JPH07505772A - フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フラボノイド経路の酵素をコードする遺伝子配列およびその用途本発明は、一般 にフラボノイド経路代謝酵素をコードする遺伝子配列に関し、さらに詳しくはフ ラボノイド３′−ヒドロキシラーゼまはそのフラグメントもしくは誘導体、なら びに植物および他の生物を着色させる場合のそれらの用途に関する。

花の産業では、顕花植物類の新しい種々の品種を開発しようと努力がなされてい る。このような新品種を創製するのに有効な方法は花色を操作する方法である。

古典的な品種改良法を利用して、花の経済品種の大部分に広範囲の色を生じさせ ることにいくらか成功している。しかしこの方法は特定の種の遺伝子プールの制 約によって制限があり、そのため、単一の種が全スペクトルの色を有する変種を 有するということはまれである。その上に伝統的な品種改良法は精密さを欠いて いる。美的感覚に訴える花の魅力はかたち、香気および色のような多くの因子の 組合わせである。そして雑種形成によって一つの特性を改変させると、同等に有 用な特徴が犠牲になることが多い。切花および観賞用の種に精密な色の変化を設 計し実施できれば、製品の回転が速くかつ新規性が重要な市場特性である産業で は、大きな商業的機会が提供されるであろう。

花色は２種の色素：フラボノイド類およびカロチノイド類に主として依存してい る。フラボノイド類は、イエロー〜レッド〜ブルーにわたる範囲の色に寄与して いる。カロチノイド類はオレンジまたはイエローの薄い色を与え、通常イエロー またはオレンジ色の花の主な色素である。花色に大きく寄与するフラボノイドの 分子は、シアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジン およびベラルゴニジンのグリコジル化された誘導体であるアントシアニン類であ り、液胞中に局在している。種々のアントシアニン類が著しく異なった色を生じ させることができる。また花色は、無色のフラボノイド類とのコピグメント化（ ｃｏ−ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）　、金属複合体化、グリコジル化、アシル化 および液胞ｐＨによって影響を受ける（Ｆｏｒｋｍａｎｎの１９９１年の文献） 。

フラボノイド色素類の生合成経路（以後“フラボノイド経路”と呼ぶ）は充分に 確立されており、図１に示す（Ｅｂｅ　ｌとＨａｈｌｂｒｏｃｋの１９８８の文 献；　ＨａｈｌｂｒｏｃｋとＧｒｉｓｅｂａｃｈの１９９１年の文献；　Ｗｉｅ ｒｉｎｇとＤｅｖｌａｍｉｎｇの１９８４年の文献ＨＳｃｈａｒａｍらの１９８ ４年の文献；　５ｔａｆｆｏｒｄの１９９０年の文献）。フラボノイド経路にお いて最初に行われるステップでは、３分子のマロニル−ＣｏＡと１分子のｐ−フ マロイル−ＣｏＡの縮合反応が行われる。この反応は、酵素のカルコンシンター ゼ（Ｃｌ（Ｓ）によって触媒される。この反応の生成物の２’、４．４’。

６′、テトラヒドロキシ−カルコンは、通常、差のカルコンフラバノンイソメラ ーゼ（ＣＨＩ）によって迅速に異性化されてナリンゲニンを生成する。続いてナ リンゲニンは、中央環の３位がフラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ２Ｏ）によ ってヒドロキシル化されてジヒドロケンフェノール（ＤＨＫ）を生成する。

Ｄ）ＩＫのＢ環のヒドロキシル化反応のパターンは、花弁の色を決定するのに重 要な役割を演する。そのＢ環は、３′位または３′位と５′位の両者がヒドロキ シル化されて、それぞれジヒドロクエルセチン（ＤＨＱ）およびジヒドロミリセ チン（ＤＨＭ）を生成する。この経路に関与する二つの鍵酵素はフラボノイド３ ′−ヒドロキシラーゼとフラボノイド３’、５’−ヒドロキシラーゼであり、両 者ともにシトクロムＰ４５０のクラスである。シトクロムＰ４５０酵素は自然界 に広く分布し、そして遺伝子は、を髄動物、昆虫、酵母、真菌、細菌および植物 から単離されて配列が決定されている。

フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼはＤＨＫに作用してＤＨＱを生成し、かつ ナリンゲニンに作用してエリオシクチオールを生成する。

ＤＨＱを還元してグリコジル化すると、シアニジングリコシドとベオニジングリ コシドの色素を生成し、これらの色素は多くの植物の種（例えばバラ、カーネー ションおよびキク）において、レッドとピンクの花色に寄与している。またこれ らのアントシアニン類が合成されて他の花色をもたらすこともある。例えばブル ーのヤグルマソウはシアニンを含有している。顕花植物中のフラボノイド経路に 関与する。フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ活性をまたは他の酵素を制御す る性能が得られれば、花弁の色を操作する手段が提供されるであろう。この手段 によって、単一の栽培品種の色が異なる変種が生成する可能性があり、かつ場合 によっては、単一種が広いスペクトルの色を生成することができるであろう。

本発明によって、フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子配列 が同定され次いでクローン化されたのである。これらの組換え配列によってＤＨ Ｋおよびナリンゲニンのような基質のヒドロキシル化反応を改変（ｍｏｄｕｌａ ｔｉｏｎ）することができ、アントシアニンの組成の修飾が行われ、その結果、 花弁の色を操作する手段が提供される。フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼが 存在すると、ＤＨＫから、シアニジンおよびペオニジンのようなアントシアニジ ン類のアンドシアニン誘導体への代謝経路を多様化させることができ、その結果 、３′−ヒドロキシル化反応のレベルを調節することによって花弁の色を操作す る手段が提供されるであろう。したがって本発明は、植物中のフラボノイド３′ −ヒドロキシラーゼ活性を変化させることに関し、この変化には、本発明の配列 を導入することによって、既存のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼの活性の レベルを上昇もしくは低下させることが含まれる。またフラボノイド３′−ヒド ロキシラーゼ活性のレベルを低下させることは、ダウンレギュレーション（ｄｏ ｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）と呼ぶこともできる。さらに本発明は、花の外に 、果実と野菜の植物および例えば観賞用植物の葉にまで広い範囲にわたっている 。したがって、本発明の一つの態様は、フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ酵 素（以後３′−ヒドロキシラーゼと呼ぶ）またはこの酵素の機能誘導体をコード するヌクレオチドの配列または該酵素またはその機能誘導体をコードする配列に 対して相補的なヌクレオチド配列からなる核酸単離体を提供するものである。

“核酸単離体”という用語は、天然では発生しない状態の遺伝子配列を意味する 。一般にこの用語は、その自然状態から逸脱した状態で単離されるか、または合 成されるか、または非自然的に発生する環境に誘導されることを意味する。さら に具体的に述べると、この用語には、生体外で形成されるかまたは保持される核 酸分子が含まれ、この分子としてはゲノムＤＮＡフラグメント、組換え分子もし くは合成分子、および非相同の核酸と組合わせた核酸がある。またこの用語には 、３′−ヒドロキシラーゼもしくはその一部を、そのプロモーターもしくは他の プロモーターに対して逆の配向でコードするゲノムのＤＮＡもしくはｃＤＮＡま たはその一部も含まれる。さらにこの用語には、他の核酸配列について少なくと も部分的に精製した後に天然に生成する配列も含まれる。

“遺伝子配列”という用語は本願では最も一般的な意味で用いられ、３′−ヒド ロキシラーゼのアミノ酸配列を、直接にまたは相補的シリーズの塩基によって特 定する連続シリーズのヌクレオチド塩基を含む。このようなアミノ酸の配列は、 全長の３′−ヒドロキシラーゼもしくはその端を切り取った活性形態で構成され ているかまたは該酵素のＮ末端、Ｃ末端もしくは内側部分のような特定の領域と 一致することもある。また本願で目標としている核酸配列には、遺伝子プローブ として、または植物中で対応する遺伝子の発現を調節することができる“アンチ センス７分子として有用なオリゴヌクレオチドが含まれている。本願で用いる“ アンチセンス分子”という用語には、そのプロモーターもしくは他のプロモータ ーに対して逆配向の構造ゲノム遺伝子もしくは構造ｃＤＮＡ遺伝子またはその一 部からなる遺伝子構造体が含まれている。

一つの実施態様では、３′−ヒドロキシラーゼまたはその各種機能誘導体をコー ドする核酸配列を用いて、内因性３′−ヒドロキシラーゼの活性を低下させるか 、または代わりに上記酵素をコードする核酸配列またはその各種誘導体もしくは 一部をアンチセンス配向で用いて３′−ヒドロキシラーゼの活性を低下させる。

本発明をいかなる一つの原理に限定することも望まないが、アンチセンス３′− ヒドロキシラーゼの転写物またはそのフラグメントもしくは一部（例えばオリゴ ヌクレオチド分子）は、該酵素に対して特定される天然産のｍＲＮＡのすべても しくは一部と二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）を形成して、ｍＲＮＡの蓄積もしくはｍＲ ＮＡから活性酵素への翻訳を防止できるであろう。さらに別の態様では、リボザ イム類を用いて、標的の核酸配列を不活性化することができるであろう。

フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼの活性を変化させることを本願で述べる場 合は、活性の通常の内因性または既存のレベルより高くもしくは低く、活性を３ ０％まで上昇もしくは低下させるか、またはより好ましくは３０〜５０％または さらに好ましくは５０〜７５％またはさらに一層好ましくは７５％以上上下させ ることである。活性のレベルは、５ｔｏｔｚおよびＦｏｒｋｍａｎｎの１９８２ 年の報告に記載されている方法を改変した方法を用いて容易に検定することがで きる（実施例１参照）。

本発明の核酸としては、リボ核酸またはデオキシリポ核酸であって一本鎖もしく は二本鎖で直鎖もしくは共有結合で閉環した環状分子がある。その核酸分子とし てはｃＤＮＡが好ましい。さらに本発明には、低い緊縮（ストリンジェント）条 件下、好ましくは中位の緊縮条件下および最も好ましくは高い緊縮条件下で、本 発明の核酸分子および特に図５に示すヌクレオチドの配列またはその一部分もし くは領域とハイブリダイズする他の核酸分子も含まれる。その最も好ましい実施 態様において、本発明には、図５に示すヌクレオチド配列を有する核酸分子、ま たは図５に示す配列の少なくとも一つ以上の領域に対するヌクレオチドもしくは アミノ酸の配列のレベルで類似度（ｓ　ｉｍｉ　ｆａｒ　ｉ　ｔｙ）が少なくと も４０％、好ましくは少なくとも４５％、さらに好ましくは少なくとも５５％、 さらにより好ましくは少なくとも６５〜７０％、およびさらに一層好ましくは８ ５％より大きい分子が含まれ、かつその核酸は、３′−ヒドロキシラーゼ活性を 有する酵素をコードしているか、またはかような酵素をコードする配列に相補的 である。しかし、上記のヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列は、類似度が上記 百分率より低くしかも３′−ヒドロキシラーゼ活性を有している場合もあること に留意すべきであり、そして、このような分子は配列を保存する領域を有し、本 発明の範囲に含まれると考えられる。さらに本発明には、低い緊縮（ストリンジ ェント）条件下、好ましくは中位の緊縮条件下および最も好ましくは高い緊縮条 件下で、上記の核酸分子および特に図５に示す核酸分子の一部分とハイブリダイ ズできるオリゴヌクレオチドのプライマーもしくはプローブの形態の核酸分子が 含まれる。上記の一部分は好ましくはその遺伝子の５′末端もしくは３′末端に 相当する。便宜上本発明では、上記５′末端は、実質的に構造遺伝子配列の出発 コドンおよび該遺伝子の中央部分の間の領域を形成していると考えられ、かつ上 記３′末端は、実質的に該遺伝子の中央部分および構造遺伝子配列の終止コドン の間の領域を形成していると考えられる。それ故に、オリゴヌクレオチドもしく はプローブは上記５′末端もしくは３′末端または５′末端および３′末端の両 者に共通の領域とハイブリダイズできることは明らかである。本発明にはさらに かようなプローブはすべて含まれる。好ましいオリゴヌクレオチドは実施例１で 述べる。

前記核酸またはその相補形は全長の酵素またはその一部分もしくは誘導体をコー ドできる“誘導体”という用語は、天然の酵素に対して、単一もしくは多数のア ミノ酸の置換、欠失および／または付加がなされしかも３′−ヒドロキシラーゼ 活性を有する酵素を意味する。この点について、その核酸は３′−ヒドロキシラ ーゼをコードする天然産ヌクレオチド配列を含有しているか、または前記天然配 列に対して単一もしくは多数のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加が なされた配列を含有している場合がある。また本発明の核酸またはその相補形は 、活性もしくは不活性にかかわず、３′−ヒドロキシラーゼの“一部”をコード する場合があり、そしてこのような核酸分子は、オリゴヌクレオチドのプローブ 、ポリメラーゼ連鎖反応もしくは各種の突然変異誘発法に用いるプライマーとし て、またはアンチセンス分子の生成に用いるのに有用であろう。

本発明の３′−ヒドロキシラーゼのアミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および ／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一もしくは多数のアミノ酸の配列 内挿入がある。挿入アミノ酸配列の変異体は、一つ以上のアミノ酸残基がそのタ ンパク質の予め決められた部位に導入された変異体があるが、ランダム挿入も得 られた生成物を適切にスクリーニングすることによって可能である。欠失変異体 は、その配列から一つ以上のアミノ酸が除去されていることが特徴でる。置換ア ミノ酸の変異体は、その配列中の少なくとも一つの残基が除去され次いでその位 置に異なる残基が挿入された変異体である。典型的な置換は、表１にしたがって 行われる置換である。

３′−ヒドロキシラーゼがアミノ酸置換によって誘導体化される場合、そのアミ ノ酸は一般に類似の特性、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、かさ高な側鎖な どを有する他のアミノ酸で置換される。

アミノ酸置換は一般に単一残基の置換である。アミノ酸の挿入は通常的１−１０ 個のアミノ酸残基のオーダーで行われ、および欠失は約１〜２０個の残基の範囲 内で行われる。欠失または挿入は隣接する対で行うのが好ましく、すなわち２個 の残基の欠失または２個の残基の挿入が好ましい。

