KR101317130B1 - 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌 색소의 안정화 및 청색화 방법 - Google Patents

Abstract

안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌의 3' 위치의 아실화 방법.

안토시아닌의 안정화, 안토시아닌의 청색화, 방향족 아실기 전이 효소

Description

안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌 색소의 안정화 및 청색화 방법 {METHOD OF STABILIZING, AND BLUING, OF ANTHOCYANIN PIGMENT USING GENE CODING FOR TRANSFERASE OF AROMATIC ACYL TO 3'-POSITION OF ANTHOCYANIN}

본 발명은 안토시아닌의 3' 위치에 방향족 아실기를 전이하는 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하여, 안토시아닌을 더 파랗게, 그리고 안정적으로 개변하는 방법에 관한 것으로, 안토시아닌 색소의 개변이나 안정화, 나아가서는 꽃색(花色)의 개변 및 안정화하는 데 이용할 수 있다. 더 구체적으로는, 용담 (Gentiana triflora var. japonica)을 비롯한 식물 유래의 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 또는 이 효소를 코드하는 cDNA를 이용하여, 꽃색을 파랗게 하고, 또한 안정화하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진, 단일의 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하여 안토시아닌을 더 파랗게 그리고 안정적으로 개변하는 방법에 관한 것으로, 안토시아닌 색소의 개변이나 안정화, 나아가서는 꽃색을 개변 및 안정화하는 데 이용할 수 있다.

화훼 업계는 신규하고 다양한 품종을 개발하기 위하여 노력하고 있다. 신규 품종 육성을 위한 유효한 방법의 하나로서 꽃색을 바꾸는 것이 있는데, 고전적인 육종 방법을 사용하여, 대부분의 상업적 품종에 대하여 여러 가지 꽃색을 띠는 품종이 만들어지고 있다. 그러나, 종래의 육종에 의한 방법으로는 종마다 유전자 풀이 제한되어 있기 때문에, 단일종이 광범위한 꽃색의 품종을 가진 경우는 드물다.

꽃색은 주로 두 가지 유형의 색소, 즉 플라보노이드 및 카로티노이드에 유래한다. 플라보노이드는 황색에서부터 적색 내지는 청색의 광범위한 꽃색에 주로 기여하고, 한편 카로티노이드는 오렌지 또는 황색의 색조에 주로 기여한다. 플라보노이드 중에서도 꽃색에 주로 기여하는 것은 안토시아닌이라고 총칭하는 일군의 화합물이다. 안토시아닌의 발색단은 안토시아니딘이고, 주요한 안토시아니딘으로서 페랄고니딘, 시아니딘, 델피니딘이 알려져 있다. 식물에는 다양한 안토시아닌이 존재하는 것이 알려져 있고, 그 다양성이 꽃색의 다양성의 한 요인이 되고 있다. 수백 종의 안토시아닌의 구조가 이미 결정되어 있고, 대부분의 안토시아닌의 3 위치의 수산기는 당에 의하여 수식되어 있다 (Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986).

안토시아닌의 생합성 경로는 3 위치의 배당화물의 생합성까지는 대부분의 현화 식물에서 공통이고 (Holton et al., Plant Cell 7: 1071, 1995), 그 후, 종 및 품종 특이적으로 배당화, 아실화, 메틸화 등 여러 가지 수식을 받는다. 이와 같은 품종에 있어서 수식 형태의 차이가 안토시아닌의 다양성, 즉 다채로운 꽃색의 한 가지 요인이 되고 있다. 일반적으로, 안토시아닌을 수식하는 방향족 아실기가 많을수록, 안토시아닌은 안정화하고, 청색화한다 (Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986; 사이토 노리오, 단백질 핵산 효소 47: 202, 2002). 또한 꽃색은 이들 안토시아닌과 금속의 착체 형성, 플라보놀이나 플라본 등의 플라보노이드 화합물의 코피그먼트 효과, 안토시아닌이 국부적으로 존재하는 액포(液胞)의 pH 등에 의하여 영향을 받는다(Forkmann, Plant Breeding 106: 1, 1991).

안토시아니딘을 포함하는 플라보노이드의 생합성은 상세하게 연구되어 있다. 안토시아닌의 합성에 관여하는 효소의 유전자는 모두 클로닝되고, 이들 전사 인자의 유전자도 얻어지고 있다. 따라서, 이들의 유전자의 발현을 인위적으로 개변함으로써 꽃에서 축적되는 플라보노이드의 구조와 양을 개변하여, 꽃색을 변경할 수 있다. 분자 생물학적 수법과 식물에의 유전자 도입에 의하여 안토시아닌의 구조를 개변하고, 꽃색을 변경한 예가 보고되어 있다 (Forkmann G & Martens S (2001). Curr Opin. Biotechnology, 12: 155-160 Tanaka Y & Mason J (2003) In: Singh RP & Jaiwal PK (ed.) Plant genetic engineering. PP 361-385. SCI tech publishing, Houston).

꽃색을 파랗게 하는 방법의 하나로서 안토시아닌의 B환의 수소기의 수를 증가시키는 것을 생각할 수 있다. 안토시아닌의 3' 위치를 수산화하는 반응을 촉매하는 효소 (플라보노이드 3'-수산화 효소: F3'H)와 안토시아닌의 3' 위치와 5' 위치를 수산화하는 반응을 촉매하는 효소 (플라보노이드 3' 위치 5'위 수산화 효소: F3'5'H)는 꽃색을 변화시키는 데 있어서 중요하다. 개략적으로, 페랄고니딘 (B환의 수산기가 1개)은 주황색에서부터 적색, 시아니딘 (B환의 수산기가 2개)은 적색에서부터 홍색, 델피니딘 (B환의 수산기가 3개)은 보라색으로부터 청색의 꽃에 포함되는 경우가 많다. 보라색에서부터 청색의 품종이 없는 식물종은 델피니딘을 만드는 능력이 결여된 것이 많은데, 그 대표적인 예로서, 장미, 국화, 카네이션을 들 수 있다.

이들 식물에 대하여 보라색으로부터 청색의 품종을 바이오테크놀로지에 의하여 작출하는 것은 이전부터 주목을 받고 있다. 실제로 델피니딘을 생산하는 데 필수인 F3'5'H 유전자를 발현시킴으로써, 꽃색을 청자색으로 한 카네이션 (Tanaka Y & Mason J (2003) In: Singh RP & Jaiwal PK (ed.) Plant genetic engineering. PP 361-385. SCI tech publishing, Houston)이 작제되고, 꽃잎에서 델피니딘을 생산하는 것은 가능하게 되었지만, 아직 꽃색은 충분한 청색으로 되지 않았다. 즉, 꽃색을 완전히 파랗게 하기 위하여는 F3'5'H 유전자를 도입하는 것만으로는 불충분하고, 더 연구를 할 필요가 있을 것으로 생각된다.

실제로 푸른 꽃에 포함되는 안토시아닌은 당을 사이에 두고 방향족 아실기로 수식되어 있는 것이 많다 (Honda & Saito Heterocycles 56: 633 (2002)). 이에 꽃색을 더 푸르게 하는 방법의 하나로서 카페오일기, 쿠마로일기, 시나포일기 등의 방향족 아실기에 의하여 안토시아닌을 수식하는 것을 생각할 수 있다 (Tanaka & Mason (2003) In: Singh RP & Jaiwal PK (ed.) Plant genetic engineering. pp361-385. SCI tech publishing, Houston).

일반적으로, 안토시아닌은 배당화에 의하여 약간 붉어지고, 당을 사이에 둔 방향족 아실기의 부가에 의하여 안토시아닌의 색은 파랗게 된다 (Forkmann, Plant Breeding 106: 1, 1991). 또한, 안토시아닌은 중성 용액 중에서는 불안정한 화합물이지만, 당이나 아실기에 의하여 수식됨으로써 안정성이 향상된다 (Forkmann, Plant Breeding 106:1, 1991). 나팔꽃 (Pharbitis nil) 유래의 안토시아닌을 사용한 실험에 의하여, 아실화된 안토시아닌 중에서, 글루코오스를 사이에 두고 방향족 아실기, 예를 들어 쿠마르산이나 카페산이 결합된 안토시아닌은 그 흡수 극대가 장파장측으로 이동하는 것이 관찰되었다 (Dangle et al., Phytochemistry 34:1119, 1993).

방향족 아실기가 결합된 안토시아닌에는 달개비 (Commelina communis) 유래의 아오바닌(awobanin) (Goto and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30:17, 1991)를 비롯하여 자연계로부터의 수 많은 분리예가 보고되어 있다 (Honda & Saito Heterocycles 56:633 (2002)). 예를 들면, 푸른 꽃의 안토시아닌은 시네라린 (사이네라리아 유래), 겐티오델핀 (용담 유래), 헤븐리 블루 안토시아닌 (나팔꽃 유래), 테르나틴(ternatin) (클리토리아 유래), 로벨리닌(로벨리아 유래) 등으로 대표되는 바와 같이, 복수의 방향족 아실기를 가지고 있다.

