JP5553317B2 - 花弁で機能するシソ由来のプロモーター - Google Patents
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Description
アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている(同非特許文献1参照)。例えば、アントシアニンに芳香族アシル基を転移する反応を触媒する酵素遺伝子はリンドウ、ラベンダー、ペチュニアなどから得られている(以下、特許文献1、特許文献2参照)。赤ジソの葉に蓄積されるアントシアニン(マロニルシソニン、3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin)(以下、非特許文献2参照)の合成に関わる酵素遺伝子は、ヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン3グルコシド−芳香族アシル基転移酵素(3AT)の遺伝子{以下、単に「シソアントシアニン3−アシル基転移酵素(3AT)遺伝子ともいう。}を始め既にいくつかの遺伝子が報告されている(同特許文献1参照)。さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写調節についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5'側に位置する転写制御領域の中には、Myb型転写調節因子、bHLH型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Myb型転写調節因子とbHLH型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている(同非特許文献1参照)。
以上のことから、いくつかのプロモーターが花の色を変えるために使われてはきたが、さらに別の花の色を変えるために宿主植物と目的に応じた有用なプロモーターが未だ必要とされている。
外来遺伝子を組換え植物において、好ましくは特定の器官や組織、より好ましくはアントシアニンを蓄積する器官や花弁で発現させる場合には、適切なプロモーター、ターミネーターを選択することが望まれている。本発明が解決しようとする課題は、このような配列を取得することでもある。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
(1)配列番号1に示す塩基配列を含む核酸、
(2)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
(3)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
(4)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。
[7]前記[6]に記載の切り花を用いた切り花加工品。
ここで、ストリンジェンシー条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的に求められるものである。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。具体的には、例えば、低ストリンジェンシー条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、37℃〜42℃の温度条件下、5×SSC及び0.1%SDS溶液中で洗浄することなどが挙げられる。また、高ストリンジェンシー条件としては、例えば、洗浄段階において、65℃、0.1×SSC、0.1%SDS溶液中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェンシー条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
本明細書中、「発現カセット」とは、任意の核酸にプロモーターとターミネーターを連結したDNA断片をいう。
さらに、本発明は、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域を有用な外来遺伝子に連結し、該遺伝子を導入して得られる色変わりなどの有用な形質をもつ植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織、特に、花弁、切り花に関する。形質転換可能である植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
本発明は、上記切り花を用いた加工品(切り花加工品)にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、ブリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning(Sambrook and Russell, 2001)に依った。
実施例1:シソアントシアニン3−アシル基転移酵素染色体遺伝子のクローニング
シソにはアントシアニンを葉に蓄積する赤い変種と蓄積しない緑色の変種が知られている。前者の葉から、その染色体DNAを、報告されている方法(Plant Mol Biol. December 1997; 35(6):915-27参照)で調製した。この染色体DNAをSau3AI(TOYOBO社製)で部分分解し、ショ糖密度勾配法により10〜15kbのDNA断片を含む画分を回収した。この断片を、公知の方法を用いてラムダファージベクターの一種であるEMBL3(Promega社製)のBamHI部位に挿入することにより、染色体DNAライブラリーを作製した。得られたライブラリーをシソに由来するアントシアニン3−アシル基転移酵素のcDNAであるpSAT208(Plant Cell Physiol. April 2000; 41(4):495-502参照)をプローブとして用いてスクリーニングした。ライブラリーのスクリーニングは、既に報告されている方法(Plant Cell Physiol. July 1996; 37(5):711-6参照)に拠った。プローブとハイブリダイズしたプラークを純化後、培養し、得られたファージからDNAを調製した。
