktivität zuliess (Britsch, loc. cit., 1981). Das lösliche FNS I-Enzym aus Petersilie zeichnet sich durch verschiedene (auch in den Beispielen illustrierten) Eigenschaften gegenüber der Flavonsynthase II, einem membrangebundenen, mikrosomalen Protein aus der Klasse der Cytochrom P450, das in allen anderen Pflanzen ausserhalb der Apiaceae für die Bildung der Flavon verantwortlich ist, aus (Stotz.Z. Naturforsch. 36c, 737-741, 1981, Kochs, Z. Naturforsch. 42c, 343-348, 1987, Martens, Phytochem. 49, 1953-1958, 1998). In einer aufwendigen, fünfstufigen Reinigungsprozedur konnte die FNS I lediglich teilweise aufgereinigt werden. Insgesamt wurden nur 450 μg Protein mit einer sehr geringen Aktivität aus 2,3 kg Petersilie-Zellen isoliert, jedoch war eine N-
terminale Sequenzierung des apparent homogenen Enzyms erfolglos, da vermeintlich der N- terminus blockiert war und bezweifelt werden kann, daß es sich beim aufgereinigten Protein tatsächlich um das gesuchte FNS I handelte. Die erfolgreiche Bereitsstellung eines hochspezifischen Antikörpers gegen die FNS I ist ebenfalls bislang nicht beschrieben worden. Mit Hilfe des oben beschrieben gereinigten Proteins konnte lediglich ein Antikörper mit sehr geringem Titer erhalten werden. Dieser zeigte zwar in der Immunotitration eine gewisse Spezifität, aber gleichzeitig erkannte er auch ein Protein um 47 kDa in elicitorinduzierten Soja- Rohextrakten, in denen keine FNS I Aktivität vorhanden ist (Britsch, loc. cit., 1990, Junghanns, Diplomarbeit Universität Freiburg, 1991). Somit waren Zweifel berechtigt, daß es sich bei dem oben dargestellten und aus 2,3 kg Pertersilie isolierten Polypeptid tatsächlich um die FNS I handelte.
Drei Typen von Pigmenten sind für die Farben in Blüten verantwortlich: Betalaine, Carotinoide und Flavonoide. Betalaine kommen nur in einigen wenigen Familien der Centrospermae vor, wo sie für gelbe, orange, rote und violette Farben verantwortlich sind. Carotinoide ergeben orange oder gelbe Töne und sind die Hauptpigmente in den meisten orangen und gelben Blüten. Flavonoide sind die wichtigsten und am weitesten verbreiteten Blüten- bzw. Pflanzenpigmente. Zu dieser Gruppe gehören die farbgebenden Anthocyane, die glykosyliert und oft acyliert in der Vakuole vorliegen. Unterschiedliche Anthocyane können dabei verschiedene Farbtöne produzieren. Die Blütenfarbe wird darüber hinaus auch vom pH-Wert der Vakuole, der Komplexierung mit Metallen und dem Glykosylierungs- bzw. Acylierungsmuster beeinflußt (Forkmann, 1991). Ein weiterer wichtiger Faktor für die Entstehung von verschiedenen Blütenfarben ist die Kopigmentierung der Anthocyane mit farblosen Flavonoiden, wie z.B. Flavonen oder Flavonolen oder auch Tanninen (Scott- Moncrieff, 1936). Anthocyane, die mit Flavonen kopigmentiert sind, können verschiedene Farben annehmen, die von der Grundstruktur des Anthocyan abhängen, und zwischen purpurrot und blau variieren können (Äsen und Horowitz, 1974; Goto und Kondo, 1991). Verschiedene Flavone, wie z.B. das Isoetin, sind darüber hinaus auch als gelbe Blütenpigmente identifiziert worden (Harborne, 1978).
Ein wichtiges Ziel in der gartenbaulichen Pflanzenzüchtung ist die Entwicklung von neuen Sorten bei blühenden Zierpflanzen. Klassische Züchtungsmethoden wurden in der Vergangenheit teilweise erfolgreich zur Etablierung für eine Reihe von verschiedenen Farben bei vielen wirtschaftlich wichtigen Zierpflanzen eingesetzt. Jedoch schränkt der Genpool der einzelnen Arten die Möglichkeiten für solche Ansätze auf natürliche Art und Weise ein. Aus diesem Grund gibt es bis heute nur wenige Arten, die das gesamte Farbspektrum besitzen.
Außerdem kann durch die klassischen Züchtungsmethoden keine präzise Veränderung erzielt werden. Da der ästetische Wert einer Blüte von verschiedenen Faktoren wie z.B. Form, Duft und Farbe bestimmt wird und eine Veränderung eines dieser Faktoren durch Kreuzung in der Regel nur auf Kosten von ähnlichen, anderen sichtbaren Merkmalen erzielt oder nur mit sehr hohem zeitlichen und finanziellen Aufwand erreicht werden kann, muss ein effektiverer Weg zu neuen Sorten genutzt werden. Die Möglichkeit, gezielt Blütenfarben von Pflanzen zu verändern, bringt eindeutige Vorteile gegenüber anderen Methoden. Dies ist besonders in einem Bereich wichtig, der einen hohen Produkt-Tumover besitzt und wo Neuheit ein wichtiger Marktfaktor ist. Zum Beispiel würde die Entwicklung von blaublühenden Sorten bei den Hauptschnittblumen-Arten wie Rosen, Chrysanthemen, Nelken, Lilien, Tulpen und Gerbera einen wesentlichen Marktvorteil auf dem Schnittblumenmarkt, aber auch auf dem Topfpflanzenmarkt mit sich bringen. Die Möglichkeit der Kontrolle der Synthese von Kopigmenten, z.B. Flavone, in Pflanzen ist eine nützliche Anwendung bei der gezielten Veränderung der Blütenfarben. Außerdem kann diese Anwendung neben den Blüten auch auf Früchte und andere Nutzpflanzen, z.B. auf Obst- und Gemüsepflanzen, und auf Blätter, z.B. bei Zierpflanzen, übertragen werden.
Neben ihrem Beitrag zur Blütenfarbe besitzen die Flavonoide, speziell die Flavone, noch weitere biologische Eigenschaften und Wirkungen. Sie wurden z.B. bei einigen Pflanzen als Fraßstimulanz für monophage und oligophage Insekten gefunden (Harborne und Grayer, 1994). In den meisten Fällen zeigen die Glykoside dabei eine bei weitem größere Wirkung als die entsprechenden Agiyka, was vermutlich auf die bessere Löslichkeit der Glykoside zurückzuführen ist. Außerdem können die Insekten zwischen verschiedenen Zuckerresten unterscheiden, wodurch eine weitere Differenzierung der aktiven Komponenten gegeben ist. Auch die Grundstruktur der Agiyka kann zu unterschiedlichen Wirkungen führen. Im Vergleich zu vielen anderen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen haben die Flavonoide bzw. die Flavone offensichtlich keine sehr toxische Wirkung auf Insekten. Trotzdem gibt es einige Flavone, die schon bei geringen Konzentrationen als Abschreckung für Fraßinsekten fungieren oder das Wachstum der Tiere erheblich hemmen können. Ein Einfluß der Glykosylierungsart konnte hier nicht gezeigt werden, wohl aber der der Hydroxylierung bzw. Methoxylierung des Flavons (Harborne und Grayer, 1994).
Verschiedene Flavone stimulieren darüber hinaus auch Schmetterlinge zur Eiablage auf bestimmten Pflanzen. Es wurde gezeigt, daß die Tiere erst nach dem Erkennen des Stimulus ihre Eier ablegen. Zu solchen stimulierenden Substanzen gehören z.B. die Flavone Vicenin-2 und verschiedene Luteolin-Derivate. Unterbindet man die Synthese dieser Stoffe in den
jeweiligen Wirtspflanzen, können Eiablagen der Schmetterlinge und damit Fraßschäden durch deren Raupen verhindert werden.
Durch die Ausnutzung natürlicher chemischer Abwehrmechanismen der Pflanzen können Probleme, die die Verwendung von synthetischen Insektiziden mit sich bringt, wie z.B. die Umweltbelastung, die durch Reste der eingesetzten Stoffe in der Frucht und im Boden auftreten, vermieden werden. Außerdem wird eine Resistenzbildung, wie sie bei den meisten synthetischen Pestiziden beobachtet wird, umgangen oder zumindestens verzögert werden und es werden die zum Teil erheblichen Kosten für Mittel und Ausbringung eingespart.
Eine weitere wichtige biologische Eigenschaft der Flavonoide betrifft die Aktivierung der Nodulationsgene in verschiedenen Rhizobium-Arten. Diese Bakterien infizieren Leguminosen und bilden Stickstoff-fixierende Wurzelknöllchen. Die von der Wirtspflanze produzierten Flavonoide fungieren dabei als "Signalstoff', wodurch die Bakterien den Infektionsprozeß einleiten. Zu diesen pflanzenspezifischen, aktiven Verbindungen gehören auch verschiedene Flavone, wie z.B. Apigenin, Luteolin und 7,4'-Dihydroxyflavon (Firmin et.al., 1986; Redmond et.al., 1986). Wird die Flavonproduktion und deren Abgabe durch die Wurzel bzw. das Fla- vonmuster in diesem Gewebe verändert, kann eine Verbesserung der Stickstoff-Fixierung oder aber eventuell eine Etablierung dieses Mechanismus bei Nicht-Leguminosen Pflanzen erreicht werden.
Durch Ausnutzung dieser natürlichen Symbiosemechanismen kann die Stickstoff-Düngung und damit die Belastung der Umwelt durch die Auswaschung der Nährstoffe reduziert werden. Zudem werden Kosten für die Düngermittel und deren Ausbringung eingespart.
Innerhalb der Pflanze beeinflussen verschiedene natürlich vorkommende Flavonoide, wie z.B. das Flavon Apigenin oder die Flavonole Kaempferol und Quercetin, den Auxin-Transport in unterschiedlichen Pflanzengeweben und Transportsystemen. Sie verhalten sich dabei ähnlich wie synthetische Transportinhibitoren. Auxine beeinflussen als pflanzeneigene Wachstumsregulatoren die Zellstreckung, Zellteilung, Apikaidominanz, Wurzel- und Sproßneubildung sowie die Parthenokarpie. Eine induzierte, veränderte Flavonoidkonzentration (endogene Veränderung und/oder exogene Applikation) kann somit über die Interaktion mit Auxinen das Wachstum von Pflanzen erheblich beeinflussen. Dadurch können synthetische Wuchshemmstoffe ersetzt werden.
Flavonoide besitzen als bioaktive Substanzen darüber hinaus auch eine nicht unbedeutende Rolle bei der menschlichen und tierischen Ernährung. Sie kommen in Früchten, Gemüsen, Nüssen, Samen, Stengeln, aber auch in Tee und Wein vor. Schon seit längerem werden den Flavonoiden, auch verschiedenen Flavonen, antiallergische, entzündungshemmende, antivirale, proliferationsreduzierende und anticanzerogene Eigenschaften zugesprochen. Aber auch ein Einfluß auf den menschlichen und tierischen Stoffwechsel und das hochkomplexe Immunsystem wird beschrieben. Die Flavonoide bzw. Flavone beeinflussen in diesem Zusammenhang eine große Anzahl verschiedener Enzyme (z.B. die Hyaluronidase- oder Aldose-Reduktase), sie besitzen wichtige, enzyminduzierende und antioxidative Eigenschaften, können freie Radikale abfangen, chelatisieren verschiedene Metallkationen und beeinflussen auch die zelluläre Proteinphosphorylierung (Middleton und Kandaswami, 1994).
Die Verbesserung von Nutzpflanzen, die für die Ernährung von Mensch und Tier aufgrund ihres Gehalts an gesundheitsfördernden Flavonoiden wichtig sind, durch die gezielte Veränderung des Gehalts oder Musters der entsprechenden Verbindungen, leistet einen erheblichen Beitrag zur gesunden Ernährung von Mensch und Tier.
Obgleich eine biochemische Flavonsynthase I-Aktivität in Apiaceae seit 1975 beschrieben war, konnte, wie oben bereits dargestellt, das tatsächlich beteiligte Enzym nicht oder nur unrein zur Verfügung gestellt werden. Aminosäuresequenzen oder DNA-Sequenzen der entsprechenden Proteine, bzw. Gene sind nicht bekannt. Weiterhin wurde eine erfolgreiche Bereitstellung einer codierenden FNS I Sequenz durch die oben beschriebene, geringe Homologie der Dioxygenasen behindert.
Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere Mittel und Verfahren bereitzustellen (zusätzlich zur Flavonsynthase II und deren Verwendung), um gezielt die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen zu verändern und zu steuern, um z.B. die Blütenfarbe einer Pflanze zu verändern oder die Resistenzeigenschaften und Symbiosefähigkeit einer Pflanze zu verbessern.
Insbesondere war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, weitere und effektivere Mittel und Verfahren bereitzustellen, die zur gezielten Synthese von definierten Flavonen verwendet werden können. Derartig gewonnene Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie oder in Kosmetika Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Die Erfindung betrifft daher eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Flavonsynthase I (FNS I) kodiert. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine in SEQ ID NO:1 gezeigte Nukleinsäuresequenz oder einen Teil hiervon. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die mit der in SEQ ID NO:1 gezeigten Nukleinsäuresequenz oder einem Teil hiervon hybridisiert und/oder mindestens eine 60%ige, besser eine mindestens 65%ige, noch besser eine mindestens 70%ige oder am besten mindestens eine 75%ige Homologie oder am besten eine Homologie größer als 80% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz besitzt.
Wie in den Beispielen dokumentiert, wurde hier überraschend gefunden, daß nur durch spezifisch-degenerierte Primer eine FNS l-kodierende Sequenz aufgefunden werden kann, die sich von der FHT (Flavanon-3-Hydroxylase) und verwandten, anderen Dioxygenasen unterscheidet.
