JP5697040B2 - デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法 - Google Patents
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Description
アントシアニンの生合成に関わる酵素や該酵素をコードする遺伝子はよく研究されている(同非特許文献1参照)。例えば、アントシアニンに芳香族アシル基を転移する反応を触媒する酵素遺伝子はリンドウ、ラベンダー、ペチュニアなどから得られている(以下、特許文献1、特許文献2参照)。赤ジソの葉に蓄積されるアントシアニン(マロニルシソニン、3-O-(6-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranosyl)-5-O-(6-O-malonyl-β-D-glucopyranosyl)-cyanidin)(以下、非特許文献2参照)の合成に関わる酵素遺伝子は、ヒドロキシシナモイルCoA:アントシアニン3グルコシド−芳香族アシル基転移酵素(3AT)の遺伝子{以下、単に「シソアントシアニン3−アシル基転移酵素(3AT)遺伝子」ともいう。}を始め既に報告されている(特許文献1参照)。さらにアントシアニンの生合成酵素の遺伝子の転写制御(調節)についても知見が得られている。これらの遺伝子の開始コドンの5'側に位置する転写調節領域の中には、Myb型転写調節因子、bHLH型転写調節因子が結合するシスエレメント配列がある。Myb型転写調節因子とbHLH型転写調節因子がペチュニア、トウモロコシ、シソなどのアントシアニンの合成を制御していることも知られている(非特許文献1参照)。
したがって、いくつかのプロモーターが花の色を変えるために使われてきたが、さらに別の花の色を変えるために宿主植物と目的に応じた有用なプロモーターが求められている。
したがって、青色系の育種は、新たな需要を喚起するための目標の一つとされている。キクの花色は、アントシアニンとカロテノイドの組み合わせにより発現している。アントシアニンは基本骨格であるアントシアニジンの構造の違いや、糖や有機酸による修飾の違いなどにより、多様な色を発現できる。しかし、キクの花色を担うアントシアニンは、シアニジンの3位がグルコースとマロン酸により修飾された二種類(cyanidin 3-O-(6"-O-monomalonyl-β-glucopyranosideとcyanidin 3-O-(3",6"-O-dimalonyl-β-glucopyranoside)であることが知られている(以下、非特許文献6参照)。また、それらの構造は比較的単純である(図1参照)。これにより、キクのアントシアニンによる発色の幅が極めて小さい要因になっている。ところで、青色系の発色は、主にアントシアニンによるものであるが、キクには、鍵となる酵素であるフラボノイド3',5'-水酸化酵素(F3'5'H)をコードする遺伝子が存在しないため、青を発色するデルフィニジン系アントシアニンが生合成されない(図1参照)。そこで、キクの花弁に蓄積するアントシアニン系色素を改変して、青色系の花色をもつキクの作出を可能にするために、遺伝子工学的手法を用いたキクのアントシアニンの発現制御技術の開発が望まれている。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
(1)配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列を含む核酸、
(2)キク由来フラバノン3-水酸化酵素(F3H)遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、
(3)キク由来フラバノン3-水酸化酵素(F3H)遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列から成る核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる核酸、及び
(4)キク由来フラバノン3-水酸化酵素(F3H)遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸を転写調節領域として用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素(F3'5'H)をキク植物において発現させて、その花弁にデルフィニジンを含むキク植物を生産する方法。
[8]配列[7]に記載の切り花を用いた切り花加工品。
本明細書中、「発現カセット」とは、任意の核酸にプロモーターとターミネーターを連結したDNA断片をいう。
本発明は、上記切り花を用いた加工品(切り花加工品)にも関する。ここで、切り花加工品としては、当該切り花を用いた押し花、プリザーブドフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning(Sambrook and Russell, 2001)に依った。
特許文献6に記載されたpBIEF1αを、制限酵素HindIIIとBamHIで消化することにより、タバコEF1αのプロモーター配列を含む約1.2kbのDNA断片を得た。このDNA断片を、特許文献4に記載されたpSPB909のアイリスDFR cDNAの5'側に挿入することによりプラスミドpSFL339を得た。同様に、アイリスDFR cDNAの代わりにペチュニアDFR cDNA(国際公開公報WO 96/36716に記載)を挿入したプラスミドpSFL340も構築した。
