JP3507858B2 - 植物において外来遺伝子の発現を安定化させるｄｎａ断片、外来遺伝子を植物において安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物 - Google Patents
植物において外来遺伝子の発現を安定化させるｄｎａ断片、外来遺伝子を植物において安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物Info
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- JP3507858B2 JP3507858B2 JP32940099A JP32940099A JP3507858B2 JP 3507858 B2 JP3507858 B2 JP 3507858B2 JP 32940099 A JP32940099 A JP 32940099A JP 32940099 A JP32940099 A JP 32940099A JP 3507858 B2 JP3507858 B2 JP 3507858B2
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/822—Reducing position variability, e.g. by the use of scaffold attachment region/matrix attachment region (SAR/MAR); Use of SAR/MAR to regulate gene expression
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物細胞において
外来遺伝子の発現を安定化させるＤＮＡ断片、及び外来
遺伝子を植物細胞において安定に発現させるための遺伝
子導入方法、更には外来遺伝子を安定に発現させた形質
転換植物に関するものである。
外来遺伝子の発現を安定化させるＤＮＡ断片、及び外来
遺伝子を植物細胞において安定に発現させるための遺伝
子導入方法、更には外来遺伝子を安定に発現させた形質
転換植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】植物に種々の性質を付与する目的で、外
来の遺伝子を導入した形質転換植物が作製されている
が、その場合に個体間による導入遺伝子発現のばらつき
が大きいことが問題となる。このばらつきは、導入され
た染色体上の位置によると考えられている。外来遺伝子
が活性化クロマチン領域に挿入された場合には高い発現
が得られ、反対に不活性化クロマチン（ヘテロクロマチ
ン）領域に挿入された場合には十分な発現が得られない
とされ（Galli,1:166-172,Current opinion in plant t
echnology (1998) 1:166-172, Matzke et al.,Current
opinion in plant technology (1998) 1: 142-148 ）、
このような現象は「ポジション効果」と呼ばれている。
このようなポジション効果のために植物に導入した外来
遺伝子は、しばしば全く発現しないか、発現しても弱い
か、あるいは発現しても植物の成長や外環境により発現
しなくなることがある。この現象は遺伝子組み換え植物
の商業化に際し障害となっており、導入遺伝子の発現を
安定化する手法の確立が必要とされる。
来の遺伝子を導入した形質転換植物が作製されている
が、その場合に個体間による導入遺伝子発現のばらつき
が大きいことが問題となる。このばらつきは、導入され
た染色体上の位置によると考えられている。外来遺伝子
が活性化クロマチン領域に挿入された場合には高い発現
が得られ、反対に不活性化クロマチン（ヘテロクロマチ
ン）領域に挿入された場合には十分な発現が得られない
とされ（Galli,1:166-172,Current opinion in plant t
echnology (1998) 1:166-172, Matzke et al.,Current
opinion in plant technology (1998) 1: 142-148 ）、
このような現象は「ポジション効果」と呼ばれている。
このようなポジション効果のために植物に導入した外来
遺伝子は、しばしば全く発現しないか、発現しても弱い
か、あるいは発現しても植物の成長や外環境により発現
しなくなることがある。この現象は遺伝子組み換え植物
の商業化に際し障害となっており、導入遺伝子の発現を
安定化する手法の確立が必要とされる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】近年、多様な遺伝子を
導入した形質転換体の解析から、例外的に染色体上の導