Bevorzugt, und wie hierin beschrieben, kodiert die Nukleinsäuresequenz ein Protein oder Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Flavonsynthase I.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die degeneriert ist bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz gemäß der vorhergehenden Ausführungsformen.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist bevorzugt DNA oder RNA und ist bevorzugterweise abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, z.B. Pflanzen aus der Familie der Apiaceae (Daucus carota u.a.).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße
Nukleinsäuresequenz eine rekombinante Nukleinsäuresequenz. Des weiteren betrifft die
Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die zu der Flavonsynthase I (FNS l)-kodierenden Sequenz komplementär ist.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure zur Verfügung, die eine für Flavonsynthase I (FNS I) oder für ein funktionelles Derivat dieses Enzyms kodierende Nukleinsäure oder eine komplementäre Nukleinsäure umfaßt. Mit dem Begriff "FNS l Enzym" sind Enzyme des Flavonoidbiosyntheseweges gemeint, die z.B. Flavanone wie Naringenin und Eriodictyol oder auch andere Verbindungen aus dieser Klasse als Substrat für die Synthese der entsprechenden Flavone (in diesem Fall Apigenin und Luteolin) verwenden.
Bevorzugt bezeichnet „FNS I Enzym" oder „Flavonsynthase I Enzym" eine bevorzugt lösliche, 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase. Bevorzugte Flavonsynthase I Enzyme sind solche, die eine Doppelbindung zwischen dem C2 und C3 Atom von Flavanonen wie Naringenin und Eriodictyol einführen. Das erfindungsgemäße Flavonsynthase I Enzym ist weiterhin dadurch charakterisiert, dass die katalysierte Reaktion bevorzugt unabhängig von NADPH stattfindet. Das erfindungsgemäße Flavonsynthase I Enzym ist auch dadurch charakterisiert, dass es nicht membrangebunden ist. Das erfindungsgemäße Flavonsynthase I Enzym ist weiterhin bevorzugt dadurch charakterisiert, dass es kein Cytochrom P450-Enzym ist.
Bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, die aus dem natürlichen Umfeld isoliert oder chemisch synthetisiert wurde. Insbesondere bevorzugt sind Nukleinsäuremoleküle, die in vitro gebildet oder erhalten werden, einschließlich genomischer DNA-Fragmente, rekombinanter und synthetischer Moleküle und Nukleinsäuren in Kombination mit heterologen Nukleinsäuren. Dies umfaßt auch genomische DNA oder cDNA oder Teile davon, die die FNS I oder Teile davon in reverser Orientierung zum entsprechenden oder einem anderen Promotor kodieren. Weiter eingeschlossen sind natürlich vorkommende, nahe verwandte Nukleinsäuresequenzen.
Der Begriff "Nukleinsäuresequenz, kodierend eine Flavonsynthase I", wird hierbei in der allgemeinsten Form gebraucht und umfaßt jede aufeinanderfolgende Reihe von Nukleotidbasen, die direkt oder über eine komplementäre Reihe von Basen eine Aminosäuresequenz einer FNS I bestimmt.
Ein Polypeptid mit einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz der Flavonsynthase I meint eine vollständige (füll length) FNS I oder eine aktive, unvollständige Form derselben.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Oligonukleotide, die als genetische Proben oder als "Antisense"-Moleküle zur Regulierung der Expression des entsprechenden
Gens in Pflanzen oder anderen Organismen verwendet werden können. Ein "Antisense-
Molekül", wie es hier beschrieben ist, umfaßt auch ein Genkonstrukt, das aus einem strukturellen, genomischen oder einem cDNA-Gen oder einem Teil hiervon in reverser Orientierung in Bezug auf seinen oder einen anderen Promotor besteht.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäuresequenz, die für die FNS I oder für verschiedene funktioneile Derivate dieser kodiert, zur Reduzierung der Aktivität von endogener FNS I verwendet, oder alternativ wird eine Nukleinsäuresequenz, die dieses Enzym oder verschiedene Derivate oder Teile davon kodiert, in Antisense-Orientierung verwendet, um die Aktivität der FNS I zu reduzieren. Darüber hinaus ist es aber auch möglich, daß ein Antisense- Transkript der FNS I oder ein Fragment oder ein Teil der FNS I (z.B. ein Oligonukleotid- Molekül) eine Duplex mit allen oder Teilen der natürlich vorkommenden mRNA, die das Enzym spezifiziert, eingeht und so eine Akkumulation von oder die Translation der mRNA in das aktive Enzym verhindert. Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von Ribozymen, um spezielle Nukleinsäuresequenzen zu inaktivieren.
Hier erwähnte Änderungen der FNS I-Aktivität betreffen eine Erhöhung oder Reduzierung der Aktivität von bis zu 30% oder besser von 30 bis 50% oder noch besser 50 bis 75% bzw. am besten von 75% oder noch höher bzw. niedriger zum normalen, endogenen oder existierenden Wert der Aktivität. Die Höhe der Aktivität kann leicht mit der bei Martens und Forkmann (1998) beschriebenen Methode für die FNS II getestet werden (siehe Beispiel 3).
Bei der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäure kann es sich auch um eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure handeln, die als einzelsträngiges oder doppelsträngiges und lineares oder kovalent kreisförmig geschlossenes Molekül vorliegen kann. Üblicherweise liegt das Nukleinsäuremolekül als cDNA vor. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch andere Nukleinsäuremoleküle, die unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingungen mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen oder speziell mit der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz oder einem Teil oder einem Bereich davon hybridisieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleinsäuresequenz oder ein Molekül, das mindestens eine 60%ige, besser eine mindestens 65%ige, noch besser eine mindestens 70%ige oder am besten mindestens eine 75%ige oder am besten eine Ähnlichkeit höher als 80% auf der Ebene der Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz zu mindestens einem oder mehreren Bereichen (bevorzugt über den ganzen Bereich) der in SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz besitzt und wobei die Nukleinsäure kodierend oder komplementär zu einer Sequenz ist, die ein Enzym kodiert, das FNS I-Aktivität besitzt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiter Nukleinsäuremoleküle in der Form von Oligonukleotid- Primern oder kompetente Proben zur Hybridisierung mit einem Teil der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle und spezielle mit dem in SEQ ID NO:1 dargestellten. Die Hybridisierung kann unter niedrig-, besser unter mittel- und am besten unter hoch-stringenten Bedingung erfolgen. Bevorzugterweise entspricht der Teil dem 5'- oder 3'-Ende des Gens. Aus Zweckmäßigkeit wird das 5'-Ende hier definiert als der Bereich hauptsächlich zwischen dem Startcodon der strukturellen, genetischen Sequenz bis zum mittleren Bereich des Gens. Das 3'- Ende wird hier betrachtet als der Bereich, der die strukturelle genetische Sequenz zwischen dem mittleren Bereich des Gens und dem Stopcodon definiert. Es ist daher klar, daß Oligonukleotide oder Proben mit dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende oder mit einem Bereich gemeinsam zu beiden, dem 5'- oder 3'-Ende, hybridisieren können. Die vorliegende Erfindung umfaßt alle solche Proben. Bevorzugte Oligonukleotide sind in den Beispielen dargestellt.
Wie bereits oben erwähnt, bedeutet der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen. Am meisten bevorzugt sind hierbei stringente Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind. Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 50% Formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardt's- Lösung, 40 mM Natriumphosphat pH 6,8; 0,5% (Gew. Vol.) BSA, 1% (Gew.A ol.) SDS, 0,1 mg/ml Heringsperma-DNA bei einer Hybridisierungstemperatur von 42°C und anschließendes Waschen der Filter in 0,5 x SSC/0,5% SDS bei 60°C. Ein Beispiel für konventionelle nicht stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung unter den angegebenen Bedingungen mit der Ausnahme, daß 30% Formamid anstatt 50% verwendet werden und die Filter anschließend in 2 x SSC/0,5% SDS bei 56°C gewaschen werden. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z.B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden, die vorzugsweise aus Pilzen hergestellt wurden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Moleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z.B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Als Hybridisierungssonde können z.B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter SEQ ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich
auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe üblicher Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls übereinstimmt.
Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren. Unter "Fragmenten" werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um ein Protein mit FNS I-Aktivität zu codieren. Der Ausdruck "Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang ebenfalls, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden aber einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen.
Der Begriff „Derivat" umfasst hierbei, inter alia, alle Abkömmlinge basierend auf Seq. No. 1 die Flavonsynthase I Aktivität besitzen. Dabei kann die abgeleitete Enzymaktivität gegenüber der entsprechenden Protein der Ausgangssequenz sowohl erhöht als reduziert sein. Die Aktivität des Derivates kann analog der in den Beispielen dargestellten Aktivitätstests nachgewiesen und quantifiziert werden
Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 60%, insbesondere eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise über 75%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Dabei weisen die durch diese Nukleinsäuremoleküle codierten Proteine vorzugsweise eine Sequenzidentität zu der in SEQ ID No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz von mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, insbesondere mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% und ganz bevorzugt von mindestens 95% auf. Zur Bestimmung der Homologie kann dabei auf gängige Computerprogramme zurückgegriffen werden. Bevorzugt für die Bestimmung der Homolgie der Sequenzen und für das Alignment ist hierbei das Programm CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program (version 1.8, June 1999) (http://clustalw.genome.ad.jp,.
Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können dabei beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion und/oder Rekombination entstanden sein. Erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle können auch anderweitige Derivate der Sequenzen pflanzlichen Ursprungs sein. Eine Derivatisierung der Sequenzen kann notwendig sein, um eine Expression in bestimmten Wirtszellen möglich zu machen.
Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Biologische Funktionen der FNS und insbesondere der hier erfinderischen FNS I, sind hierin und auch in der Einleitung beschrieben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Stämmen oder Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.
Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen vorzugsweise bestimmte gemeinsame Charakteristika auf, wie Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität oder Konformation, oder physikalische Eigenschaften, wie das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH- Optimum oder Temperatur-Optimum.
In einer bevorzugten Ausführungsform codieren die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen ein Polypeptid mit den Eigenschaften einer FNS I.
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA- als auch RNA-Moleküle handeln. Entsprechende DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische DNA- oder cDNA-Moleküle. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können aus natürlichen Quellen isoliert werden, vorzugsweise aus Pflanzen oder sie können nach bekannten Verfahren synthetisiert werden.
Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken ist es ferner möglich (siehe z.B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'- Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen. Andererseits können auch gezielt Enzyme hergestellt
werden, die aufgrund der Addition von Signalsequenzen in verschiedenen Kompartimenten lokalisiert sind.
Insbesondere kann der Fachmann auch Sequenzen verwenden, die das erfinderische Protein/Polypetid, insbesondere die FNS I (und/oder deren hier beschriebenen Fragmente und Derivate) zur Expression in Wurzelgewebe der Pflanzen bringt, beispielsweise zur erhöhten Flavonproduktion im Wurzelgewebe und dadurch zur verbesserten Besiedlung mit Knölchenbildenden Bakterien (Stickstofffixierung). Weiterhin kann der Fachmann durch die erfinderische Lehre und durch Bereitstellung der hierin beschriebenen Nuklein und Aminosäuresequenzen die Expression von FNS I (und/oder deren funktionelle Fragmente oder Derivate) in für menschliche und tierische Ernährung wichtige Pflanzenteilen, wie Fruchtgewebe, steuern. Dies kann zum Beiepiel über gewebespezifische Promotoren geschehen, die mit den erfindungsgemässen Nukleinsäuren verbunden sind.
Ferner ist auch die Einführung von Punktmutationen denkbar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z.B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten Km-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen z.B. über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen.
Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in wϊro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder
Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ihre komplementäre Form kann das vollständige Enzym oder einen Teil oder ein Derivat kodieren. Mit "Derivat" ist eine einzelne oder multiple Aminosäuresubstitution, -deletion und/oder -addition in Bezug zum natürlich vorkommenden Enzym gemeint, wobei vorzugsweise die Flavonsynthase I-Aktivität erhalten bleibt. Die spezifische FNS I Aktivität kann nach Verfahren getestet werden, wie, inter alia, in den Beispielen beschrieben sind. In diesem Zusammenhang umfaßt die erfindungsgemäße Nukleinsäure die natürlich vorkommende Nukleotidsequenz, die für die FNS I kodiert und einzelne oder multiple Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung oder ihre komplementäre Form kann auch einen Teil der FNS I kodieren, entweder aktiv oder inaktiv. Solch ein Nukleinsäuremolekül kann als Oligonukleotid-Probe, als Primer für die Polymerasekettenreaktion, in verschiedenen mutagenen Techniken oder zur Erstellung von Antisense-Molekülen verwendet werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das rekombinante DNA-Molekül ein Vektor oder ein Vektor mit einem Promotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure fähig. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können in einer von beiden Orientierungen in Kombination mit einem Vektormolekül, z.B. einem Expressionsvektor, vorliegen. Der Begriff "Vektormolekül" wird dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um jegliche intermediären Vehikel für das Nukleinsäuremolekül einzuschließen, die es z.B. ermöglichen, die Nukleinsäure in Zellen, insbesondere Pflanzenzellen, zu transferieren und/oder sie in ein Genom zu integrieren. Bevorzugt werden diese Vektormoleküle oder Teile davon zur Integration in ein Pflanzengenom verwendet. Solche Vektormoleküle können in prokaryotischen Zellen und/oder in eukaryotischen Zellen repliziert und/oder exprimiert werden. Ein intermediäres Vehikel kann z.B. für den Gebrauch bei der Elektroporation, beim Mikroprojektilbeschuß, beim Transfer mit Hilfe von Agrobakterien oder bei der Insertion über DNA- oder RNA-Viren angepaßt sein. Das intermediäre Vehikel und/oder das darin enthaltene Nukleinsäuremolekül kann stabil im Pflanzengenom integriert werden. Das Nukleinsäuremolekül kann zusätzlich auch noch eine Promotor-Sequenz beinhalten, die zur Einleitung der Expression des Nukleinsäuremoleküls in einer Zelle, insbesondere einer
Pflanzenzelle, geeignet ist. Das Nukleinsäuremolekül und der Promotor können ebenfalls durch verschiedene Verfahren (siehe oben) in die Zelle eingeführt werden.
Die hier beschriebenen FNS I codierenden Sequenzen, deren funktionelle Fragmente, Derivate als auch deren Mutationen können, wie in den Beispielen dargestellt auf FNS I-Aktivität getestet werden, z.B. unter Verwendung spezifischer Expressionsysteme, wie hier beschrieben. Eine weitere Möglichkeit zur Funktionskontrolle bietet die gezielte Transformation von verschiedenen Pflanzen, die Expression der Sequenz in ihnen und die Synthese der Flavone, die biochemisch und chromatographisch nachgewiesen werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein erfindugsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül enthalten. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik übliche Vektoren. Bevorzugterweise betrifft die Erfindung Vektoren, wobei das Nukleinsäuremolekül oder das rekombinate Nukleinsäuremolkül operativ verknüpft ist mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und/oder Synthese einer translatierbaren RNA in pro- und/oder eukaryotischen Zellen gewährleisten. Wie bereits oben beschrieben, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch mit regulatorischen Elementen, wie Promotoren verbunden sein, die die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in spezifischen Geweben, wie z.B. Wurzelgeweben und/oder Fruchtgeweben oder Blütenblättern steuern.