시네라리아(Senecio cruentus) 유래의 시네라린(Goto et al., Tetrahedron 25: 6021, 1984)에는 1 개의 지방족 아실기와 3개의 방향족 아실기를 가지는데, 이들 방향족 아실기가 중성 수용액 중에서의 색소의 안정화에 기여하는 것이 보고되고 있다 (Goto et al., Tetrahedron 25: 6021, 1984). 또한, 용담 꽃잎의 주요 색소인 겐티오델핀 (DEL 3G-5CafG-3'CafG)은 델피니딘 3 위치 배당화물을 기본 골격으로 하고, 5 위치와 3' 위치 수산기에 글루코오스 1 분자와 카페산 1 분자로 이루어지는 측쇄를 가진다. 이들 5 위치 및 3' 위치의 당-아실기 측쇄에 의하여 샌드위치 모양의 분자 내의 스태킹(stacking)이 일어나, 수용액 중에서 색소가 안정화되는 것이 보고되어 있다 (Yoshida et al., Tetrahedron 48: 4313, 1992). 또한, 2개의 당-방향족 아실기 측쇄 중, 5 위치 보다 3' 위치의 당-방향족 아실기가 색소의 안정화, 청색화에 크게 기여하고 있는 것이 확인되었다(Yoshida et al. Phytochemistry 54: 85, 2000).

방향족 아실기 전이 반응은 1980년에 석죽과의 식물인 끈끈이장구채(Silene)(Kansteeg et al., Biochem. Physiol. Pflanzen 175: 403, 1980)에서 처음으로 나타내고, 향무류 (Matthiola)의 가용화 산소 분획에도 마찬가지의 방향족 아실기 전이 효소 활성이 발견되었다 (Teusch et al., Phytochemistry 26: 991, 1986). 그 후, 용담으로부터 안토시아닌의 5 위치의 당에 카페산이나 쿠마르산 등의 방향족 아실기를 전이하는 안토시아닌 5 위치 방향족 아실기 전이 효소 (이하 5AT)가 단리되고 (Fujiwara et al., Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997), 정제된 효소의 내부 아미노산 배열의 정보를 기초로, 용담의 5AT를 코드하는 cDNA가 단리되었다 (Fujiwara et al., Plant J., 16, 421, 1998).

이 유전자를 기초로 토레니아 (W02005/017147)로부터 호모로그가 단리되었고, 또한 이들 효소간에 있어서 보존된 아미노산 배열을 기초로, 안토시아닌의 3 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 효소 (3AT)를 코드하는 차조기의 cDNA가 단리되었다 (Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol 41:495, 2000). 차조기 3AT 유전자를 사용하여 마찬가지로 차조기과의 라벤더로부터 3AT 유전자가 클로닝되고 있다 (WO96/25500).

페튜니아로부터 안토시아니딘-3-루티노시드에 아실기를 전이하는 효소 유전자도 얻어지고 있다 (특표 2003-528603). 또한, 차조기 3AT 유전자 또는 토레니아 5AT 유전자를 장미에 도입하였더니, 꽃잎에서 3 위치 또는 5 위치에 방향족 아실기가 부가된 안토시아닌이 생성되었지만, 꽃색깔을 유의하게 파란색으로 바꾸는 것에는 이르지 못하고, 흡수 극대 값이 장파장으로 1-2 nm 정도 시프트하고 있었을 뿐이었다.

이 원인으로서는, 요시다 등의 보고 (Yoshida et al. Tetrahedron 48: 4313, 1992)에 있는 바와 같이, 3위치, 5위치 등의 A환 또는 C환의 아실화만으로는 충분한 효과가 없고, 3' 위치의 아실화가 안토시아닌의 청색화, 안정화를 위하여 필요하며, 더 좋기로는 3' 위치를 포함한 복수의 위치의 아실화가 필요한 것으로 생각되었다. 실제로, 3' 위치의 당에 방향족 아실기가 부가되어 있는 안토시아닌이 있기 때문에, 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 반응을 촉매하는 효소 (3'AT)가 존재하는 것으로 추측된다. 그러나, 지금까지 3'AT의 반응이 측정된 적은 없었고, 또한 3'AT의 효소 또는 3'AT를 코드하는 유전자가 클로닝된 적도 없다.

지금까지 보고되어 있는 아실기 전이 효소는 모두 안토시아닌의 3 위치 또는 5 위치에 작용하는 것이고, 반응의 위치 특이성은 높은 것이 보고되어 있다 (Fujiwara et al., Plant J., 16, 421, 1998, Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physio1. 41, 495, 2000). 따라서, 이미 알려진 방향족 아실기 전이 효소를 이용하여 3' 위치의 아실화를 실시할 수 없다고 생각되었다. 또한, 아직까지 안토시아닌의 복수의 위치에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 방향족 아실기 전이 효소에 대하여도 보고되어 있지 않다. 따라서, 종래의 기술 수준에서는, 예를 들면 유전자 재조합 식물을 제작하고, 안토시아닌의 3' 위치, 그리고 3' 위치를 포함한 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 것은 불가능하였다. 즉, 안토시아닌의 3' 위치 그리고 3' 위치를 비롯한 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 부가하는 수법에 의하여 안토시아닌을 더 파랗게 그리고 안정화시키고, 나아가 꽃색을 더 파랗게 하고, 안정화시키는 것은 곤란하였다.

특허 문헌 1: W096/25500

특허 문헌 2: W02005/017147

특허 문헌 3: 특표2003-528603

비특허 문헌 1: Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986

비특허 문헌 2: Holton et al., P1ant Cell 7: 107l, 1995

비특허 문헌 3: Harbone, in The Flavonoids: 565, 1986

비특허 문헌 4: 사이토 노리오, 단백질 핵산 효소 47: 202, 2002

비특허 문헌 5: Forkmann, Plant Breeding 106:1, 1991

비특허 문헌 6: Forkmann G & Martens S (2001). Curr 0pin. Biotechnolgy, 12: 155-160

비특허 문헌 7: Tanaka Y & Mason J (2003) In: Singh RP & Jaiwal PK (ed.) Plant genetic engineering. pp361-385. SCI tech publishing, Houston

비특허 문헌 8: Honda & Saito Heterocycles 56: 633 (2002)

비특허 문헌 9: Forkmann, Plant Breeding 106: 1, 1991

비특허 문헌 10: Dangle et al., Phytochemistry 34: 1119, 1993

비특허 문헌 11: Goto et al., Tetrahedron 25: 6021, 1984

비특허 문헌 12: Yoshida et al., Tetrahedron 48: 4313, 1992

비특허 문헌 13: Yoshida et al., Phytochemistry 54: 85, 2000

비특허 문헌 14: Goto and Kondo, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 17, 1991

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비특허 문헌 18: Fujiwara et al., Plant J., 16, 421, 1998

비특허 문헌 19: Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol 41: 495, 2000

전술한 요시다 등의 보고에 있는 바와 같이, 안토시아닌의 안정화와 청색화에는 안토시아닌의 방향족 아실기가 기여하고, 특히 5 위치의 당-아실기 측쇄보다 3' 위치의 당-아실기 측쇄의 기여가 크다. 또한, 3' 위치를 포함한 복수 위치의 당-아실기 측쇄에 의하여 안토시아닌은 더 파랗게 안정되는 것으로 생각할 수 있다. 따라서, 안토시아닌의 3' 위치 또는 3' 위치를 포함한 복수의 당의 위치에 방향족 아실기를 전이하는 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하면, 인위적으로 안토시아닌을 수식하고, 안토시아닌을 더 안정적인 화합물로 개변하고, 또한 그 안토시아닌이 더 파란색을 띠도록 할 수 있는 것으로 생각된다.

이상과 같이, 안토시아닌의 안정화, 청색화를 위하여, 3' 위치 방향족 아실기 전이를 실시하는 것은 매우 유효한 수단이다. 그러기 위하여는 지금까지 보고되지 않은 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 또는 본 효소를 코드하는 유전자가 필수이다. 본 발명자들은 용담으로부터 단리된 안토시아닌 5 위치 방향족 아실기 전이 효소의 효소학적 성질을 상세하게 조사함으로써, 용담의 5 위치 방향족 아실기 전이 효소가 3' 위치 아실기 전이 활성도 코드하고 있는 것을 밝혀내었다. 즉, 본 효소는 단일 효소이면서 안토시아닌의 5 위치 및 3' 위치 2 부분의 당에 각각 방향족 아실기 전이 반응을 촉매하는 것임을 밝혔다.

따라서, 본 발명은 안토시아닌의 3' 위치에 방향족 아실기를 부가함으로써 안토시아닌을 더 파랗게 안정화하는 방법을 제공한다. 또한, 해당 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 식물에 도입하고 발현시킴으로써, 꽃색깔을 더 안정적으로 파랗게 하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 (1) 안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌의 3' 위치 아실화 방법을 제공한다.

(2) 본 발명은 또한 안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌의 안정화 방법을 제공한다.

(3) 본 발명은 또한 안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 안토시아닌의 청색화 방법을 제공한다.

(4) 본 발명은 또한 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 식물에서 발현하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소를 아실화하는 방법을 제공한다.

(5) 본 발명은 또한 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 식물에 도입하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소가 아실화되는 것에 의한 상기 색소를 안정화하는 방법을 제공한다.

(6) 본 발명은 또한 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 식물에 도입하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소가 아실화되는 것에 의한 상기 색소를 청색화하는 방법을 제공한다.

(7) 본 발명은 또한 상기 (4) 내지 (6)의 어느 하나에 기재되어 있는 방법에 따라 얻은 식물체, 상기 식물체의 영양 증식체 또는 종자, 또는 상기 식물체와 동일한 성질을 가진 상기 식물체의 자손이 되는 식물체, 상기 식물체의 영양 증식체 또는 종자를 제공한다.