上記のアミノ酸変異体は、当該技術分野で公知のペプチド合成法、例えば固相ペ プチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの１９６４年の文献）などを用い、または 組換えＤＮＡ操作法によって容易に製造することができる。

公知の配列または一部公知の反応を有するＤＮＡの予め決められた部位に置換変 異を行う方法は公知であり、例えばＭ１３突然変異変異性がある。置換、挿入も しくは欠失の変異体として出現する変異体タンパク質を産生ずるＤＮＡ配列操作 法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献に便利に記載されている。

表１ アミノ酸置換を行うのに適切な残基 Ａｓｎ　Ｇｉｎ　；Ｈｉｓ Ｇｉｎ　Ａｓｎ Ｇｌｕ　Ａｓｐ ＧＩＹ　Ｐｒ。

１ｉｓ　Ａｓｎ　；Ｇｉｎ ＋１ｅ　Ｌｅｕ　；Ｖａｌ ｌｅｕ　ｌｉｅ　；Ｖａｌ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　；　Ｇｉｎ　；　ＧｌｕＭｅｔ　Ｌｅｕ　；　ｌ１ｅ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　；　Ｌｅｕ　；　ＴｙｒＴｙｒ　Ｔｒｐ　；　Ｐｈｅ Ｖａｌ　ｌｉｅ　；Ｌｅｕ 本発明の３′−ヒドロキシラーゼの組換えもしくは合成の変異体および誘導体の 他の例としては、炭水化物、脂質および／またはタンパク質またはポリペプチド のような、本発明の酵素に関連する０ずれかの分子の単一もしくは多数の置換、 欠失および／または付加を行ったものがある。

また“類似体”および“誘導体”という用語には、３′−ヒドロキシラーゼと化 学的機能が同等のものおよび上記のアミノ酸誘導体も含まれる。便宜上、本願に おいて“３′−ヒドロキシラーゼが引用された場合は、変異体、誘導体、類似体 、同族体またはそのフラグメントの引用が含まれる。

本発明はペチュニア由来の核酸配列を用いて例示するというのは、ペチュニアは 現在、最も便利でかつ好ましい材料源であるからである。しかし当該技術分野の 当業者には、類似の配列を、他の植物またはある種の微生物のようないくつかの 起源から単離できることが直ちに分かるであろう。他の植物の例としては、限定 されないが、カーネーション、キク、バラ、トウモロコシ、キンギョソウ、タバ コ、ヤグルマソウ、テンジクアオイおよびアサガオがある。フラボノイド経路の 酵素および特に３′−ヒドロキシラーゼを直接にもしくは間接的にコードするか ような核酸配列はすべて、その起源にかかわらず本発明に含まれる。

本願で目的とする核酸分子は、どちらかの配向にて、単独で、または例えば発現 ベクターのようなベクター分子と組合わせて存在していてもよい。ベクター分子 という用語は、その最も広い意味で用いられ、核酸を植物細胞中に移入させ易く することができおよび／または植物ゲノム中に組込み易くすることができる、核 酸分子に対する中間伝達体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　ｖｅｈｉｃｌｅ）が含 まれる。中間伝達体は、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクト タイルボンバードメント（ｍｉｃｒｏ　ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄ ｍｅｎｔ）アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ＋ｒ＋＋＋）媒介によ る移入、またはＤＮＡウィルスもしくはＲＮＡウィルスによる挿入の場合に使用 するよう構成されている。

中間伝達体および／またはその中に含有されている核酸分子は植物ゲノム中に安 定して組込まれる必要がある場合またはこのような必要がない場合がある。また このようなベクター分子は原核細胞内で複製および／または発現できる。このベ クター分子またはその一部分は植物のゲノム中に組込むことができることが好ま しい。該核酸分子はさらに、その核酸分子を植物細胞内で発現させることができ るプロモーターを含有している。また該核酸分子とプロモーターは、先に述べた ような多くの手段によって細胞内に導入することができる。

本発明によれば、３′−ヒドロキシラーゼまたはその誘導体もしくは一部分をコ ードする核酸配列を、植物中にどちらかの配向で導入し発現させ、その結果、Ｄ ＨＫおよび／または他の適切な基質を、これらが植物細胞内で合成されている場 合、最終的にアンドシアニジン類例えばシアニジンおよび／またはペオニジンの アントシアニン誘導体に変換させるか、または代わりに内因性のもしくは既存の ３′−ヒドロキシラーゼ活性を低下させるかもしくは除くことによって代謝生成 物の上記のような変換を阻害する手段が提供される。

アントシアニン類の産生はレッドまたはブルーの花色の生成に寄与している。植 物中いずれかの配向での核酸配列の発現は、構成的、誘導性または発達性であり および組織特異的な場合もある。発現という用語はその最も広い意味で用いられ 、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質両者の産生も含まれる。またこの用語 には核酸分子の部分的発現も含まれる。

本発明の上記態様によって、３′−ヒドロキシラーゼまたはその活性な変異体も しくは誘導体を合成することができる形質転換植物の製造方法が提供される。そ してその製造方法は、３′−ヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチドの配列 からなる核酸分子を最終的に発現させることができる条件下で、適切な植物の細 胞を前記核酸分子で安定に形質転換し、得られた細胞から形質転換植物を再生さ せ、次いで該核酸を発現させるのに充分な時間と条件下で前記形質転換植物を成 長させる方法である。その結果、形質転換植物は、対応する非形質転換植物で発 現される量に比べて高いレベルの３′−ヒドロキシラーゼ活性を生成することが できる。

本発明の他の態様では、内因性のもしくは既存の３′−ヒドロキシラーゼ活性が 低い形質転換植物の製造方法が提供され、その製造方法は、３′−ヒドロキシラ ーゼをコードするヌクレオチドの配列または３′−ヒドロキシラーゼをコードす る配列に対して相補的なヌクレオチドの配列からなる核酸分子で、適切な植物の 細胞を安定に形質転換し、得られた細胞から形質転換植物を再生させ、次いで必 要な場合、前記核酸を発現させるのに充分な条件下で前記形質転換植物を成長さ せることを含んでなる方法である。

本発明の他の態様では、内因性のもしくは既存の３′−ヒドロキシラーゼ活性が 低い、遺伝子が修飾された植物の製造方法が提供され、その製造方法は、適当に 変化させ、植物細胞に導入した３′−ヒドロキシラーゼ遺伝子またはその誘導体 もしくは一部分から、その３′−ヒドロキシラーゼ遺伝子を、相同性組換えによ りその内因性配列を修飾することによって変化させ、次いで得られた遺伝子修飾 植物を上記細胞から再生させることを含んでなる方法である。

好ましい実施態様で、本発明は変化した花の特性を示す形質転換顕花植物の製造 方法を提供するものである。そしてその製造方法は、適切な植物の細胞を本発明 の核酸配列で安定に形質転換し、得られた細胞から形質転換植物を再生させ、次 いで前記核酸配列に３′−ヒドロキシラーゼ酵素を発現させるのに充分な時間と 条件下で前記形質転換植物を成長させることを含んでなる方法である。あるいは 前記の方法は、適切な植物の細胞を本発明の核酸配列またはその相補的配列で安 定に形質転換し、得られた細胞から形質転換植物を再生させ、次いで内因性のも しくは既存の３′−ヒドロキシラーゼの活性のレベルを変化させるのに充分な時 間と条件下で、前記形質転換植物を成長させることを含んでなる方法でもよい。

その変化させるレベルは、比較しうる非形質転換植物の３′−ヒドロキシラーゼ 活性の内因性のもしくは既存のレベルより低いことが好ましいであろう。本発明 を限定することは望まないが、作用モードの一つの原理は、内因性３′−ヒドロ キシラーゼ活性を低下させるには、導入された核酸配列またはその相補的配列を 発現させる必要があるということである。しかし、導入された遺伝子配列または その相補的配列の発現は、所望の作用すなわち変化した花の特性を示す顕花植物 を達成するのに必要でないことがある。

関連する実施態様で、本発明は花の特性が変化した顕花植物の製造方法を提供す るものであり、その製造方法は、適当に変化させ、植物細胞に導入した３′−ヒ ドロキシラーゼ遺伝子またはその誘導体もしくは一部分から、その３′−ヒドロ キシラーゼ遺伝子を、相同的組換えによりその内因性配列を修飾することによっ て変化させ、次いで遺伝子を修飾された植物を前記細胞から再生させることを含 んでなる方法である。

本発明の核酸分子は、発育段階で調節されることがありまたは調節されないこと がある。変化させた花は好ましくは受容植物（ｒｅｃｉ−ｐｉｅｎｔ　ｐｌａｎ ｔ）の生理的状態によって、レッドの花または他の色合い（ｃｏｌｏｒ　５ｈａ ｄｅ）を産生ずる。“受容植物”という用語は、３′−ヒドロキシラーゼ酵素に 対する基質または３′−ヒドロキシラーゼ酵素自体を産生ずることができ、かつ 所望の色を発生させるのに必要な適切な生理学的特性および遺伝子型をもってい る植物を意味する。

受容植物としては限定はないが、ペチュニア、カーネーション、キク、バラ、キ ンギョソウ、タバコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイ、リシアンタス（Ｉｉｓｉ ａｎｔｈｕｓ）およびアサガオがある。

したがって、本発明には、３′−ヒドロキシラーゼまたはその一部分をコードす るか、または３′−ヒドロキシラーゼの調節を行う必要がある場合に任意に転写 可能な１ＩＩＲＮＡ分子のすべてまたは一部に実質的に相補的な核酸配列を有す る組換え遺伝子を発現できる形質転換植物の製造方法が含まれ、その製造方法は 、必要な場合に、３′−ヒドロキシラーゼまたはその誘導体もしくは一部分をコ ードするヌクレオチドの配列、または３′−ヒドロキシラーゼまたはその誘導体 もしくは一部分をコードする配列に対して相補的ヌクレオチドの配列からなる核 酸単離体（ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　１ｓｏｌａｔｅ）を最終的に発現させる 条件下で、該核酸単離体によって、適切な植物の細胞を安定に形質転換し、次い で該細胞から形質転換植物を再生させることを含んでなる方法である。

当該技術分野の当業者であれば、例えば標的植物中に天然に存在する酵素の発現 を増減させてレッドの異なる色合いのような異なる色合いをもたらすような本発 明の方法に適用しつる変法は直ちに分かるであろう。

それ故に、本発明には、本発明の核酸配列のすべてもしくは一部を含有するすべ ての形質転換植物および／またはその相同もしくは類縁の形態またはこれらのい ずれかのアンチセンス形態および特に変化した花の特性を示す形質転換植物が含 まれる。これらの形質転換植物には、３′−ヒドロキシラーゼをコードするヌク レオチド配列または３′−ヒドロキシラーゼをコードする配列に相補的なヌクレ オチド配列を含んでなる核酸分子が導入されているであろう。一般にこの核酸配 列は植物のゲノムに安定に導入されるが、また本発明には、植物細胞内で複製で きるＤＮＡウィルスもしくはＲＮＡウィルスのような自発的に複製する核酸配列 内に３′−ヒドロキシラーゼのヌクレオチド配列を導入することも含まれる。ま た本発明には、このような形質転換植物の種子も含まれる。このような種子は、 特に着色している場合、植物の商標標識（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ　ｔａｇ）と して有用である。

本発明の別の態様は組換え形の３′−ヒドロキシラーゼに関する。

組換え形のこれらの酵素は、例えば一層活性が強い酵素を開発する研究を行うの に用いる材料源を提供し、かつ着色化合物を産生ずる生体外の系を開発するのに 有用であろう。

さらに別の態様で、本発明は、植物中で、３′−ヒドロキシラーゼ酵素を発現で きるか、または内因性３′−ヒドロキシラーゼをダウンレギュレー）　（ｄｏｗ ｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）できる遺伝子構造体を製造する場合の上記遺伝子配列の 用途が含まれる。

本発明は、以下の図面と実施例を参照してさらに説明するが、本発明を限定する ものではない。

図面中の図１は、フラボノイド色素の生合成経路の概略図である。

この経路の最初のパートに関与している酵素は下記のとおりである。

ＰＡＬ　＝フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、Ｃ４Ｈ＝シンナメート４−ヒ ドロキシラーゼ、　４ＣＬ　＝　４−フマレート：　ＣｏＡリガーゼ；ＣＲ２＝ カルコンシンターゼ、ＣＨ１＝カルコンフラバノンイソメラーゼ、　Ｆ３Ｈ＝フ ラバノン３−ヒドロキシラーゼ、ＤＦＲ＝ジヒドロフラボノール−４−レダーク ターゼ、　ＵＦＧＴ＝ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド−３−〇−グルコシル ートランスフェラーゼ。後のステップはピー・ハイブリダ（Ｐ、　ｈｙｂｒｉｄ ａ）の花に起こる変換に対応し、各番号は次のことを意味する。１＝シアニジン −３−グリコシドおよびデルフイニジンー３−グリコシドのグルコシル残基への ラムノース糖の付加反応；２＝モ ３＝３′メチル化反応；　４＝５’メチル化反応；５＝３’、５’メチル化反応 。

図２（Ａ）は、ｃＤＮＡライブラリー＃ｌをプローブして以下のシトクロムＰ　 ４５０同族体を同定するのに用いるＤＮＡフラグメントの概略図である。Ｐ２Ｓ ５　：黒四角印で示すヘム結合領域（Ｈａｅｍ）を有する、一般的なシトクロム （ｇｅｎｅｌａｌｌｚｅｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）　Ｐ２Ｓ５　ｃＤＮＡクロ ーン；　ｐｃＧＰＩ４２　：　ｐｃＧＰ１４２　ＤＮＡを鋳型として用い、オリ ゴ１と２テＰＣＲを行うことによって９８０ｂｐのフラグメントが得られた。ｐ ＣＧＰ１４７　：ｐｃＧＰ１４７をＳａｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩで消化することに よって１．３ｋｂのフラグ）　：／　トカｊｌｌｌサレタ；　ｐｃＧＰ１５８　 ：　ｐｃＧＰ１５８　ＤＮＡを鋳型としテ用イ、オリゴ３と４でＰＣＲを行うこ とによって９００　ｂｐのフラグメントが得られた。、　ｐｃＧＰ１６０　：　 ｐｃＧＰ１６０をＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＶで消化することにヨッテ６００ｂｐ ノフラクメントカ単離サレタ；　ｐＣＧＰ４５４　：　ｐＣＧＰ４５４　ＤＮＡ を鋳型として用い、オリゴ３と５でＰＣＲを行うことによってフラグメントが得 られた。精製したすべてのフラグメントには、実施例１に記載したようにして” Ｐ−ｄＣＴＰの標識を付けた。