青いサイネリアセネッティー(サントリーフラワーズ社)の蕾の花弁から定法に基づいてRNAを抽出した。このRNAから調製したpoly-A + RNAを用いて、ZAP-cDNA(登録商標)Library Construction Kit(ストラタジーン社、製品番号200450)を用いて製造者の推奨する方法に従って、cDNAライブラリーを作製した。このcDNAライブラリーを、DIGシステム(Roche Applied Science社)で標識したチョウマメF3'5'H cDNA(Clitoria ternatea)(Plant Biotechnology 23, 5-11 (2006)参照)を用いて、同社が推奨する方法でスクリーニングを行った。得られた48個のシグナルを示すファージを純化した。これらのファージから製造者(ストラタジーン社)の推奨する方法でin vivo excisionによりプラスミドを得た。
国際特許出願PCT/AU03/01111に記載されているバラ由来のカルコン合成酵素プロモーターにパンジー由来のF3'5'HBP#18遺伝子を連結したバイナリーベクターを構築し、pBRBP18とした。参考例1及び2に記載したように、このバイナリーベクターが含む遺伝子をキク品種キク品種94-765に導入した。形質転換キクの花弁のアントシアニジンを分析したところ、全アントシアニジンに対し最高5.4%のデルフィニジンが検出されたが、花の色に変化は見られなかった。
また、バラカルコン合成酵素遺伝子プロモーターを用いたデルフィニジン生産の例として、表1中、上から9番目に記載するpSPB3325(バラCHSpro::パンジー#18+バラCHSp::キクF3'H IR)が挙げられ、この例では、デルフィニジン生産は最高3.6%であった。
(1)シソアントシアニン3−アシル基転移酵素染色体遺伝子のクローニング
シソにはアントシアニンを葉に蓄積する赤い変種と蓄積しない緑色の変種が知られている。前者の葉から、その染色体DNAを、報告されている方法(Plant Mol Biol. December 1997; 35(6):915-27参照)で調製した。この染色体DNAをSau3AI(TOYOBO社製)で部分分解し、ショ糖密度勾配法により10〜15kbのDNA断片を含む画分を回収した。この断片を、公知の方法を用いてラムダファージベクターの一種であるEMBL3(Promega社製)のBamHI部位に挿入することにより、染色体DNAライブラリーを作製した。得られたライブラリーをシソに由来するアントシアニン3−アシル基転移酵素のcDNAであるpSAT208(Plant Cell Physiol. April 2000; 41(4):495-502参照)をプローブとして用いてスクリーニングした。ライブラリーのスクリーニングは、既に報告されている方法(Plant Cell Physiol. July 1996; 37(5):711-6参照)に拠った。プローブとハイブリダイズしたプラークを純化後、培養し、得られたファージからDNAを調製した。
上記で得たDNA10μgをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、ハイボンドN(アマシャム社製)にブロットした。この膜を上記と同じようにハイブリダイズしたところ、約6.8kbのDNA断片がプローブとハイブリダイズすることがわかった。同じDNA20μgをXbaIで消化し、0.7%アガロースゲルで分離した後、約6.8kbのDNA断片を、ジーンクリーンを用いて精製し、XbaIで消化したpBluescriptSKII-と連結した。得られたプラスミドをpSPB513とした。このプラスミドに含まれるシソ由来のDNA配列をプライマーウォーキング法により決定した。その塩基配列を配列番号4に示す。この配列にはアントシアニン3−アシル基cDNAであるpSAT208と高い相同性を示す領域があり、この領域がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列番号6)はpSAT208のコードするアミノ酸配列と比べて19個のアミノ酸残基の置換と2個のアミノ酸の欠失が見られ、イントロンは観察されなかった。また、上記pSAT208と高い相同性を示す領域の配列は、その開始コドンと考えられるATGの上流に3438bpの配列と、その終止コドンと考えられるTAAの下流に2052bpの配列を含んでいた。上記3438bpの配列内には、アントシアニン3−アシル基転移酵素ではない別のオープンリーディングフレーム(ORF、配列番号5)が存在した。この部分を除く、シソアントシアニン3−アシル基転移酵素遺伝子の転写調節領域を増幅するために、以下の実験を行った。
1ngのpSPB513を鋳型として2種のプライマー(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’(配列番号7、下線部はHindIIIの認識配列)、5’-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’(配列番号8、下線部はBamHIの認識配列)を用いて、PCR(95℃1分間保持後、52℃1分間、72℃2分間、95℃1分間からなる反応を25サイクル)を行なった。増幅された約1.1kbのDNA断片をHindIIIとBamHIで消化した。
パンジーのフラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子BP#40(WO 04/020637参照)の転写調節領域をTaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kitを用いて、以下のように増幅した。