(8) 본 발명은 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단일의 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 부가하는 방법을 제공한다.

(9) 본 발명은 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단일의 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 안정화 방법을 제공한다.

(10) 본 발명은 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단일의 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 청색화 방법을 제공한다.

(11) 본 발명은 또한 상기 복수 위치의 하나가 안토시아닌의 3' 위치의 당인 상기 (8) 내지 (10)의 어느 하나에 기재되어 있는 방법을 제공한다.

(12) 본 발명은 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단일의 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 식물에서 발현하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소를 아실화하는 방법을 제공한다.

(13) 본 발명은 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단일 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 식물에 도입하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소가 아실화되는 것에 의한, 상기 색소를 안정화하는 방법을 제공한다.

(14) 본 발명은 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단일 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 식물에 도입하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소가 아실화되는 것에 의한 상기 색소를 청색화하는 방법을 제공한다.

(15) 본 발명은 또한 상기 복수 위치의 하나는 안토시아닌의 3' 위치의 당인 것인 상기 (12) 내지 (14)의 어느 하나에 기재되어 있는 방법을 제공한다.

(16) 본 발명은 또한 상기 (12) 내지 (15)의 어느 하나에 기재되어 있는 방법에 의하여 얻은 식물체, 상기 식물체의 영양 증식체 또는 종자, 또는 상기 식물체와 동일한 성질을 가지는 상기 식물체의 자손이 되는 식물체, 상기 식물체의 영양 증식체 또는 종자를 제공한다.

(17) 본 발명은 또한 배열 번호: 4 또는 6에 기재된 아미노산 배열을 가지고, 안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자, 또는 상기 아미노산 배열에 대하여 70% 이상의 배열의 동일성을 가지고, 또한 안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자, 또는 배열 번호: 3 또는 5에 기재된 뉴클레오티드 배열에 대하여 70% 이상의 동일성을 가지고, 또한 안토시아닌 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자를 제공한다.

(18) 본 발명은 또한 배열 번호: 4 또는 6에 기재된 아미노산 배열을 가지고, 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자, 또는 상기 아미노산 배열에 대하여 70% 이상의 배열의 동일성을 가지고, 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자, 또는 배열 번호: 3 또는 5에 기재된 뉴클레오티드는 배열에 대하여 70% 이상의 동일성을 가지고, 또한 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자를 제공한다.

(19) 본 발명은 또한 상기 복수 위치의 하나는 안토시아닌의 3' 위치의 당인 상기 (18)에 기재된 유전자를 제공한다.

(20) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를 포함하여 이루어지는 벡터를 제공한다.

(21) 본 발명은 또한 상기 (20)에 기재된 벡터에 의하여 형질 전환된 숙주를 제공한다.

(22) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 제공한다.

(23) 본 발명은 또한 상기 (21)에 기재된 숙주를 배양하고, 또는 생육시키고, 또한 상기 숙주로부터 플라보노이드의 3' 위치에 당을 전이하는 활성을 가진 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 상기 단백질의 제조방법을 제공한다.

(24) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자가 도입된 식물 또는 이것과 동일한 성질을 가진 그 자손 또는 그들의 조직을 제공한다.

(25) 본 발명은 또는 상기 (24)에 기재된 식물의 절화(切花) 또는 이와 동일한 성질을 가진 그 자손의 절화(切花)를 제공한다.

(26) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 3' 위치의 아실화 방법을 제공한다.

(27) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 안정화 방법을 제공한다.

(28) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 청색화의 방법을 제공한다.

(29) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를 식물에서 발현하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소를 아실화하는 방법을 제공한다.

(30) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를, 식물에 도입하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소가 아실화되는 것에 의한 상기 색소의 안정화 방법을 제공한다.

(31) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를, 식물에 도입하고, 상기 식물체 내에 있어서 목적 색소가 아실화되는 것에 의한, 상기 색소의 청색화 방법을 제공한다.

(32) 본 발명은 또한 상기 (17) 내지 (19)의 어느 하나에 기재된 유전자를 사용하는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 복수 위치의 당에 방향족 아실기를 부가하는 방법을 제공한다.

(33) 본 발명은 또한 상기 복수 위치의 하나가, 안토시아닌의 3' 위치의 당인 상기 (32)에 기재되어 있는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에 관련된 안토시아닌계 화합물의 구조식, 명칭 및 약호를 나타낸다.

도 2는 본 발명에 관련된 안토시아닌계 화합물의 구조식, 명칭 및 약호를 나타낸다.

도 3은 50μM의 DEL 3G-5G-3'G를 기질로서 사용하였을 경우의 반응 생성물의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 중에서, triG는 DEL 3G-5G-3'G를, 5Caf는 DEL 3G-5CafG-3'G를, 3'Caf는 DEL 3G-5G-3'CafG를, 그리고 5, 3'Caf는 Gentiodelphin (DEL 3G-5CafG-3'CafG)를 나타낸다.

도 4는 100μM의 DEL 3G-5G-3'G를 기질로서 사용한 경우의 반응 생성물의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 중에서, triG는 DEL 3G-5G-3'G를, 5Caf는 DEL 3G-5CafG-3'G를, 3'Caf는 DEL 3G-5G-3'CafG를, 그리고 5, 3'Caf는 Gentiodelphin (DEL 3G-5CafG-3'CafG)을 나타낸다.

도 5는 200μM의 DEL 3G-5G-3'G를 기질로서 사용하였을 경우의 반응 생성물의 경시 변화를 나타내는 그래프이다. 도 중에서, triG는 DEL 3G-5G-3'G를, 5 Caf는 DEL 3G-5CafG-3'G를, 3'Caf는 DEL 3G-5G-3'CafG를, 그리고 5, 3'Caf는 Gentiodelphin (DEL 3G-5CafG-3'CafG)을 나타낸다.

도 6은 용담 꽃잎으로부터 부분 정제한 단백질의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 왼쪽은 SDS-PAGE의 결과를 나타내고, 오른쪽은 GAT4 항체를 이용한 웨스턴블롯의 결과를 나타낸다. 도 중에서, M은 분자량 마커이며, 레인 1은 40 내지 70% 황산암모늄 침전 분획의 결과이며, 또한 레인 2는 다이매트릭스 컬럼(Dymatrix Cloumn) 후의 활성 분획의 결과이다.

도7은 메디오 (Medio) 착즙액을 사용한 꽃색 시뮬레이션 결과를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 실시 상태

본 명세서에 있어서는 용담 유래의 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 또는 이 효소를 코드하는 유전자를 사용하는 방법에 대하여 설명하고 있으나, 사용하는 유전자 또는 그 유전자에 의하여 코드되는 단백질은 이것에 한정되는 것은 아니다. 복수개의 아미노산의 부가, 결실 또는 다른 아미노산과의 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가지는 단백질도, 원래의 단백질과 동등한 효소 활성을 유지하는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명은 3' 위치의 당에의 방향족 아실기 전이 활성을 유지하고 있는 한, 용담의 해당 효소의 아미노산 배열에 1개 또는 복수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산과의 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가지는 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 유전자를 사용하였을 경우에도 본 발명에 속한다.

본 발명은 또한 용담 유래의 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소의 아미노산 배열, 배열 번호: 4 또는 6에 기재된 아미노산 배열에 대하여, 70% 이상, 좋기로는 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 배열을 가지고, 또한 안토시아닌의 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자도 본 발명에 속한다.

또한, 용담 유래의 3' 위치의 당에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 DNA에 대하여, 5xSSC, 50℃라고 하는 비교적 온화한 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자를 사용하는 경우에도 본 발명에 속한다. 또한, 용담 유래의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 DNA에 대하여, 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 활성을 가진 단백질을 코드하는 유전자를 사용하는 경우에도 본 발명에 속한다.

여기서 말하는 스트린젠트한 조건이라 함은, 예를 들면 2xSSC, 65℃이지만, 하이브리다이제이션의 조건은 프로브에 사용하는 DNA의 길이 및 염기 조성에 따라서 다르기 때문에, 이 조건에 한정되는 것은 아니다. 이와 같은 하이브리다이제이션에 의하여 선택되는 유전자로서는, 천연 유래의 것, 예를 들면 3' 위치에 방향족 아실기가 부가된 안토시아닌을 함유하는 식물, 예를 들면 클리토리아나 로벨리아, 사이네리아 유래의 유전자를 들 수 있지만, 식물 유래에 한정되는 것은 아니다. 즉, 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 활성을 가진 효소를 코드하는 유전자이면, 모두 이용 가능하다. 또한, 하이브리다이제이션에 의하여 선택되는 유전자는 cDNA이어도 좋고, 게놈 DNA이어도 좋다. 또한, 로벨리아나 클리토리아 등, 3' 위치에 방향족 아실기가 부가된 안토시아닌을 함유하는 식물로부터, 상기 용담의 효소의 정제법을 그대로 또는 일부를 개변하여, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 정제할 수 있다. 또한 정제한 효소의 아미노산 배열을 결정함으로써, 해당 효소를 코드하는 유전자를 클로닝할 수 있다.

개변된 아미노산 배열을 가지는 단백질을 코드하는 DNA는 공지의 부위 특정 변이 유발법이나 PCR법을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 배열을 개변하고 싶은 DNA 단편을 cDNA 또는 게놈 DNA의 제한 효소 처리에 의하여 얻고, 이것을 주형으로 하여, 소망하는 아미노산 배열의 개변에 대응한 프라이머를 이용하여 부위 특이적 변이 유발 또는 PCR법을 실시하고, 소망하는 아미노산 배열의 개변에 대응한 DNA 단편을 얻을 수 있다. 그 후, 이 개변을 도입한 DNA 단편을 목적으로 하는 효소의 다른 부분을 코드하는 DNA 단편과 연결하면 좋다.