図２　（Ｂ）　−２（Ｈ）は、（ｉ　）　ｐｃＧＰ１４２、（ｉｉ　）　ｐｃＧ Ｐ１４７、（ｉｉ　）　ｐｃＧＰ１５８、（ｉｖ）　ｐｃＧＰ１６０および（ｖ ）　ｐＣＧＰ４５４由来のｃＤＮＡ挿入断片に対する部分ヌクレオチド配列と対 応する予想アミノ酸翻訳生成物を示す。ｃＤＮＡライブラリー＃１をプローブし て関連クローンを単離するのに使用した領域を矢印で示した。

図３（Ａ）〜３（Ｄ）は、ｐｃＧＰ６０２由来（７）　ｃＤＮＡ挿入断片に対す るヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。内部の旧ｎｃ　Ｕ　−ＥｃｏＲ Ｖ部位とＥｃｏＲＶ　−ＨｉｎｄＩ［１部位の間の配列を含有する二つのプロー ブを用いて、一群のシトクロムＰ　４５０同族体中の関連配列を同定した。

図４　（Ａ）は、１）　ｐｃＧＰ１６１　；　２）　ｐｃＧＰ１６２　；　３） 　ｐｃＧＰ１６３　；４　）　ｐｃＧＰＩ６５　；　５　）　ｐｃＧＰＩ６６　 ；および６）　ｐｃＧＰ１６７由来のｃＤＮＡ挿入断片に対する部分ヌクレオチ ド配列を示し、図４（Ｂ）は７　）　ｐｃＧＰ１６８　；　８　）　ｐｃＧＰ１ ６９　；　９　）　ｐｃＧＰ１７１および１０）　ｐｃＧＰ１７３由来のｃＤＮ Ａ挿入断片に対する部分ヌクレオチド配列を示す。これらのすべてのクローンの ｃＤＮＡ挿入断片を含有する混合プローブを使用して、ｃＤＮＡライブラリー＃ ２をスクリーニングし関連配列を得た。

図５はｐｃＧＰ６１９由来のｃＤＮＡ挿入断片に対するヌクレオチド配列と予想 アミノ酸配列である。

図６はｐｃＧＰ６１９の制限酵素地図の線図を示す。そのｃＤＮＡ挿入断片の部 分長さを、（矢印に対置させて）実線の末端部を有する肉太直線で示す。これら をＭ１３−ｍｐ１８とｍｐ１９中にサブクローン化し、次いで上記のヌクレオチ ドブライマーの配列を用いて配列を決定して、オーバラップしている配列の情報 を得た。サブクローン化した各ピースから得た配列情報の程度と方向を矢印で示 す。特にことわらないかぎりプライマー４０を使用した。１９０＝プライマー配 列１９０；１９１　＝プライマー配列１９１　、ポリＴ＝ポリＴオリゴヌクレオ チドをプライマーとして使用した；　ｄｓ　５ｅｑ＝配列は二本鎖ＤＮＡで読取 った。

ＡＴＧはメチオニン開始コドンを示し、およびそのクローンの全長を塩基対の数 で示す。

図７は、基質として３Ｈ−ナリンゲニンを用いて、酵母エキスの３′〜ヒドロキ シラーゼを検定した結果を示す。オートラジオグラフは、プラスミドｐｃＧＰ６ ２１で形質転換された酵母（１，２）の大きさによって３Ｈ−ナリンゲニンが３ ′−ヒドロキシル化誘導体のエリオシクチオールに変換することを示している。

非形質転換酵母（Ｃ）には３′−ヒドロキシラーゼ活性は全く検出されなかった 。

図８はｐＣＧＰ６３５由来の挿入断片に対するヌクレオチド配列と予想アミノ酸 配列を示す。これらの配列は、バラの推定３′−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡクロ ーンを単離する場合にプローブとして用いることができる。

図９はｐＣＧＰ７７２由来の挿入断片に対するヌクレオチド配列および予想アミ ノ酸配列を示す。これらの配列はカーネーションの推定３′−ヒドロキシラーゼ ｃＤＮＡクローンを単離する場合にプローブとして用いることができる。

図１ＯはｐＣＧＰ７７３由来の挿入断片に対するヌクレオチド配列および予想ア ミノ酸配列を示す。これらの配列はカーネーションの推定３′−ヒドロキシラー ゼｃＤＮＡクローンを単離する場合にプローブとして使用できる。

図１１はｐＣＧＰ８５４由来の挿入断片に対するヌクレオチド配列および予想ア ミノ酸配列を示す。これらの配列は推定３′−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡクロー ンを選択するのにプローブとして用いた。下線をつけたアミノ酸は、ｐｃＧＰ６ １９由来の９７１位と１０９１位の間のｃＤＮＡ挿入断片のアミノ酸と同一であ る。

プラスミドｐｃＧＰ８０９を含有する非武装化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）微生物のア グロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）の菌株ＡＧＬＯは、オーストラリア、２０３７、ニューサウス ウェールズ州、ピンプル、スアキン・ストリートｌに所在のｔｈｅ　Ａｕ５ｔｒ ａｌｉａｎ　Ｇｏｖｅｒ−ｎｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓに、１９９３年３月２４日付けで受託番号にて寄託した。

実施例１ ３′−ヒドロキシラーゼおよび関連核酸配列の単離エリオシクチオールはＣａｒ ｉ　Ｒｏｔｈ　ＫＧ社から入手し、ナリンゲンはＳ　ｉ　ｇｍａ社から入手した 。〔３Ｈ〕ナリンゲニン（Ｓ、　７　Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）はＡｍｅｒｓｈａｍ社 から入手した。酵素はすべて商業的供給源から入手し、メーカーの指示にしたが って使用した。

細菌の菌株 使用した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）菌株は以下のとおりであ る。

ＤＨ５ａ　５ｕｐＥ４４．Δ（ｌａｃＺＹＡ−ＡｒｇＦ）０１６９．φ８０Ｌａ ｃＺΔＭ１５゜ｈｓｄＲ１７（ｒｘ　、Ｌ　＋）、　ｒｅｃＡｌ、ｅｎｄＡｌ、 ｇｙｒＡ９６．　ｔｈｉ−１゜ｒｅｌＡｌ、　ｄｅｏＲ，（Ｈａｎａｈａｎ、の １９８３年の文献およびＢＲＬの１９８６年の文献） ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　５ｕｐＥ４４．　ｈｓｄＲ１７（ｒｇ　−、ｌｌ１ｋ”　） ＋　ｒｅｃＡｌ、　ｅｎｄＡＩ。

ｇｙｒＡ９６．　ｔｈｉ−１，ｔｅｌＡｌ、　１ａｃ−、［Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、 ＩａｃｌＱ。

１ａｃＺΔＭ１５．　ＴｎｌＯ（Ｌｅｔ’　）］（Ｂｕｌｌｏｃｋらの１９８７ 年の文献）ＰＬＫ−Ｆ　’　ｒｅｃＡ、　ｈｓｄＲ１７（ｒＫ　−、ｍ、　”　 ）、　ｍｃｒＡ、　ｍｃｒＢ、　ｌａｃ。

５ｕｐＥ４４．　ｇａｌＫ２．　ｇａｌＴ２２．　ｌｌ１ｅｔＢ１．［Ｆ　’　 ｐｒｏＡＢ、１ａｃｌ’ＩａｃＺΔＭ１５．　ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’　）］　（ス トラタジェン社）ＳＯＬＲＣ１４（ｍｃｒＡ）、Δ（ｍｃｒｃＢ−ｒｓｄＳＭＲ −１ＩＩｒｒ）１７１．５ｂｃＣ，ｒｅｃＢ、　ｒｅｃＪ。

ｕｍｕｃ：　：　Ｔｎ５　（ｋａｎ’　）、ｕｖｒＣ，ｌａｃ、　ｇｙｒＡ９６ ．　ｔｈｉ−１，ｒｅｌＡｌ。

［Ｆ’　ｐｒｏＡＢ、　１ａｃｌＱＺΔＭ１５］、　Ｓｕ　（非抑制性）（スト ラタジエン社） 非武装化アグロバクテリウム・ツメファシェンス菌株ＡＧＬＯ（Ｌａｚ。

らの１９９１年の文献）は、Ｒ，Ｌｕｄｗｊｇ　（米国、カリフォルニア州、サ ンタ・クルーズ所在のカリフォルニア大学、生物学部）から入手した。

クローニングベクターｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔはストラタジエン社から入手した 。

大腸菌およびＡ、ツメファシェンスの形質転換大腸菌菌株ＤＨ５ａ細胞の形質転 換をＩｎｏｕｅらの１９９０年の報告の方法にしたがって実施した。

５０ｍＬのＭＧ／　Ｌ　（Ｇａｒｆ　１ｎｋｅｌおよびＮｅ５ｔｅｒの１９８０ 年の文献）培地に接種し、次に２８℃で振盪しながら１６時間増殖させることに よって調製したコンピテントＡＧＬＯ細胞１００ｍＬに、プラスミドＤＮＡ５ｎ ＋ｇを添加することによって、プラスミドｐｃＧＰ８０９をアグロバクテリウム ・ツメファシェンス菌株ＡＧＬＯ中に導入した。次にこれらの細胞をペレット化 し次いで８５％（Ｖ／Ｖ）　１００ｍＭ　ＣａＣ１＝　／１５％（Ｖ／Ｖ）グリ セリンの０．５＋ｎＬ中に再懸濁させた。得られたＤＮＡ−アグロバクテリウム 混合物を、液体窒素中で２分間インキュベートすることによって凍結し、次に３ ７℃にて５分間インキュベートすることによって解凍させた。そのＤＮＡ　／細 菌混合物をさらに１０分間氷上に置いた。次いでその細胞をＭＧ／Ｌ培地１培地 １混Ｌし、２８℃で振盪しながら、１６時間インキュベートした。ｐｃＧＰ８０ ９を保有するエイ・ツメファシェンスの細胞を、１００　ｍｇ／ｍＬのゲンタマ イシンを含有するＭＧ／Ｌ寒天プレート上で選択した。ｐｃＧＰ８０９が存在す ることは、ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したＤＮＡをサザーン分析す ることによって確認した。

植物の材料 ペチュニアのＦ１雑種“Ｏｌｄ　Ｇｌｏｒｙ　Ｂｌｕｅ″（ＯＧＢ）の種子を米 国のＢａ１ｌ　５ｅａｄ社から入手した。

クリサンセマム・モリホリウム（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕａ＋　ｍｏｒｉｆｏ ｌｉｕｍ）の栽培品種を、ビクトリア州所在のＢａｇｕｌｅｙ　Ｆｌｏｗｅｒ　 ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｅｒｓ社から得た。

グイアンタス・キャリオフィルスＣＶ、ラグナ（Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏ ｐｈ−ｙｌｌｕｓ　ｃｖ、　Ｌａｇｕｎａ）およびローザ・ハイブリダｃｖ、カ ーディナル（Ｒｏｓａ　ｈｙｂｒｉｄａ　ｃｖ、Ｋａｒｄｉｎａｌ）は、ビクト リア州所在のＶａｎ　Ｗｙｋ　ａｎｄＳｏｎ　Ｆｌｏｗｅｒ　５ｕｐｐｌｙ社か ら入手した。

植物は、最小１０．０００ルツクスの光強度の１４時間の日長（ｄａｙ　ｌｅｎ ｇｔｈ）でかつ２２〜２６℃の温度にて特殊成長室内で栽培した。

ペチュニアの花の発育５段階は以下のように定義した。

段階ｌ：未着色の閉じたつぼみ（長さは＜　２５ｍｍ）。

段階２：着色し閉じたつぼみ（長さは２５〜３５ｍｍ）。

段階３：花冠が現れた黒紫色のつぼみ（長さは＞　３５ｍｍ）。

段階４：まだ開やくしていない黒紫色の開いた花（長さは＞　５０ｍｍ）。

段階５：すべてのやくが開きかつ充分に開いた花。

キクの花の発育の段階は以下のように定義した。

段階０：花のつぼみは目視できない。

段階１：花のつぼみが目視できる：小花はほうによって完全に覆われている。

段階２：花のつぼみが開いている：小花の先端が目視できる。

段階３；小花がしっかりと重なり合っている。

段階４：はとんどすべての小花の先端が露出した。外側の小花は開いているがど れも水平ではない。

段階５：外側の小花は水平である。

段階６：花は成熟に近づいている。

グイアンタス・キャリオフィルスの花の発育の段階は次のように定義した。

段階１：花のつぼみは目視できない。

段階２：花のつぼみが開いている：小花の先端が目視できる。

段階３：はとんどすべての小花の先端は露出した。外側の小花は開いているがど れも水平でない。

段階４：外側の小花は水平である。

ローザ・ハイブリダの花の成長の段階を以下のように定義した。

段階ｌ：未着色の固く閉じたつぼみ（高さがＩＯ−１２ｍｍＨ幅が５ｍｍ）。

段階２：着色し固く閉じたつぼみ（高さ１５ｍ＋ｎ　；幅９　ｍｍ）。

段階３：着色し閉じたつぼみ；がく片が丁度開き始めようとしている（高さが２ ０〜２５ｍｍＨ幅が１３〜１５ｍ＋＋＋）。

段階４：花のつぼみが開き始めている；花弁が濃く着色しかく片が分離した（つ ぼみ；高さが２５〜３０ｍｍで幅が１８＋ｎｎ＋）。

段階５：がく片が完全に開き、そのいくつかはカールしている。

花弁は濃色に着色して開きつつある（つぼみは高さが３０〜３３ｍｍで幅が２０ ＋ｎｍである）。

ｃＤＮＡライブラリー＃１の構築 段階３〜４のペチュニアｃｖ、　ＯＧＢの花のげん部（ｆｌｏｗｅｒ　ｌｉｍｂ ）の組織２０ｇを、１０ｍＭバナジルリポヌクレオシドコンプレックスを含有す るＦＥＢ（２００ｍＭ　）リス−〇ＣＩ（ｐＨ８，６）、６０ａ＋Ｍ　ＫＣＩ、 ３０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２５ｍＭＥＧＴＡ）　Ｉ００ｍＬ中にホモジナイズした 。得られたホモジネートを、滅菌Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ 社）で濾過することによって細胞残査を除いた。Ｕｌｔｒａ−Ｃ１ｅａｙ（登録 商標）　Ｑｕｉｃｋ−８ｅａｌ　（登録商標）　（Ｂｅｃｋｍａｎ社）遠心分離 管に入れた、２５％（Ｗ／Ｖ）スクロースと２５０単位のＩｎｈｉｂｉｔ　Ａｃ ｅ　（５−Ｐｒｉ＋ｎｅ　３−Ｐｒｉｍｅ）を含有する、ＦＥＢ６ｍＬおよび５ ０％（Ｗ／Ｖ）スクロースと２５０単位のＩｎｈｉｂｉｔ　Ａｃｅを含有するＦ ＥＢ６ｍＬの段階勾配の上面に、得られた濾液を層状に入れた。これらの管を、 ７０Ｔｉロータで２６．　ＯＯＯｒｐｍにて３．５時間遠心分離した。膜結合ポ リソームを、２５％スクロース１５０％スクロースの界面から集めて４Ｍイソチ オシアン酸グアニジニウム溶液に添加した。得られた変性ポリソームを、Ｔｕｒ ｐｅｎおよびＧｒｉｆｆｉｔｈの１９８６年の文献に記載されているようにして ５．７　Ｍ　ＣｓＣｌのクッションによってペレット化して、該ポリソームから ＲＮＡを単離した。