パンジーの葉からDNA easy plant kit (QIAGEN社)を用いて染色体DNAを調製した。3μgの染色体DNAを制限酵素HindIIIにより消化した。消化したDNAをHindIII末端DNA(TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kitに含まれる)と、Ligation High (TaKaRa)を用いて、16℃で40分間反応させ、連結した。反応液4μlを10μlの水で薄め、連結したDNAを94℃10分間の処理により変性させた後、氷中で冷却した。5pmolのプライマーC1 (5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’、配列番号9、HindIIIカセット配列の一部の配列でKitに含まれる)と5pmolのプライマーBP40-i5 (5’-AGGTGCATGATCGGACCATACTTC-3’、配列番号10、BP#40の翻訳領域の相補鎖に相当する)を加え、キットのプロトコールに従い、25μlの反応液で、98℃20秒間、68℃で15分間の反応を30回繰り返した。反応液を水で10倍に希釈した。このうち、0.5μlを鋳型として、5pmolのプライマーC2(5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’、配列番号11、HindIIIカセット配列の一部の配列でKitに含まれる)と5pmolのプライマー BP40-i7 (5’-GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3’、配列番号12)を含む25μlの反応液で、98℃で5分間反応後、98℃で20秒間、68℃で15分間の反応を30回繰り返した。
約2kbのBP#40の5'-非翻訳領域と200bpの翻訳領域を増幅するために、200ngのパンジーの染色体DNAを鋳型として、50pmolのプライマー BP40-i7 (配列番号12)と50pmolのプライマーBP40 pro-F (5’-ACTCAAACAAGCATCTCGCCATAGG-3’、配列番号13、BP#40遺伝子の5'-非翻訳領域にある配列)を用いて25μlの反応液でPCRを行なった。98℃5分間処理した後、98℃20秒間と68℃15分間からなる反応を30回繰り返した。増幅されたDNA断片をpCR2.1に挿入した。このDNA断片には約2.1kbの5’-非翻訳領域と200bpの翻訳領域が含まれていた。このプラスミドをpSFL614とした。プラスミドpSFL614配列の塩基配列を配列番号14に示す。
pSFL620をPacIで消化後、約3.2kbのDNA断片を回収した。このDNA断片をpBin+のPacI部位に挿入した。得られたプラスミドをpSPB3317とした。上述のpSPB3311をAscIとXbaIで消化して得られる断片を、pSPB3317のAscIとXbaI部位に導入し、得られたプラスミドをpSPB3323とした。
上記(4)で調製したpSPB3323をアグロバクテリウムに導入し、このアグロバクテリウムを用いてキク品種94-765(精興園、未発売)を公知の方法により形質転換した。6系統の形質転換系統を取得した。
分析サンプルは、高速液体クロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析した。カラムはInertsil ODS-2(粒径5μm, 4.6×250mm, ジーエルサイエンス)を用い、流速0.8ml/minで、移動相は1.5%リン酸を含む、5%酢酸、6.25%アセトニトリルから20%酢酸、25%アセトニトリルの直線濃度勾配20分間の後、1.5%リン酸および20%酢酸を含む25%アセトニトリルで5分間のイソクラティック溶出を行った。検出はAgilent 1100 シリーズ ダイオードアレイ検出器(ジーエルサイエンス)を用い、250nmから600nmの波長領域を検出し、530nmの吸光度の面積により各アントシアニジンの存在比を求めた。
分析の結果、形質転換体である分析系統1300-3、1300-4、1300-5、及び1300-6において、それぞれ、デルフィニジンが全アントシアニジンの0.9%、0.8%、1.4%、及び0.6%検出された。これは、パンジーのBP#40転写調節領域がBP#40の転写を司ったことを示唆するが、花色の変化にはいたらなかった。
ハマナスの染色体DNAライブラリーを、λBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen, http://www.merckbiosciences.com/product/69242)を用いて、以下のように作製した。ハマナスの若い葉から、Nucleon Phytopure [Registered] (TEPNEL Life Sciences)を用いて染色体DNAを調製した。約100μgの染色体DNAを制限酵素Sau3AIで部分消化した。
このDNA断片をdGTP とdATPの存在下においてDNA polymerase I Klenow fragment (TOYOBO)で部分的にフィルインをし、ショ糖密度勾配遠心により分画した。約13kbの大きさにDNAを回収し、エタノール沈殿により濃縮した。約180ngのDNAを1μL の λBlueSTARTM Xho I Half-Site Arms Kitと4℃で15時間連結した後、in vitro packaging反応を行ない、染色体ライブラリーを得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、品種94-765から組換えキクを得た。花弁でアントシアニジン全量のうち0.6%程度のデルフィジンを生産している系統があった。