또는, 단축된 아미노산 배열로 이루어지는 효소를 코드하는 DNA를 얻으려면, 예를 들면 목적으로 하는 아미노산 배열보다 긴 아미노산 배열, 예를 들면 전체 길이 아미노산 배열을 코드하는 DNA를 소망하는 제한 효소에 의하여 절단하고, 그 결과 얻은 DNA 단편이 목적으로 하는 아미노산 배열의 전체를 코드하고 있지 않은 경우에는 부족 부분의 아미노산 배열에 대응하는 DNA 단편을 합성하여, 연결하면 좋다. 이와 같이 하여 얻은 유전자를 대장균 또는 효모에서의 유전자 발현계를 이용하여 발현시키고, 상기 대장균 또는 효모의 추출액 중의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 활성을 측정함으로써, 얻은 유전자가 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 목적으로 하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA를 합성할 수도 있다.

본 발명은 또한 방향족 아실기 전이 효소 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 특히 발현 벡터 및 상기 벡터에 의하여 형질 전환된 숙주 세포로부터 추출한 방향족 아실기 전이 효소를 사용한 경우도 해당한다. 숙주로서는, 원핵 생물 또는 진핵 생물을 사용할 수 있다. 원핵 생물로서는, 세균, 예를 들면 에쉐리키아 (Escherichia)속에 속하는 세균, 예를 들면 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 (Bacillus)속 미생물, 예를 들면 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등 종래 공지의 숙주 세포를 이용할 수 있다. 진핵 세포로서는, 예를 들면 진핵 미생물, 좋기로는 효모 또는 사상균을 사용할 수 있다.

효모로서는, 예를 들면 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae) 등의 사카로미세스 (Saccharomyces)속 효모를 들 수 있고, 또 사상균 으로서는, 예를 들면 아스페르길러스 오리제 (Aspergillus oryzae), 아스페르길러스 니거 (Aspergillus niger) 등의 아스페르길러스 (Aspergillus)속 미생물 및 페니실륨 (Penicillium)속 미생물 등을 들 수 있다. 또한 동물 세포 또는 식물 세포도 숙주 세포로서 사용할 수 있고, 동물 세포로서는, 마우스, 햄스터, 원숭이, 사람 등의 세포계가 사용된다. 또한, 곤충 세포, 예를 들면 누에 세포, 또는 누에의 성충 그 자체도 숙주로서 사용된다.

발현 벡터로서는 그것들을 도입하여야 할 숙주의 생물종에 의존한 프로모터 및 터미네이터 등의 발현 제어 영역, 및 복제 기점 등을 함유한다. 세균용, 특히 대장균에 있어서의 발현 프로모터로서는, 종래 공지의 프로모터, 예를 들면 trc 프로모터, tac 프로모터, lac 프로모터 등을 사용할 수 있다. 또한, 효모용 프로모터로서는, 예를 들면 글리세르알데히드 3 인산 디히드로게나제 프로모터, PH05 프로모터 등이 사용되고, 사상균용 프로모터로서는, 예를 들면 아밀라제, trpC 등의 프로모터를 사용할 수 있으나, 이들 프로모터에 한정되는 것은 아니다. 또한, 동물 세포용 프로모터로서는, 바이러스성 프로모터, 예를 들면 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터 등이 사용된다.

발현 벡터의 제작은 제한 효소, 리가제 등을 사용하여 통상의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 또한, 발현 벡터에 의한 숙주 세포의 형질 전환도 종래 공지의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 식물의 발현 벡터로서는, 예를 들면 애그로박테륨을 사용하는 경우에는 pBI121 등의 바이너리 벡터를, 파티클 건을 사용하는 경우에는 pUC19 등의 대장균 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터로 형질 전환된 식물세포를, 예를 들면 항생 물질 내성 유전자 등의 마커 유전자를 사용하여 선발하고, 적절한 식물 호르몬 등의 조건을 이용하여 재분화시켜, 형질 전환된 식물체를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 형질 전환된 숙주 세포 또는 형질 전환 식물체를 배양 또는 재배하고, 배양물 등으로부터 통상의 방법에 따라서, 예를 들면, 여과, 원심 분리, 세포의 파쇄, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등에 의하여 회수, 정제한 안토시아닌의 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 이용한 경우에도 본 발명에 속한다.

현재의 기술 수준을 가지고 하면, 식물에 유전자를 도입하고, 그 유전자를 구성적 또는 조직 특이적으로 발현시키는 것이 가능하며, 또한 안티센스법이나 코서프레션법 등에 의하여 목적으로 하는 유전자의 발현을 억제하는 것도 가능하다. 형질 전환 가능한 식물의 예로서는, 장미, 국화, 카네이션, 금어초, 시클라멘, 난, 꽃도라지, 후리지아, 거베라, 글라디올러스, 안개꽃, 카랑코에, 백합, 페라고늄, 제라늄, 페튜니아, 토레니아, 튤립, 벼, 대맥, 소맥, 유채, 포테이토, 토마토, 포플러, 바나나, 유칼리, 고구마, 대두, 알파파, 루핀, 옥수수, 컬리플라워 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 안토시아닌의 3' 위치의 방향족 아실화 방법에서 사용하는 것은 용담 유래의 아실기 전이 효소 및 본 효소를 코드하는 용담의 cDNA나 유전자, 그리고 이 cDNA나 유전자를 대장균 등의 숙주에서 발현시켜 얻는 재조합체 효소에 한정되는 것이 아니며, 널리 다른 생물로부터 얻을 수 있는 안토 시아닌 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소, 그 효소를 코드하는 cDNA나 유전자, 그리고 이들 cDNA나 유전자를 대장균 등의 숙주에서 발현시켜 얻는 재조합체 효소로 대용하였을 경우에도 가능하다.

또한, 본 명세서에 있어서는 안토시아닌을 포함하는 플라보노이드의 아실기 전이 반응에 있어서, 아실기의 공여체로서 p-쿠마로일-CoA 또는 카페오일-CoA 등의 CoA 에스테르를 들었지만, p-쿠마로일, 페루로일 또는 신나포일-1-O-글루코오스 등의 하이드록시신나모일1-0-글루코오스도 방향족 아실기의 공여체로서의 이용이 가능하므로 (Glassgen and Seitz, Planta 186:582, 1992), 본 발명에 관한 효소를 사용한 이용이 가능하다.

이하에, 본 발명을 실시예에 기초하여 상세하게 설명한다. 실험의 순서는 특히 기술하지 않는 한 샘브룩 (Sambrook) 등의 분자 클로닝 (Molecular Cloning) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), PCT-JP96-00348, 후지와라 (Fujiwara) 등의 보고 (1997, 1998)에 따랐다.

실시예 1. 용담 유래의 아실기 전이 효소 cDNA의 대장균에 있어서의 발현과 재조합체 단백질의 정제

용담 유래의 아실기 전이 효소 cDNA의 대장균 발현용 콘스트랙트 pGeAT 102 (Fujiwara et al., Plant J., 16, 421, 1998에 기재)로부터 Nco Ⅰ/Hind Ⅲ 절단에 의하여 아실기 전이 효소의 코드 영역 및 3' 비번역 영역을 포함하는 플래그먼트를 대장균 발현 벡터 pQE60 (QIAGEN사)의 Nco I/Hind Ⅲ에 서브클로닝하고, 대장균 발 현용 콘스트랙트 pQE8를 얻었다.

pQE8를 도입한 대장균 JM 109주를 SB 배지를 사용하여 37℃에서 0D600nm=0.8까지 배양한 후, 배양 온도를 15℃로 내려서 1 시간 더 배양하고, IPTG 최종 농도 0.1 M이 되도록 첨가하여, 용담 아실기 전이 효소 유전자의 발현을 유도하였다. 15℃, 1 시간 배양하고, 집균한 것을 초음파 파괴하여, 이하의 정제에 사용하였다. 파쇄한 균체를 DE52 (Whatman)에 걸러, 150 mM NaCl을 포함하는 25 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 의한 걸러지지 않고 통과한 분획을 회수하였다. 또한, 황산암모늄 염석에 의하여 40 내지 60%의 황산암모늄 포화 분획을 회수하여, 소량의 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 용해하고, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 의하여 평형화한 SephadexG-25 (Pharmacia사)를 사용하여 탈염하였다.

이것을 DEAE-TOYOPEAL (TOSOH사)에 부하한 후, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에서부터 0.5 M NaCl를 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 이르는 직선 농도 구배에 의하여 용출하였더니, 약 120 내지 240 mM NaCl의 용출 분획에 델피니딘 3,5-디글루코시드 (DEL 3G-5G)에 대한 5 위치 방향족 아실기 전이 효소 활성을 볼 수 있었다. 활성 분획을 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 완충액에 대하여 투석한 후, 블루 세파로스(Blue Sepharose) (Pharmacia사)에 부하하였다. 블루 세파로스 그대로 통과한 분획에는 활성은 없으며, 흡착된 활성 분획을 1 M NaCl를 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)을 사용하여 용출하였다.