上記で得たDNA10μgをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、ハイボンドN(アマシャム社製)にブロットした。この膜を上記と同じようにハイブリダイズしたところ、約6.8kbのDNA断片がプローブとハイブリダイズすることがわかった。同じDNA20μgをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、約6.8kbのDNA断片を、ジーンクリーンを用いて精製し、XbaIで消化したpBluscriptSKII-と連結した。得られたプラスミドをpSPB513とした。このプラスミドに含まれるシソ由来のDNA配列をプライマーウォーキング法により決定した。その塩基配列を配列番号4に示す。この配列には、アントシアニン3−アシル基転移酵素cDNAであるpSAT208と高い相同性を示す領域があり、この領域がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列番号6)は、pSAT208のコードするアミノ酸配列と比べて19個のアミノ酸残基の置換と2個のアミノ酸の欠失が見られ、イントロンは観察されなかった。また、上記pSAT208と高い相同性を示す領域を含む配列は、その開始コドンと考えられるATGの上流に3438bpの配列と、その終止コドンと考えられるTAAの下流に2052bpの配列を含んでいた。上記3438bpの配列内には、アントシアニン3−アシル基転移酵素ではない別のオープンリーディングフレーム(ORF、配列番号5)が存在した。この部分を除く、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を増幅するために、以下の実験を行った。
1ngのpSPB513を鋳型として2種のプライマー(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’(配列番号7、下線部はHindIIIの認識配列)、5’-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’(配列番号8、下線部はBamHIの認識配列)を用いて、PCR(95℃1分間保持後、52℃1分間、72℃2分間、95℃1分間からなる反応を25サイクル)を行なった。増幅された約1.1kbのDNA断片をHindIIIとBamHIで消化した。
特許文献4に記載されたプラスミドpSPB567(エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35Sプロモーターの3'側にパンジー由来のF3'5'H遺伝子が連結され、さらにその3'側にノパリンシンターゼのターミネーターが連結されている)をPacIで消化し、パンジー由来のF3'5'H遺伝子を含むDNA断片をpBin+(Transgenic Research 4, 288-290, 1995参照)のPacI部位にクローニングした。得られたプラスミドの内、エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイク35SプロモーターがpBin+のAscI部位の近くにあるところのプラスミドをpSPB575とした。このプラスミドをHindIIIとBamHIで消化し、ここに前記したシソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域を含む約1.1kbのDNA断片を、HindIIIとBamHIで消化したDNA断片を挿入した。得られたプラスミドをpSFL205とした(図1参照)。
実施例3で得られたプラスミドpSPB3311(バイナリーベクター)を、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法で、ペチュニア品種バカラレッド(サカタのタネ社製)に形質転換し、約20系統の形質転換体を得た。形質転換は公知の方法(Plant J. 1994, 5, p. 81)に拠った。また、同様に、特許文献1に記載されているpBELA11(ラベンダーアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子を植物で発現させるためのバイナリーベクター、エンハンサーを繰り返したカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターとノパリンシンターゼ由来ターミネーターの間にラベンダーのアントシアニン3−アシル基転移酵素cDNAが挿入されている)で、ペチュニア品種バカラレッド(サカタのタネ)を形質転換して、約20系統の形質転換個体を得た。
上記2種のバイナリーベクター(pSPB3311又はpBELA11)を含むアグロバクテリウムを用いて形質転換したペチュニアの花の色は、形質転換前のバカラレッドに比較して相対的に薄い赤色をしていた。それぞれ代表的な組換えペチュニアをそれぞれPT266-7, PT267-1とした。これらのペチュニア花弁のアントシアニンを特許文献4に記載された方法で分析した。組換えペチュニアの花弁では、宿主に比べ高速液体クロマトグラフィーの保持時間が長いアントシアニン量が増加していて、これらの吸収スペクトルは310nm付近に肩が観察された。これは、組換えペチュニアでは芳香族アシル基が結合したと考えられるアントシアニン量が増加したことを示しており、導入したシソあるいはラベンダーのアントシアニン3アシル基転移酵素遺伝子がペチュニアにおいて機能したことを示す。
さらにLC-FT-ICR-MSの手法(J. Japan. Soc. Hort. Sci. 77:94-102 (2008), Plant J. 54:949-962)により宿主と組換えペチュニアのアントシアニンを分析した。この手法を用いるとアントシアニンの精密マススペクトルを測定でき、タンデム質量分析によりMS/MSスペクトルを得ることができる。PT266-7, PT267-1では、宿主には見られないシアニジン(クマロイル)グルコシド〔m/z 595.143717, MS/MS 287〕、デルフィニジン(クマロイル)グルコシド〔m/z 611.139648, MS/MS 303.1〕、ペオニジン(クマロイル)グルコシド〔m/z 609.161119, MS/MS 303.1〕に一致する分子量とMS/MSスペクトルを示すアントシアニンが検出された(〔〕内にm/z と MS/MS のm/zを示した)。