また、ハマナスDFRプロモーターを用いた他の参考例は、表1中、上から2番目(pSPB3316(ハマナスDFRpro::パンジー#40+バラANSpro::トレニア5GT、デルフィニジン生産系統無し)と5番目(pSPB3325(ハマナスDFRpro::パンジー#40+リンドウ3'GTpro::トレニアMT、デルフィニジン最高0.9%)がある。いずれも花色の変化には至らなかった。
参考例5で作製したハマナス染色体DNAライブラリーをトレニアのフラバノン3-水酸化酵素(F3H) cDNA (NCBI No. AB211958)によりスクリーニングし、シグナルを示すプラークを得た。そのうち1プラークについて参考例5と同様にプラスミドに変換した。これを制限酵素SpeIで消化し、2.6kbのDNA断片を回収し、pBluescript SKII- (STRATAGENE)のSpeI部位にサブクローングすることにより、プラスミドpSPB804を得た。このプラスミドはF3Hに相同性を示す塩基配列を有していた。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、品種94-765から組換えキクを3系統得たが、花弁でデルフィニジン生産が見られた系統はなかった(表1参照)。
pSFL814(参考例6)を鋳型に、ADH-BP40-Fd(5'-CAAGAAAAATAAATGGCAATTCTAGTCACCGAC-3'、配列番号26)とNcoI-BP40-Rv(5'-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3'、配列番号27)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、及びpBI221 ADH-221を鋳型にBamHI-ADH-Fd(5'-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号28)とBP40-ADH-Rv(5'-TAGAATTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号29)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片を混合して鋳型に用い、BamHI-ADH-Fd(5'-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号30)とNcoI-BP40-Rv(5'-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3'、配列番号31)をプライマーに用いて、PCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがパンジーF3'5'H#40の開始コドンに直結したDNA断片を得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の得られた形質転換体4系統のうちでデルフィニジンが検出された個体はなかった(表1参照)。
pBI221 ADH221を鋳型に、ADH KpnI Forward (5'-CGGTACCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号32)とGUS19R(5'-TTTCTACAGGACGTAACATAAGGGA-3'、配列番号33)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片を、KpnIとSmaIで消化して約110bpのタバコADH-5'UTR DNA断片を得た。このDNA断片と、pBRBP18(pBIN19上にバラCHSpro::パンジーF3'5'H#18::NOSterの発現カセットを入れたもの)をKpnIとSmaIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結して、pBIN19バラCHSpro::ADH-パンジーF3',5'H#18::NOSterを得た。このプラスミドでは、タバコADH-5'UTRとパンジーF3'5'H#18の間に38bのスペーサーが存在する。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク30系統を得た。このうち5系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は1.9%に達した。しかし、花色の変化は見られなかった。
pBRBP18(参考例3)を鋳型に、HAPS-RhCHSpro3k-Fd(5'-CCAAGCTTGGCGCGCCTTAATTAAATTTAAATCAGCAAGAGTTGAAGAAATAG-3'、配列番号85)とNS-RhCHSpro3k-Rv(5'-AAAGCTAGCACTAGTCATCTCGGAGAAGGGTCG-3'、配列番号86)をプライマーとして用い、Pyrobest Polymerase(Takara)を用いたPCRにより得られたDNA断片を、HindIIIとNheIで消化し、pBI121 ADHNFをHindIIIとXbaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片と連結することにより得られたバイナリーベクターをpBI121-RhCHSp-GUS-NOStとした。
pBI121-RhCHSp-GUS-NOStをSpeIおよびEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクターの断片に、実施例10で得られたpCR-ADHBP40-SpeSacをSpeI及びEcoICRIで消化して得られるADHNF-パンジーF3'5'H #40 DNA断片を、連結して、pBI121-バラCHSpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterを得て、Agrobacterium tumefaciens EHA105株に形質転換した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク19系統を得たが、デルフィニジンが検出された個体はなかった。