Ｕｎｉ−ＺＡＰ　（登録商標）　ＸＲベクターキット（ストラタジエン社）を使 用し、ポリソームのＲＮＡ　２５μｇを鋳型として用いてＺＡＰ中に方向性ｃＤ ＮＡライブラリーを構築した。その−次ライブラリーは、２５０．０００のプラ ーク形成単位（ｐｆｕ）を含有していたが、ＮＺＹプレート上で一夜増殖させる ことによって増幅しくＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献）、次いでその増 幅されたファージストック（ｐｈａｇｅ　５ｔｏｃｋ）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら の１９８９年の文献に記載されているようにして、ＰＳＢ　（１００＋ｎＭ　Ｎ ａＣ１：８　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋、５０１ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５ ）　、０．０１％（Ｗ／　Ｖ　）ゼラチン）中で溶出させた。

ｃＤＮＡライブラリー＃２の構築 ＴｕｒｐｅｎおよびＧｒｉｆｆｉｔｈの１９８６年の文献の方法を用い、ビー・ ハイブリダｃｖ、　ＯＧＢの段階３〜４の花の花弁組織から全ＲＮＡを単離した 。

オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィー（Ａｖ　ｉ　ｖおよびＬｅｄｅｒの １９７２年の文献）を３サイクル実施することによって、上記全ＲＮＡがらポリ （Ａ）　”　ＲＮＡを選択した。

ポリ（Ａ）″ＲＮＡ２μｇを、１　ｘ　５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　（登録商標） 反応緩衝液、１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５００　ｕＭ　ｄＡＴＰ 　、５００μＭ　ｄＧＴＰ、　５００　ｕＭ　ｄＴＴＰ　、　５００　μＭ５− メチルーｄＣＴＰ１０．７５μｇオリゴヌクレオチド＃６および２μＬの５ｕｐ ｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＢＲＬ社）を含有する２０μＬの容積中で逆転写 させた。得られた反応混合物を、３７℃で５０分間次いで４４℃で１０分間イン キュベートし次に氷上に置いた。

第二のストランド反応混合物（Ｓｔｒａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍ１ｘ）　（ １４０μＬ）を上記の第一ストランド反応混合物に添加した。第二ストランド反 応混合物は、２１ｍＭトリス−ＨＣｌ　、　１０４＋ｎＭ　ＫＣＩ　、　５．３ ｍＭ　ＭｇＣ１，，１７１ｕＭ　β−ＮＡＤ、　１１．４＋ｎＭ　（ＮＨ＋　） ｘｓＯ，，２１４ｕＭ　ｄＡＴＰ　、　６４２　ｕＭｄＣＴＰ、　２１４　ｕＭ 　ｄＧＴＰ　、　２１４　ｕＭ　ｄＴＴＰ　、　４　ｍＭ　ＤＴＴ、　１０μＣ ｉ”Ｐ　−ｄＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍＭｏ１ｅ）、１５単位のイー・コリー ＤＮＡ　リガーゼ、４０単位のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社） および０．８単位のＲＮアーゼＨで構成されていた。最終混合物を１６℃で１５ ０分間インキュベートした。二本ｃＤＮＡを平滑断端にするため、１０単位のＴ 　４　ＤＮＡポリメラーゼを添加し、次いで反応を１６℃でさらに１５分間続け た。反応を停止させ次いでフェノール／クロポルムで抽出することによってｃＤ ＮＡを精製し、次にクロロホルムで抽出しエタノールで沈殿させた。

ＥｃｏＲＩでアダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を上記ｃＤＮＡに連結させ次いで メーカー推奨の条件を用いてキナーゼで処理した。酵素を熱で（７０℃、２０分 間）変性し、次いでＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出しエタノールで沈 殿させることによって精製した。得られたｃＤＮＡを、メーカーの推奨条件を利 用し、１００μＬの反応容積中、５０単位のＸｈｏ　Ｉ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ社）で消化した。Ｘｈｏ　Ｉ酵素を熱で殺しく７０℃、２０分間）、次いでそ の混合物は、ＳＴＥ緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献）中で予め 平衡化した５４００５ｐｕｎ　ｃｏｌｕｍｎ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を通過 させた。

溶出液をフェノール１クロロホルムで抽出しエタノールで沈殿させた。４℃で３ ０分間微量遠心分離に付した後、得られたｃＤＮＡペレットを７０％（Ｖ／Ｖ） エタノールですすいで風乾し、次いでｌｏμＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス− ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。

ＮＡ−４５メンプラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１社）を 用いて、１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルで電気泳動させた。７．５μＬの試料が 呟大きさが１．３〜２．５ｋｂの範囲のｃＤＮＡを単離した。

上記ノ大キサテ分画しりｃＤＮＡを、５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，０ ）　、１０ｍＭ　ＭｇＣＩｙ、ｌ０ｍＭ　ＤＴＴ、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰおよび２単 位のＴ　４　ＤＮＡリガーゼで構成された反応緩衝液５μＬ中で、λＺＡＰＩＩ 　ＥｃｏＲＩ／　Ｘｈｏｌ／ＣＩＡＰで処理したベクター（ストラタジェン社） ｌμｇと連結した。この反応は４℃で２日間実施した。

室温で２時間放置した後、連結反応混合物はＰａｃｋａｇｅｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてパッケージした。組換え体の総数は２７０．００ ０ｐｆｕであった。

ＰＬＫ−Ｆ　’細胞をトランスフェクトした後、１５０．０００ｐｆｕの量のパ ッケージされたｃＤＮＡを、１５ｃ＋ｎ直径のプレート当り１０．０ＯＯｐｆｕ の割合でプレートした。これらのプレートは３７℃で８時間インキュベートし次 いで４℃で一夜保管した。２セツトのリフト（ｌｉｆｔ）をＣｏ１ｏｎｙ／Ｐｌ ａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ（登録商標）フィルター（Ｄｕｐｏｎｔ社）上に取りメ ーカーが推奨するとおりに処理した。

ｃＤＮＡライブラリー＃３の構築 クリサンセマム・モリフォリウムＣＶ、ダーク・ピンク・ボンボン（Ｃｈｒｙｓ ａｎｔｈｅｍｕｍ　ｍｏｒｉｆｏｌｉｎｍ　ｃｖ　、　Ｄａｒｋ　Ｐｉｎｋ　Ｐ ｏｍｐｏｍ）　（参照番号５９９９）の段階１．２および３の花の花弁組織から 、やはりＴｕｒｐｅｎとＧｒｉｆｆｉｔｈの１９８６年の文献の方法を用いて全 ＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡは、ビー・ハイブリダの場合と同様 に、３サイクルのオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィー（ＡｖｉｖとＬｅ ｄｅｒの１９７２年の文献）によって、全ＲＮＡから選択した。ポリ（Ａ）　” 　ＲＮＡ　２μｇを鋳型として用い、ビー・ハイブリダについて先に述べたのと 同様にしてｃＤＮＡを合成した。

分画と連結を行ってから、続いてｃＤＮＡ反応混合物はＰａｃｋａｇｅｎｅｓｙ ｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてパッケージした。組換え体の総数は３ ７、０００ｐｆ　ｕであった。

ＸＬ−１−Ｂｌｕｅの細胞をトランスフェクトした後、（増幅されたライブラリ ー）の３００．０００ｐｆｕの量のパッケージされたｃＤＮＡを、１５ｃ＋ｎ直 径のプレート当り２０．０００ｐｆｕの割合でプレートした。そのプレートを３ ７℃で８時間インキュベートし次いで４℃で一夜保管した。２セツトのリフトを Ｃｏ１ｏｎｙ／Ｐｌａｑｕｅ　５ｃｒｅｅｎ　（Ｄｕｐｏｎｔ社）上に取りメー カーが推奨するように処理した。

ＰＣＨの鋳型の製造 ＤＮＡはアルカル溶解法（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献）を用いて単 離した。プラスミドＤＮＡはＣｓＣ１勾配液にバンド形成させることによってさ らに精製した。このＤＮＡをＰＣＲに用いる鋳型として使用した。

２、　クリサンセマムのゲノムＤＮＡ 全ＤＮＡを単離するため、５ｇのクリサンセマムの花弁の組織を液体窒素中で凍 結させ、次いで冷乳鉢で微粉末に粉砕した。粉砕された組織を、フェノール：ク ロロホルム５ｍＬで抽出し、続いてＮＴＭＥＳ緩衝液（０，０１Ｍ　ＮａＣ１； 　０．Ｉ　Ｍ　トリスｐＨ８，５；　５　ｍＭ　ＭｇＣＬ　：　１　ｍＭＥＤＴ Ａ；１％５ＤＳ）　５　ＩＩＩＬで抽出した。水性層を５ｍＬのフェノール：ク ロロホルムで再抽出し次いでその水性層を遠心分離した後に集めた。

上記溶液に、０．５ｎ＋Ｌの３　Ｍ　ＮａＡＣ、ｐＨ５，８と２倍容積のエタノ ールを添加した後、ＤＮＡを該溶液から巻きとった。最終のペレットを２ｍＬの ＴＥ緩衝液中に再懸濁させ、ＰＣＲに用いる前にその濃度を測定した。

３、　グイアンタスのｃＤＮＡ ＴｕｒｐｅｎおよびＧｒｉｆｆｉｔｈの１９８６年の文献の方法を同様に用い、 ディ・キャリオフィルスＣＶ、ラグナの段階３の花の花弁組織から全ＲＮＡを単 離した。ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡは、メーカーのプロトコルに従ってＯｒｉｇｏ ｔｅｘ　ｄＴ−３０（Ｔａｋａｒａ、日本）を用いて全ＲＮＡがら選択し、次い でその２μｇを、メーカーが推奨するとおりに５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵 素を用いて逆転写させた。得られたｃＤＮＡをＴＥ緩衝液１０μＬに溶解した。

ＰＣＲ反応を行うため、５μＬを鋳型として用いた。ＰＣＨの条件は以下に述べ る。

４、　ローザのｃＤＮＡ ローザ・ハイブリダＣＶ、カーディナルの段階１のつぼみがら全ＲＮＡを調製し た。この段階で、つぼみは高さが１．Ｏ〜１．２ｃｍで幅が約０．５ｃｍであっ た。これらのつぼみは完全に閉じており、かく片を切り取っても色素は目視でき なかった。

凍結された組織（１〜３ｇ）を、乳鉢を用いて液体窒素中で粉砕し、予め冷却し た緩衝液Ａ　Ｃ０，２Ｍホウ酸、１０＋ｎＭ　ＥＤＴＡ　（ナトリウム塩）（ｐ Ｈ７，６）　２５＋＋＋Ｌ中に入れ、短時間ホモジナイズした。抽出物が室温に 到達するまで、抽出物を回転振盪器で混合し、次に緩衝液Ａで平衡化した等容積 のフェノール／クロロホルム（１：　ＩＶ／Ｖ）を添加した。さらにＩＯ分間混 合した後、そのＲＮＡ製剤を１０．０００　Ｘ　ｇで１０分間、２０℃にて遠心 分離した。上方の水層を残し、フェノールの界面を先に述べたのと同様にして再 抽出した。水層をプールし、次いで０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ）１６．０）に まで調節し、２６５倍容積の９５％エタノールを添加して混合物を一２０℃で一 夜貯蔵した。その両分を１０．ＯＯＯＸｇで４℃にて１０分間遠心分離し、得ら れたペレットを、緩衝液Ｂ　［２５ｍＭホウ酸、１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ナ トリウム塩）、０．１Ｍ　ＮａＣＩ（ｐ）１７．６）］　２２０ｍにゆるやかに 溶解し、次いで０．４倍容積の２−プトキシエタノール（２８Ｂ＞を添加した。

この溶液を氷上で３０分間インキュベートした。次にその溶液をｌｏ、ｏｏＯＸ ｇで０℃にて１０分間遠心分離し上澄み液を注意深く集めた。１．０倍容積の２ ８Ｂを添加し氷上でさらに３０分間インキュベートした後、上澄み液を再びｔｏ 、　ｏｏ。

Ｘｇで０℃にて１０分間遠心分離した。得られたペレットは、緩衝液Ａ：２ＢＢ （１：ＩＶ／Ｖ）でゆるやかに洗浄し、次ニア０％（Ｖ／Ｖ）エタノール、０． １Ｍ酢酸カリウムおよび最後に９５％エタノールで洗浄した。得られたペレット は風乾し、次いでジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水１ｍＬに 溶解した。この溶液は３Ｍ塩化リチウムにまで調節し、６０分間氷上に置き、次 いで１０．０００Ｘｇで０℃にて１０分間遠心分離した。得られたペレットを３ ＭＬｉＣ＋で２回洗浄し次いで７０％エタノール、０．１Ｍ酢酸カリウムで洗浄 した。得られたＲＮＡペレットをＤＥＰＣで処理した水４００μＬに溶解し、次 いで等容積のフェノール／クロロホルムで抽出した。そのＲＮＡ混合物を１０． ０００Ｘｇで２０℃にて５分間遠心分離し、水性層を集め、０．１Ｍ酢酸ナトリ ウムにまで調節し、次いでさらに２．５倍容積の９５％エタノールを添加した。