Daher ist vorzugsweise das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen operativ verbunden, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer Vektor die folgenden Elemente enthalten:
- Einen Promotor, der die Transkription nachgeschalteter Codierregionen in Zellen des Wirtsorganismus sicherstellt, und gegebenenfalls Enhancer-Elemente.
- Eine Codierregion als Fusion an den Promotor, die zumindest ein offenes Leseraster für die Translation eines Polypeptids enthält. Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Codierregion um ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül.
- Gegebenenfalls weitere Sequenzen als Fusion an die Codierregion, beispielsweise Transkriptionsterminationssignale, wenn dies zur erfolgreichen Genexpression in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich ist, oder Signalsequenzen, die die subzelluläre Lokalisation des Genprodukts beeinflussen oder die die Sekretion des Proteins bewirken.
Ein derartiger Vektor kann weitere Gene enthalten, wie Markergene, die die Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Die Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls umfaßt die Transkription des Nucleinsäuremoleküls in translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression des Nucleinsäuremolküls in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten, sind dem Fachmann bekannt. Mögliche regulatorische Elemente, die für die Expression des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls in prokaryontischen Wirtszellen geeignet sind, umfassen beispielsweise den PL, lac, trp oder tac Promotor in E. coli. Besonders bevorzugt wird der in E. coli durch IPTG induzierbare lacZ-Promoter verwendet. Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen erlauben, sind der AOX1 und der GAL1 Promotor in. Für die Expression in Hefe wird bevorzugt der in Hefe hochaktive Promotor des Alkohol-Dehydrogenase-Gens aus Saccharomyces cerevisiae verwendet. Wie in den Beispielen beschrieben, können Promotoren, wie der T7-Promotor verwendet werden; siehe pYES2.1 Vektor des Beispiels 8. Weitere geeignete Vektorsysteme sind im Stand der Technik beschrieben, beispielsweise Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press N.Y., und in Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY..
Regulatorische Elemente für die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Pflanzenzellen sind prinzipiell jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promoter, Enhancer, Terminator, etc. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression in den erfindungsgemäßen Pflanzen konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
Sinnvolle Promotoren sind z.B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus (siehe beispielsweise US 5,352,605) und der Ubiquitin-Promotor (siehe beispielsweise US 5,614,399) für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor B33 (Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z.B. der ST-LS1- Promotor (Stockhaus, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), der Ca/b-Promotor (siehe beispielsweise US 5,656,496, US 5,639,952, Bansal, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 3654-3658) und der Rubisco SSU-Promotor (siehe beispielsweise US 5,034,322, US 4,962,028). Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiviert
werden (siehe beispielsweise WO 93/07279). Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat-shock Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können samenspezifische Promotoren, wie z.B. der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in Vicia faba und anderen Pflanzen gewährleistet, verwendet werden (Fiedler, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). Ferner können auch fruchtspezifische Promotoren eingesetzt werden, wie z.B. in WO 91/01373 beschrieben. Für die Expression in reifenden Tomatenfrüchten eignen sich z.B. cis-regulatorische Elemente eines Polygalacturonase-Promotors aus Tomate, die im äußeren bzw. inneren Pericarp aktiv sind (Nicholass et al., Plant Mol. Biol. 28 (1995), 423-435; Montgomery et al., Plant Cell 5 (1993), 1049-1062). Einen weiteren fruchtspezifischen Promotor für die Tomate beschreiben Van Haaren et al. (Plant Mol. Biol. 21 (1993), 625-640). Darüberhinaus können Promotoren für eine endospermspezifische Expression verwendet werden, wie z.B. der Glutelinpromotor (Leisy, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng, Plant J. 4 (1993), 357-366), der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais (Pedersen, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93) oder der shrunken-1 -Promotor (sh- 1) aus Mais (Werr, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380).
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ist insbesondere in solchen Organen der Pflanze von Vorteil, die einen erhöhten Gehalt an Saccharose aufweisen oder Saccharose speichern. Solche Organe sind z.B. die Rübe der Zuckerrübe oder der Stamm des Zuckerrohrs und der Zuckerhirse. Besonders bevorzugt werden daher Promotoren verwendet, die die Expression in diesen Organen vermitteln, wie beispielsweise der Patatin-Promotor B33 aus Solanum tuberosum. Zur spezifischen Expression im Stamm von Zuckerrohrpflanzen kann der Ubiquitin-Promotor in Kombination mit dem ersten Intron verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren können darüberhinaus weitere Funktionseinheiten besitzen, die eine Stabilisierung des Vektors in einem Wirtsorganismus bewirken, wie einen bakteriellen Replikationsursprung oder die 2-Mikron-DNA zur Stabilisierung und autonomen Replikation in Hefe. Ferner können "left border"- und "right border"-Sequenzen agrobakterieller T-DNA enthalten sein, wodurch eine stabile Integration in das Erbgut von Pflanzen ermöglicht wird. Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. z.B. Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das in dem erfindungsgemäßen Vektor enthaltene Nucleinsäuremolekül eine Region, die eine funktionale Signalsequenz zur Sekretion des codierten Enzyms enthält. Derartige Sequenzen sind bekannt.
Ein Signalpeptid, das die Lokalisation des Proteins zum Beispeil in der Vakuole gewährleistet, ist das Signalpeptid der Carboxypeptidase Y aus Hefe (CPY). Das entsprechende Gen ist beispielsweise in Valls et al. (Cell 48, 887-899) beschrieben. Pflanzliche Signalsequenzen sind z.B. die der Lektingene aus Gerste (Raikhel und Lerner, Dev. Genet. 12 (1991), 255-269) oder die 43 Aminosäuren aus dem N-terminalen Bereich des reifen Phytohämagglutinins der Bohne (Tague et al., Plant Cell 2 (1990), 533-546). Ein Beispiel für ein C-terminales Signalpeptid ist das der Chitinase (Neuhaus et al., Plant J. 5 (1994), 45-54).
Eine bevorzugte Signalsequenz ist beispielsweise die Signalsequenz des Proteinase-Inhibitor II Gens aus Kartoffel. Es kann aber auch jede andere Signalsequenz, die zur Sekretion eines Polypeptids in dem gewählten Wirt führt, verwendet werden. Die sektretierte FNS I (und/oder der funktionellen Fragmente oder Derivate) kann aus dem Kulturmedium gewonnen und für in vitro Synthesen eingesetzt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das in dem Vektor enthaltene Nucleinsäuremolekül eine Region, die eine Signalsequenz zur vakuolären Lokalisation in pflanzlichen Zellen codiert, bevorzugt die aus dem Patatingen der Kartoffel (Sonnewald, Plant J. 1 (1998), 95-106). Dies erlaubt die subzelluläre Lokalisation der FNS I in den Vakuolen von gentechnisch veränderten Pflanzenzellen und Pflanzen, beispielsweise Zuckerrübe oder Kartoffel, und die Akkumulation von hochmolekularen Flavonen in den Vakuolen. Weitere vakuoläre Signalsequenzen sind beispielsweise beschrieben bei Matsuoka (Journal of Experimental Botany 50 (1999), 165-174), Chrispeels (Cell 68 (1992), 613-616), Matsuoka (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991), 834-838), Bednarek (Plant Cell 3 (1991), 1195-1206), Nakamura (Plant Phys. 101 (1993) 1-5).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält das in dem Vektor enthaltene Nucleinsäuremolekül eine Region, die eine Signalsequenz zur plastidären Lokalisation in pflanzlichen Zellen codiert.
Als Signalsequenz kann beispielsweise die Signalsequenz der Ferrodoxin: NADP(+)- oxidoreduetase (FNR) aus Spinat verwendet werden. Die Sequenz enthält den 5'- nichttranslatierten Bereich sowie die flankierende Transitpeptidsequenz der cDNA des plastidären Proteins Ferrodoxin:NADP(+)-oxidoreductase aus Spinat (Nucleotid -171 bis +165; Jansen, Current Genetics 13 (1988), 517-522).
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäure/DNA Moleküle enthalten, mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind, oder von einer Zelle abstammen, die mit einem solchen Vektor transfomiert ist. Die Wirtszellen können prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, insbesondere Pilzzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen. Bevorzugte Pilzzellen sind Hefezellen, wie auch in den Beispielen beschrieben.
Insbesondere betrifft daher die Erfindung Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren transient oder stabil enthalten oder von einer solchen Zelle abstammen. Unter einer Wirtszelle wird ein Organismus verstanden, der in der Lage ist, in vitro rekombinierte DNA aufzunehmen und gegebenenfalls die von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codierten Proteine zu synthetisieren. Die Wirtszellen können entweder prokaryontischen oder eukaryontischen Ursprungs sein. Der Begriff "prokaryontisch" schließt dabei alle Bakterien ein, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül transformiert oder transfiziert werden können und vorteilhafterweise die Expression eines Proteins mit FNS I- Aktivität erlauben. Prokaryontische Wirtszellen schließen beispielsweise gram-negative wie auch gram-positive Bakterien ein, wie z.B. E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis. Der Begriff "eukaryontisch" schließt Insektenzellen, pilzliche Zellen, Pflanzenzellen, und auch tierische Zellen ein. Bevorzugte pilzliche Zellen sind beispielsweise solche, die für die Fermentation benutzt werden oder benutzt werden können, insbesondere Saccharomyces, dabei besonders bevorzugt S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia etc. Bevorzugt ist eine solche pilzliche Wirtszelle eine Zelle aus der Gattung Aspergillus und besonders bevorzugt aus der Spezies Aspergillus niger. Interessant ist insbesondere die Expression der erfindungsgemäßen FNS I in diesen Zellen in Kombination mit einer sekretorischen Signalsequenz, z.B. der aus dem Patatingen oder des 1-SST-Gens aus Aspergillus foetidus (Rehm et al., J. Bac. 180 (1998), 1305-1319). Dadurch wird die FNS I und/oder deren funktionellen Fragmente oder Derivate in das Medium sekretiert. Ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit FNS I- Aktivität codiert, oder ein entsprechender Vektor kann durch dem Fachmann geläufige Techniken in die Wirtszelle transfiziert oder transformiert werden. Verfahren zur Herstellung von fusionierten, operativ verknüpften Genen und deren Expression in geeigneten Wirtszellen sind dem Fachmann wohlbekannt und beschrieben beispielsweise in Sambrook oder Ausubel, siehe oben. Bevorzugte Wirte sind auch E. coli und spezifische Pflanzen oder Pflanzenzellen, wie in den Beispieln illustriert. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Zellen dadurch gekennzeichnet, daß das eingeführte erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül entweder heterolog in Bezug auf die transformierte Zelle ist, d.h. natürlicherweise nicht in diesen Zellen vorkommt, oder an einem
anderen Ort im Genom lokalisiert ist als die entsprechende natürlicherweise auftretende Sequenz.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, kann das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül mit DNA- Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kompartiment gewährleisten; siehe oben. Derartige Sequenzen sind bekannt (siehe beispielsweise Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29).
Jedoch kann auch erfindungsgemäß gewünscht sein, zum Beispiel in den hier beschriebenen Wirtszellen, Pflanzenzellen, .Pflanzen, insbesondere auch den trasngenen Pflanzen, die Expression der FNS I zu reduzieren oder zu inhibieren. Dies kann aufgrund der hier bereitgestellten Nukelinsäuresequenzen zum Beispeil auf der Ebene der Expresion von FSN I geschehen. Zum Beiepiel kann die FNS I-Expression durch „anti-sense" Moleküle oder die Co- Expression von „sense"-Molekülen reduziert oder inhibiert werden. Weitere, dem Fachmann bekannte Verfahren und Techniken umfassn hierbei, inter alia, RNAi-Ansätze, der Einsatz von Ribozymen, die in vivo Mutagenese als auch die Expression von Antikörper-Molekülen oder Aptameren.
Die erfindungsgemäßen Wirte umfassen somit auch transgene Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzen, die mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül(en) transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von derartig transformierten Zellen abstammen oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert wurden. Derartige Zellen enthalten ein oder mehrere erfindungsgemäße(s) Nukleinsäuremolekül(e), wobei diese(s) vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft ist/sind, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor. Derartige Zellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt, oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt, d.h. in einer anderen genomischen Umgebung.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Protein im Cytosol enthalten. Hierzu ist, inter alia, die als SEQ ID No. 2 angegebene Proteinsequenz ohne weitere Signalsequenzen zu verwenden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Protein in den Piastiden oder Vakuolen enthalten. Zur Erzielung einer plastidären oder vakuolären Lokalisation des erfindungsgemäßen Proteins kann man die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und/oder die erfindungsgemäßen Vektoren in der oben beschriebenen Weise modifizieren.
Da die Vakuole in der Regel große Mengen an biochemischen und/oder chemischen Vorstufen der Flavonsyntheseprodukte speichern kann, die dem erfindungsgemäßen Protein als Substrat dienen, ist dieses Kompartiment gut geeignet, um Pflanzenzellen zu erzeugen, die aufgrund der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins Flavone in den Vakuolen produzieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher Pflanzenzellen, die das erfindungsgemäße Protein in der Vakuole enthalten. Weiter oben wurde bereits erläutert, wie die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und/oder Vektoren konstruiert sein müssen, um eine vakuoläre Lokalisation des erfindungsgemäßen Proteins zu vermitteln.