キクのフラバノン3-水酸化酵素遺伝子(F3H)cDNA断片を用いたゲノミックライブラリのスクリーニングにより得られた、F3Hのプロモーター領域を含むDNA断片をサブクローニングして得られたpBluescript SK- gF3H9(菅野ら(2001)園学雑70(別2)193、配列番号35)を鋳型に、HANS-F3Hpro1k-Fd (5'-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3'、配列番号36、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列)と、SNM-F3Hpro-Rv(5'-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3'、配列番号37、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列)をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1(Invitrogen)にクローニングして、pCR HANS-CmF3Hp1k-NSを得た。また、HANS-F3Hpro1k-Fdと、NSM-F3Hpro-Rv(5'-GCTAGCACTAGTACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3'、配列番号38、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列)をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングして、pCR HANS-CmF3Hp1k-SNを得た。HANS-F3Hpro1k-FdとBclI-CmF3Hp-Rv(5'-TTTTGATCATTTTTTATTTTTTCTTCACACAGTG-3'、配列番号39、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列)をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングしてpCR HANS-CmF3Hp1k-BclIを得た。さらに、pBI121 ADHNF(Satoh J. et al., (2004) J Biosci Bioengineer)をHindIII及びXbaIで消化して得られるバイナリーベクター断片とpCR HANS-CmF3Hp1k-SNをHindIII及びNheIで消化して得られる約1.1kbのキクF3HプロモーターDNA断片を連結することにより、pBI121 HANS-CmF3Hp1k-Sを得た。
pBluescript SK- gF3H9を鋳型に、HANS-F3Hpro500-Fd(5'-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTACTGTTCGAACCTACAAAGG-3'、配列番号83、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列)と、MX-F3Hpro-Rv(5'-TTTCTAGAACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3'、配列番号84、下線部はF3Hのプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列)をプライマーとして用いてPCRにより増幅したDNA断片をpCR2.1にクローニングして、pCR HANS-CmF3Hpro500-Xを得た。また、pBI121 ADHNFをHindIIIとXbaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片と、pCR HANS-CmF3Hpro500-XをHindIII及びXbaIで消化して得られる約500bpのキクF3HプロモーターDNA断片を連結することにより、pBI121 HANS-CmF3Hp500-Xを得た。
DNAデータベースGenBankに登録されているカンパニュラ(Campanula medium)のF3'5'HcDNA(アクセション番号D14590)の翻訳配列に基づいて2種のプライマーCamF1 (5’-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3’、配列番号49)とCamR1 (5’-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3'、配列番号50)を合成した。市販のカンパニュラの蕾の花弁からRNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN社)を用いてRNAを抽出し、RT-PCRキットを用いて1st strand DNAを合成した。この1st strand DNAを鋳型に、プライマーを用いてPCRを実施した。得られたDNA断片をpCR-TOPO IIにクローニングした。この内、クローン#4(pSPB2561とした)の塩基配列を配列番号51と決定した。