이어서, 본 분획을 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) (Pharmacia사)에 흡착시켜, 40% 포화 황산암모늄을 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)로부터 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에의 직선 농도 구배로 용출하였다. 활성 분획은 0% 황산암모늄으로 용출하였다. 이것을 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)에 대하여 투석한 후, 다이매트릭스 컬럼 오렌지 에이 (Dyematrix Column Orange A) (Amicon사)에 흡착시켜, 0.3 M NaCl와 0.5 mM DTT를 함유하는 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)을 사용하여 용출하였다. 활성은 그대로 통과된 분획에는 없고, 흡착 분획에만 활성이 관찰되었으며, 이것을 센트리콘-10 (Amicon사)에 의하여 농축하였다.

실시예 2. 재조합 아실기 전이 효소의 활성 측정

도 1 및 도 2에서 도시하는 3 종류의 델피니딘 유도체, 델피니딘 3,5, 3'-트리글루코시드 (DEL 3G-5G-3'G), 델피니딘 3-글루코실-5-카페오일글루코실-3'-글루코시드 (DEL 3G-5CafG-3'G), 델피니딘 3-글루코실-5-글루코실-3'-카페오일글루코시드 (DEL 3G-5G-3' CafG)를 기질로 하고, 실시예 1에서 얻은 재조합 효소를 사용하여, 그 효소 활성을 측정하였다. 전량 50 ㎕의 반응액 중에서, 100 mM 칼륨 인산 버퍼 (pH 8.5), 0.2 mM 카페오일 CoA, 250 mM의 상기 각 기질, 효소액 5 ㎕을 포함하고, 30℃, 15분 반응을 실시하였다. 0.1% 트리플루오로초산(TFA)을 함유하는 90% 아세트니트릴 수용액을 반응액을 등량 첨가하고, 반응을 정지시켰다.

또한, 반응 생성물의 경시 변화를 조사하기 위하여, 25배로 희석한 효소액 5㎕, 기질로서 50 μM, 100 μM 또는 200 μM의 DEL 3G-5G-3'G를 사용하고, 2.5, 5, 10, 20 분 후에 반응을 멈추고, 생성물을 분석하였다. 반응 생성물의 분석은 DE-41 칼럼 (4.6x250mm, Shodex사)을 사용한 역층 액체 고속 크로마토그래프 (HPLC)에 의하여 실시하였다. 샘플의 용출은 0.5% TFA를 포함하는 20 내지 50% 직선 농도 구배 의 아세트니트릴 수용액으로 0.6 ㎖/min, 15분, 그 후 50%의 아세트니트릴 수용액으로 0.6 ㎖/min, 10분간 실시하고 SPD-M10A (시마쓰 세이사쿠쇼 제품)을 사용하여 250 내지 600 nm의 파장으로 검출하였다. 이미 알려진 시료의 HPLC 용출 시간 및 흡수 스펙트럼과 생성물의 것을 비교하고, 생성물의 구조의 동정을 실시하였다.

상기 3종의 화합물을 기질로 한 반응의 결과, 재조합 아실기 전이 효소는 어느 기질과도 반응하였다. 250 mM의 DEL 3G-5CafG-3'G를 기질로 하면 94.1%가 DEL 3G-5CafG-3'CafG로 변환되었다. 한편, 250 mM의 DEL 3G-5G-3'CafG를 기질로 하면 95.2%가 DEL 3G-5CafG-3'CafG로 변환되었다. 또한, 250 mM의 DEL 3G-5G-3'G를 기질로 하면, 7.2%가 5위치에만 방향족 아실기가 부가된 DEL 3G-5CafG-3'G, 58.7%가 DEL 3G-5CafG-3'CafG로 변환되고, 3' 위치에만 방향족 아실기가 부가된 DEL 3G-5G-3'CafG는 흔적량 (1% 이하)이었다.

희석한 효소액을 사용하여, DEL 3G-5G-3'G를 기질로 하여 반응의 경시 변화를 측정한 결과, 반응 시간의 경과에 따라 DEL 3G-5CafG-3'G와 DEL 3G-5CafG-3'CafG의 생성량이 증가하였다. DEL 3G-5G-3'CafG의 생성량은 다른 2개에 비하여 매우 적고, 기질량을 증가시키고, 반응 시간을 길게 함으로써 약간 검출되는 정도이었다 (도 3, 도 4 및 도 5). 이것은 희석하고 있지 않은 효소액을 DEL 3G-5G-3'G에 반응시킨 결과와 일치한다.

이상의 결과로부터, 용담 유래의 아실기 전이 효소 유전자를 대장균으로 발현시켜 얻은 재조합 단백질은 안토시아닌의 5 위치와 3' 위치의 당에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 것이 분명해졌다. 즉, 이전의 보고 (Fujiwara et al., Plant J., 16, 421, 1998)에서는 이 효소는 안토시아닌의 5 위치에만 특이적으로 방향족 아실기를 전이한다고 여겨졌지만, 본 발명에 의하여 본 효소는 3' 위치, 5 위치의 양쪽 모두의 당에 방향족 아실기를 전이하는 것으로 밝혀졌다. 또한, DEL 3G-5G-3'G를 기질로 하였을 경우의 반응 생성물로부터, 5 위치 글루코오스에의 방향족 아실기 부가가 선행되고, 그 후 3' 위치 글루코오스에의 방향족 아실기 부가가 일어날 가능성이 높다고 생각된다.

실시예 3. 용담 유래의 방향족 아실기 전이 효소의 정제

용담 유래의 방향족 아실기 전이 효소 cDNA를 대장균으로 발현시켜 얻는 효소가, 안토시아닌의 5 위치 및 3' 위치 글루코오스에의 방향족 아실기 전이 활성을 가진 것이 밝혀졌지만 (실시예 2), 용담 꽃잎에 존재하는 천연의 효소에 대하여도, 단일의 효소가 5 위치 방향족 아실기 전이 효소 활성과 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 활성을 가진 것을 확인하기 위하여, 용담 꽃잎으로부터 이 효소의 정제를 실시하였다. 일련의 정제에 있어서, 실시예 2의 기재와 동일하게 하여, 각 컬럼 크로마토그래피의 용출 분획 각각에 DEL 3G-5G를 기질로 한 5 위치 아실기 전이 효소 활성과 DEL 3G-5G-3'G를 기질로 한 5 위치, 3' 위치 아실기 전이 효소 활성을 측정하였다.

용담의 5 위치 방향족 아실기 전이 효소를 정제한 후지와라 등의 보고 (Fujiwara et al., Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997)에 따라, 용담 꽃잎 약 100 g의 파쇄 추출물로부터 황산 암모늄 40-70% 포화 염석 분획을 얻었다. 이를 10 μM p-아미노페닐메탄술포닐 플루오라이드 (APMSF), 1 mM DTT를 함유하는 20 mM Tris- HCl (pH 7.0) (이하, Tris 버퍼로 기재)로 평형화한 세파덱스 G-25 (Pharmacia사)에 의하여 탈염한 후, Tris 버퍼로 평형화한 MONO Q (Pharmacia사)에 부하하였다. Tris 버퍼로 미흡착 분획을 세정한 후, 0 내지 0.5 M NaCl를 포함하는 Tris 버퍼를 유속 5 ㎖/min, 20 min 흘려 흡착 분획을 용출하였다. 방향족 아실기 전이 활성은 0.2 내지 0.42 M NaCl로 용출되는 분획에 존재하였다.

이를 HiTrap Blue (Pharmacia사)에 부하하고, Tris 버퍼로 충분히 세정한 후, 0.9 M NaCl를 포함하는 Tris 버퍼로 흡착 분획을 용출하였다. 활성은 흡착 분획에 존재하였다. 그 후, 활성 분획을 DEAE-Sepharose (Pharmacia사)에 부하하였다. Tris 버퍼로 충분히 세정한 후, 흡착 분획을 0 내지 0.5 M NaCl를 포함하는 Tris 버퍼를 0.5 ㎖/min, 60 분간 흘려 사용하였다. 활성은 0.22 내지 0.3 mM NaCl를 포함하는 Tris 버퍼로 용출되는 분획에서 관찰되었다. 그 후, 활성 분획을 센트리콘 30 (Amicon사)으로 농축한 후, 다이매트릭스 컬럼 레드 (Dyematrix Column Red) (Amicon사)에 걸었다. Tris 버퍼로 미흡착 분획을 세정한 후, 흡착된 분획을 1.5 M KCl을 포함하는 Tris 버퍼에 의하여 용출하였다. 이것을 SDS-PAGE에 의한 해석에 사용하였더니, 아실기 전이 효소의 추정 분자량 52 kDa 부근에는 거의 단일한 밴드 밖에 검출되지 않았다.

일련의 정제에 있어서, 각 컬럼 크로마토그래피의 용출 분획에 대하여 DEL 3G-5G를 기질로 한 5 위치 아실기 전이 효소 활성과 DEL 3G-5G-3'G를 기질로 한 5위치, 3' 위치 아실기 전이 효소 활성을 측정하였더니, 두 가지 활성이 가장 강한 활성을 나타내는 프랙션은 완전하게 일치하고 있었다. 다이매트릭스 컬럼 레드 (Dyematrix Column Red)에 흡착된 활성 분획을 사용하여 실시예 2와 동일한 3 종류의 기질, DEL 3G-5G-3'G, DEL 3G-5CafG-3'G, DEL 3G-5G-3'CafG에 대한 활성을 측정하였더니, 어느 기질과도 반응하여 실시예 2와 동일한 반응 특성을 나타내었다.