Die transgenen Pflanzenzellen und Pflanzengewebe können nach dem Fachmann bekannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Femer sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen können zu jeder beliebigen Pflanzenspezies gehören, vorzugsweise zu monokotyledonen oder dikotyledonen Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Pflanzenzellen aus landwirtschaftlichen Nutzpflanzen, d.h. aus Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für Zwecke der Ernährung oder für technische, insbesondere industrielle Zwecke. Vorzugweise betrifft die Erfindung faserbildende (z.B. Flachs, Hanf, Baumwolle), ölspeichemde (z.B. Raps, Sonnenblume, Sojabohne), zuckerspeichernde (z.B. Zuckerrübe, Zuckerrohr, Zuckerhirse, Banane) und proteinspeichernde Pflanzen (z.B. Leguminosen). Besonders bevorzugt sind sind in diesem Zusammenhang Pflanzen, die besonders zur Flavonsynthese geeignet sind, wie Grässer oder Pflanzen der Familie der Fabaceae, wie zum Beispiel Klee. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Futterpflanzen (z.B. Futter- und Weidegräser, Alfalfa, Klee etc.), Gemüsepflanzen (z.B. Melone, Tomate, Banane,
Chicoree, Lauch, Spargel, Mohrrübe) oder Pflanzen wie, z.B. Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Kartoffel, Mais, Reis, Erbse, Maniok, Mungbohne). In diesem Zusammenhang sei auch auf die unten beschriebenen erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen verwiesen. Die Erfindung umfaßt ebenfalls Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte der erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge, Calli, Zellkulturen etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, wobei
(a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls und/oder eines erfindungsgemäßen Vektors; und
(b) aus der Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und gegebenenfalls
(c) aus der Pflanze nach (b) weitere Pflanzen erzeugt werden.
Der Begriff "genetisch modifiziert" bedeutet dabei im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, daß die pflanzliche Zelle durch Einführung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls in ihrer genetischen Information verändert ist, und daß das Vorhandensein oder die Expression des erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls zu einer phänotypischen Veränderung führt. Phänotypische Veränderung bedeutet dabei vorzugsweise eine meßbare Veränderung einer oder mehrerer Funktionen der Zellen. Beispielsweise zeigen genetisch modifizierte erfindungsgemäße Pflanzen eine Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins oder eine erhöhte FNS I-Gesamtaktivität.
Die Regeneration von Pflanzen gemäß Schritt (b) kann nach dem Fachman bekannten Methoden erfolgen. Die Erzeugung weiterer Pflanzen gemäß Schritt (c) der erfindungsgemäßen Verfahren kann z.B. erfolgen durch vegetative Vermehrung (beispielsweise über Stecklinge, Knollen oder über Calluskultur und Regeneration ganzer Pflanzen) oder durch generative Vermehrung. Die generative Vermehrung findet dabei vorzugsweise kontrolliert statt, d.h. es werden ausgewählte Pflanzen mit bestimmten Eigenschaften miteinander gekreuzt und vermehrt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial erfindungsgemäßer Pflanzen sowie der gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten transgenen Pflanzen. Der Begriff Vermehrungsmaterial umfaßt dabei jene Bestandteile der Pflanze, die geeignet sind zur
Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder generativem Weg. Für die vegetative
Vermehrung eignen sich beispielsweise Früchte, Samen, Sämlinge, Protoplasten, Zellkulturen etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmateriai um Knollen und Samen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung erntebare Pflanzenteile erfindungsgemäßer Pflanzen, wie Früchte, Blätter, Speicherwurzeln, Wurzeln, Blüten, Knospen, Sprosse oder Stämme, vorzugsweise Samen oder Knollen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Futtermittel und/oder Nahrungsmittel, die die erfindungsgemäßen erntebaren Pflanzenteile, bevorzugt Samen oder Knollen, enthalten.
Vorzugsweise wirken die erfindungsgemäßen Pflanzenteile nach Verzehr im Vergleich zu entsprechenden Pflanzenteilen von Pflanzen, die nicht in der erfindungsgemäßen Weise genetisch modifiziert worden sind, vorteilhaft auf die Gesundheit des Menschen und/oder des Tieres. Entsprechendes gilt für die erfindungsgemäßen Futtermittel und/oder Nahrungsmittel. Bei Menschen beispielsweise kann der Verzehr der erfindungsgemäßen Nahrungsmittel zu einer Stärkung des Immunsystems oder zur Prophylaxe von proliferativen Erkrankungen, wie Krebserkrankungen führen. Bei diesen positiven Effekten handelt es sich vorzugsweise um prophylaktische oder die Heilung unterstützende Effekte.
Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Wirtszellen, wobei geeignete Wirtszellen mit einem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül oder Vektor transformiert werden. Verfahren für die Transformation der verschiedenen in Betracht kommenden Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer FNS I, bei dem ein erfindungsgemäßer Wirt unter Bedingungen kultiviert wird, die die Expression des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls erlauben und anschließend die FNS I und/oder deren funktioneile Derivate oder Fragmente aus der Kultur, d.h. den Zellen und/oder dem möglicherweise vorhandenen Kulturmedium, isoliert wird. In dem vorgenannten Verfahren werden die transformierten oder transfizierten Wirtszellen beispielsweise in Fermentern kultiviert, bis eine optimale Zelldichte erreicht ist. Gegebenenfalls kann bei induzierbaren Promotoren erst am Schluß der Fermentation die Expression des Proteins, das durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül codiert wird, induziert werden. Das so exprimierte Protein kann dann anhand von bekannten Techniken aus dem Medium, Zelllysaten, oder zellulären Membranfraktionen nach bekannten Techniken gereinigt werden. Die Isolierung
und Reinigung der beispielsweise mikrobiell exprimierten Proteine kann durch präparative chromatographische oder auch immunologische Trenntechniken erreicht werden, beispielsweise unter Zuhilfenahme von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern, die das von dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codierte Protein erkennen. In diesem Zusammenhang mag erwähnt werden, daß das von dem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül codierte Protein mit FNS I-Aktivität auch weitere funktionelle Aminosäuresequenzen enthalten kann, beispielsweise Protein-tags (GST, GFP, Flag, HA- Peptid, His-tag), die von heterologen Proteinen stammen können oder synthetisch erzeugt wurden.
Die Erfindung betrifft ferner Proteine/Polypeptide, die FNS I-Aktivität besitzen, d.h. auch Derivate und Fragmente, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden oder durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind. Die erfindungsgemäßen FNS I können vorzugsweise zur Herstellung von Flavonen, wie hierin beschrieben, verwendet werden. Vorzugsweise liegen die erfindungsgemäßen Polypeptide in einer Reinheit von mindestesn 70%, vorzugsweise von mindestens 80%, mehr bevorzugt von mindestens 90% und am meisten bevorzugt von 100% vor. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch zur Herstellung von Antikörpern dienen, die wiederum zum Nachweis und/oder zur Reinigung von FNS I genutzt werden können. Erfindungsgemäße Polypeptide und Antikörper sind hier beschrieben.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Herstellung einer FNS I (und/oder deren funktionellen Fragmente oder Derivate), bei dem eine Wirtszelle und/oder eine Pflanzenzelle wie hier beschrieben unter Bedingungen kultiviert wird, die die Synthese von FNS I (oder deren Fragmente oder Derivate) erlauben und wobei die FNS I aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert wird.
Die Erfindung betrifft daher weiterhin ein Polypeptid, das durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kodiert wird und/oder nach dem oben beschriebenen Verfahren erhalten werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz oder einen Teil hiervon oder Derivate davon. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Polypeptid abgeleitet aus einer flavonhaltigen Pflanze, wie z.B. aus der Familie der Apiaceae (Daucus carota u.a.). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt das erfindungsgemäße Polypeptid Flavonsynthase I-Aktivität.
Derivate und Fragmente im Sinne dieser Erfindung wurden bereits oben beschrieben und umfassen, inter alia, Aminosäure-Insertionsderivate, Deletionsderivate, Additionsderivate und/oder Substitutionsaminosäure-Varianten der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2, als auch funktioneile Teile der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, die lang genug sind, spezifische FNS I-Aktivität zu zeigen. Die Begriffe "Analogon" und "Derivat" erstrecken sich auch auf alle funktionellen chemischen Äquivalente der FNS I und auch auf alle Aminosäurederivate, die hier bereits beschrieben wurden.
Aminosäure-Insertionsderivate der erfindungsgemäßen FNS I umfassen sowohl Amino- und Carboxylenverschmelzungen als auch Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren innerhalb der Sequenz. Insertionsaminosäure-Sequenzvarianten sind solche, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste an einer vorbestimmten Stelle in das Protein eingefügt worden sind, obgleich eine zufällige Insertion mit einem geeigneten Screening des Produkts auch möglich ist. Deletionsvarianten sind charakterisiert durch das Entfernen von einer oder mehreren Aminosäuren aus der Sequenz. Substitutionsaminosäure-Varianten sind solche, bei denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an dieser Stelle eingefügt worden ist. Typische Substitutionen sind in Tabelle 1 dargestellt.
TABELLE 1
Geeignete Reste für eine Aminosäure Substitution
Original Aminosäure Exemplarische Substitution durch
Ala Ser Arg Lys Asn Gin; His Asp Glu Cys Ser Gin Asn Glu Asp Gly Pro His Asn; Gin Ile Leu; Val Leu Ile; Val Lys Arg; Gin; Glu Met Leu; Ile Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe
Nal Ile; Leu
Im allgemeinen werden Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften ersetzt, wie Hydrophobizität, Hydrophilizität, Elektronegativität, sehr umfangreiche Seitenketten und ähnliches. Substitutionen von Aminosäuren betreffen in der Regel nur einen Rest, wohingegen Insertionen normalerweise einen Bereich von 1 bis 10 Aminosäureresten und Deletionen einen Bereich von 1 bis 20 Resten betreffen. Deletionen und Insertionen werden bevorzugt an nebeneinanderliegenden Paaren durchgeführt, z.B. eine Deletion von zwei Resten oder eine Insertion von zwei Resten.
Die oben beschriebenen Aminosäure-Varianten erfindungsgemäßer Derivate können leicht mit Hilfe von bekannten Peptidsynthesetechniken wie z.B. durch Solid Phase Synthesis und ähnliche Verfahren oder durch rekombinante DΝA-Manipulationen hergestellt werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA durchzuführen, die eine bekannte oder teilweise bekannte Sequenz besitzt, sind gut bekannt und schließen z.B. M13-Mutagenese ein. Die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Herstellung von Proteinen mit Substitutionen, Insertionen oder Deletionen ist z.B. in Sambrook et.al. (1989) ausführlich beschrieben.
Andere Beispiele von rekombinanten oder synthetischen Mutanten und Derivaten der erfindungsgemäßen FNS I schließen einzelne oder multiple Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen jeglicher Moleküle, die mit dem Enzym assozlert sind, wie Kohlenhydrate, Lipide und/oder Proteine oder Polypeptide, ein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Formen der FNS I. Die rekombinanten Formen des Enzyms bieten eine Möglichkeit, um z.B. aktivere Enzyme oder Systeme zur in ϊro-Produktion verschiedener Flavone zur Verwendung in verschiedenen Bereichen, wie z.B. der Humanmedizin und Kosmetik, zu entwickeln. Letzteres System kann unter anderem in der Krebsforschung zur Anwendung kommen.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Antikörper, die spezifisch das erfindungsgemäße Polypeptid und/oder dessen Fragmente oder Derivate erkennt. Vorzugweise erkennen die erfindugsgemäßen Antikörper spezifisch die hier beschriebenen FNS I Moleküle, d.h., sie zeigen keine nennenswerte Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen. Der Begriff „Antikörper"
umfasst sowohl monoclonale als auch polyclonale Antikörper, ebenso wie Fragmente oder Derivate von Antikörpern, wie Fab-Fragmente, scFVs, chimäre Antikörper und ähnliche.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung transgene Pflanzen, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz. Generelle Verfahren zur Herstellung von transgenen
Pflanzen sind hierin und in den Beispielen beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz zur Expression geeignet und ist gegebenenfalls regulierbar oder wird in der Pflanze entwicklungsabhängig reguliert. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ist die transgene Pflanze ausgewählt aus der Gruppe von flavonhaltigen Pflanzen, wie z.B. aus Petersilie (Petroselinum erispum) und Karotte (Daucus carota), trägt eine endogene FNS I oder in einer weiteren Ausführungsform aus z.B. Gerbera (Gerbera
Hybriden), Aster (Callistephus chinensis), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Chrysantheme
(Chrysanthemum indicum), Dahlie (Dahlia Hybriden), Gloxinie (Sinningia Hybriden), Verbene
(Verbena Hybriden) und Streptocarpus (S. Hybriden), trägt eine endogene FNS II und enthält weiterhin eine erfindungsgemäße, nicht-endogene FNS I-Nukleinsäuresequenz.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz, die für eine FNS I oder ein Fragment oder Derivat dieser kodiert, in eine Pflanze in einer von beiden möglichen Orientierungen eingeführt und dort exprimiert werden und dadurch die Möglichkeit bieten, entweder Naringenin (NAR) und/oder andere geeignete Substrate, wenn sie in der Pflanzenzelle synthetisiert werden, umzuwandeln, was letztendlich zur Bildung von verschiedenen Flavonen führt. Darüber hinaus kann die Bildung dieser Metaboliten durch Reduktion oder Eliminierung endogener oder vorhandener FNS I-Aktivität verhindert werden. Die Synthese von unterschiedlichen Mengen an Flavonen führt zu einer Veränderung der Blütenfarbe, z.B. bei Gerbera. Am Beispiel der für den Locus Fns heterozygoten, flavonhaltigen, orangen Sorte "Th 58" (fns+ fns) konnte in Selbstungsnachkommenschaften eine Farbvariation von dunkelrot (flavonfrei; Genotyp: fns fns) über verschiedene orangerot Töne (flavonhaltig; Genotyp: fns* fns) bis zu einem gelborange (stark flavonhaltig; Genotyp: fns* fns+) gezeigt werden. Dieses Experiment läßt sich beliebig auf andere für den Locus Fns heterozygote Gerbera Sorten übertragen (Martens, 2000). Die Expression einer weiteren Flavonsynthase in Sense-Orientierung führt, z.B. in Gerbera zu einer weiteren Reduktion der Anthocyane bzw. zu einer Erhöhung des Flavongehaltes. Beides hat einen bedeutenden Einfluss auf die Blütenfarbe (Aufhellung, Kopigmentierung). Eine weitaus wichtigere Anwendung ist die Expression der FNS I alleine oder zusammen mit einer endogenen FNS II. Dies führt zu einer deutlichen Erhöhung des Flavongehaltes und damit zu einer erhöhten Funktionalität bezüglich bioaktiver Inhaltsstoffe in Nahrungspflanzen. Die Fähigkeit und
Effektivität der Kommunikation zwischen Pflanzen und verschiedenen anderen Organismen (Pilze, Bakterien, Insekten u.a.) im Zusammenhang mit Stickstofffixierung bzw. Pathogenabwehr werden verbessert bzw. können induziert und reguliert werden. Auch bezüglich der Bio-Produktion von speziellen Flavonen in unterschiedlichen pflanzlichen Geweben für eine anschliessende Extraktion und Isolierung der Substanzen bietet dieser Ansatz wesentliche neue Möglichkeiten und Vorteile. Die Expression der Nukleinsäuresequenz in einer von beiden möglichen Orientierungen in der Pflanze kann konstitutiv, induzierbar oder entwicklungsbezogen und auch gewebespezifisch sein. Das Wort "Expression" ist dabei in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet, um die Produktion von RNA oder von beidem, RNA und Protein, einzuschließen. Es ist auch auf eine teilweise Expression von Nukleinsäuremolekülen ausgedehnt.