pSPB2561を鋳型に、ADH-Campa-Fd(5'-CAAGAAAAATAAATGTCTATAGACATAACCATTC-3'、配列番号53)とHpaI-Campa-Rv(5'-GTTAACATCTCTGGCACCACC-3'、配列番号54)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd(配列番号42)とCampa-ADH-Rv(5'-GTCTATAGACATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号55)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd(配列番号42)とHpaI-Campa-Rv(5'-GTTAACATCTCTGGCACCACC-3'、配列番号56)をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがカンパニュラF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後にXbaIとHpaIで消化して得られる約650bの断片と、pSPB2561をXbaIとHpaIで消化して得られるベクター断片とを連結してpCR ADHNF-Campanula F3'5'Hを得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク48系統を得た。このうち30系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は80.5%に達した。
pBI121キクF3Hpro1k::ADHNF-カンパニュラF3'5'H::NOSterからpSPB3738を構築した。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens AGL0株に導入し、これを用いてキク品種Sei Taitan(精興園)を形質転換した。得られた26系統の組換えキクのうち6系統で花色の変化が見られ、薄層クロマトグラフィーにより、デルフィニジンを検出できた。
pBluescript SK-にクローニングしたトルコギキョウF3'5'H遺伝子(EgF3'5'H, GenBank AB078957)を、XhoIで消化した後に、Blunting High (TOYOBO)で平滑末端化し、さらに、XbaIで消化して得られた約1.9kbのEgF3'5'H DNA断片を、XbaI及びEcoICRIで消化して得られるpIG121-Hmバイナリーベクターの断片に連結することにより、pIG121-Hm 35S::EgF3'5'Hを得た。
次に、pBluescript SK- EgF3'5'Hを鋳型に、ADH-EgF3'5'H-Fd(5'-CAAGAAAAATAAATGGCTGTTGGAAATGGCGTT-3'、配列番号40)とHpaI-EgF3'5'H-Rv(5'-GTTAACGCTGAGCCTAGTGCC-3'、配列番号41)をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221(Satoh J. et al., (2004) J Biosci Bioengineer)を鋳型に、XbaI-ADH-Fd(5'-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3'、配列番号42)及びEgF3'5'H-ADH-Rv(5'-TCCAACAGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号43)をプライマーに用いてPCRにより増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd(配列番号42)及びHpaI-EgF3'5'H-Rv(5'-GTTAACGCTGAGCCTAGTGCC-3'、配列番号44)をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bp(Satoh J. et al., (2004) J Biosci Bioengineer)がEgF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaI及びHpaIで消化して得られる約1.3kbのDNA断片と、pIG121-Hm 35S::EgF3'5'HをXbaI及びHpaIで消化して得られるバイナリーベクターの断片を連結することにより、pIG121-Hm 35S::ADHNF-EgF3'5'Hを得た。このpIG121-Hm 35S::ADHNF-EgF3'5'HをHindIII及びXbaIで消化して得られる約1.2kbのEgF3'5'HのDNA断片と約15kbのバイナリーベクターのDNA断片、さたにpCR HANS-CmF3Hp1k-MNSをHindIII及びSpeIで消化して得られるDNA断片を連結し、pIG121-Hm キクF3Hpro1k::ADHNF-トルコギキョウF3'5'H::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク5系統を得た。このうち1系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は4.4%であった。
pBluescript SK-にクローニングしたロベリアの花弁由来のF3'5'H遺伝子(LeF3'5'H1, GenBank AB221077及びLeF3'5'H4, GenBank AB221078)をKpnIで消化した後に、Blunting High (TOYOBO)で平滑末端化し、さらに、XbaIで消化して得られた約1.9kbのEgF3'5'H DNA断片を、XbaI及びEcoICRIで消化して得られるpIG121-Hmバイナリーベクターの断片に連結することにより、pIG121-Hm 35S::LeF3'5'H1及びpIG121-Hm 35S::LeF3'5'H4を得た。