入位置に依存せずに発現する現象が見出され、その後の
解析から、そのような現象は３つのケースに大別されて
いる。すなわち、インスレーター、ＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ）およびＭＡＲ（ｍａ
ｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）の関
与が示唆され、これら三者は作用機構は異なるが染色体
上の境界として機能し、周辺のクロマチンの影響を遮断
すると考えられている。
導入した形質転換体の解析から、例外的に染色体上の導
入位置に依存せずに発現する現象が見出され、その後の
解析から、そのような現象は３つのケースに大別されて
いる。すなわち、インスレーター、ＬＣＲ（ｌｏｃｕｓ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ）およびＭＡＲ（ｍａ
ｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）の関
与が示唆され、これら三者は作用機構は異なるが染色体
上の境界として機能し、周辺のクロマチンの影響を遮断
すると考えられている。
【０００４】ポジション効果を抑制して、植物において
導入遺伝子の安定した発現を得る目的で、上述したＭＡ
Ｒが利用されている。ＭＡＲは、アデニン、チミン（Ａ
Ｔ）リッチな配列、トポイソメラーゼＩＩの認識配列を
含むなどの特徴を持ち、インビトロで核膜結合活性を有
する機能領域である。染色体上では、１０〜１００ｋｂ
に一つは存在しているとされ、これらの領域を介して染
色体は核膜と結合して高次構造を形成している。ＭＡＲ
は、染色体を限られたスペースである核内にコンパクト
に収めるために必須の存在であるが、近年の研究により
遺伝子発現制御にも関与している事実が知られてきてい
る。
導入遺伝子の安定した発現を得る目的で、上述したＭＡ
Ｒが利用されている。ＭＡＲは、アデニン、チミン（Ａ
Ｔ）リッチな配列、トポイソメラーゼＩＩの認識配列を
含むなどの特徴を持ち、インビトロで核膜結合活性を有
する機能領域である。染色体上では、１０〜１００ｋｂ
に一つは存在しているとされ、これらの領域を介して染
色体は核膜と結合して高次構造を形成している。ＭＡＲ
は、染色体を限られたスペースである核内にコンパクト
に収めるために必須の存在であるが、近年の研究により
遺伝子発現制御にも関与している事実が知られてきてい
る。
【０００５】また、ＭＡＲ間にクロマチンループが形成
され、このループ内の遺伝子発現の独立性が保証される
と考えられている。発現安定化に、ＭＡＲを使用した効
果については統一性が見られず、結果として安定発現が
得られない場合が多い。その現象の理由として、多くの
ＭＡＲが発現を上昇させること、また複数コピー導入時
にはポジション効果以外の特異的なＤＮＡのメチル化な
どによる発現の不活性化が生じることなどが挙げられ
る。このため、全てのＭＡＲが染色体上の境界としての
機能を有していない可能性が示唆され(Galli,1:166-17
2,Current opinion in plant technology (1998) 1:166
-172, Matzke et al.,Current opinion inplant techno
logy (1998) 1: 142-148) 、有用技術として手法として
確立されるには至っていない。
され、このループ内の遺伝子発現の独立性が保証される
と考えられている。発現安定化に、ＭＡＲを使用した効
果については統一性が見られず、結果として安定発現が
得られない場合が多い。その現象の理由として、多くの
ＭＡＲが発現を上昇させること、また複数コピー導入時
にはポジション効果以外の特異的なＤＮＡのメチル化な
どによる発現の不活性化が生じることなどが挙げられ
る。このため、全てのＭＡＲが染色体上の境界としての
機能を有していない可能性が示唆され(Galli,1:166-17
2,Current opinion in plant technology (1998) 1:166
-172, Matzke et al.,Current opinion inplant techno
logy (1998) 1: 142-148) 、有用技術として手法として
確立されるには至っていない。
【０００６】一方、ポジション効果を抑制する目的で、
上述したインスレーターもまた、使用されている。エン
ハンサーやサイレンサーは数ｋｂ離れていてもその効果
が及ぶ事が知られており、その様な隣接する遺伝子の干
渉効果を遮断する働きを有する機能領域（ＤＮＡ断片）
がインスレーターである、と定義されている。高等真核
植物では、エンハンサーやサイレンサーが、特定の一つ