Die Erfindung betrifft, wie oben bereits beschrieben, ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die fähig sind, FNS I oder aktive Mutanten oder Derivate zu synthetisieren. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für die besagte FNS I kodiert, unter Bedingungen, die die mögliche Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls herbeiführt, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Wachstum dieser transgenen Pflanze für eine bestimmte Zeit und unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Expression der Nukleinsäure herbeizuführen. Die transgene Pflanze kann höhere Werte einer FNS I-Aktivität im Vergleich zu dem Wert, der in vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen gemessen wird, zeigen oder die Werte können niedriger sein im Vergleich zu denen von vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanzen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit reduzierter, endogener oder vorhandener FNS I-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die eine Sequenz oder eine komplementäre Sequenz der FNS I kodiert, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und, falls nötig, das Heranziehen dieser transgenen Pflanze unter geeigneten Bedingungen, um die Expression von Nukleinsäuren zu erreichen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze mit reduzierter endogener oder vorhandener FNS I-Aktivität. Dieses Verfahren umfaßt die Veränderung des FNS I-Gens durch eine Modifikation der endogenen
Sequenz über homologe Rekombination, ausgehend von einem entsprechend veränderten
Gen einer FNS I oder eines Derivats oder eines Teils davon. Das Gen wird in die Pflanzenzelle eingeführt und eine genetisch modifizierte Pflanze wird aus der Zelle regeneriert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen, vorzugweise blühenden Pflanze. Bevorzugt zeigt die transgene Pflanze veränderten Blüteneigenschaften. Dieses Verfahren umfaßt das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz in eine Zelle einer geeigneten flavonfreien Pflanze, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen einer transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter Bedingungen, um die Expression der erfindungsgemäßen, eingebrachten Nukleinsäuresequenz zu erreichen. Die transgene Pflanze kann zum Beispiel ausgewählt sein aus der Gruppe von flavonfreien Pflanzen bestehend aus Euphorbia (E. pulcherrima), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybride), Pelargonium (P. spec), Begonia (B. spec), Nelke (Dianthus caryophyllus) und Tulpe (Tulipa Hybriden). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Pflanze zur Expression einer endogenen Flavonsynthase I fähig. Eine derartige transgene Pflanze kann z.B. ausgewählt sein aus der Familie der Apiaceae mit Petersilie (Petroselinum erispum), (Daucus carote) u.a. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird diese endogene Flavonsynthase I bei Expression der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure koexprimiert.
In einer Ausführungsform wird die endogen vorhandene Flavonsynthase I-Aktivität durch Einbringen der Nukleinsäuresequenz reduziert. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder einer dazu komplementären Sequenz, die Regeneration einer transgenen Pflanze aus der Zelle und das Heranziehen dieser transgenen Pflanze zu einer Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um die Höhe der Aktivität der endogenen oder vorhandenen FNS I zu verändern. Bevorzugterweise ist der veränderte Wert geringer als das endogene oder vorhandene Level der FNS I-Aktivität in einer vergleichbaren, nicht-transgenen Pflanze. Gegebenenfalls ist für die Reduktion der endogenen FNS I-Aktivität die Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz oder deren komplementären Sequenz erforderlich. Weitere Methoden zur Reduktion der FNS I- Aktivität umfassen die oben bereits beschriebenen Verwendungen von Ribozymen, anrti-sense Molekülen, Antikörpern und Aptameren, co- Expression von „sense"-Molekülen, in vivo Mutagenese, etc. Somit kann eine Expression der eingeführten genetischen Sequenz oder ihres komplementären Analogon nötig sein, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Dies meint im wesentlichen eine flavonhaltige Pflanze mit veränderten Gehalt und Muster an bioaktiven Flavonoiden besonders der Flavone.
In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer flavonhaltigen Pflanze, die unterschiedliche Gehalte und Muster an bioaktiven Flavonoiden besonders an Flavonen zeigt. Dieses Verfahren umfaßt Veränderungen des FNS I-Gens durch Modifikation der endogenen Sequenzen über homologe Rekombination eines entsprechend veränderten Gens einer FNS I oder eines Derivats oder eines Teils davon, die Einführung in die Pflanzenzelle und die Regeneration der genetisch veränderten Pflanze aus der Zelle.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann darüber hinaus entwicklungsabhängig reguliert werden. In der Regel schließt eine veränderte Infloreszenz die Produktion von schwächer gefärbten Blüten oder auch anderen Farbtönen ein, abhängig von den physiologischen Bedingungen der Empfängerpflanze. Mit "Empfängerpflanze" ist eine Pflanze gemeint, die eine meßbare Menge Substrat für das FNS I-Enzym oder auch die FNS II produziert und die entsprechenden physiologischen Eigenschaften und Genotyp besitzt, die notwendig für die Entwicklung der gewünschten Farben sind. Dies schließt folgende Pflanzen ein, ist aber nicht auf diese begrenzt : Gloxinie (Sinningia Hybriden), Löwenmäulchen (Antirrhinum majus), Columnea (Columnea Hybriden), Dahlie (Dahlia variabilis), Gloxinie (Sinningia cardinelis), Streptocarpus (Streptocarpus Hybridus), Verbene (Verbena Hybrida), Chrysantheme (Chrysanthemum indicum), Einblatt (Spethiphyllum wallisl), Petunie (Petunia Hybrida), Cyclamen (Cyclamen persicum), Rose (Rosa Hybriden) und Pelargonie (P. spec).
Entsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die meßbar ein rekombinantes Gen exprimiert, das die FNS I oder einen Teil davon kodiert oder welche eine Nukleinsäuresequenz trägt, die im wesentlichen komplementär zum gesamten oder zu einem Teil des mRNA-Moleküls ist, das, falls nötig, ohne weiteres transkribierbar ist, um die Regulation der FNS I zu bewirken. Dieses Verfahren umfaßt die stabile Transformation einer Zelle einer geeigneten Pflanze mit der isolierten Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidequenz, die für eine FNS I oder ein Derivat oder einen Teil davon kodiert, oder eine zu der kodierenden Nukleotidsequenz komplementäre Sequenz, falls erforderlich unter Bedingungen, die eine Expression der besagten isolierten Nukleinsäure erlauben, und durch Regeneration einer transgenen Pflanze aus einer Zelle.
Der Fachmann bemerkt sofort die Möglichkeiten der Anwendung bei der vorliegenden Erfindung, wie z.B. eine Erhöhung oder Reduzierung der Expression der Enzyme, die natürlicherweise in einer Zielpflanze vorhanden sind. Dies führt zu verschiedenen neuen
Blütenfarbtönen, wie zum Beispiel verschiedenen Orange- oder Dunkelrot-Tönen, aber auch zu einer Veränderung der Gehaltes und des Musters an bioaktiven Flavonoiden besonders der Flavone.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf alle transgenen Pflanzen, die die gesamte oder einen Teil der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz enthalten und/oder eine homologe oder verwandte Form dieser oder eine Antisense-Form von irgendeiner der beschriebenen aufweisen, und im einzelnen diejenigen transgenen Pflanzen, die unterschiedliche Blüteneigenschaften zeigen. Die transgenen Pflanzen können eingeführte Nukleinsäuremoleküle enthalten, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die eine FNS I oder eine komplementäre Sequenz kodiert. Im allgemeinen wird die Nukleinsäure stabil in das Pflanzengenom eingeführt, obwohl die vorliegende Erfindung auch die Einführung einer FNS I Nukleotidsequenz innerhalb einer autonom-replizierenden Nukleinsäuresequenz wie z.B. DNA- oder RNA-Viren, die fähig sind, in einer Pflanzenzelle zu replizieren, einschließt. Die Erfindung schließt darüber hinaus auch Samen der transgenen Pflanze ein, besonders, wenn sie flavonhaltig sind.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen FNS I-Gens kann die Flavonoidbiosynthese bzw. die Bildung von Flavonen in Pflanzen auf verschiedene Art und Weise gezielt verändert werden.
Im pflanzlichen Bereich müssen vorab zwei unterschiedliche Ausgangspunkte berücksichtigt werden. Zum einen stehen Pflanzen zur Verfügung, die natürlicherweise Flavone oder deren Glykoside bilden, wie z.B. Antirrhinum und Verbena in Blüten, Clerodendron, Citrus, Petroselinum und Daucus in Blättern, Althaea und Sophora (Leguminosae) in Wurzeln und Prunus und Pinus spec. im Hartholz (Wollenweber, 1994; Williams und Harborne, 1994). Neben dieser sehr großen Gruppe gibt es aber auch einige Pflanzen, die in bestimmten Geweben keine Flavone synthetisieren. Dies ist z.B. bei einigen Blüten von wichtigen Zierpflanzen wie Pelargonium, Cyclemen und Petunie und in Apfelblättern und vielen anderen wichtigen Nutzpflanzen der Fall.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine veränderte FNS I-Aktivität in Pflanzen und anderen Organismen, die sowohl durch eine Erhöhung als auch durch eine Reduzierung der natürlich vorkommenden FNS I-Aktivität mittels der Einführung der Sequenz aus der vorliegenden Erfindung erreicht werden kann. Eine Reduzierung der Höhe der FNS I-Aktivität kann auch als eine Down-Regulierung beschrieben werden.
In flavonhaltigen Pflanzen kann die Synthese von Flavonen mit Hilfe von geeigneten Methoden gezielt hoch- oder down-reguliert werden oder ganz ausgeschaltet werden. Dies hat für die Pflanze verschiedene Folgen. Grundsätzlich hat eine solche Veränderung am Biosyntheseweg Auswirkungen auf die gesamte Flavonoidbiosynthese, da eine ständige Konkurrenz mehrerer Enzyme (FNS I oder FNS II, FHT, F3Η, F3',5'H) um das Substrat (Flavanone, z.B. Naringenin) herrscht. Das bedeutet im einzelnen, daß z.B. eine Hochregulierung der FNS I die Synthese von Flavonoiden im späteren Biosyntheseweg (Abb. 1A) reduziert und dadurch z.B. blassere Blütenfarben erreicht werden können. Außerdem kann durch diese gezielte Erhöhung des Flavongehalts, die nur bestimmte Gewebe betreffen kann, die Resistenzeigenschaft und die Symbiosefähigkeit der Pflanze deutlich verbessert oder auch der entsprechende Gehalt bzw. das Muster an bioaktiven Flavonen beeinflusst werden. Demgegenüber führt eine Down Regulierung zu einer Steigerung der Synthese von anderen, eventuell für die Pflanze nützlicheren Flavonoiden. Dies kann sowohl die für den UV-Schutz wichtigen Flavonole als auch die farbgebenden Anthocyane oder resistenzinduzierenden Proanthocyanidine und Phytoalexine betreffen. Eine vollständige Unterdrückung der Flavonbildung führt zu einer Verstärkung der Wirkungen einer Down-Regulierung und kann mögliche Stimulanzien für Insekten entfernen und somit zur Resistenzbildung beitragen.
Eine völlige Neu-Synthese von Flavonen kann durch das gezielte Einführen der FNS I in Pflanzen ohne natürliche Aktivität erreicht werden. Abhängig von den vorhandenen Substraten kann so der Flavongehalt und das Flavonmuster reguliert werden. Durch Etablierung dieses Schrittes können Blütenfarben, Resistenzeigenschaften und die Fähigkeit zur Symbiose mit Stickstoff-fixierenden Bakterien gezielt verändert werden. Darüber hinaus kann durch die Öffnung eines neuen Biosyntheseweges die Bildung von für die Pflanze weniger nützlichen Flavonoiden (z.B. Fraßstimulanzien) reduziert werden oder auch die Synthese von Biflavonen, die aus Flavonen hervorgehen, etabliert werden.
Mit Hilfe dieser Ansätze können wichtige flavonhaltige oder flavonfreie Nutzpflanzen in ihrem Flavonoidmuster und -gehalt, einschließlich der Flavone, so verändert werden, daß ihre positiven Eigenschaften in Bezug auf die Biologie von Mensch und Tier optimiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur gezielten Veränderung des Flavongehalts bzw. -musters in verschiedenen Pflanzengeweben (Blüten, Wurzeln, Blätter u.a.) und anderen Organismen und damit allgemein die Veränderung der Flavonoidzusammensetzung, speziell die Veränderung von Blütenfarben durch Kopigmentierung, von Resistenzeigenschaften und der Fähigkeit der Nodulation bei
Leguminosen und des Gehaltes bzw. Musters an bioaktiven Flavonoiden besonders der Flavone.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung von Flavonen, wobei erfindungsgemäße Wirtszellen, oder diese enthaltende Wirtsorganismen, unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression der erfindungsgemäßen FNS I sowie die Synthese von Flavonen erlauben. Gegebenfalls werden von außen Flavanone oder äquivalente Substrate für die hier beschriebenen, erfindungsgemäße FNS I zugeführt.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle ist es möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden Flavone in Organismen herzustellen, wie es bisher durch konventionelle Verfahren nicht möglich war. Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Wirten wie Bakterien, Pilzen oder pflanzlichen Zellen, um die Aktivität der entsprechenden FNS I zu erhöhen, oder die Einführung in Zellen, die dieses Enzym normalerweise nicht exprimieren. Die erfindungsgemäßen Wirtszellen synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Expression mindestens eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls Flavone. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch die aus den erfindungsgemäßen Wirtszellen sowie dem Vermehrungsmaterial und bei Pflanzen aus den Pflanzen oder aus deren Ernteprodukten erhältlichen Flavone. Somit betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere Verfahren zur Herstellung von Flavonen, umfassend:
(a) Kultivierung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, oder eines eine derartige Zelle enthaltenden Wirts, unter Bedingungen, die die Produktion von FNS I (und/oder deren funktionellen Fragmenten oder Derivaten) und Umsetzung von gegebenenfalls von außen zugeführter Flavanonen, oder eines äquivalenten Substrats zu Flavonen erlauben; und
(b) Gewinnung der so hergestellten Flavone aus den kultivierten Wirtszellen, Wirten oder aus dem Medium.