氷上で３０分間インキュベートした後、混合物を１３、ＯＯＯｒｐｍ　（５，０ ００Ｘｇ）で２０℃にて２０分間遠心分離し、生成したＲＮＡペレットをＤＢＰ Ｃで処理して水４００　ｍＬ中にゆるやかに再懸濁させた。

ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ　ｄＴ−３０（Ｔａｋａｒａ、日 本）によって、メーカーのプロトコルにしたがって、全ＲＮＡから選択した。

二本鎖ｃＤＮＡは、ペチュニアｃＤＮＡライブラリー＃２を構築する場合にさき に述べたのと同じ方法を用いて、２μｇのポリ（Ａ）　”　ＲＮＡから合成した 。そのｃＤＮＡをＴＥ緩衝液１０μＬに溶解した。

オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチド類とプライマー類は、メーカーが推奨する方法を用い、Ａｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂ１０５ｙＳｔｅｌｌｌＳ　ＰＣＲ−Ｍａｔｅ　ＤＮＡ合成器で合 成した。

合成したオリゴヌクレオチド類と、プライマー類は、５’−３’：オリゴｌ　： 　ＧＴＴＣＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＴＧオリゴ２　：　ＧＣＴＧＣＡＣＴＴＡ ＡＴＣＣＡＴＡＴオリゴ３　：　ＧＧＡＴＧＡＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ ＣＣＡＴＧオリゴ４　：　ＴＧＣＡＴＡ（、ＣＴＴＴＴＧＧＧオリゴ５　：　Ｃ ＣＩＧＧ（Ａ／Ｇ）ＣＡＩＡＴＩＣ（Ｇ／Ｔ）（Ｃ／ＴＸＣ／Ｔ）ＴＩＣＣＩＧ ＣＩＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＧＧオリゴ６　：　ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧ ＡＧＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴオリゴ７　： 　ＣＣＩＧＣ（Ａ／Ｇ）ＣＡＩＡＴＩＣ（Ｇ／Ｔ）ＩＣ（Ｔ／Ｇ）ＩｃｃＩＧｃ Ｉｃｃ（Ａ／Ｇ）ＡＡＩＧＧプライマー−４０ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧ ＡＣプライマー１９０　ＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＧＣプライマー１９１ 　ＣＴＧＣＴＧＣＡＡＡＣＡＡＧＴＣＣポリ−Ｔ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴ（ＡＧＣ）オリゴ５を設計する場合の原理は次のとおりである。アボカ ドシトクロムＰ４５０　（Ｂｏｚａｋらの１９９０年の文献）の推定ヘム結合領 域由来のアミノ酸配列および二つのペチュニアシトクロムＰ４５０同族体のｐｃ Ｇ１４２およびｐｃＧ１４７がコードする対応する配列を並べた。

アボカド　ＰＦＧＡＧＲＲＧＣＰＧ ｐｃＧＰ１４２　Ｐ　Ｆ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｋ　ＲＩ　ＣＰ　ＧｐｃＧＰ１４７　Ｐ 　Ｆ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　ＲＲＩ　ＣＰ　Ｇしたがって、これら三種の植物シトクロム のＢ４５０のヘム結合領域の共通アミノ酸配列は下記の配列であることが分かる であろう。

Ｐ　Ｆ　Ｇ　Ａ（Ｓ）　Ｇ　Ｒ（Ｋ）　ＲＩ（Ｇ）　ＣＰ　Ｃ３種のシトクロム ２４５０分子のヘム結合領域に見られるアミノ酸をコードしつるヌクレオチド配 列の可能な順列は以下のように波峰Ｘは４種のヌクレオチド（Ａ、　Ｃ，Ｇおよ びＴ）をすべて使用できるヌクレオチドの位置を示す。オリゴ５は上記３種の植 物シトクロムＰ４５０由来の共通配列のサブセットを相補するよう設計した。

デオキシイノシン（Ｉ）は、塩基縮重が３より大きい場合に主として使用した。

得られたオリゴヌクレオチド配列は上記のとおりであった。

クローン化されたペチュニアシトクロムＰ４５０配列を増幅するために、ＰＣＲ 混合物には、１００１ｇのプラスミド鋳型、１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（１）８８ ．３）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、　１．２５ｍＭ　ＭｇＣＩａ、０．２＋ｎＭノ各ｄ ＮＴＰ、　１．０　μＭの各プライマーおよび０．５単位のＡｍｐｌｉ　Ｔａｑ 　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ社）を含有させた。反応混合物（１００μｌ ）は、９５℃、１分間；４２℃、１分間および７２℃、２分間のサイクルを３０ 回実施した。

ＰＣＲｆｉ合物ニハ、１００　ｎｇ（７）ｃＤＮＡ鋳型、１０＋ｎＭトリスー　 ＨＣＩ（ｐｉ（８，３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ５１．５　ｍＭ　ＭｇＣＩｔ、０． ００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、０．２ｍＭ（７）各ｄＮＴＰ、　１．ＯｕＭの各 プライマーおよび５単位のＡｍｐｌｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕ ｓ社）を含有させた。反応混合物（１００ＴｎＬ）は、最初に、９５℃、３分間 ；５５℃、１分間および７２℃、１分間のサイクルを実施し、次に９５℃、５５ ℃および７２℃で各々１分間づつのサイクルをさらに３９回実施した。増幅させ た生成物を、５ｅａｐｌａｑｕｅの低融解（ＩＯＷ　ｍｅｌｔｉｎｇ）アガロー ス（ＦＭＣ社）を用いてゲル精製を行った。得られた混合物を、該アガロースが 融解するまで加熱し、次にＴＥで飽和したフェノールで抽出した。水性相をフェ ノール／クロロホルムで抽出し、増幅した生成物をエタノールで沈殿させた。ゲ ル精製に続いて、増幅された生成物を、ＨＯＩｔＯｎおよびＧｒａｈａｍの１９ ９１年の文献に記載されているｄｄＴ−ｔａｉＩｅｄ　ｐＢＩｕｅｓｃｒ：ｐｔ ベクター中に直接クリサンセマムの反応混合物は、２００　ｎｇのゲノムＤＮＡ 鋳型、１０ｍＭ）　ＩＪ　ス−ＨＣＩ（ｐｌ＋８．３）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、２ ．５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、０．００１％（Ｗ／　Ｖ　）ゼラチン、０．２＋ｎＭ の各ｄＮＴＰ、　１．０μＭの各プライマーおよび５単位のＡｍｐｌｉ　Ｔａｑ 　ＤＮＡポリメラーゼＣＣｅｔｕＢ社）を含有していた。５０ｍ１゜の反応容積 を、９５℃、５５℃および７２℃で９０秒づつのサイクルを３５回実施した。増 幅された生成物をＧｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０１　Ｉｎｃ、社）を用い てゲル精製を行い、次に、Ｈｏ１ｔｏｎおよびＧｒａｈａｍの１９９１年の文献 に記載されているｄｄｔ−ｔａｉｌｅｄ　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に 直接クローンローザの反応混合物は、上記のようにして調製したｄｓ　ｃＤＮＡ の１０倍希釈後１μｍ、ｌｏｗｌｙ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）、５０ｍＭ　 ＫＣＩ、２．５＋ｎＭＭｇＣＩ２．０１ＯＯ１％（Ｗ／■）セラチン、０．２＋ ｎＭノ各ｄＮＴＰ、　１．ＯｕＭの各プライマーおよび５単位のＡｍｐｌｉ　Ｔ ａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ社）を含有していた。５０μＬの反応容 積について、９５℃、１分間；５５℃、１分間；および７２℃、３分間のサイク ルを３０回実施した。増幅された生成物をＧｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０ １　Ｉｎｃ、社）を使用してゲル精製を行い、次いで、）ＩａｌｔｏｎおよびＧ ｒａｈａｉ＋の１９９１年の文献に記載されているｄｄＴ−ｔａｉｌｅｄ　ｐＢ ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に直接クローン化した。

ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングｃＤＮＡライブラリー＃２由来の２個の プラークのリフトに、以下のようにして雑種を形成させて洗浄した。すなわち高 緊縮条件（雑種形成ご５０％（ｖ／Ｖ）ホルムアミド、６ＸＳＳＣ１１％　（Ｗ ／Ｖ）　ＳＤＳ、４２℃１．：テ１６時間および洗浄、　２ＸＳＳＣ、１％ＳＤ Ｓ　、６５℃にて２×１５分間）を用いて同胞クローンを検出し、次いで低緊縮 条件（雑種形成・２０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ　、　４２℃ニ テ１６時間、および洗浄＋　６ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ　、６５℃で１時間）を用 いて関連配列を検出した。

ｃＤＮＡライブラリー＃３由来のリフトに、以下のようにして雑種を形成させて 洗浄した。−次スクリーニングでは、ｐｃＧＰ６１９由来のペチュニア３′−ヒ ドロキシラーゼｃＤＮＡ　ＥｃｏＲＩ　−ＸｈｏＩ挿入断片（図６参照）を用い 、雑種形成条件は２０％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ　、１０％ （Ｗ／Ｖ）デキストラン硫酸、３７℃で１６時間であり、洗浄条件＋；！０．ｌ Ｘ５ＳＣ、１％（Ｗ／Ｖ）　ＳＤＳ　、室温であった。二次スクリーニングでは 、ｐＣＧＰ８５４由来のＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ挿入断片を用い、雑種形成と 洗浄の条件は、雑種形成反応を４２℃で１６時間行ったことを除いて同一であっ た。

ＤＮＡプローブの３２Ｐ−標識化 オリゴ標識化キット（Ｂｒｅｓａｔｅｃ社）を用い、５０μＣｉのＣａ−”Ｐ） −ｄＣＴＰで、ＤＮＡフラグメント（５０−１００ｎｇ）に放射能の標識を付け た。

組込まれなかったＣａ−”Ｐ〕−ｄＣＴＰは、セファデックスＧ−５０（Ｆｉｎ ｅ）カラムのクロマトグラフィーで除去した。

ＤＮＡ配列の分析 ＤＮＡの配列決定は、５ｅｑｕｅｎａｓｅ酵素（ｕｓｅ、バージョン２．１）を 用い、事実上サンガーらの１９７７年の報告の方法によって実施した。クローン のｐｃＧＰ６０２とｐｃＧＰ６１９の完全配列は、標準のクローン化法（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献）を用いて得た異なるＭ１３−ｍｐ１８とＭ＋ ３−ｍｐ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒらの１９８３年の文献；　Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎの１９８５年の文献）サブクローン由来の配列を編集することに よって決定した。いくつかの領域については、オーバーラツプしている配列のデ ータを得るため、プライマー−４０、−１９０、−１９１およびポリ−Ｔを含む 特定のオリゴヌクレオチドブライマーを合成する必要があった。

これらの配列のいくつかの位置を示す、ｐｃＧＰ６１９の制限地図を図６に示す 。

Ｇｅｎｂａｎｋ　、　！ＶＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＥＭＢＬのデータベースに対 する相同性の調査を、ＦＡＳＴＡとＴＦＡＳＴＡのプログラムを用いて実施した （　ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの１９８８年の文献）。

３′−ヒドロキシラーゼの検定 ３′−ヒドロキシラーゼ酵素の活性は、５ｔｏｔｚおよびＦｏｒｋｍａｎｎの１ ９８２年の文献に記載されている方法の改変法を用いて測定した。検定反応混合 物は、一般に酵母抽出物１００μｌ、５０ｍＭ　ＮＡＤＰｔｌ含有検定緩衝液（ １００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８，０）、１　ｍＭ　ＲＤＴＡおよび２０ｍＭ 　２−メルカプトエタノール〕　５μｍのおよび１０μＣｉの〔３Ｈ〕−ナリン ゲニンを含有していたが該検定緩衝液で最終容積２１０μｍまでにした。２３℃ で２〜１６時間インキュベートしてから反応混合物を酢酸エチル０．５ｍＬで抽 出した。酢酸エチル相を減圧乾燥し、次いで酢酸エチル１Ｏｕｌ中に再懸濁させ た。クロロホルム：酢酸：水（１０：　９　：ｌＶ／Ｖ）溶媒系を用いて、セル ロース薄層プレート（Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ５５７７、ドイツ）上に、トリチウム 化フラボノイド分子を分離した。

クロマトグラフィーを完了し、ＴＬＣプレートに、７％２．５−ジフェニルオキ サゾール含有ジエチルエーテルをスプレィした。反応生成物をオートラジオグラ フィーで位置を決め、反応生成物の横に展開され紫外線で目視可能な非放射線の ナリンゲニンとエリオシクチオールの標準と比べて同定した。

ｐｃＧＰ６２１の構築 ｐｃＧＰ６１９由来の全ｃＤＮＡ挿入断片を含有する１、８ｋｂのＥｃｏＲＩ　 −Ｘｈｏ　１断片を、ｐＹＨＣＣｌｏｌ（Ｔａｎａｋａらの１９８８年の文献） 由来の８ｋｂのＥｃｏＲｌ−３ａｌＩフラグメントと連結させた。得られたプラ スミドｐｃＧＰ６２１は、酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ のプロモーターの後にセンス配向Ｃ５ｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で連 結したｐｃＧＰ６１９ｃＤＮＡフラグメントを含有していた。