pSPB3311を導入したペチュニアの花弁を同様に5段階に分け、シソのアントシアニン3アシル基転移酵素遺伝子の発現を調べたところ、花弁が開花し始める段階から開花間もない段階で強く発現し、成熟した花弁では発現量が減少していた。一方、pBELA11を導入したペチュニアは、生育段階に係わりなく、一定の転写物の量を示した。以上の結果から、シソ由来のアントシアニン3−アシル基転移酵素転写制御領域は、シソとは異種のペチュニアで構造遺伝子を転写させることができること、そしてその転写はアントシアニン生合成酵素の遺伝子と並行していることが示され、花の色を変化させるためにこのような転写調節領域は有用であることが明らかとなった。換言すれば、本実施例において、シソ由来のアントシアニン3−アシル基転移酵素の染色体遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域は、花弁あるいはアントシアニンが蓄積する器官で、アントシアニンの構造を変える、すなわち花の色を変えるために必要なレベルで機能することが示され、これらは人為的に異種の遺伝子を発現させるために有用であることを意味している。
図1に示すpSFL205を、バラ品種ラバンデに導入し、27系統の組換えバラ植物体を取得した。バラの形質転換に関してはすでに多くの方法が報告されており(例えば、Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994)、米国特許第5480789号、同第5792927号、EP536327A1号公報、米国特許公開第20010007157A1号公報参照)、これらの方法に従って形質転換を実施できる。
具体的にはAgrobacterium tumefaciens Agl0株(Lazo et al. Bio/Technology 9: 963-967, 1991)の菌液中に、無菌苗の葉から誘導したバラのカルスを5分間浸し、滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、継代用培地に移植し、2日間暗所で共存培養した。
その後、カルベニシリンを400mg/l 加えたMS液体培地で洗浄し、継代用培地にカナマイシン50mg/l とカルベニシリン200mg/lを加えた選抜・除菌用培地へ移植した。選抜培地上で生育阻害を受けず、正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、カナマイシン耐性カルスを選抜した。
カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、カナマイシン50mg/l、カルベニシリン 200mg/lを添加した再分化用の培地で培養し、カナマイシン耐性シュートを得た。得られたシュートは1/2MS培地で発根させた後、馴化を行った。馴化個体は鉢上げ後、閉鎖系温室で栽培して開花させた。
バラ花弁に含まれるアントシアニジンの量は次のように測定した。凍結乾燥した花弁0.5gを、4mlの0.1%TFAを含む50% アセトニトリル(CH3CN)中で20分間、超音波下で抽出し、0.45μmのフィルターで濾過した。上記濾液0.2mlをガラス試験管中で減圧乾固し、0.2mlの6N塩酸(HCl)に溶解し、100℃で20分間、加水分解を行った。分解後のアントシアニジンは0.2mlの1-ペンタノールで抽出し、有機層をHPLCで以下の条件により分析した。カラムはODS-A312(6mmφx15cm、ワイエムシー株式会社)を用い、移動相としてAcOH:MeOH:H2O=15:20:65の溶液を用い、流速1ml/minで溶出した。検出はフォトダイオードアレイ検出器 SPD-M10A(島津製作所)で600-400nmのスペクトルを測定し、吸収極大(λmax)及びリテンションタイム(R.T.)で同定し、520nmの吸光度の面積で定量した。このHPLC条件下でデルフィニジン及びシアニジンのR.T.及びλmaxは、それぞれ、4.0分と5.2分、及びび534nmと525nmであった。同定と定量には、フナコシ株式会社より購入したデルフィニジン塩酸塩及びシアニジン塩酸塩を標品として用いた。
組換えバラ花弁に含まれるデルフィジンの含有率(総アントシアニジン量の中のデルフィニジンの割合)は最高51%で平均は20.5%であった。この結果は、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素転写調節領域が、シソとは異種の植物において目的の遺伝子を転写させることができることを示している。
Claims (7)
- 以下の:
(1)配列番号1に示す塩基配列を含む核酸、
(2)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、及び
(3)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号1に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸。 - 請求項1に記載の核酸を含む発現ベクター又は発現カセット。
- 配列番号2に示す塩基配列を含む、請求項2に記載の発現ベクター又は発現カセット。
- 請求項2又は3に記載の発現ベクター又は発現カセットにより形質転換されたキクを除く非ヒト宿主。
- 請求項1に記載の核酸が導入された、キクを除く植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
- 切り花である、請求項5に記載のキクを除く植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
- 請求項6に記載の切り花を用いた切り花加工品。
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