Bei den Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um Pflanzen- oder Pilzzellen und bei den Wirten vorzugsweise um Pflanzen oder Pilze.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein in-vitro Verfahren zur Herstellung von Flavonen, umfassend:
(a) Inkontaktbringen von Flavanonen oder eines äquivalenten Substrats mit einer erfindungsgemäßen FNS I unter Bedingungen, die die Umsetzung zu Flavonen erlauben; und
(b) Gewinnung der so hergestellten Flavone.
Ein zu Flavanonen äquivalentes Substrat ist dabei beispielsweise ein Substrat, das von der Wirtszelle oder einem oder mehreren anderen anwesenden Enzym(en) in Flavone umgesetzt wird. Es können aber auch derivatisierte Flavanone verwendet werden. Derivate hiervon sind zum Beispiel methylierte, glykosylierte, acylierte oder synthetische Flavanone.
Bevorzugt eingesetzte Flavanone sind ausgewählt aus der Gruppe von Naringenin, Hesperetin und Eriodictyol, jedoch sind die hier beschriebenen Verfahren und Verwendungen nicht auf die hier genannten Flavanone limitiert. Weitere Flavanone sind dem Fachmann bekannt, inter alia, aus Harborne, Comparative Biochemistry of the Flavonoids, 1967; Markham, Techniques of Flavonoid Identification, 1982 und Harborne, The Flavonoids - Advances in Research since 1986, 1994.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Flavonen, umfassend den Schritt der Extraktion der Flavone aus einer oben beschriebenen erfindungsgemäßen Pflanze(nzelle) und/oder aus Teilen einer solchen Pflanze. Vorzugsweise umfaßt ein solches Verfahren auch den Schritt des Erntens der kultivierten Pflanzen und/oder Teile dieser Pflanzen vor der Extraktion der Flavone und besonders bevorzugt ferner den Schritt der Kultivierung erfindungsgemäßer Pflanzen vor dem Ernten. Verfahren zur Extraktion der Flavone aus Pflanzen oder Teilen von Pflanzen sind dem Fachmann bekannt und wurden beispielsweise beschrieben von Tyrach (1997), Plant Breeding 116, 377-381.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Flavone, die aus einer erfindungsgemäßen Wirtszelle oder nach einem der vorbeschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Diese Flavone können vorzugsweise in der Herstellung von Arzneimitteln, Nahrungsergänzungsmittlen oder als Kosmetika eingesetzt werden
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Wirtszellen, die Flavone, synthetisieren, als
Nahrungsmittelzusatz verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da Flavone positive Auswirkungen auf die Gesundheit haben und insbesondere zur Stärkung des Immunsystems oder zur Prophylaxe von proliferativen Erkrankungen, wie Krebs, dienen können. Jedoch können die
Flavone, die nach den hier dargestellten Verfahren hergestellt werden, auch zur Therapie von Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebserkrankungen genutzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Flavonen, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung der Flavone eine erfindungsgemäße FNS I verwendet wird oder ein Wirtsorganismus, der eine erfindungsgemäße FNS I exprimiert. Daher betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur Synthese von Flavonen. In geeigneten Expressionssystemen können das Enzym selbst und daraus letzendlich natürliche Flavone, ausgehend von geeigneten Substraten, synthetisiert werden. Eine Möglichkeit ist die Verwendung von geeigneten Expressionssystemen zur Gewinnung von gesundheitsfördernden, natürlichen Flavonen. Diese Expressionssysteme können pflanzlicher Art sein oder aus Zeil- bzw. Hefekulturen bestehen. Die Expression der FNS I in Pflanzen oder in Zellkulturen kann zur direkten Gewinnung der entsprechenden Flavone verwendet werden, wobei das Hefe-Expressionssystem zur Gewinnung des intakten Enzyms bevorzugt sein kann. Mit diesem Enzym können dann chemische oder natürliche Vorstufen (Flavanone) zum entsprechenden Flavon umgesetzt werden. Die auf diese Art synthetisierten Flavone können unter anderem bei der Krebstherapie ode in Kosmetika Verwendung finden oder in Form von Medikamenten zur Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.
Folglich betrifft die Erfindung auch Verwendungen eines nach einem der hier bereitgestellten Verfahren hergestellten Flavone zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe von proliferativen Erkrankungen, wie zum Bespiel Krebserkrankungen ,oder zur Stärkung des Immunsystems. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Flavone zur Herstellung von Arzneimitteln oder Medikamenten zum therapeutischen Einsatz als Antioxidantien. Weiterhin können die mit hier offenbarten Verfahren hergestellten Flavone zur Herstellung von anti-allergischen, entzündungshemmenden und anti-viralen pharmazeutischen Formulierungen genutzt werden.
Weiterhin können die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Flavone ebenfalls als Pflanzenschutzmittel, bevorzugterweise als Insektizide, eingesetzt werden. Sie können, inter alia, als Abschreckung von Fraßinsekten dienen oder das Wachstum der Tiere hemmen.
Die vorliegende Erfindung ist ausführlich beschrieben durch die folgenden Abbildungen und Beispiele. Die vorliegende Erfindung ist anhand einer Nukleinsäuresequenz, die aus
Petroselinum erispum „Gigante d'ltalia" abgeleitet wurde, veranschaulicht. Es liegt nun nahe,
daß ähnliche Sequenzen leicht aus verschiedenen anderen Quellen, wie z.B. anderen Pflanzen oder speziellen Mikroorganismen, isoliert werden können. Beispiele für andere Flavon- produzierende Pflanzen schließen unteranderem verschiedene Vertreter aus der Familie der Apiaceae, wie z.B. die Karotte (Deucus cerota) und Sellerie (Apium greveolens) ein, sind aber nicht auf diese begrenzt. Alle diese Nukleinsäuresequenzen, die direkt oder indirekt ein Enzym des Flavonoidbiosyntheseweges und im speziellen die FNS I kodieren, ohne Rücksicht auf deren Quelle, sind von der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
Die Abbildungen zeigen:
ABBILDUNG 1A+B zeigt eine schematische Darstellung des allgemeinen Flavonoid-Biosyn- theseweges und der chemischen Strukturen verschiedener Flavonoide.
Beteiligte Enzyme sind in Abb. 1A wie folgt abgekürzt : CHS = Chalkonsynthase; CHI = Chalkonisomerase; FHT = Flavanon 3-Hydroxylase; DFR = Dihydroflavonol 4-Reduktase; ANS = Anthocyanidinsynthase; FGT = Flavonoid 3-Glukosyltransferase; FNS I bzw. II = Flavonsynthase I bzw. II; FLS = Flavonolsynthase; F3'H = Flavonoid 3'-Hydroxylase; F3',5'H = Flavonoid 3',5'-Hydroxylase. Die Ebene der Flavonbildung ist in Abbildung 1A besonders (++++) gekennzeichnet. In Abbildung 1B ist im oberen Teil die FNS I-Reaktion in Gegenwart von 2-Oxoglutarat mit einigen üblichen Flavanonen gezeigt. Im unteren Teil sind weitere wichtige Flavonoide dargestellt.
ABBILDUNG 2 zeigt die Aktivität bzw. die fehlende Aktivität der FNS I im Enzymextrakt bzw. in Mikrosomen aus Blättern von Petroselinum erispum „Gigante d'ltalia" mit und ohne Zugabe von 2-Oxoglutarat. Die Aktivität der FNS I wurde durch den Umsatz von 14C-markiertem Naringenin zum entsprechenden Flavon Apigenin gemessen.
ABBILDUNG 3 zeigt einen Ausschnitt aus einem Aminosäure Alignment von 14 verschiedenen Dioxygensesequenzen aus dem Flavonoidbiosyntheseweg. Folgende Sequenzen wurden eingeschlossen : Flavanon 3-Hydroxylasen aus Petunie Hybride (Acc.Nr. X60512), Metthiole incane (X72594), Dendrentheme x grandiflorum (U86837), Deucus cerota (AF184270) und Callistephus chinensis (X72593); Flavonolsynthasen aus Petunie Hybride (Z22543), Eustome russellianum (AF240764), Citrus unshiu (AB011796) und Solanum tuberosum (X92178); Anthocyanidinsynthasen aus Petunie Hybride (X70786), Metthiole incena (AF026058), Callistephus chinensis (AF015885) und Daucus carote (AF184274). Im unteren Bereiche sind
zwei hochkonservierte Bereich dargestellt aus denen zwei degeneriete Dioxygenase- spezifische PCR-Primer abgeleitet wurden.
ABBILDUNG 4 zeigt eine schematische Darstellung der verschiedenen generierten Dioxygenase-DNA-Fragmente. Alle Klone enthalten mindestens einen der in Abb. 3 gezeigten hochkonservierten Sequenzbereiche. PPCdioxy3.3 : ein 455 bp langes Fragment konnte über PCR mit Hilfe der Oligo's "Dioxyl H" und "Dioxyl R" mit einem DNA-Template, das aus einer cDNA Synthese mit dem Oligo(dT)-Primer und Gesamt-RNA stammte, generiert werden.
pPCrace3.8 : ein 907 bp langes Fragment wurde ausgehend von cDNA aus Petroselinum erispum über eine PCR-gestützte 3'-RACE-Methode mit den Oligo's "PCrace3A", "PCrace3B, "PCrace3C" und "Oligo(dT)" (GIBCO-BRL) bzw. "PCR-Anker" isoliert.
PPCrace5.6 : ein 289 bp langes Fragment wurde ausgehend von cDNA aus Petroselinum erispum über eine PCR-gestützte 5'-RACE-Methode mit den Oligo's "PCrace5A", "PCraceδB, "PCraceδC" und "AAP" (GIBCO-BRL) bzw. "backrace" isoliert.
pPCFNS-ORF : ein 1246 bp langes Fragment mit einem offenen Leserahmen wurde über PCR mit Hilfe der Oligo's "PCFNS1H" und "PCFNS1R" isoliert. Als Template wurde cDNA von Petroselinum erispum verwendet.
ABBILDUNG 5 und 6 sind Darstellungen der Nukleinsäure bzw. der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz des vollständigen Klons.
ABBILDUNG 7 zeigt einen FNS I-Test mit Hefe-Proteinextrakt. Als Substrat wurde [14C] Naringenin verwendet. Proteinextrakt wurde aus transformierten Hefen (INVSd - pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFsense und pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFantisense) präpariert. Das Autoradiogramm zeigt die Umwandlung von [14C] Naringenin zum entsprechenden Flavon, dem [1 C] Apigenin, mit einem Extrakt der transformierten Hefe mit dem Sense-Konstrukt (INVSc 1 - pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFsense; A). Im Kontroll-Experiment (INVSc 1 - pYES2.1TOPO-PCFNS-ORFantisense; B) wurde keine Aktivität gemessen. Das Produkt wurde in vier verschiedenen Laufmitteln durch Co-Chromatographie mit authentischen Apigenin identifiziert.
BEISPIEL 1
Materialien
Chemikalien, Enzyme und Radiochemikalien
Naringenin, Eriodictyol, Apigenin und Luteolin wurden bei Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. [14C] Naringenin wurde aus [14C] Malonyl-CoA (ARC, St. Louis, USA) und p- Cumaroyl-CoA (Dr. Werner Heller, GSF, Neuherberg, Deutschland) nach der in Britsch et.al. (1981) beschriebenen Methode mit teilweise gereinigter Chalkonsynthase (CHS) und Chal- konisomerase aus Petersilie Suspensionskultur hergestellt. Alle weiteren Enzyme wurden von kommerziellen Anbietern bezogen und nach deren Beschreibung verwendet.
Bakterien- und Hefestämme
Die folgenden Escherichia coli-Stämme wurden verwendet : TOP10F' und TOP10, beide von Invitrogen (Groningen, Niederlande). Außerdem wurde folgender Hefestamm verwendet: INVSd (Invitrogen).
Die Klonierungsvektoren pCR2.1 und pYES2.1-TOPO wurden von Invitrogen bezogen. Die Ligation von Insert mit den Vektoren pCR2.1 und pYES2.1-TOPO bzw. die Transformation der Bakterien erfolgte nach Angaben des Herstellers.
Pflanzenmaterial
Es standen sowohl Freiland- als auch Gewächshauspflanzen der Petroselinum erispum Sorte
„Gigante d'ltalia" (Kiepenkerl, Stuttgart, Deutschland) zur Verfügung.
BEISPIEL 2
Kultivierung der Pflanzen und Entwicklunqsstadien
Pflanzen von Petroselinum erispum wurden unter praxisüblichen Bedingungen in einem Gewächshaus bzw. im Freiland kultiviert.
Petroselinum Blätter wurden zu verschiedenen Entwicklungsstadien, die wie folgt definiert wurden, geerntet :
Stadium 1 Laub noch zusammen gefaltet; etwa bis 1 cm lang
Stadium 2 Laub entfaltet sich; etwa bis 3 cm lang Stadium 3 Laub entfaltet; etwa bis 6 cm
Stadium 4 Laub völlig entfaltet bis 12 cm lang
BEISPIEL 3
Biochemische und enzymologische Charakterisierung des Pflanzenmaterials
Zur Extraktion und Identifizierung von Flavonoiden wurden bekannte Standardmethoden verwendet (Marbry et.al., 1970; Harborne, 1967). Flavone wurden darüber hinaus unter UV- Licht (243 nm) vor und nach Bedampfung mit Ammoniak detektiert. Flavanone wurden durch Reduktion mit Natriumborhydrid und nachfolgender Behandlung mit Salzsäuredämpfen identifiziert (Eigen et.al., 1957).