のプロモーターだけではなく、複数のプロモーターの転
写活性にも影響を与える場合があるため、染色体上で
は、複数のエレメントがランダムに影響を与える可能性
がある。これは遺伝子発現に多様性を持たせる反面、無
秩序ではない厳密な秩序ある制御のためには、エンハン
サーやサイレンサーの影響を限定する機構が必要と想像
される。現在では、インスレーターがこれらの影響力を
限定していると考えられている。
上述したインスレーターもまた、使用されている。エン
ハンサーやサイレンサーは数ｋｂ離れていてもその効果
が及ぶ事が知られており、その様な隣接する遺伝子の干
渉効果を遮断する働きを有する機能領域（ＤＮＡ断片）
がインスレーターである、と定義されている。高等真核
植物では、エンハンサーやサイレンサーが、特定の一つ
のプロモーターだけではなく、複数のプロモーターの転
写活性にも影響を与える場合があるため、染色体上で
は、複数のエレメントがランダムに影響を与える可能性
がある。これは遺伝子発現に多様性を持たせる反面、無
秩序ではない厳密な秩序ある制御のためには、エンハン
サーやサイレンサーの影響を限定する機構が必要と想像
される。現在では、インスレーターがこれらの影響力を
限定していると考えられている。
【０００７】これまでにショウジョウバエを始めとして
多様な生物からインスレーターが同定されており、その
例として、ショウジョウバエ由来のｇｙｐｓｙインスレ
ーター、ｈｓｐ７０ｓｃｓ−ｓｃｓ’インスレーターお
よびＦａｂ−７インスレーター、ニワトリ由来のベータ
グロビンインスレーター、およびヒト由来のａｐｏＢイ
ンスレーターなどがある。関与しているタンパク質も同
定され始め、特にｇｙｐｓｙインスレーター、ｈｓｐ７
０ｓｃｓ−ｓｃｓ’インスレーターについて解析が進ん
でいる（赤坂、細胞工学(1997) 16: 1476-1484）。この
中で、ニワトリ由来のベータグロビンインスレーターが
種を超えて遺伝子発現の安定化に効果を示す事が報告さ
れている。また、本発明者らは、ウニのアリルスルファ
ターゼ遺伝子から単離したインスレーターを連結するこ
とによって、植物細胞の染色体に組み込まれた外来遺伝
子の発現を安定化できる事を示した（特願平１１−２５
３１７４）。これらの知見を基にして、導入遺伝子の発
現安定化機能を有する、新規の遺伝子を得る事を目的と
して、本発明の研究開発は進められた。
多様な生物からインスレーターが同定されており、その
例として、ショウジョウバエ由来のｇｙｐｓｙインスレ
ーター、ｈｓｐ７０ｓｃｓ−ｓｃｓ’インスレーターお
よびＦａｂ−７インスレーター、ニワトリ由来のベータ
グロビンインスレーター、およびヒト由来のａｐｏＢイ
ンスレーターなどがある。関与しているタンパク質も同
定され始め、特にｇｙｐｓｙインスレーター、ｈｓｐ７
０ｓｃｓ−ｓｃｓ’インスレーターについて解析が進ん
でいる（赤坂、細胞工学(1997) 16: 1476-1484）。この
中で、ニワトリ由来のベータグロビンインスレーターが
種を超えて遺伝子発現の安定化に効果を示す事が報告さ
れている。また、本発明者らは、ウニのアリルスルファ
ターゼ遺伝子から単離したインスレーターを連結するこ
とによって、植物細胞の染色体に組み込まれた外来遺伝
子の発現を安定化できる事を示した（特願平１１−２５
３１７４）。これらの知見を基にして、導入遺伝子の発
現安定化機能を有する、新規の遺伝子を得る事を目的と
して、本発明の研究開発は進められた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、タバコ培
養細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ，ＢＹ
２）から数種の高発現プロモーターを単離した。その様
にして得た各プロモーターＤＮＡ断片にＧＵＳレポータ
ー遺伝子を連結し、タバコ培養細胞に導入し、それぞれ
独立した形質転換クローンにおけるＧＵＳ活性を調べ
た。その結果、タバコ由来のアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＮｔＡＤＨ）遺伝子のプロモーターの発現が、複数
クローン間において非常に安定している事がわかった。
養細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ，ＢＹ
２）から数種の高発現プロモーターを単離した。その様
にして得た各プロモーターＤＮＡ断片にＧＵＳレポータ
ー遺伝子を連結し、タバコ培養細胞に導入し、それぞれ
独立した形質転換クローンにおけるＧＵＳ活性を調べ
た。その結果、タバコ由来のアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＮｔＡＤＨ）遺伝子のプロモーターの発現が、複数
クローン間において非常に安定している事がわかった。