を、Ｉｔｏらの１９８３年の文献にしたがって、ｐｃＧＰ６２１で形質転換した 。

これらの形質転換体は、Ｇ−１３１５のトリプトファン合成能を回復させる性能 によって選択した。

３′−ヒドロキシラーゼ活性検定用酵母エキスの調製Ｇ−１３１５／ｐｃ［ｌ、 Ｐ６２１　（１）単一単離体を、２０ｍＬ（７）ＹＮＢＣ［１，２Ｘ　（Ｗ／■ ）のアミノ酸なし酵母窒素ベース（Ｄｉｆｃｏ社）、２％（Ｗ／　Ｖ　）のグル コースおよび０．３％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）〕に接種し、続い て３０℃にて２日間インキュベートした。細胞を遠心分離によって集め、ＴＥ緩 衝液で一回洗浄し、次に緩衝液Ａ　Ｃｌ０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、 ０．６５Ｍ　’７　ルビトール、０．１　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．１　ｍＭ　ＢＤ ＴＡ　）で−回洗浄し、次いでザイモリアーゼ（０，１ｍｇ／ｍＬ）　（Ｓｅｉ ｋａｇａｋｕＫｏｇｙｏ　、日本）を含有する緩衝液Ｂ　（１０ｍＭトリス−Ｈ ＣＩ（ｐＨ７，５）、１．２Ｍフルビトール、０．１　ｍＭ　ＤＴＴＳｏ、　１ 　ｍＭ　ＥＤＴＡ　）　中ニ再懸濁すｅた。３０℃で１時間インキュベートした 後、細胞を遠心分離によってベレット化し、これを４００μＬの緩衝液Ａ中に再 懸濁させた。次にその細胞懸濁液をガラスピーズ（直径＝０．４ｍｍ）とともに ２分間渦動させ、次いで１００μＬの試料について活性を検定した。

ｐＣＧＰ２９３の構築 発現バイナリ−ベクターｐＣＧＰ２９３を、ＴｉバイナリベクターｐｃＧＮ１５ ５９（ＭｃＢｒｉｄｅとＳｕｍｍｅｒｆｅｌ　ｔの１９９０年の文献）から誘導 した。プラスミドｐｃＧＮ１５５９をＫｐｎ　Ｉで消化し、突出している３′末 端を、標準のプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献）にしたがっ て、Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼで除去した。このベクターをさらにＸｂａ　Ｉ で消化し、生成した５′突出部を、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメン トを用いて修復した。そのベクターを再連結しｐＣＧＰ６７を得た。Ｍａｃプロ モーター、ｍａｓターミネータ−および各種のクローニング部位を含有するＩ、 　９７ｋｂのＰＳｔｌフラグメント（Ｃｏｍａ　；らの１９９０年の文献ンをｐ ｃＧＰ４０から単離し、ｐＣＧＰ６７のＰｓｔ１部位に挿入してｐＣＧＰ２９３ を得た。

プラスミドｐｃＧＰ４０を次のようにして構築した。すなわち、ＧＵＳ遺伝子（ Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの１９８７年の文献）をＢａｗｌ（Ｉ　−５ａｃｌフラグ メントとしてｐＣＧＮ７３３４から除去し、次いでｐｃＧＮ７３３４を、マルチ クローニング部位を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ１３−由来のＢａｍ１（ Ｉ　−Ｓａｃ　Ｉフラグメントで置換した。プラスミドｐＣＧＮ７３３４　（米 国、カリフォルニア州のＣａｌｇｅｎｅ　Ｉｎｃ、社から入手した）は、Ｍａｃ 　−ＧＵＳ−ｍａｓ遺伝子融合体を含有するフラグメントをｐＣＧＮ７３２９　 （Ｃｏｍａｉ　らの１９９０年の文献）のＸｈｏ　Ｉ部位中に挿入することによ って構築されたものである。

ｐｃＧＰ８０９の構築 ｐｃＧＰ６１９由来のｃＤＮＡ挿入断片を、ｐＣＧＰ２９３のＭａｃプロモータ ー（Ｃｏｍａ　ｉらの１９９０年の文献）の後にセンス配向でクローン化するこ とによって、プラスミド１）ＣＧＰ８０９を構築した。上記ｃＤＮＡ挿入断片を 含有する１、８ｋｂのｆｌａｍＨＩ　−Ｋｐｎ　ＩフラグメントをｐｃＧＰ６１ ９がら単離し、ｐＣＧＰ２９３をＢａｍＨＩ　−Ｋｐｎ　Ｉで消化したものに連 結した。ｐｃＧＰ８０９に上記挿入断片が正しく挿入されているということは、 ゲンタマイシン耐性形質転換体から単離したＤＮＡを制限分析することによって 確ａ、植物の材料 ペチュニア・ハイブリダ（５ｋｒ４　Ｘ５ｗ６３）の種子を次亜塩素酸ナトリウ ム１．２５％（Ｗ／Ｖ）溶液中で１０分間滅菌し、次いで滅菌水で３回すすいだ 。滅菌された種子を１００　ｍｇ／　Ｌジベレリン酸（ＧＡ、　）溶液中に１６ 〜２０時間浸漬した。次にこれらの種子を、１％（Ｖ／Ｖ）スクロースおよび０ ．８％（Ｗ／Ｖ）　Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ寒天を補充した１０％（Ｗ／Ｖ）　 ＭＳ　（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇの１９６２年の文献）培地上で２ 週間発芽させた。若い苗を、３％（Ｗ／ｖ）スクロースで補充したＭＳ培地に移 して３週間後に、シフイー・ビート（Ｊｉｆｆｙ　Ｐｅａｔ）のペレット（ノル ウェー所在のＪｉｆｆｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｌｔｄ、社）に移し、噴霧と電照 下で（１３５μＥ、ハロゲン化水銀光、２２℃）２〜３週間保持した。次にこれ らの若い植物をグロースキャビネットに移した（６８μＥ、冷白色蛍光、２５℃ ）。共栽培（ｃｏ−ｃｕｔ目ｖａｔｉｏｎ）を行うため、若い葉を収穫し、１． ３５％（Ｗ／Ｖ）次亜塩素酸ナトリウム中で２分間滅菌し、続いて滅菌水中で３ 回すすいだ。葉の組織を２５ｍｍ’の四角形に切断し、０．０５ｍｇ／　Ｌのキ ネチンと１０ｍｇ／Ｌの２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）を補充 したＭＳ培地上で２４時間前培養を行った。

ｂ、アグロバクテリウムとペチュニアの組織との共培養バイナリーベクターｐｃ ＧＰ８０９を含有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス菌株ＡＧＬＯ（Ｌ ａｚｏらの１９９１年の文献）を、１００　ｍｇ／　ｌ。

ゲンタマイシンを含有するＭＧ／　Ｌ　（ＧａｒｆｉｎｋｅｌおよびＮｅ５ｔｅ ｒの１９８０年の文献）寒天プレート上に４℃で保持した。１％（Ｗ／Ｖ）　Ｂ ａｃｔ。

−ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）　Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物および１％（Ｗ／Ｖ ）　ＮａＣ１を含有する液体培地で、単一コロニーを一夜増殖させた。翌日、３ ％（Ｗ／Ｖ）スクロースを含有する液体ＭＳ培地（ＢＰＭ）で希釈することによ って、最終濃度５ＸＩＯ”細胞１ｍＬに調整した。

葉のディスクを、ＡＧＬＯ／　Ｉ）ＣＧＰ８０９含有ＢＰＭ中に５分間浸漬した 。その葉のディスクを吸取り紙を用いて乾燥し、共培養培地上に４日装置いた。

その共培養培地はｏ、　０５ｍｇ／　Ｌのキネチンおよび１．０　ｍｇ／　Ｌの ２．４−Ｄを補充したＳＨ培地（Ｓｃｈｅｎｋおよび旧１ｄｅｒｂｒａｎｄ　ｔ の１９７２年の文献）で構成され、その共培養培地を覆ってタバコ細胞懸濁液の フィーダ層（ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒ）が流延され、そしてタバコ細胞懸濁液 の上面に濾紙を配置した。

Ｃ８形質転換ペチユニア植物の回収 共培養を行った後、３％（Ｗ／Ｖ）のスクロース、２ｍｇ／Ｌのａ−ベンジルア ミノプリン（ＢＡＰ）、１００　ｍｇ／　Ｌのカナマイシン、３５０ｍｇ／Ｌの セホタキシム、０．３％（Ｗ／Ｖ）のＧｅ１ｒｉｔｅ　Ｇｅ１ｌａｎ　Ｇｕｍ（ Ｓｃｔｔｗｅｉｚｅｒｈａｌ　１社）を補充した新鮮なＭＳ培地で構成されてい る選択培地に、葉のディスクを移した。３週間後、再生中の外債片を新鮮な培地 に移した。カナマイシン選択に耐えて生残った不定シュート（ａｄｖｅｎｔＨｉ ｏｕｓ　５ｈｏｏｔ）を単離し、１００　ｍｇ／　Ｌカナマイシンおよび３５０ 　ｍｇ／　Ｌセホタキシムを含有するＢＰＭに移して根を誘発させた。

全培養物を、２３±２℃にて、１６時間の日長（６０μＥ、冷白色蛍光）下に維 持した。根の長さが２〜３ｃｍになったときに、その形質転換ペチュニア小植物 を、８ｃｍチューブに入れた。高温滅菌処理済のＤｅｂｃｏ５１４１０１２鉢植 え混合物に移した。４週間後、植物は、同じ鉢植え混合物を使用している１５ｃ Ｉｌ′ｌの鉢（ポット）に改植し、２３℃にて１４時間の日長（３００μＥ、ハ ロゲン化水銀光）下に維持した。

２、試験結果 ｃＤＮＡライブラリー＃ｌからのシトクロムＰ４５０同族体の単離シトクロムＰ ４５０の酵素に対して類似した配列の領域を有する五つのペチュニアｃＤＮＡク ローンが単離されたことはすでに報告されている（国際特許願第ＰＣＴ／ＡＵ９ ２１００３３４号）。これらのクローンの部分配列は、ｐｃＧＰ１４２　、ｐｃ ＧＰ１４７　、ｐｃＧＰ１５８　、ｐｃＧＰ１６０およびｐＣＧＰ４５４と命名 され、図２に示しである。これら五つのシトクロムＰ４５０同族体のコーディン グ領域を有する！！ｐ標識化ＤＮＡフラグメントの混合プローブ（図２Ａと２Ｂ 参照）を用いて、関連配列について、ｃＤＮＡのライブラリー＃１由来の５０． ０００個の組換え体をスクリーニングした。低緊縮の雑種形成および洗浄の条件 下で合計１５２個の雑種形成りローンを検出した。さらに１３種の異なるシトク ロムＰ４５０同族体を、上記雑種形成りローンから単離したＤＮＡの配列を分析 することによって同定した。

これらのクローンの中の一つのｐｃＧＰ１７４と命名されたクローンは、ペチュ ニアの旧１遺伝子座に対応することが分かっている（国際特許願第ＰＣＴ／ＡＵ ９２１００３３４号参照）。上記クローンの全長変形ｐｃＧＰ６０２　（ｃＤＮ Ａライブラリー＃２から単離された）のヌクレオチド配列を図３に示す。スクリ ーンで単離された１３種の他のシトクロムＰ　４５０同族体のうちの１０種：　 ｐｃＧＰ１６１　、　ｐｃＧＰ１６２　、ｐｃＧＰ１６３、ｐｃＧＰ１６５　、 ｐｃＧＰ１６６　、ｐｃＧＰ１６７　、ｐｃＧＰ１６８　、ｐｃＧＰ１６９　、 ｐｃＧＰ１７１およびｐｃＧＰ１７３は混合プローブとして用いて、ｃＤＮＡラ イブラリー＃２をスクリーニングし、別のシトクロムＰ４５０同族体を得た（次 章参照）。

ペチュニアからのシトクロムＰ　４５０同族体の単離ｐｃＧＰ１６１５ｐｃＧＰ １６２　、ｐｃＧＰ１６３　、ｐｃＧＰ１６５　、ｐｃＧＰ１６６　、ｐｃＧＰ １６７、ｐｃＧＰ１６８　、ｐｃＧＰ１６９　、ｐｃＧＰ１７１およびｐｃＧＰ １７３由来の１２ｐ標識化ｃＤＮＡ挿入断片の混合プローブ（図４）を用いて、 ｃＤＮＡライブラリー＃２から１．５　ＸＩＯ’個の組換え体をスクリーニング した。２００個以コニの雑種形質クローンが、低緊縮の雑種形成と６５℃におけ る２ＸＳＳＣと１％ＳＤＳ中での洗浄によって検出された。これらのクローンの うち２５個が、ｐｃＧＰ６０２の内部の旧ｎｃｌＩ−ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲ Ｖ　−ＨｌｎｄＩＩ［のフラグメント（図３）を含有するプローブと、低緊縮条 件下で雑種を形成したが、高緊縮条件下では雑種を形成しなかった。これらのグ ループのクローンの配列を分析した結果、１７個がｐｃＧＰ６０２　（ペチュニ アの旧ｌ遺伝子座に対応することは先に示した、国際特許願第ＰＣＴ／ＡＵ９２ １００３３４号）の同胞であることが分かり、かつ６個がＨｆ２遺伝子座でコー ドされた他のペチュニアｃＤＮＡクローンの同胞であることが明らかになった。

１個のクローンはシトクロムＰ４５０に対して配列相同性を全く示さなかった。

そしてｐｃＧＰ６１９と命名された１個のクローンは、ｐｃＧＰ６０２に対し、 ヌクレオチドとアミノ酸のレベルでそれぞれ５７％と３９％の配列相同性を示し た。ｐｃＧＰ６１９　ｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列と波峰アミノ酸配列を図 ５に示し、配列決定法の概略を制限地図を図６に示す。

酵母内でのｐｃＧＰ６１９　ｃＤＮＡの発現ｐｃＧＰ６１９由来のｃＤＮＡ挿入 断片を、酵母ベクターｐＹＨＨｃｃ１０１中、グリセルアルデヒド３−リン酸デ ヒドロデナーゼのプロモーターの後にセンス配向で連結した。得られた構造体（ ｐｃＧＰ６２１と命名）を用いて酵母菌株Ｇ−１３１５（Ａｓｈｉｋａｒｉらの １９８９年の文献）を形質転換した。３′−ヒドロキシラーゼの活性はＧ　−１ ３１５／　ｐｃＧＰ６２１の抽出物中に検出されたが非形質転換酵母の抽出物に 検出されなかった（図７）。これらのことから、ｐｃＧＰ６１９由来のｃＤＮＡ 挿入断片は３′−ヒドロキシラーゼをコードしていると結論した。

ペチュニア内での３′−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡの発現ｐｃＧＰ８０９と命名 されたバイナリ−プラスミド構造体を、アグロバクテリウム媒介遺伝子移入法を 利用して、Ｆ１ペチュニア雑種ＳＫｒ　４　ｘ　５ｗ６３中に導入した。ＳＫｒ 　４　Ｘ　５ｗ６３の葉のディスクをＡＧＬＯ／ｐｃＧＰ８０９と共培養し、Ｓ Ｋｒ　４　ｘ　５ｗ６３ゲノム中にｐｃＧＰ６１９　ｃＤＮＡ挿入断片が組込れ ていることを、カナマインシ選択を行った後に得た植物をサザーン分析すること によって確認した。