Dünnschicht Chromatographie wurde auf vorbeschichteten Cellulose Platten G1440 der Firma Schleicher & Schüll (Dassel, Deutschland) und Merck (Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Hierzu wurden folgende Laufmittel verwendet : (1) Chloroform - Essigsäure - Wasser (10 : 9 : 1); (2) 30 % Essigsäure; (3) Essigsäure - Salzsäure - Wasser (30 : 3 : 10) und (4) tert.-Buthanol - Essigsäure - Wasser (3 : 1 : 1).
Der Flavongehalt von Blättern während der Entwicklung wurde durch Extraktion der Pigmente mit Ethylacetat aus Geweben verschiedener Stadien bestimmt. Das Verhältnis Gewebe zu Extraktionsmittel betrug 1 : 40 (g/ml) und die Extraktionsdauer 48 Stunden bei 4°C im Dunkeln. Enzymaufarbeitungen und FNS I Tests wurden, wie in Martens und Forkmann (1998) für die Flavonsynthase II beschrieben, durchgeführt. Die Aufarbeitung erfolgte mit 6.0 ml Tris-HCI Puffer (pH 7.5), der 28 mmol/l 2-Mercaptoethanol und 10 mmol/l Natriumascorbat erhielt, bei 4°C mit 1.0 g Petalen, 0.5 g Dowex (equilibriert mit Tris-HCI Puffer, pH 7.5) und 0.5 g Seesand. Nach dem homogenisieren in einem vorgekühlten Mörser wurde das Homogenat in Eppendorf Tubes überführt und zweimal für 5 min. bei 10.000 x g zentrifugiert. Der nun klare Überstand diente als Rohextrakt oder wurde zur Fällung von Mikrosomen mit MgCI2 nach Diesperger et.al. (1974) verwendet. Der Proteingehalt der Aufarbeitungen wurde nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt.
Der Standardtest für die FNS I enthielt in einem Gesamtvolumen von 200 μl : 175 μl Tris-HCI Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; Naringenin), 1 μmol Natriumascorbat, 10 nmol Eisen (II) sulfat, 20 nmol 2-Oxoglutarat und 15 μl Rohextrakt. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 25°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 μl Methanol, das eine Mischung der entsprechenden Flavonoide enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. 50 μl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 (s.o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio-Imaging Analyser (Fuji Photo Film Co.,
Tokio, Japan) und des TINA Software Packets (Raytest, Straubenhardt, Deutschland) lokalisiert und quantifiziert.
In Abb. 2 sind beispielhaft die Ergebnisse der Enzymtests mit der Petroselinum Sorte „ Gigante d'ltalia" mit zwei verschiedenen Proteinquellen mit und ohne 2-Oxoglutarat-Zugabe gezeigt.
BEISPIEL 4
Synthese von Oligonukleotiden und Klonierunqstrateqie
Oligonukleotide wurden bei der Firma Metabion (Martinsried, Deutschland) synthetisiert. Folgende Oligonukleotide wurden verwendet (5' - 3') :
Dioxyl H : 5'-GAITGGGGIRTIWTICAIKTIRYIRAYCAYGG-3' (SEQ ID NO:3)
Dioxyl R: 5'- TCIGTRTGISYIWYIAMICCYAAITCIGG -3' (SEQ ID NO:4) PCrace3A : 5'-GTCTTTCTCGTGAATTCTTTGC-3' (SEQ ID NO:5)
PCrace3B : 5'-AAGTGTTATCAGAGGCCATGG-3' (SEQ ID NO:6)
PcraceδA : 5'-TGGTTGATCTCCATCCTTCG-3' (SEQ ID NO:7)
PCraceδB : 5'-AAATCAAGCCGCTGTCAATACC-3' (SEQ ID NO:8)
PCraceδC : 5'-TGTAACCCACCAACCTGATCC-3' (SEQ ID NO:9) Oligo(dT) 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACT(16)(AGC)-3' (SEQ ID NO:10)
PCR-Anker : 5'-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3' (SEQ ID NO:11)
AAP : 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' (SEQ ID NO:12)
Backrace : 5'-GCCACGCGTCGACTAGTACG-3' (SEQ ID NO:13)
PCFNS1H : 5'-CAATGGCTCCTACAACAATAACTGC-3' (SEQ ID NO:14) PCFNS1R : 5'-CTCCATAGTATTCAGCGTTTAGACATGG-3' (SEQ ID NO: 15)
Dioxy2H : 5'-CCIMMITGYC CIMRRCCIGA ITTRRCITTR GG-3' (SEQ ID NO: 16)
Die Verwendung von Sequenzinformationen zur Flavonsynthase II eignen aufgrund der zu erwartenden sehr geringen Homologie nicht zur erfolgreichen Klonierung der Flavonsynthase I. Die zwei Proteine katalysieren zwar die gleiche Reaktion, die Einführung einer Doppelbindung zwischen dem C2 und dem C3 Atom und setzen die gleichen Substrate, die Flavanone zu Flavonen um, besitzen aber ansonsten keine Gemeinsamkeiten. Sie gehören verschiedenen Enzymklassen an (FNS I : Dioxygenase; FNS II : Cytochrom P450), sind unterschiedlich lokalisiert (löslich; membrangebunden) und sie benötigen verschiedene Kofaktoren für ihre Aktivität (Oxoglutarat; NADPH plus eine assoziertes Enzym). Darüber hinaus ist ihre Verbreitung sehr unterschiedlich : eine Flavonsynthase I-Aktivität wurde nur in einigen
Vertretern der Apiaceae gefunden, die Flavonsynthase II dagegen in allen anderen flavonhaltigen Pflanzen.
Zur Klonierung eines putativen Flavonsynthase I Fragmentes aus Petersilie wurden aus zwei hochkonservierten Bereichen in den bekannten Dioxygenasen Sequenzen des Flavonoidbiosyntheseweges (siehe Abb. 3) zwei stark degenerierte forward Primer abgeleitet, siehe SEQ ID NO: 3 und 16. Diese Primer sollten es ermöglichen in Kombination mit einem zum Poly-A-Schwanz der mRNA komplementären, nicht degenerierten Oligo(dT)-Primer in zwei PCR-Runden spezifische Fragment, die für verschiedene Dioxygenase Protein kodieren zu amplifizieren. Nach der nested PCR wurden Produkte mit deutlichen Banden im erwarteten Bereich von 700 - 900 bp einkloniert und sequenziert (siehe Beispiel 5). Die Sequenzvergleiche der einzelnen Klone ergaben hohe Homologien (größer 85%) zu verschiedenen bekannten Dioxygenasen (z.B ACC, FLS und FHT). Jedoch musste festgestellt werden, daß kein putativer FNS I klon erhalten wurde. Erst durch die ungewöhnliche Verwendung eines zweiten stark generierten Primers (SEQ ID NO: 4) als reverse Primer anstelle des Oligo(dT)s (SEQ ID NO: 10) konnte ein weiteres Fragment amplifiziert werden, das überraschenderweise ebenfalls eine hohe Homologie (78%) zu bekannten FHT Sequenzen zeigte, sich aber deutlich von dem bereits im ersten Ansatz erhaltenen FHT-Fragment unterschied. Aufgrund der Tatsache, das die verschiedenen FHTs allgemein zueinander sehr homolog (>75%) sind und besonders innerhalb einer Familie noch höhere Homologien (>80%) besitzen, wäre für ein zweites FHT Gen in Petersilie mit einer noch höheren Homologie zurechnen. Somit lag die Vermutung nahe, das es sich bei dem zweiten Klon nicht um eine FHT handeln könnte. Erst die Klonierungsstrategie mit zwei stark degenerierten Primern führte zur erfolgreichen Klonierung einer funktionellen Flavonsynthase I aus Petersilie, wie in Beispiel 5 dargestellt.
BEISPIEL 5
Klonierung eines Dioxygenase-Fragments aus Petroselinum erispum
Isolierung von Gesamt RNA aus Petroselinum Laub
Gesamt RNA wurde aus Petroselinum Laub von verschiedenen Entwicklungsstadien in denen die FNS I-Aktivität nachgewiesen werden konnte nach einer bei Giuliano et.al. (1993) beschriebenen Methode isoliert. 1.2 g in flüssigem Stickstoff eingefrorenes Pflanzenmaterial
wurde in einem vorgekühlten Moser zu feinem Pulver gerieben und in ein ebenfalls vorgekühltes Corex-Röhrchen überführt. Das Gewebe wurde in 3 ml vorgelegtem Extraktionspuffer, bestehend aus 4 M Guanidium Thiocyanat, 0.15 M Natriumacetat (pH 5.3), 0.2 % Natrium Sacrosinat und 0.7 % ß-Mercaptoethanol, und 2.4 ml Wasser-equilibriertem Phenol (gesättigt mit 0.1 M Citrat-Puffer, pH 4.3, Sigma, Deisenhofen, Deutschland) durch kräftiges Vortexen homogenisiert. Nach der Zugabe von 0.6 ml Chloroform wurde das gut gemischte Homogenat für 20 min auf Eis belassen und anschließend bei 15.000 x g zentrifugiert (Sorvall RC-5B plus; SS34). Die abgenommene Oberphase wurde mit 1 Vol. Isopropanol versetzt und erneut auf Eis für 60 min inkubiert. Nach 30 min Zentrifugation bei 15.000 x g (Sorvall s.o.) wurde die Oberphase verworfen und das Pellet in sterilem H20 vorsichtig resuspendiert. Zur Entfernung der Polysaccharide wurde die Lösung mit 100% Ethanol (20% (v/v) Endkonzentration) versetzt, 20 min auf Eis inkubiert und 10 min bei 10.000 x g und 4°C zentrifugiert. Der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand wurde mit 1/3 Vol. 8 M Lithiumchlorid versetzt. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurde 20 min bei 15.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die gefällte RNA wurde zweimal mit je 1 ml 80% Ethanol gewaschen und dann in 50 μl H20 resuspendiert und bei -70°C gelagert. Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm (Pharmacia Biochrom 4060). Falls erforderlich wurde zudem poly (A)+ RNA aus der Gesamt RNA durch zwei Zyklen Oligo (dT) Cellulose Chromatographie isoliert (Sambrook et.al., 1989).
Reverse Transkription von RNA
5 μg Gesamt RNA oder 500 ng poly (A)+ RNA, isoliert aus den oben beschriebenen unterschiedlichen Blattstadien, wurde in einem 25 μl Ansatz mit einem der späteren Verwendung entsprechendenden Primer mittels Reverse Transkriptase (SuperScript™ I, GIBCO BRL, Paisley, Großbritanien) in cDNA umgeschrieben. Zur RNA wurde 1 μl des jeweiligen Primer (1 μM final) und Wasser bis zu einem Volumen von 17 μl gegeben. Dieser Ansatz wurde anschließend bei 70°C für 10 min. denaturiert und dann auf Eis gestellt. Nach der Zugabe von 4 μl 5 x SuperScript First Strand Buffer, 2 μl 100 mM Dithiothreitol, 1 μl 10 mM dNTP Mix, wurde der Ansatz bei 42°C für 2 min. vorinkubiert. Anschließend wurde 1 μl (200 U) SuperScript™ Reverse Transkriptase direkt dazupipettiert. Die Reaktion wurde bei 42°C für 60 min. und anschließend für 15 min. bei 70°C inkubiert. Die resultierenden cDNA's wurden direkt als Template für den jeweiligen PCR Ansatz verwendet.
PCR-Amplifikation mit Dioxygenase spezifischen Primern
Die Amplifikation eines putativen FNS I Fragmentes wurde mittels PCR, mit den degenerierten Primern „Dioxyl H" und „Dioxyl R" durchgeführt. Der PCR Ansatz enthielt in einem Gesamtvolumen von 50 μl folgende Komponenten : 36.5 μl Wasser, 5 μl 10 x Polymerase Puffer, 2.5 mM MgCl2, 0.2 μM dNTP Mix, je 1 μM der beiden Primer, 2 μl aus dem oben beschriebenen cDNA Ansatz und 0.5 μl 5 U/μl AGS-Gold Polymerase (Hybaid, Heidelberg, Deutschland). Folgende PCR-Parameter wurden verwendet : Ein Denaturierungsschritt bei 94°C für 10 min., anschließend 40 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 50°C (Annealing) für 2 min. und 72°C (Extension) für 30 sec. und zum Abschluß eine abschließende Extension bei 72°C für 7 min. 15 μl des PCR-Produktes wurden nun mit 5 μl Ladepuffer {80% Formamid, 1 mg/ml Bromphenolblau und 40μl Ethidiumbromidlösung pro ml} versehen und gemischt. Die so vorbereiteten Proben wurden auf ein 5%-iges Low-Melting Agarose geladen und für 3 Stunden bei maximal 80 V getrennt. Anschließend wurde das Gel auf dem UV-Schirm betrachtet und die Größe der PCR-Produkte mit Hilfe einer 50 kb Ladder (MBI, St. Leon-Roth, Deutschland) ermittelt. Amplifikate mit der erwarteten Länge wurden in den TOPO pCR2.1 Vektor einkloniert und anschließend in TOPO 10F' one-shot Kompetentezellen (Invitrogen) nach Herstellerangaben transformiert. Plasmid Isolierung aus, über blau-weiß Screening identifizierten, transformierten Bakterien wurde mit Hilfe des Plasmid Miniprep - Quantum Prep - Kits (Bio-Rad, München, Deutschland) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die nach einem Verdau mit geeigneten Restriktionsenzymen (z.B. Eco Rl; Boehringer Mannheim, Deutschland) und einer Auftrennung auf einem 3%-igem Low-Melting Agarosegel identifizierten Inserts mit einer Länge von ca. 400 bp, wurden sequenziert DNA Sequenzierung dieser und anderer Klone erfolgte durch die Firma TopLab (Martinsried, Deutschland).
BEISPIEL 6
Isolierung des full-length Klon von pPCdioχy2.6
Der cDNA Klon pPCdioxy3.3 entspricht nicht einem full-length Klon, sondern nur dem Bereich zwischen den beiden konservierten Bereichen. Das Ende (3'-Ende) der Sequenz, einschließlich eines oder mehrerer Stopkodons und der Anfang (5'-Ende) fehlen. Um den vollständigen Klon von pPCdioxy3.3 zu bekommen, wurden PCR gestütze RACE Methoden nach Frohman et.al.
(1988) mit Hilfe des 3' und 5'-RACE System, Version 2.0 (GibcoBRL) verwendet.