다이매트릭스 컬럼 레드 (Dyematrix Column Red)에 흡착한 활성 분획을 SDS 폴리아크릴 아미도겔 전기 영동에 의하여 분리한 후, 공지의 방법 (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 76, 4350, l979)에 기초하여 분리 후의 단백질을 니트로셀룰로스 멤브레인 Hybond-ECL (Amersham사)에 전사한 후, 용담의 안토시아닌 5 위치 아실기 전이 효소에 대한 특이적 항체 (Fujiwara et al., Eur. J. Biochem. 249, 45, 1997)를 이용하여 웨스턴법에 의하여 검출하였더니 명료한 1개의 밴드가 관찰되었다 (도 6).

이상의 결과로부터, 용담 꽃잎에 존재하는 안토시아닌 3' 위치 방향족 아실기 전이 활성과 안토시아닌 5위 방향족 아실기 전이 활성이 단일의 단백질에 유래하는 것이 밝혀졌다.

실시예 4. 용담의 아실기 전이 효소에 의한 안토시아닌의 안정화, 청색화

DEL 3G-5G-3'G, DEL 3G-5CafG-3'G, DEL 3G-5G-3'CafG, DEL 3G-5CafG-3'CafG에 관한 상대적인 안정성에 대하여는 이미 보고되어 있다. 즉, pH 6.5의 수용액에 있어서 DEL 3G-5CafG-3'CafG가 가장 안정되어 있어 퇴색되기 어렵고, 이어서 DEL 3G-5G-3'CafG, DEL 3G-5CafG-3'G, DEL 3G-5G-3'G의 순서로 안정적이다 (Yoshida et al., Phytochemistry 54, 85, 2000). 또한, 흡수 극대는 DEL 3G-5CafG-3'CafG가 가장 장파장이며, 이하 DEL 3G-5G-3'CafG, DEL 3G-5CafG-3'G, DEL 3G-5G-3'G이었다. 즉, 바라보았을 때 가장 파랗게 보이는 것은 DEL 3G-5CafG-3'CafG이고, 이어서 DEL 3G-5G-3'CafG인 것으로 나타나 있다 (Yoshida et al., Phytochemistry 54, 85, 2000).

용담 유래의 안토시아닌 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자를 장미에 도입하고, 장미 꽃잎에 있어서 DEL 3G-5CafG-3'CafG가 생성된 경우의 꽃색깔을 추측하기 위하여, 장미 (품종 Medeo) 꽃잎의 착즙 중에 있어서 정제 색소의 발색을 조사하였다. 정제 색소로서는, DEL 3G-5CafG-3'CafG 및 비교 대조로서 DEL 3G-5G, 시아니딘 3,5-디글루코시드 (CYA 3G-5G), 페랄고니딘 3,5-디글루코시드 (PEL 3G-5G), 말비딘 3,5-디글루코시드 (MAL 3G-5G)를 사용하였다. -80℃에서 1 시간 이상 동결한 메데오 (Medeo) 꽃잎 약 20 g을 가정용 마늘 착즙기를 사용하여 착즙하고, 10OO rpm으로 1 분간 원심하여 꽃잎 잔사를 제거한 상청을 착즙액으로 하였다.

착즙액 1 ㎖에 상기 정제 색소의 50 mM DMSO 용액을 20 ㎕ 첨가하고, 10 분간 정치한 후, 분광 측색계 UV-2500PC (시마쓰 세이사쿠쇼 제품)로 380-780 nm의 흡수 스펙트럼 및 투과 스펙트럼을 측정하였다. 투과 스펙트럼으로부터 CIE L^*a^*b 표색계 (JISZ8729)로 환산하였다. 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트 (RHSCC) 번호는 상기 기기 측정에 의하여 얻은 색채값 (CIE L^*a^*b^* 표색계)을 기초로, 색채 분류 시스템 Version 2.1.1 (가부시키가이샤 니혼 소고 겐큐쇼, 일본; 일본 공개 특허 공보 2002-016935)를 사용하여 근사색의 조합을 실시하였다. 이 시스템을 이용함으로 써 객관적으로 근사한 RHSCC 번호를 선택할 수 있다. 착즙액에 가한 색소의 최종 농도는 장미 꽃잎 액포 중의 평균적 안토시아닌 농도와 근사한 것이다. 다만, 3G-5CafG-3'CafG에 대하여는 흡광도가 너무 높기 때문에 4배 희석하여 측정하였다. 또한, 메데오 (Medeo)는 장미 원예종의 평균적인 꽃잎 pH (pH 4.38)를 나타내는 품종이다.

도 7에 나타내는 바와 같이, 상기 5종의 정제 색소 중에서 DEL 3G-5CafG-3'CafG는 장미 꽃잎 착즙액 중에 있어서, 가장 큰 극대 흡수 스펙트럼을 나타내었다. 투과 스펙트럼으로부터 환산한 L^*a^*b^*값을 기초로 RHSCC (영국 왕립 원예 협회 칼라 챠트)를 사용하여 근사색을 구하면 89A가 되고, 도 7에도 나타내는 바와 같이 5종의 정제 색소 중에서, 가장 푸른 색을 나타내었다.

이 결과로부터, 예를 들면 장미 꽃잎에 있어서, 안토시아닌 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자를, F3'5'H 유전자 (W02004/020637) 및 3' 위치의 당 전이 효소 유전자 (W001/92509)와 함께 발현시킴으로써, 장미 꽃잎에 있어서 DEL 3G-5CafG-3'CafG를 생성하고, 그 결과 푸른 색을 나타내는 장미꽃을 작출하는 것이 가능한 것으로 생각할 수 있다. 마찬가지로, 카네이션, 국화, 페튜니아, 버베나, 니렘베르기아, 백합 등에서도 푸른 꽃의 품종을 제작할 수 있다.

실시예 5. 용담 근연종으로부터 안토시아닌의 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 호모 로그의 단리

용담속 (Gentiana)에는 용담뿐만이 아니라 겐티아나 루비쿤다(Gentiana Rubicunda)나 겐티아나 야쿠시멘시스(Gentiana Yakushimensis) 등 여러 가지 근연종이 존재한다. 이들로부터, PCR에 의하여 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 호모로그의 취득을 시도하였다.

용담으로부터 얻은 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자에는 인트론을 포함하지 않는 것을 알고 있었으므로, 근친 종의 잎으로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. 게놈 DNA의 추출에는 QIAGEN사의 DNeasy를 사용하여, 제조원이 추천하는 방법에 따라 실시하였다. 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자에 특이적인 프라이머 GAT4-Met-F 및 GAT4-B는 이하와 같은 배열을 가지고, 이들을 프라이머로 하여 PCR를 실시함으로써, 코드 영역 전체를 포함하는 전체 길이의 cDNA가 증폭된다. PCR의 반응 조건은 아래와 같다.

프라이머의 배열

GAT4-Met-F TCA TTA TGG AGC AAA TCC AAA (배열 번호: 1)

GAT4-B CAT GTC AGG TGT GAG GTT CAA C (배열 번호: 2)

PCR 조건

변성 반응 94℃ 5분, 1 사이클

증폭 반응 94℃ 1분, 55℃ 1분 30초, 72℃ 3분을 30 사이클

신장 반응 72℃ 7분, 1 사이클

이 PCR에 의하여, 겐티아나 야쿠시멘시스 (Gentiana Yakushimensis), 오크롤레우카 (Ochroleuca), 우타리엔시스 (Wutariensis)의 3종에 있어서, 기대되는 1.5 kb 정도의 밴드가 증폭되었다. 이들을 회수하고, pCRII-TOPO (Invitrogen)으로 클로닝하고, 염기 배열을 결정하였다. 각 종으로부터 얻은 증폭 단편의 뉴클레오티드 배열 및 대응하는 아미노산 배열을 배열표에 나타낸다.

겐티아나 야쿠시멘시스 (Gentiana Yakushimensis) 배열 번호: 3 및 4

오크롤레우카 (Ochroleuca) 및 우타리엔시스 (Wutariensis) 배열 번호: 5 및 6

오크롤레우카 (Ochroleuca)와 우타리엔시스 (Wutariensis)로부터 얻은 플래그먼트는 동일한 아미노산 배열을 코드하고 있었다. 최초로 용담으로부터 얻은 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소와의 동일성은 겐티아나 야쿠시멘시스 (Gentiana Yakushimensis) 유래의 것은 95%, 오크롤레우카 (Ochroleuca) 유래의 것과 우타리엔시스 (Wutariensis) 유래의 것은 각각 90%이었다. 이 동일성의 정도가 높은 것을 볼 때, 이들은 안토시아닌의 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소의 호모로그라고 생각된다.

실시예 6. 용담의 안토시아닌의 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소의 니렘베르기아에 있어서의 발현

용담의 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자를, 마찬가지로 용담 유래의 3' 위치의 당 전이 효소 유전자, 팬지 유래의 F3'5'H 유전자와 함께 니렘베르기아에 도입하였다. 이것에 의하여 얻는 형질 전환체에 있어서는 먼저 용담의 3' 위치의 당 전이 효소의 작용에 의하여 DEL 3G-5G의 3' 위치가 배당화되고 DEL 3G-5G-3'G가 생성되고, 이것에 용담의 안토시아닌의 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전 이 효소가 작용하여 최종 산물인 겐티오델핀 (DEL 3G-5CafG-3'CafG)이 생성될 것이 기대된다.