ＳＫｒ　４　Ｘ　５ｗ６３雑種中に導入された３′−ヒドロキシラーゼｒ、ＤＮ Ａの発現は花色に対して顕著な影響を与えた。５Ｋｒ４　Ｘ５ｗ６３の花弁の一 部の色が薄いピンクからレッドに変化した。観察されたこの色の変化は、５５Ｄ −５６Ｃ／Ｄから５４Ａ　−５５Ａ　ヘ移行したとＲｏｙａｌ　１ｌｏｒｔｉｃ ｕトｔｕｌａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　’　ｓ　Ｃｏ１ｏｕｒ　Ｃｈａｒｔから番号 によって示されるであろう。他の生化学的条件と生理的条件は個々の結果に影響 し、そして形質転換植物内で３′−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡを発現させること によって達成される特定の色の変化を引用することが、観察される可能性がある 色の変化の範囲を限定すると解すべきではない。

フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼの変異体および誘導体の種類光に開示した 標準の突然変異誘発法を用いて、フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼの一連の 変異体、誘導体および部分は入手可能であり、これらのものは本発明にとって有 用であろう。このような突然変異誘発法に関する特定の説明とプロトコルについ てはＳａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年の文献を参照するのが便利である。本発明 において単離可能でかつ考えられる３′−ヒドロキシラーゼの変異体、誘導体お よび部分としては下記のものがある。

標準のサザーン分析法を用いて、リンゴ、カーネーション、ヤグルマソウ、アサ ガオおよびバラを含む各種の植物種から単離したＤＮＡの“培養プロット（ｎｕ ｒｓｅｒｙ　ｂｌｏｔ）″を製造し、このプロットによって、ペチュニアの３′ −ヒドロキシラーゼに関連する遺伝子配列についてスクリーニングした。試験結 果は、試験を行ったすべての植物中に関連する遺伝子配列が存在することを明確 に示した。上記の培養プロットは、上記の種の各々由来の約１０＋ｎｇづつのＤ ＮＡを含有するレーン１〜５で構成されている。使用したプローブＤＮＡはｐｃ ＧＰ６１９由来の旧ｎＤＩ［Ｉ　−ＥｃｏＲＶフラグメントであった。サザーン 分析は一連の緊縮条件下で実施した。各々の種の中にいくかつの類似の配列が存 在していることを示す適切な緊縮条件は、５０％ホルムアミド、ＩＭ　ＮａＣｌ 　、１％ＳＯ３、１，０％デキストラン硫酸中、４２℃で一部インキユベートし 続いて２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、６０℃で３０分間づつ３回洗浄する条件であ った。

ローザからの、シトクロムＰ４５０と相同のＰＣＲ産物の単離材料と方法の項に 記載したようにして合成したバラの花弁の二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として用い、ペ チュニア３′−ヒドロキシラーゼに関連する配列を、オリゴヌクレオチド７およ び１９０を使用して増幅した。約４００　ｂｐのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔに連結し、回収された組換えプラスミドの一つをｐＣＧＰ６３５と命名し た。ｐＣＧＰ６３５挿入断片のヌクレオチド配列と波峰アミノ酸反応を図８に示 す。この挿入断片は、ヌクレオチドのレベルで、ペチュニアｐｃＧＰ６１９　ｃ ＤＮＡに対して６０％の類似度を示す。

グイアンタスからの、シトクロムＰ４５０と相同のＰＣＲ産物の単離材料と方法 の項に記載したのと同様にして合成したカーネーションの花弁の一本鎖ｃＤＮＡ を鋳型として用い、ペチュニア３′−ヒドロキシラーゼに関連する配列を、オリ ゴヌクレオチド７および１９０を使って増幅した。約４００　ｂｐのＰＣＲ産物 をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結した。

これらの組換えプラスミドの配列を分析した結果、二つの異なるシトクロムＰ４ ５０同族体が増幅されクローン化されていることが明らかになった。これら二つ の分子の代表的なりローンをｐＣＧＰ７７２およびｐＣＧＰ７７３と命名した。

各挿入断片のヌクレオチド配列と演鐸アミノ酸反応をそれぞれ図９と１０に示す 。上記の波峰アミノ酸配列を他のシトクロムＰ４５０同族体と比較して以下の結 果を得た。

ｐＣＧＰ７７２　ｐｃＧＰ７７３ ｐｃＧＰ６１９　５９．２％　６４．８％ｐｃＧＰ１５８　（ヘム結合領域）６ ２．９％　６１．１％ｐｃＧＰ１６８　（ヘム結合領域）　５９．５％アボカド シトクロムＰ　４５０　５７．８％クリサンセマムからの、シトクロムＰ　４５ ０と相同のＰＣＲ産物の単離材料と方法の項に記載したのと同様にして単離した クリサンセマムのゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ペチュニア３′−ヒドロキシ ラーゼに関連する配列を、オリゴヌクレオチド７と１９０を使って増幅した。約 ４００　ｂｐのＰＣＲ産物をｄｄＴ　−ｔａｉｌｅｄ　ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ に連結し、回収された組換えプラスミドをｐＣＧＰ８５４と命名した。これらの 塩基対１２０個のヌクレオチド配列と波峰アミノ酸配列を図１１に示す。この配 列を、図５に示すペチュニアｃＤＮＡクローンｐｃＧＰ６１９由来の配列と比較 した所、９７１位〜１０９１位間の配列のセグメントに対し、ＤＮＡとアミノ酸 のレベルでそれぞれ７３％と６５％の類似度を示している。

ペチュニア３′−ヒドロキシラーゼに対して配列類似性を有するクリサンセマム の花弁ｃＤＮＡのクローンの単離ｐＣＧＰ６Ｉ９由来のｃＤＮＡ挿入断片を用い て、関連配列についてｃＤＮＡライブラリー＃３をスクリーニングした。材料と 方法の項で述べた雑種形成と洗浄の条件を用いて、６４個の雑種形成りローンを 検出した。

またこれらクローンのうち１２個はｐＣＧＰ８５４由来の挿入断片と雑種を形成 した。ｐｃＧＰ６１９とｐＣＧＰ８５４のプローブの両方と雑種を形成した推定 全長クローンの配列を分析した結果、そのクローンは、図１１に示すＰＣＲ産物 の配列のそれと同一の配列を含有していたので推定クリサンセマム３′−ヒドロ キシラーゼをコードしていることが明らかになった。

クリサンセマムの花弁のｃＤＮＡクローンの酵母内での発現上記の花弁ｃＤＮＡ クローンは、酵母ベクターｐＹＨｃｃ１０１内のグリセルアルデヒド−３−リン 酸デヒドロゲナーゼプロモーターの後にセンス配向で連結することができる。得 られた構造体で、酵母菌株のＧ−１３１５（Ａｓｈｉｋａｒｉらの１９８９年の 文献）は形質転換される。３′−ヒドロキシラーゼの活性は、Ｇ−１３１５＋構 造体の抽出物中に検出できるが、非形質転換酵母の抽出物中には検出できない。

上記の試験結果から、上記のｃＤＮＡ挿入断片は３′−ヒドロキシラーゼをコー ドしていると結論することができる。

当該技術分野の当業者は、本願に記載した発明は、具体的に述べた発明以外の変 形を受け易いことは分かるであろう。本発明はこのような変形をすべて含んでい ると解すべきである。また本発明は、本明細書に、個々にもしくは集合的に言及 もしくは提示されたすべてのステップ、特徴、組成物および化合物、ならびに前 記ステップもしくは特徴のいずれかの二つ以上のいずれかおよびすべての組合わ せを含んでいる。

引用文献 Ａｓｈｉｋａｒｉ、　Ｔ、、　Ｋｉｕｃｈｉ−Ｇｏｔｏ、　Ｔａｎａｋａ、　Ｙ 、、　５ｈｉｂａｎｏ、　Ｙ、、　Ａｍａｃｈｉ。

Ｔ、、　ａｎｄ　Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ、　Ｈ，Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３０　：　５１５−５２０゜１９８９゜ Ａｖｉｖ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ、　Ｐ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９　：　１４０８−１４１２．１９７２゜ Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＲＬｐＵ Ｃｈｏｓｔ　：　［！、ｃｏｌｉＤ）１５ａ”ｃｏｍｐ−ｅＬｅｎｔ　ｃｅｌｌ ｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓ、Ｌａｂ、Ｆｏｃｕｓ、８（２）　：　９．１９ ８６゜Ｂｏｚａｘ、Ｋ、Ｒ，、Ｙｕ、Ｈ，、Ｓｉｒｅｖａｇ、Ｒ，ａｎｄ　Ｃｈ ｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ、Ｒ，Ｅ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１ＩｓＡ８７　：　３９０４ −３９０８．１９９０゜Ｂｕｌｌｏｃｋ、　Ｗ、０．、　Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ、 　Ｊ、Ｍ、ａｎｄ　５ｈｏｒｔ、　Ｊ、Ｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５： ３７６、１９８７゜ Ｃｏｍａｉ、Ｌ、、Ｍｏｒａｎ、Ｐ、ａｎｄ　Ｍａｓｌｙａｒ、Ｄ、、Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ１５　：　３７３−３８１．１９９０ ゜Ｅｂｅｌ、Ｊ、ａｎｄ　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、Ｋ、、Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｆｌａｖ ｏｎｏｉｄｓ　：　Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎＲｅｓｅａｒｃｈ　５ｉｎｃｅ　１ ９８０．　Ｈａｒｂｏｒｎｅ、　Ｊ、Ｂ、　（Ｅｄ、）　Ａｃａｄｅ＋ｎｊｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　ＵＳＡ、　６４１−６７９．１９８８゜Ｆｏ ｒｋｍａｎｎ、Ｇ、Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　１０６　：　１−２６．　 １９９１゜Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ、　Ｄ、Ｊ、ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ、　Ｅ、Ｗ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４４　：　７３２−７４３．１９８０゜Ｈａｈｌｂ ｒｏｃｋ、　Ｋ、ａｎｄ　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、　Ｈ，Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌ ａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、３０１０５−１３０．１９７９゜ Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８６　：　５５７． １９８３゜Ｈｏ１ｔｏｎ、　Ｔ、Ａ、ａｎｄ　Ｇｒａｈａｍ、　Ｍ、Ｗ、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９　：　１１５６゜１９９１゜ Ｉｎｏｕｅ、Ｈ，、Ｎｏｊｉｍａ、Ｈ，ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，Ｇｅｎｅ 　９６　：　２３−２８．　１９９０゜Ｉｔｏ、　Ｈ，、Ｆｕｋｕｄａ、　Ｙ、 、　Ｍｕｒａｔａ、　Ｋ、ａｎｄ　Ｋｉｍｕｒａ、　Ａ、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉ ｏｌ、。

１５３　：　１６３−１６８．１９８３゜Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、Ｒ，Ａ、、Ｋａ ｖａｎａｇｈ、Ｔ、、Ａ、ａｎｄ　Ｂｅｖａｎ、Ｍ、Ｗ、［！ＭＢＯＪ、６　（ １３）　：３９０１−３９０７．　１９８７゜ Ｌａｚｏ、　Ｇ、Ｒ，、Ｐａ５ｃａ１．　Ａ、Ｓ、ａｎｄ”　ｕｄｗｉｇ、　Ｒ ，Ａ、Ｂｉｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９　：９６３−９６７．１９９１゜ ＭｃＢｒｉｄｅ、Ｋ、Ｅ、ａｎｄ　Ｓｕｉ＋ｍｅｒｆｅｌｔ、Ｋ、Ｒ，Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１４　：２６９−２７６　１９９０ ゜ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ＋ｎ、Ｓｏｃ、８５　：　２１４９． 　１９６４゜Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ、Ｔ、ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ、Ｆ、Ｐｈｙｓｉｏ ｌ、ＰＩａｎｔ　１５　：　７３−９７．　１９６２゜Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ、Ｊ 、、Ｋｅｍｐ、Ｔ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、Ｇｅｎｅ　２６　：　１０１ ．　１９８３゜Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ、Ｒ，ａｎｄ　Ｌｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：　２４４４−２４４８． １９８８゜ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ 、Ｔ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ　（２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔ−ｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ　１９８９゜Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、、Ｎｊｃｋｌｅｎ、Ｓ、ａｎｄ　Ｃｏｕｊｓｏｎ、Ａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７４　：　５４６３−５４６７、　１９７７゜５ｃ ｈｅｎｋ、　Ｒ，Ｕ、ａｎｄ　Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄｔ、　Ａ、Ｃ，Ｃａｎ、 Ｊ、Ｂｏｔ、５０：　１９９−２０４．１９７２゜５ｃｈｒａ＋ｎ　Ａ、Ｗ、、 Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ａｎｄ　Ｂｅｎｎ１ｎｋ、Ｇ、Ｊ、Ｈ，Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｅ ｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ、　Ｉｎ　：　Ｐｅｔｕｎｉａ　５ｉｎｋ。

Ｋ、Ｃ，（Ｅｄ、）　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒ ｍａｎｙ　ｐｐ　６８−７５．　１９８４゜５ｔａｆｆｏｒｄ、Ｈ，Ａ、Ｆｌａ ｖｏｎｏｉｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、Ｂｏｃａ　 Ｒａｔｏｎ。

Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡ、１９９０゜ ５ｔｏｔｚ、Ｇ、ａｎｄ　Ｆｏｒｋｆｌａｎｎ、Ｇ、Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃ ｈ　３７ｃ：　１９−２３．　１９８２゜Ｔａｎａｋａ、　Ｙ、、Ａｓｈｉｋａ ｒｉ、　Ｔ、、　５ｈｉｂａｎｏ、　Ｙ、、　Ａｍａｃｈｉ、　Ｔ、、　Ｙｏｓ ｈｉｚｕｍｉ。

Ｈ，ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｂａｒａ、Ｈ，Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１０３　：　９５ ４−９６１．　１９８８゜Ｔｕｒｐｅｎ、Ｔ、Ｈ，ａｎｄ　Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、 Ｏ，Ｍ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４　：　１１−１５．１９８６゜Ｗｉｅ ｒｉｎｇ、ｔ（、ａｎｄ　Ｄｅ　Ｖｌａｍｉｎｇ、Ｐ、Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ 　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ　ｏｆＰｉｇｍｅｎｔｓ、Ｉｎ　：　Ｐ ｅｔｕｎｉａ　５ｉｎｋ、Ｋ、Ｃ，（Ｅｄ、）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ ｇ。