Zuerst wurden verschiedene genspezifische 3' bzw. 5'-RACE Primer (pPCrace3A+B und pPCrace5A-C) auf der Grundlage von pPCdioxy3.3 konstruiert und zusätzlich noch der nested Amplifikationsprimer "Backrace". Für das 3 -RACE wurde mit Hilfe des Oligo(dT)-Primers
Gesamt-RNA nach der in Beispiel 5 Methode in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde
das First Strand Produkt vom Überschuß an Nukleotiden und des Primers mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstellerangaben gereinigt. Die PCR-Amplifikation der cDNA erfolgte in 0.5 ml dünnwandigen PCR-Gefäßen nach folgendem Protokoll : Einmalige Denaturierung bei 94°C für 10 min., anschließend 40 Zyklen bestehend aus 94°C für 1 min., 57°C für 1 min. und 72°C für 2 min. Abschließend wurde noch ein Extensionschritt von 7 min. durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen : 36.5 μl Wasser, 5.0 μl 10 x PCR-Puffer, 3.0 μl 25 mM MgCI2, 1.0 μl 10 mM dNTP, 1.0 μl 25 μM pPCrace3A, 1.0 μl 25μM Oligo(dT), 2.0 μl cDNA und 0.5 μl 5 U/μl AGS-Gold Polymerase (Hybaid). 15 μl des 5'-RACE Produktes wurden auf einem 3%-igem Low-Melting Agarosegel bei der Verwendung von geeigneten Längenstandards analysiert. Spezifische Einzelbanden im Bereich von ca. 1000 kb wurden für eine nested-PCR verwendet. Nach einer Reinigung wie bereits oben beschrieben, wurde auch der dargestellte PCR-Ansatz mit den Primern pPCrace3B und PCR-Anker und dem gereinigten und 1 : 500 verdünnten PCR-Produkt als Template wiederholt. Nach einer erneuten Analyse der Produkte wurden spezifische Fragmente in der erwarteten Länge einkloniert und über Sequenzanalyse verifiziert. Für das 5'-RACE wurde mit Hilfe des pPCraceδA Gesamt-RNA nach der in Beispiel 5 Methode in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde das First Strand Produkt vom Überschuß an Nukleotiden und des Primers mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) nach Herstellerangaben gereinigt. Durch die Terminale Transferase (TdT) wurde die gereinigte cDNA mit einem Oligo-dC Tail versehen. Der Tailing Ansatz sah wie folgt aus : 6.5 μl Wasser, 5.0 μl 5 x Tailing Puffer, 2.5 μl 2 mM dCTP und 10 μl cDNA. Dieser Mix wurde für 3 min. bei 94°C denaturiert und anschließend für 1 min. auf Eis gestellt. Durch die Zugabe von 1 μl TdT wurde die Reaktion gestartet und dann für 10 min. bei 37°C inkubiert. Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte durch Inkubation bei 65°C für 10 min. Die PCR-Amplifikation der dC-getailten cDNA erfolgte in 0.5 ml dünnwandigen PCR-Gefäßen nach folgendem Protokoll : Einmalige Denaturierung bei 94°C für 10 min., anschließend 35 Zyklen bestehend aus 94°C für 1 min., 57°C für 1 min. und 72°C für 2 min. Abschließend wurde noch ein Extensionschritt von 7 min. durchgeführt. Der PCR-Ansatz setzte sich aus folgenden Komponenten zusammen : 31.5 μl Wasser, 5.0 μl 10 x PCR-Puffer, 3.0 μl 25 mM MgCI2, 1.0 μl 10 mM dNTP, 2.0 μl 10 μM pPCraceδB, 2.0 μl 10μM AAP, 5.0 μl dC-tailed cDNA und 0.5 μl 5 U/μl Teq DNA Polymerase (Promega, Madison, USA). 15 μl des δ'-RACE Produktes wurden auf einem 3%-igem Low-Melting Agarosegel bei der Verwendung von geeigneten Längenstandards analysiert. Spezifische Einzelbanden im Bereich von ca. 600 kb wurden für eine nested-PCR verwendet. Nach einer Reinigung wie bereits oben beschrieben, wurde auch der dargestellte PCR-Ansatz mit den Primern pPCraceδC und backrace und dem gereinigten und 1 : 500 verdünnten PCR-Produkt als Template wiederholt. Nach einer erneuten Analyse
der Produkte wurden spezifische Fragmente in der erwarteten Länge einkloniert und über Sequenzanalyse verifiziert.
Mit Hilfe der RACE-Methoden wurden ein -900 kb langes und ein -300 kb langes spezifisches Fragment amplifiziert. In den überlappenden Bereichen sind diese neuen Fragmente homolog zum Fragment pPCdioxy2.6. Der Gesamt-Klon (1431 bp) besitzt einen offenen Leserahmen und zeigt auf Aminosäure Ebene eine 78%-ige Homologie zur Flavanon 3-Hydroxylase aus Deucus cerote.
BEISPIEL 8
Expression von pPCFNS-ORF in Hefe
Konstruktion von pYes2.1TOPOPCYFNSsense und pYes2.1TOPOPCYFNSantisense Ein 1246 kb PCR Fragment, entsprechend pPCFNS-ORF, wurde direkt in den Hefe Expressionsvektor pYES2.1TOPO ligiert. Die entstandenen Plasmide wurden mit Hilfe der interner Restriktionsschnittstellen des Fragmentes pPCFNS-ORF hinsichtlich des vorhandenen Insert und der jeweiligen Orientierung überprüft, Die so charakterisierten Fragmente wurden als pYes2.1TOPOPCYFNSsense und pYes2.1TOPOPCYFNSantisense bezeichnet
Hefe Transformation
Der Hefe Stamm INVSc 1 wurde mit den Plasmiden pYes2.1TOPOPCYFNSsense und pYes2.1TOPOPCYFNSantisense entspechend dem Protokoll nach Gietz et.al. (1992) transformiert. Die Selektion transformierter Hefezellen erfolgte über einen Komplementationsmarker.
Präparation von Hefe Proteinextrakt für Flavonsynthase I Tests Einzelne Kolonien von INVSc 1/ pYes2.1TOPOPCYFNSsense und INV/Sc 1 pYes2.1TOPOPCYFNSantisense, die auf Selektionsmedium SGI {20 g Glucose (w/v), 1 g Pepton (Fluka), 6.7 g Yeast Nitrogen Base without amino acids (Difco) und 20 mg L- Tryptophan (Fluka) pro Liter} herangezogen wurden, wurden anschließend in δ x δ ml SGI- broth inokuliert und bei 200 rpm und 30°C für 24 Stunden inkubiert. Bei einer OD60o von 0.2 - 0.4 der 1 : 10 verdünnten Vorkultur erfolgte ein vollständiges Überimpfen in 250 ml YPGE {δ g Glucose, 10 g Pepton, 10 g Yeast Extract (Fluka) und 3 Vol. % Ethanol pro Liter}. Die Hauptkultur wurde bei 30°C und 120 rpm bebrütet. Bei einer OD600 von 0.8 bis 1.2 erfolgte die Induktion durch Zufütterung von 27 ml 200 g/l steriler Galaktose Lösung. Nach 12 bis 15 Stunden, bei einer OD600 von etwa 0.6 bis 1.2 der 1 : 10 verdünnten Hauptkultur, wurden die Hefezellen durch Zentr ifugation geerntet, einmal mit TEK {50 mM Tris- HCI pH 7.4, 1 mM EDTA und 0.1 M KCI} gewaschen und in Tris-HCI, pH 7.5 resuspendiert. Der Aufschluß der Hefen erfolgte bei 4°C mit 1 δ g Glassbeads (Sigma) je Ansatz. Die Glassbeads wurden anschließend zweimal mit 5 ml Tris-HCL, pH 7.5 gewaschen und der vereinigte Überstand diente als Enyzmquelle für die FNS I Tests. FNS I-Aktivität wurde, wie für die FNS II bei Martens und Forkmann (1998) beschrieben, gemessen. Der Standardtest für die Flavonsynthase I enthielt in einem Gesamtvolumen von
200 μl : 120 μl Tris-HCI Puffer (pH 7.5), 0.3 nmol radioaktive markiertes Substrat (83 Bq; [14c] Naringenin), 1 μmol Natriumascorbat, 10 nmol Eisen (II) sulfat, 20 nmol 2-Oxoglutarat und 50 μl der Hefe Proteinpräparation. Nach einer Inkubation von 20 min. bei 2δ°C wurde die Reaktion durch die Zugabe von 20 μl Methanol, das eine Mischung von Naringenin und Apigenin (Produkt) enthielt, gestoppt. Die Extraktion des Reaktionsgemisches erfolgte zweimal mit 100 bzw. δO μl Ethylacetat. Die obere Phase wurde auf Cellulose Dünnschichtplatten im Laufmittel 1 bis 4 (s.o.) chromatographiert. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Fuji BAS 1000 Bio- Imaging Analyser (Fuji) und des TINA Software Packets (Raytest) lokalisiert und quantifiziert. Der Enzymextrakt, der aus INVSc 1/ pYes2.1TOPOPCYFNSsense hergestellt wurde, zeigt eine deutliche FNS I-Aktivität, wohingegen die entsprechende Fraktion aus INVSc 1/ pYes2.1TOPOPCYFNSantisense keine Aktivität zeigte (Abb. 7). Die Ergebnisse der Hefeexpression bestätigen, daß das cDNA Insert pPCYFNS-ORF für ein FNS I Enzym kodiert. Darüberhinaus zeigt das Ergebnis, daß die Expression des Enzyms, das durch den Petroselinum cDNA Klon kodiert wird, in Hefe ausreichend ist, um die direkte Bildung von Flavonen zu erreichen. Dies legt nahe, daß nur ein einziges Enzym für die Einführung der Doppelbindung zwischen C2 und C3 erforderlich ist (Abb. 1 B).
BEISPIEL 9
Vektoren und Hybriden
Agrobacterium vector
Die cDNA, die für die FNS I von Petersilie kodiert, wird in einen Agrobacterium- Vektor (z.B. pGPTV) Moniert. Das Plasmid enthält das FNS I Insert in Sense- oder Antisense-Orientierung und ist unter der Kontrolle des CaMV 3δS oder eines geeigneten gewebespezifischen Promotor. Als Selektionsmarker kann z.B. das nos-nptll Gen, das für die Kanamycin Resistenz kodiert, verwendet werden. Das vollständige Plasmid wird in einen geeigneten Agrobacterien Stamm (z.B. C58, GV3101) transferiert.
Petunia Hybriden :
Für die Transformation der Blattscheiben mit Agrobacterium tumefaciens werden 2-3 cm grosse Blätter von sterilen Sprosskulturen in Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspension entsprechender Agrobacterien (109 Zellen/ml YEB-Medium) für δ min inkubiert (Horsch , Science 227, 1229-1231 , 198δ). Die infizierten Blattstücke werden auf hormonfreiem LS-Medium für 3 Tage bei 25°C gehalten. Während dieser Zeit überwachsen die Bakterien die Blattsegmente, die anschließend in flüssigem LS-Medium ohne Hormone
gewaschen und auf LS-Medium mit Kanamycin (75μg/ml) gelegt werden. Nach ca 3 Wochenwerden erste transformierte Sprosse sichtbar, die auf hormonfreiem Medium in Gegenwart von Kanamycin bewurzelt werden.
Gerbera Hybriden :
Petiolenteile von sterilen Gerberakulturen der Sorte „Regina" werden für die Transformation mit Agrobacterium verwendet. Die Petiolen der vorkultivierten Gerberapflanzen werden in etwa 0.5 cm kleine Stücke geschnitten und in Regenerationsmedium supplementiert mit Hormonen (IAA 0.1 mg/l, BAP 1.0 mg/l, Zeatin 1.0 mg/l) überführt. Nach der Zugabe von 30 μl einer entsprechenden Agrobacterium Vorkultur werden sie unter leichtem Schütteln für 2 Tage in Luria Medium im Dunkeln inkubiert. Nach der Kokultivierung erfolgen zwei Waschschritte a 5 min mit sterilem Wasser und anschliessend mit Claforan-Wasser (250 mg/l). Zur Regeneration werden die Pflanzenteile auf entsprechenden Platten mit Claforan (250 mg/l) für eine Woche im Dunkeln kultiviert. Naschliessend werden die Explantate auf Selektionsmedium transferiert (δO mg/l Kanamycin und 67,δ mg/l Claforan) und nach einer weiteren Woche im dunkeln unter Normallicht weiterkultiviert. Ein Umsetzen ist alle zwei Wochen erforderlich. Nach etwa 7 Wochen werden erste transformierte grüne Zellhaufen sichtbar, die auf Regenerationsmedium überführt werden (Elomaa et al., BIO/TECHNOLOGY 11 , 508-511, 1993).
BEISPIEL 10
Produktionsverfahren - Biotransformation
Transformierte Hefezellen werden, wie in Beispiel 8 beschrieben, in 250 ml Medium bis zu einer OD von etwa 1.0 angezogen. Gleichzeitig mit der Induktion des Promotors durch Galaktose wird eine ethanolische Lösung (5 ml), die Flavanone (250 mg, z.B. Naringenin, Hesperetin, Eriodictyol) enthält, zur Kultur gegeben. Die gelösten Flavanone werden von den Hefezellen aufgenommen und durch die expremierte Flavonsynthase I zu dem entsprechenden Flavon (hier Apigenin, Diosmetin und Luteolin). Nach einer Inkubation von 20 h wird die Kultur mit 200 ml Ethylacetat versetzt. Dadurch werden die Hefezellen zerstört und die gebildeten Flavone werden vollständig in die Lösungsmittelphase extrahiert. Die Phasentrennung erfolgt durch Zentrifugation des Gemisches bei 10.000 x g für 15 min. Die organische Oberphase wird in einem Rotationsverdampfer eingeengt und so für die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie oder die weitere Aufreinigung mittels Säulenchromatographie bzw. präparative HPLC vorbereitet. Mit diesem Verfahren konnten bereits Naringenin,
Hesperetin und Eriodictyol erfolgreich umgesetzt werden. Die entstandenen Produkte wurde durch Co-Chromatographie mit authentischen Proben identifiziert (Harborne, Comparative Biochemistry of the Flavonoids, 1967; Markham, Techniques of Flavonoid Identification, 1982; Harborne, The Flavonoids - Advances in Research since 1986, 1994).
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