발현용 콘스트랙트 pSPB1536는 식물 발현용 바이너리 벡터 (van Engelen FA et al. (1995) Transgenic Res 4:288-290)의 HindⅢ와 EcoRI 사이트에 3' 위치의 당 전이 효소 발현 카세트, PacI 사이트에 팬지 유래의 F3'5'H의 발현 카세트, AscI 사이트에 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소의 발현 카세트를 도입함으로써 제작하였다. 어느 발현 카세트도 컬리플라워 모자이크 바이러스 유래의 35S 프로모터에 의하여 제어되고, 각각의 구조 유전자의 하류에 애그로박테륨 유래의 노파린 합성 효소 유전자의 터미네이터 배열을 가진다. 니렘베르기아에의 유전자 도입은 다나카 등의 보고 (Tanaka et al. (2005) Plant Cell Tiss. Org. Cult. 80:1-24)에 기재된 바와 같이 실시하였다.

얻은 니렘베르기아 형질 전환체에 있어서의 3개의 도입 유전자 (용담의 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 유전자, 용담의 3' 위치의 당 전이 효소 유전자, 팬지의 F3'5'H 유전자)의 발현을 RT-PCR에서 확인하였다. 이들 3개의 유전자에 대하여도 전사 산물이 확인된 계통에 대하여, 미즈타니 등의 보고 (Fukuchi-Mizutani et al. (2003) Plant Physiol 132: 1652-1663)에 개시하고 있는 바와 같이 하여 꽃잎의 색소 분석을 실시하였지만, 어느 계통에 있어서도 기대되는 최종 산물인 겐티오델핀은 검출되지 않았다.

한편, 3개의 도입 유전자의 전사 산물이 확인된 형질 전환체의 꽃잎으로부터 후지와라 등의 보고 (Fujiwara et al. (1997) Eur J Biochem 249: 45-51)에 있는 바와 같이 하여 조효소액을 추출하였다. 이것을 효소액으로서 사용하여, 실시예 2와 동일하게 하여 DEL 3G-5G-3'G를 기질로 하여 시험관 내 (in vitro)에서 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 활성을 측정하였더니, 겐티오델핀의 생성이 확인되었다. 한편, 대조군으로서 사용한 비재조합체 니렘베르기아 유래의 조효소를 사용한 경우에는 겐티오델핀은 검출되지 않았다. 이 결과로부터, 재조합체 니렘베르기아는 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소의 활성, 즉, 기질로서 사용한 DEL 3G-5G-3'G의 5위 및 3' 위치에 방향족 아실기를 전이하는 활성을 가진 것이 분명해졌다.

그러나, 동일한 니렘베르기아 형질 전환체의 조효소액을 사용하여, 미즈타니 등의 보고 (Fukuchi-Mizutani et al. (2003) Plant Physiol 132: 1652-1663)에 있는 바와 같이 하여 시험관 내에서의 3' 위치의 당 전이 효소의 활성도 측정하였지만, 3' 위치의 당 전이 효소 활성은 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터, 형질 전환체 니렘베르기아의 세포 내에 있어서 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소는 활성을 가진 단백질이 존재하고 있다는 것이 확인되었다. 그러나, 기대되는 겐티오델핀이 형질 전환체의 꽃잎에 있어서 검출되지 않았던 것은 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소가 작용하는 전단계에서 기능하여야 할 3' 위치의 당 전이 효소의 단백질이 니렘베르기아의 세포 내에서 합성되지 않았거나, 또는 합성되어도 기능하지 않았기 때문이라고 생각할 수 있다.

이상과 같이, 본 발명에 있어서는 용담 유래의 방향족 아실기 전이 효소 유 전자를 대장균에서 발현시켜 얻는 재조합 방향족 아실기 전이 효소가 델피니딘 배당체의 5 위치의 당 뿐만이 아니라, 3' 위치의 당에도 방향족 아실기를 전이하는 활성을 겸비하고 있는 것을 밝혀내었다. 또한, 용담 꽃잎으로부터 정제한 천연의 안토시아닌 5 위치 방향족 아실기 전이 효소가 3' 위치의 당에도 방향족 아실기를 전이하는 활성을 겸비하는 것, 즉 지금까지의 안토시아닌 방향족 아실기 전이 효소와는 달리, 단일 효소가 안토시아닌의 5 위치와 3' 위치의 두 가지 모두 방향족 아실기를 전이하는 것을 밝혀내었다. 또한, 이 유전자를 이종 식물에서 발현시켜, 5, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소 활성을 얻을 수 있었다.

안토시아닌의 안정화와 청색화에는 5 위치의 방향족 아실기보다 3' 위치 방향족 아실기가 더 크게 기여하고, 더 좋기로는, 3' 위치를 비롯한 복수 위치의 당-아실 측쇄를 가지는 것이 좋다고 생각되고 있다. 따라서, 본 발명에 기재한 바와 같이, 5 위치와 3' 위치 양쪽에 모두 방향족 아실기를 전이하는 5 위치, 3' 위치에의 방향족 아실기 전이 효소를 사용하여, 안토시아닌 배당체의 5 위치와 3' 위치 양쪽 모두의 방향족 아실화를 실시함으로써, 더 안정적인 파란 색을 띠는 안토시아닌을 작출하는 것이 가능하다. 또한, 이 효소를 코드하는 유전자를, 기타 필요한 안토시아닌 합성계 또는 안토시아닌 수식 유전자와 함께 식물체에서 발현시킴으로써, 안토시아닌을 주로 하는 꽃색을 더 안정적으로, 그리고 파랗게 하는 것이 가능하다.