pBI121-キクF3Hpro1k::ADHNF-ロベリアF3'5'H1::NOSterを形質転換したアグロバクテリウムを用いて、キク品種'94-765'由来の組換えキク12系統を得たが、デルフィニジンを含有する個体は得られなかった。また、pBI121-キクF3Hpro1k::ADHNF-ロベリアF3'5'H4::NOSterを形質転換したアグロバクテリウムを用いて、キク品種'94-765'由来の組換えキク34系統を得たが、デルフィニジンを含有する個体は得られなかった。
pCR HANS-CmF3Hp1k-BclIをAscI及びBclIで消化することにより得られる約1.1kbのキクF3HプロモーターDNA断片と、pBinPLUS ハマナスF3Hpro::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSTerをAscIとBamHIで消化することにより得られるバイナリーベクターの断片を連結することにより、pBinPLUSキクF3Hpro1k::ADHNF-パンジーF3'5'H#40::NOSterを得た。このプラスミドをAgrobacterium tumefaciens EHA105株に導入した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク6系統を得た。このうち4系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は26.8%に達した。
参考例2で得たシネラリアF3'5'H(pSPB2774)を鋳型に、ADH-ScF3'5'H-Fd(5'-CAAGAAAAATAAATGAGCATTCTAACCCTAATC-3'、配列番号57)とNdeI-ScF3'5'H-Rv(5'-CATATGTTTAGCTCCAGAATTTGG-3'、配列番号58)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd(配列番号42)とScF3'5'H-ADH-Rv(5'-TAGAATGCTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号59)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd(配列番号42)とNdeI-ScF3'5'H-Rv(5'-CATATGTTTAGCTCCAGAATTTGG-3'、配列番号60)をプライマーに用いてPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがシネラリアF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとNdeIで消化して得られたDNA断片と、pSPB2774をXbaIとNdeIで消化して得られたベクター断片とを連結してpBluescript Sk- ADHNF-シネラリアF3'5'Hを得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキ50系統を得た。このうち37系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は36.2%に達した。
pBluescript SK-にクローニングされたリンドウF3'5'H(プラスミドpG48、WO2004/020637に記載)を鋳型にADH-Gentian-Fd(5'-CAAGAAAAATAAATGTCACCCATTTACACCACCC-3'、配列番号61)とSalI-GentianF3'5'H-Rv(5'-GTCGACGCTATTGCTAAGCC-3'、配列番号62)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd(配列番号42)とGentian-ADH-Rv(5'-AATGGGTGACATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号63)をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd(配列番号42)とSalI-GentianF3'5'H-Rv(5'-GTCGACGCTATTGCTAAGCC-3'、配列番号64)をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがリンドウF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとSalIで消化して得られる約400bのDNA断片と、pG48をXbaIとSalIで消化して得られるベクター断片とを連結してpBluescript SK- ADHNF-リンドウF3'5'Hを得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク21系統を得たが、デルフィニジンを含有する個体は得られなかった。