Ｂｅｒ−ｆｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ　ｐｐ　４９−６５．　１９８４゜Ｙａｎｉｓ ｃｈ−Ｐｒｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ 、　Ｊ、Ｇｅｎｅ　３３　：　１０３゜１９８５゜ フェニルアラニン　ｐ−フマロイル−ＣｏＡＦＩＧＵＲＥＩＡ シアニジン−３−ルチノシド　デルフィニジンー３−ルチノシドｐＣＧＰ　１． ２ＦＩＧＵＲＥ２Ｂ ＦＳＳ　工　ＲＮＤＥ　工　ＳＳＬ ＴＴＴ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　ＣＧＧ　ＭＴ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　Ａ’ＩＴ　 ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＣＴＣ工　ＳＳＩＨＳＭＮＧＳＶＶ ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　ＡＴ’ｒ　ＣＡＴ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＭＣ　ＧＧＴ　 ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＣＮＭＴＱＫ　工　ＬＣＦＴＮＳ ＡＡＣ　ＡＴＧ　ＡＣＡ　ＣＭ　ＭＧ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　ＴＴｒ　ＡＣ Ａ　ＭＣ　ＴＣＴＶＴＣＲＴＡＦＧＫＶＹＫ ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＴＧＴ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　ＴｒＣ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　 ＧＴＡ　ＴＡＣ　ＡＡＡＬ　Ｅ　Ｌ　Ｖ　Ｇ　Ｇ　Ｆ　Ｄ　−−−−−−−−− −−−−−−ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＴＴＴＧＡＴ 　−−−−−−−−−−−−−−−ＦＥＮＳＰＶＥＦ　工　ＧＮＨ ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　Ａ’ＩＴ 　ＧＣＡ　ＭＴ　ＣＡＣＦＥＬＶＰＦＧＡＧＫＲＩ ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＴＴｒ　ＧＧＴ　’ＩＴＡ　ＧＣＴ 　ＭＴ　Ａ’Ｉ’ｒ　ＡＧＡＨＰＬＡＲＦＬＹＨＦＮＷ ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＧＣＴ　ＣＧＡ　ＴｒＣ　ＣＴＣ　ＴＡＣ　ＣＡＴ　 ＴｒＴ　ＭＣ　ＴＧＧＡＬＰＹＥＴＮＰＥＤＬＤ ＧＣＧ　Ｃ’ＩｗｒＣＣＡ　ＴＡＴ　ＧＭ　ＡＣＴ　ＭＴ　ＣＣＴ　ＧＭ　ＧＡ Ｔ　ＴＴＡ　ＧＡＴＴＧＡＴＧＴｒＣＴＧＣＴＴｒＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴ ＣＡＴＡＣＴＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣ’ｆ’ｒＣＡＴＣｒＣＣＴＴＡＡＴＴＴＧ ＡＧＴＴｒＧ　ＧＴ′ＧＴＡＣＡＴＴｒＧＴＧＴＣＴＣＣσｒＴ１’ＴＡＧｃＴ ＴＴＧＭＴｒＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＴＧＡＴＣＡＣＡＴＴＴｒＣ’ＩＴｆ ｆｒＣＴＧＴｒＡＣＴＣＣＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴＧＧ ＴＣＡＡＴＴＡＴＧＣＣＡＴＡＴ’ＩＴＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＴＣＡＡ ＴＴＣＣＣＴＣＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＡＴＡＧＡＴｒＡＴＡＡＡＡσ■込ＴＴＭ ＴＧＡＡＴＣ ｐｃＧＰ１４７　ＦＩＧＵＲＥ　２。

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ＦａｍＰＣＴｎＳＭ２夏ｏｔｅ（−１町−１−一一コに一障ｏｒ６１１１ａｈｍ Ｉ’２１１（ＩｕｌＹ１９９２１ｃｏｐｙｕ−一１−閲ｍｌ畔−１−聞Ｎ・ 国際調査報告　ＰＣｒｌＡ圀層… Ｆ【１ｉｎＰＣＴ／Ｉｓメ１ｒス真０１ａｏｍｎｗｔｔｍｏｌ−噛Ｃ（−１ｄ＋ ｈｍ％ＩｍｙＩ？ｌ’２１ｃａｐｏｎ−冒■−ｅａｈ１−−−１軸 国際調査報告　ＰＣＴ／Ａ（２）贋丁 Ｆｏｒｍ　ＫゴｎｓＡ／２１ｏＩ１１ｍ＆ａａｉｌｙ　−ＭＩ＋ｊｙ　１９９２ １−一フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、 ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、Ｒ○、　ＲＵ 、ＳＤ。

ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　コーニッシュ、ニドウィナ　セシリーオーストラリア国、ビク トリア　３８０８．アッパー　ベーコンスフイールド、リードペター　ロード、 ロット　３３ （７２）発明者　タナカ、ヨシカズ オーストラリア国、ビクトリア　３０８４．　ロザナ、ベルビュー　アベニュ　 ５／４９

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. １．フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ酵素もしくは該酵素の機能誘導体をコ ードするヌクレオチドの配列、またはフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ酵素 もしくは該酵素の機能誘導体をコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を 含んでなる核酸単離体。
2. ２．前記核酸がＤＮＡまたはＣＤＮＡである請求の範囲１記載の核酸単離体。
3. ３．前記核酸がゲノムＤＮＡである請求の範囲１記載の核酸単離体。
4. ４．前記酵素が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、トウモロコシ、キ ンギョソウ、タバコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイまたはアサガオを起源とす る酵素である請求の範囲１，２または３に記載の核酸単離体。
5. ５．前記酵素が、ペチュニア、カーネーション、キクまたはパラを起源とする酵 素である請求の範囲４記載の核酸単離体。
6. ６．前記酵素が、ペチュニアを起源とする酵素である請求の範囲４記載の核酸単 離体。
7. ７．図５に記載されているヌクレオチド配列の実質的にすべてまたは一部を含ん でなるヌクレオチド配列、またはその一つ以上の領域に対して少なくとも４０％ の類似度を有するヌクレオチド配列をもっている請求の範囲１記載の核酸単離体 。
8. ８．形質転換植物中に存在している請求の範囲１〜７のいずれか一つに記載の核 酸単離体。
9. ９．形質転換植物が、変化したレベルのフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ活 性を示す請求の範囲８記載の核酸単離体。
10. １０．変化したレベルのフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼの活性が、活性の 低下である請求の範囲９記載の核酸単離体。
11. １１．形質転換植物が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、キンギョソ ウ、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイ、リシアンタスまたはアサガオであ る請求の範囲８または９に記載の核酸単離体。
12. １２．形質転換植物がペチュニア、カーネーション、キク、またはパラである請 求の範囲８または９に記載の核酸単離体。
13. １３．形質転換植物がペチュニアである請求の範囲１０記載の核酸単離体。
14. １４．ペクター中に含有されている請求の範囲１〜１３のいずれか一つに記載の 核酸単離体。
15. １５．前記ペクターがバイナリーペクターである請求の範囲１４記載の核酸単離 体。
16. １６．前記ペクターがウイルス性ペクターである請求の範囲１４記載の核酸単離 体。
17. １７．ペクターおよび核酸単離体がｐＣＧＰ８０９である請求の範囲１４または １５に記載の核酸単離体。
18. １８．請求の範囲１の核酸単離体とハイプリダイズすることができるヌクレオチ ドの配列を含んでなるオリゴヌクレオチド。
19. １９．前記オリゴヌクレオチドが、請求の範囲１記載の核酸単離体の５′領域と ハイブリダイズすることができる請求の範囲１８記載のオリゴヌクレオチド。
20. ２０．前記オリゴヌクレオチドが、請求の範囲１記載の核酸単離体の３′領域と ハイプリダイズすることができる請求の範囲１８記載のオリゴヌクレオチド。
21. ２１．【配列があります】 からなるリストから選択される請求の範囲１８，１９および２０のいずれか一つ に記載のオリゴヌクレオチド。
22. ２２．請求の範囲１に記載の核酸がコードしている、フラボノイド３′−ヒドロ キシラーゼまたはその機能誘導体。
23. ２３．前記酵素が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、トウモロコシ、 キンギョソウ、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイまたはアサガオを起源と する酵素である請求の範囲２２記載のフラポノイド３′−ヒドロキシラーゼ。
24. ２４．前記酵素が、ペチュニア、カーネーション、キクまたはパラを起源とする 酵素である請求の範囲２２記載のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ。
25. ２５．酵素がペチュニア起源の酵素である請求の範囲２３記載のフラボノイド３ ′−ヒドロキシラーゼ。
26. ２６．図５に記載されているアミノ酸配列の実質的にすべてまたは一部を含んで なるアミノ酸配列、またはその一つ以上の領域に対して少なくとも４０％の類似 度を有するアミノ配列をもっている請求の範囲２３，２４または２５に記載のフ ラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ。
27. ２７．形質転換植物内で、産生するかまたは産生することができる請求の範囲２ ２〜２６のいずれか一つに記載のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ。
28. ２８．前記形質転換植物が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、キンギ ョソウ、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイ、リシアンタスまたはアサガオ である請求の範囲２７記載のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ。
29. ２９．前記形質転換植物が、ペチュニア、カーネーション、キクまたはパラであ る請求の範囲２７記載のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ。
30. ３０．前記形質転換植物がペチュニアである請求の範囲２７記載のフラポノイド ３′−ヒドロキシラーゼ。
31. ３１．３′−ヒドロキシラーゼまたはその活性変異体もしくは誘導体を合成でき る形質転換植物の製造方法であって；適切な植物の細胞を、請求の範囲１または 請求の範囲１４〜１６のいずれか一つに記載の核酸で、この核酸を最終的に発現 させることができる条件下にて、安定に形質転換し、得られた細胞から形質転換 植物を再成させ、次いで該核酸を発現させることができる充分な時間と条件下で 前記形質転換植物を成長させることを含んでなる方法。
32. ３２．核酸の発現が発育するにつれて調節される請求の範囲３１記載の方法。
33. ３３．酵素が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、トウモロコシ、キン ギョソウ、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイまたはアサガオを起源とする 酵素である請求の範囲３２記載の方法。
34. ３４．酵素が、ペチュニア、カーネーション、キクまたはパラを起源とする酵素 である請求の範囲３３記載の方法。
35. ３５．酵素がペチュニア起源の酵素である請求の範囲３４記載の方法。
36. ３６．形質転換植物がペチュニア、カーネーション、キク、パラ、キンギョソウ 、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイ、リシアンタスまたはアサガオである 請求の範囲３１〜３５のいずれか一つに記載の方法。
37. ３７．形質転換植物がペチュニア、カーネーション、キク、またはパラである請 求の範囲３６記載の方法。
38. ３８．形質転換植物がペチュニアである請求の範囲３６記載の方法。
39. ３９．内因性または既存のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼの活性が低い形 質転換植物の製造方法であって；適切な植物の細胞を、前記フラボノイド３′− ヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列、または前記フラボノイド３′ −ヒドロキシラーゼをコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んでな る核酸分子で安定に形質転換し、得られた細胞から形質転換植物を再生させ、次 いで必要な場合、前記形質転換植物を、前記核酸を発現させることができる充分 な条件下で成長させることを含んでなる方法。
40. ４０．内因性または既存のフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ活性が低い遺伝 子修飾植物の製造方法であって；適当に変化させ、植物細胞に導入した３′−ヒ ドロキシラーゼ遺伝子またはその誘導体もしくは一部分から、その３′−ヒドロ キシラーゼ遺伝子を、相同性組換えによりその内因性配列を修飾することによっ て変化させ、次いで遺伝子修飾植物を上記細胞から再生させることを含んでなる 方法。
41. ４１．核酸分子の発現が発育するにつれて調節される請求の範囲３９記載の方法 。
42. ４２．核酸分子が、図５に記載のヌクレオチド配列のすべてもしくは部分に実質 的に相補的か、または少なくとも４０％相補的なヌクレオチド配列を有している 請求の範囲３９記載の方法。
43. ４３．形質転換植物または遺伝子を変化させた植物が、ペチュニア、カーネーシ ョン、キク、パラ、キンギョソウ、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイ、リ シランタスまたはアサガオである請求の範囲３９または４０に記載の方法。
44. ４４．形質転換植物または遺伝子を変化させた植物が、ペチュニア、カーネーシ ョン、キクまたはパラである請求の範囲３９または４０に記載の方法。
45. ４５．形質転換植物または遺伝子を変化させた植物がペチュニアである請求の範 囲４４記載の方法。
46. ４６．形質転換植物が、請求の範囲１４〜１６のいずれか一つに記載の核酸を導 入することによって製造される請求の範囲３９または４０に記載の方法。
47. ４７．フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ酵素もしくはその機能誘導体をコー ドするヌクレオチド配列、またはフラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ酵素もし くはその機能誘導体をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる 導入核酸分子を保有する形質転換植物もしくはその子孫。
48. ４８．酵素が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、トウモロコシ、キン ギョソウ、タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイまたはアサガオを起源とする 酸素である請求の範囲４７記載の形質転換植物。
49. ４９．酵素が、ペチュニア、カーネーション、キクまたはパラを起源とする酵素 である請求の範囲４８記載の形質転換植物。
50. ５０．酵素がペチュニアを起源とする酵素である請求の範囲４９記載の形質転換 植物。
51. ５１．酵素が、図５に記載されているのと実質的に同じアミノ酸配列、またはそ の一つ以上の領域と少なくとも４０％の類似度を有するアミノ酸配列を有する請 求の範囲４８，４９または５０に記載の形質転換植物。
52. ５２．前記植物が、ペチュニア、カーネーション、キク、パラ、キンギョソウ、 タパコ、ヤグルマソウ、テンジクアオイ、リシアンタスまたはアサガオである請 求の範囲４７〜５１のいずれか一つに記載の形質転換植物。
53. ５３．前記植物が、ペチュニア、カーネーション、キクまたはパラである請求の 範囲５２記載の形質転換植物。
54. ５４．形質転換植物がペチュニアである請求の範囲５３記載の形質転換植物。