<110> International Flower Developments Proprietary Limited <120> Method for stabilization and blue-coloring of anthocyanin dye using gene encoding enzyme transferring aromatic acyl group to 3'-position of anthocyanin <150> JP 2004-315733 <151> 2004-10-29 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAT4-Met-F <400> 1 tcattatgga gcaaatccaa a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GAT4-B <400> 2 catgtcaggt gtgaggttca ac 22 <210> 3 <211> 1603 <212> DNA <213> Gentiana yakushimensis <220> <221> CDS <222> (6)..(1412) <223> nucleotide sequence encoding enzyme transferring aromatic acyl group to 3'-position of anthocyanin <400> 3 tcatt atg gag caa atc caa atg gcg aag gtt gtt gaa aaa tgc caa 47 Met Glu Gln Ile Gln Met Ala Lys Val Val Glu Lys Cys Gln 1 5 10 gtt aca cca cca ttt gac aca aca gat gtc gag tta tca gta ccg gta 95 Val Thr Pro Pro Phe Asp Thr Thr Asp Val Glu Leu Ser Val Pro Val 15 20 25 30 aca 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360 365 Lys Arg Val His Asn Glu Lys Gly Val Leu Ala Asp Ala Lys Thr Trp 370 375 380 Leu Ser Glu Ser Asn Gly Ile Pro Ser Lys Arg Phe Leu Gly Ile Thr 385 390 395 400 Gly Ser Pro Lys Phe Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Trp Gly Lys 405 410 415 Pro Ala Lys Phe Asp Ile Thr Ser Ile Asp Tyr Ala Glu Leu Ile Tyr 420 425 430 Val Ile Glu Ser Arg Asp Phe Glu Lys Gly Val Glu Ile Gly Val Ser 435 440 445 Leu Pro Lys Ile His Met Asp Ala Phe Ala Lys Ile Phe Glu Glu Gly 450 455 460 Phe Cys Phe Leu Ser 465 <210> 5 <211> 1587 <212> DNA <213> Ochroleuca and Wutariensis <220> <221> CDS <222> (6)..(1397) <223> nucleotide sequence encoding enzyme transferring aromatic acyl group to 3'-position of anthocyanin <400> 5 tcatt atg gag caa atc caa atg gtg aag gtt ctt gaa aaa tgt caa 47 Met Glu Gln Ile Gln Met Val Lys Val Leu Glu Lys Cys Gln 1 5 10 gtt aca cca cca tct gac aca aca gat gtc gag tta tca cta tcg gta 95 Val Thr Pro Pro Ser Asp Thr Thr Asp Val Glu Leu Ser Leu Ser Val 15 20 25 30 aca ttc ttt gat atc ccc tgg ttg cat ttg tat aag atg cag tcc ctt 143 Thr Phe Phe Asp Ile Pro Trp Leu His Leu Tyr Lys Met Gln Ser Leu 35 40 45 ctg ttt tac gat ttt ccg tat cca aaa acg cgt ttc ttg gac act gtt 191 Leu Phe Tyr Asp Phe Pro Tyr Pro Lys Thr Arg Phe Leu Asp Thr Val 50 55 60 atc cct aat ctt aag gcc tcc ttg tct ctc act cta aaa cac tac ctt 239 Ile Pro Asn Leu Lys Ala Ser Leu Ser Leu Thr Leu Lys His Tyr Leu 65 70 75 ccg ctt agc gga aat ttg tta atg ccc atc aaa tcg ggc aaa atg cca 287 Pro Leu Ser Gly Asn Leu Leu Met Pro Ile Lys Ser Gly Lys Met Pro 80 85 90 atg ttt cac tac tct cgt gat gac gga gac tcg ata act ttg atc ttt 335 Met Phe His Tyr Ser Arg Asp Asp Gly Asp Ser Ile Thr Leu Ile Phe 95 100 105 110 gcg gag tct gac cag gat ttt gac tac ctt aaa ggt cat cac ctg caa 383 Ala Glu Ser Asp Gln Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Gly His His Leu Gln 115 120 125 gat tcc aat gat ttg cat gcg ctt ttt tat gtt atg cca cgg gtt tta 431 Asp Ser Asn Asp Leu His Ala Leu Phe Tyr Val Met Pro Arg Val Leu 130 135 140 agg acc act caa gac tat aaa gtc atc ccg ctc gta gct gtg caa gta 479 Arg Thr Thr Gln Asp Tyr Lys Val Ile Pro Leu Val Ala Val Gln Val 145 150 155 acc gtt ttt cct aac cat ggc att gcc gtg gct ctg acg gca cat cat 527 Thr Val Phe Pro Asn His Gly Ile Ala Val Ala Leu Thr Ala His His 160 165 170 tca att gca gat gct aaa agt ttt gta atg ttc atg aat gct tgg gcc 575 Ser Ile Ala Asp Ala Lys Ser Phe Val Met Phe Met Asn Ala Trp Ala 175 180 185 190 tgt att aac aaa ttt ggg aaa gac aca gac tta ttg tct ggg aat ctt 623 Cys Ile Asn Lys Phe Gly Lys Asp Thr Asp Leu Leu Ser Gly Asn Leu 195 200 205 ctt cca tct ttt gat aga tcg ata atc aaa gat ctg tat ggc cta gag 671 Leu Pro Ser Phe Asp Arg Ser Ile Ile Lys Asp Leu Tyr Gly Leu Glu 210 215 220 gaa aca ttt tgg aac gaa atg caa cat att ctt gac atg ttc tct aga 719 Glu Thr Phe Trp Asn Glu Met Gln His Ile Leu Asp Met Phe Ser Arg 225 230 235 ttt gga agc aaa ccc cct cga ttc aac aag gta cga gcc aca tat gtc 767 Phe Gly Ser Lys Pro Pro Arg Phe Asn Lys Val Arg Ala Thr Tyr Val 240 245 250 cta tcc cct gtt gaa atc gag aag cta aag aac aaa gta cta aat ctc 815 Leu Ser Pro Val Glu Ile Glu Lys Leu Lys Asn Lys Val Leu Asn Leu 255 260 265 270 aga gga tct gaa ccg gca ata cgt gta acg acg ttc aca gtg aca tgt 863 Arg Gly Ser Glu Pro Ala Ile Arg Val Thr Thr Phe Thr Val Thr Cys 275 280 285 gga tac ata tgg aca tgc atg gtc aaa tca aaa gat gtc gta tcg aac 911 Gly Tyr Ile Trp Thr Cys Met Val Lys Ser Lys Asp Val Val Ser Asn 290 295 300 gac gaa aat gag ctc gag tac ttc agt ttt aca gcg gat tgc cga ggg 959 Asp Glu Asn Glu Leu Glu Tyr Phe Ser Phe Thr Ala Asp Cys Arg Gly 305 310 315 ctt ctg acg ccc ccg tgt ccg cct aac tac ttt ggc aac tgt ctt gcg 1007 Leu Leu Thr Pro Pro Cys Pro Pro Asn Tyr Phe Gly Asn Cys Leu Ala 320 325 330 ccg tgc gtt gca aaa gca aca cgt aaa gag tta gtt gga aat aaa ggg 1055 Pro Cys Val Ala Lys Ala Thr Arg Lys Glu Leu Val Gly Asn Lys Gly 335 340 345 350 ttt ctt gtt gca gtt gca gct att gtg gaa gcc att gaa aag agg gtg 1103 Phe Leu Val Ala Val Ala Ala Ile Val Glu Ala Ile Glu Lys Arg Val 355 360 365 cac aac gaa aaa ggc gtt ctt gca gat gca aaa act tgg tta tcg gaa 1151 His Asn Glu Lys Gly Val Leu Ala Asp Ala Lys Thr Trp Leu Ser Glu 370 375 380 tct aat gga atc cct tca aaa aga ttt ctc ggg att act gga tca cct 1199 Ser Asn Gly Ile Pro Ser Lys Arg Phe Leu Gly Ile Thr Gly Ser Pro 385 390 395 aag ttt gat tcg tat ggt gta gat ttt gga tgg gga aag cct gca aaa 1247 Lys Phe Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Ala Lys 400 405 410 ttt gac att acc tct att gat tat gca gaa ttg att tat gtg att gag 1295 Phe Asp Ile Thr Ser Ile Asp Tyr Ala Glu Leu Ile Tyr Val Ile Glu 415 420 425 430 tcc agg gag ttt gaa aaa ggc gtg gag atc gga gta tca ttg cct aag 1343 Ser Arg Glu Phe Glu Lys Gly Val Glu Ile Gly Val Ser Leu Pro Lys 435 440 445 att cat atg gat gca ttt gca aaa atc ttt gaa caa ggt ttt tgc ttt 1391 Ile His Met Asp Ala Phe Ala Lys Ile Phe Glu Gln Gly Phe Cys Phe 450 455 460 ttg tca tag tctctttaat agaaccaaat ttgttgcaat aaagtaccaa 1440 Leu Ser gtctctagtg acactagtta ccaaacccta ctttcgaggt aggagcacca caacaaggtt 1500 caatcactac aaggttgaac ttcataaatt ccagaggtcg aatatccacc gttgacctct 1560 gaaaagttga acctcacacc tgacatg 1587 <210> 6 <211> 464 <212> PRT <213> Ochroleuca and Wutariensis <400> 6 Met Glu Gln Ile Gln Met Val Lys Val Leu Glu Lys Cys Gln Val Thr 1 5 10 15 Pro Pro Ser Asp Thr Thr Asp Val Glu Leu Ser Leu Ser Val Thr Phe 20 25 30 Phe Asp Ile Pro Trp Leu His Leu Tyr Lys Met Gln Ser Leu Leu Phe 35 40 45 Tyr Asp Phe Pro Tyr Pro Lys Thr Arg Phe Leu Asp Thr Val Ile Pro 50 55 60 Asn Leu Lys Ala Ser Leu Ser Leu Thr Leu Lys His Tyr Leu Pro Leu 65 70 75 80 Ser Gly Asn Leu Leu Met Pro Ile Lys Ser Gly Lys Met Pro Met Phe 85 90 95 His Tyr Ser Arg Asp Asp Gly Asp Ser Ile Thr Leu Ile Phe Ala Glu 100 105 110 Ser Asp Gln Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Gly His His Leu Gln Asp Ser 115 120 125 Asn Asp Leu His Ala Leu Phe Tyr Val Met Pro Arg Val Leu Arg Thr 130 135 140 Thr Gln Asp Tyr Lys Val Ile Pro Leu Val Ala Val Gln Val Thr Val 145 150 155 160 Phe Pro Asn His Gly Ile Ala Val Ala Leu Thr Ala His His Ser Ile 165 170 175 Ala Asp Ala Lys Ser Phe Val Met Phe Met Asn Ala Trp Ala Cys Ile 180 185 190 Asn Lys Phe Gly Lys Asp Thr Asp Leu Leu Ser Gly Asn Leu Leu Pro 195 200 205 Ser Phe Asp Arg Ser Ile Ile Lys Asp Leu Tyr Gly Leu Glu Glu Thr 210 215 220 Phe Trp Asn Glu Met Gln His Ile Leu Asp Met Phe Ser Arg Phe Gly 225 230 235 240 Ser Lys Pro Pro Arg Phe Asn Lys Val Arg Ala Thr Tyr Val Leu Ser 245 250 255 Pro Val Glu Ile Glu Lys Leu Lys Asn Lys Val Leu Asn Leu Arg Gly 260 265 270 Ser Glu Pro Ala Ile Arg Val Thr Thr Phe Thr Val Thr Cys Gly Tyr 275 280 285 Ile Trp Thr Cys Met Val Lys Ser Lys Asp Val Val Ser Asn Asp Glu 290 295 300 Asn Glu Leu Glu Tyr Phe Ser Phe Thr Ala Asp Cys Arg Gly Leu Leu 305 310 315 320 Thr Pro Pro Cys Pro Pro Asn Tyr Phe Gly Asn Cys Leu Ala Pro Cys 325 330 335 Val Ala Lys Ala Thr Arg Lys Glu Leu Val Gly Asn Lys Gly Phe Leu 340 345 350 Val Ala Val Ala Ala Ile Val Glu Ala Ile Glu Lys Arg Val His Asn 355 360 365 Glu Lys Gly Val Leu Ala Asp Ala Lys Thr Trp Leu Ser Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Ile Pro Ser Lys Arg Phe Leu Gly Ile Thr Gly Ser Pro Lys Phe 385 390 395 400 Asp Ser Tyr Gly Val Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Ala Lys Phe Asp 405 410 415 Ile Thr Ser Ile Asp Tyr Ala Glu Leu Ile Tyr Val Ile Glu Ser Arg 420 425 430 Glu Phe Glu Lys Gly Val Glu Ile Gly Val Ser Leu Pro Lys Ile His 435 440 445 Met Asp Ala Phe Ala Lys Ile Phe Glu Gln Gly Phe Cys Phe Leu Ser 450 455 460

Claims (33)

1. 배열 번호: 4 또는 6에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자 또는

   용담의 5 위치 방향족 아실기 전이 효소를 코드하는 유전자를 이용하는 단계를 포함하는 안토시아닌의 3' 및 5 위치의 당 모두에 방향족 아실기를 부가하는 방법.
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