pBluescript SK-にクローニングされたバーベナF3'5'H(pHVF7、Plant Biotechonology 23, 5-11, 2006, DNAデータベースアクセッション番号ABA234898)を鋳型に、ADH-Verbena-Fd(5'-CAAGAAAAATAAATGACGTTTTCAGAGCTTATAAAC-3'、配列番号65)とNcoI-VerbenaF3'5'H-Rv(5'-CCATGGAGTAAATCAGCATCTC-3'、配列番号66)をプライマーとして用いてPCRで増幅したDNA断片、並びにpBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd(配列番号42)とVerbena-ADH-Rv(5'-TGAAAACGTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3'、配列番号67)をプライマーとして用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd(配列番号42)とNcoI-VerbenaF3'5'H-Rv(5'-CCATGGAGTAAATCAGCATCTC-3'、配列番号68)をプライマーとして用いたPCRにより、タバコADH-5'UTR 94bpがバーベナF3'5'Hの開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとNcoIで消化して得られる約700bのDNA断片と、pHVF7をXbaIとNcoIで消化して得られるベクター断片を連結してpBluescript SK- ADHNF-バーベナF3'5'Hを得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク17系統を得た。このうち11系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は最高28.4%であった。
Uni-ZAP XR Vector kit (STRATAGENE社)を用いて製造者の推奨する方法により、キンギョソウの一種である(Antirrhinum kelloggii、青キンギョソウ)の蕾から得たmRNAを用いて、cDNAライブラリーを作製した。このライブラリーを参考例2に記載した方法でスクリーニングし、2種類のF3'5'HcDNA#1(配列番号69)とF3'5'HcDNA#12(配列番号71)をそれぞれ含むプラスミドpSPB3145とpSPB3146を得た。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種94-765由来の組換えキク1系統を得た。この系統の花弁でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は2.9%に達した。
実施例1で得られたpBI121 HANS-CmF3Hp500-XをXbaIとEcoICRIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片と、実施例6で得られたpCR2.1 ADHNF-シネラリアF3'5'HをXbaIとEcoRVで消化して得られる、ADHNF-シネラリアF3'5'HのDNA断とを連結してpBI121-キクF3Hpro500::ADHNF-シネラリアF3'5'H::NOSterを得て、Agrobacterium tumefaciens EHA105株に形質転換した。
この形質転換アグロバクテリウムを用いて、キク品種大平由来の組換えキク7系統を得た。このうち5系統でデルフィニジンが検出され、デルフィニジン含有率は25.5%に達した。
Claims (7)
- 以下の:
(1)配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列を含む核酸、
(2)キク由来フラバノン3-水酸化酵素(F3H)遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列に対して1個又は数個の塩基配列の付加、欠失及び/又は置換により修飾された塩基配列を含む核酸、及び
(3)キク由来フラバノン3-水酸化酵素(F3H)遺伝子の転写調節領域として機能することができ、かつ、配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する核酸、
から成る群から選ばれる核酸を転写調節領域として用いて、フラボノイド3',5'-水酸化酵素(F3'5'H)をキク植物において発現させるステップを含む、その花弁にデルフィニジンを含むキク植物を生産する方法であって、該キク植物は、F3'5'Hをコードする遺伝子、及び該転写調節領域を含む発現ベクター又は発現カセットにより形質転換されており、かつ、該F3'5'Hは、カンパニュラ、サイネリア(シネラリア)、バーベナ、又はパンジー由来である、前記方法。 - 前記転写調節領域に加え、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーをさらに用いる、請求項1に記載の方法。
- 前記翻訳エンハンサーが前記F3'5'H遺伝子の開始コドンに直結されている、請求項2に記載の方法。
- 前記花弁中のデルフィニジンの含有率が、アントシアニジンの合計量の25質量%以上であり、前記転写調節領域に加え、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ由来の翻訳エンハンサーをさらに用い、かつ、前記転写調節領域が、配列番号34又は配列番号87に示す塩基配列を含む核酸である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法により形質転換された、キク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
- 切り花である、請求項5に記載のキク植物若しくはその子孫若しくはその栄養増殖体又はその部分若しくは組織。
- 請求項6に記載の切り花から作られた切り花加工品。
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