【０００９】その様な知見から、ＮｔＡＤＨプロモータ
ー内に遺伝子発現安定化機能配列を探索し、本発明の発
現安定化領域であるＡＤＨ２００を得た。ＡＤＨ２００
の詳細については後に述べる。ＡＤＨ２００は、植物に
おける導入遺伝子の発現を安定化させる技術として、大
いに利用価値が高いと考えられ、植物バイオ産業に対す
る貢献が期待される。
ー内に遺伝子発現安定化機能配列を探索し、本発明の発
現安定化領域であるＡＤＨ２００を得た。ＡＤＨ２００
の詳細については後に述べる。ＡＤＨ２００は、植物に
おける導入遺伝子の発現を安定化させる技術として、大
いに利用価値が高いと考えられ、植物バイオ産業に対す
る貢献が期待される。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、植物において導入した
外来の発現を安定化させる目的に使用できる、新規のＤ
ＮＡ断片を提供する。本発明のＤＮＡ断片は、タバコ由
来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔＡＤＨ）遺伝子
プロモーターの、ＴＡＴＡ ｂｏｘから２１４ｂｐ上流
までの領域の遺伝子配列であり、本発明者らは当該配列
が遺伝子発現を安定化させる作用を有する事を見出し、
当該配列をＡＤＨ２００と名づけた。ここで遺伝子発現
の安定化とは、導入した外来遺伝子の活性が認められな
い個体、又は導入した外来遺伝子の活性が非常に低い個
体の割合が顕著に減少する事を示す。本発明のＡＤＨ２
００の塩基配列は、配列表の配列番号１により特定され
る。ＡＤＨ２００の一部が欠失、置換若しくは付加され
た塩基配列からなるＤＮＡ断片も、外来遺伝子の発現を
安定化させる作用を有する限り、本発明の範囲内であ
る。
外来の発現を安定化させる目的に使用できる、新規のＤ
ＮＡ断片を提供する。本発明のＤＮＡ断片は、タバコ由
来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔＡＤＨ）遺伝子
プロモーターの、ＴＡＴＡ ｂｏｘから２１４ｂｐ上流
までの領域の遺伝子配列であり、本発明者らは当該配列
が遺伝子発現を安定化させる作用を有する事を見出し、
当該配列をＡＤＨ２００と名づけた。ここで遺伝子発現
の安定化とは、導入した外来遺伝子の活性が認められな
い個体、又は導入した外来遺伝子の活性が非常に低い個
体の割合が顕著に減少する事を示す。本発明のＡＤＨ２
００の塩基配列は、配列表の配列番号１により特定され
る。ＡＤＨ２００の一部が欠失、置換若しくは付加され
た塩基配列からなるＤＮＡ断片も、外来遺伝子の発現を
安定化させる作用を有する限り、本発明の範囲内であ
る。
【００１１】ＡＤＨ２００のＤＮＡ断片、導入するべき
外来遺伝子、及びＡＤＨ２００のＤＮＡ断片と当該外来
遺伝子の間に挟まれる位置に存在し、当該外来遺伝子の
発現を調節する外来プロモーター、を含む融合遺伝子を
含む、ベクターもまた、本発明の範囲内である。即ち、
導入した外来遺伝子の５’上流に外来プロモーター、更
に５’上流にＡＤＨ２００のＤＮＡ断片を連結した構造
より成る融合遺伝子を含むベクターも本発明の範囲内で
ある。また、導入した外来遺伝子の３’下流に外来プロ
モーター、更に３’下流にＡＤＨ２００のＤＮＡ断片を
連結した構造より成る融合遺伝子を含むベクターも本発
明の範囲内である。ここで、外来プロモーターとは、遺
伝子を導入する植物と異なる種より得られたプロモータ
ーを意味する。下記の実施例で示される様に、ＡＤＨ２
００のＤＮＡ断片は、異種のプロモーターの発現を安定
化する事により導入した遺伝子の発現を安定化するた
め、ＡＤＨ２００のＤＮＡ断片がプロモーターの「外
側」に位置している場合にも、導入遺伝子の発現を安定
化する事が可能であり、本発明の顕著な効果となってい
る。
外来遺伝子、及びＡＤＨ２００のＤＮＡ断片と当該外来
遺伝子の間に挟まれる位置に存在し、当該外来遺伝子の
発現を調節する外来プロモーター、を含む融合遺伝子を
含む、ベクターもまた、本発明の範囲内である。即ち、
導入した外来遺伝子の５’上流に外来プロモーター、更
に５’上流にＡＤＨ２００のＤＮＡ断片を連結した構造
より成る融合遺伝子を含むベクターも本発明の範囲内で
ある。また、導入した外来遺伝子の３’下流に外来プロ
モーター、更に３’下流にＡＤＨ２００のＤＮＡ断片を
連結した構造より成る融合遺伝子を含むベクターも本発
明の範囲内である。ここで、外来プロモーターとは、遺
伝子を導入する植物と異なる種より得られたプロモータ
ーを意味する。下記の実施例で示される様に、ＡＤＨ２
００のＤＮＡ断片は、異種のプロモーターの発現を安定
化する事により導入した遺伝子の発現を安定化するた
め、ＡＤＨ２００のＤＮＡ断片がプロモーターの「外
側」に位置している場合にも、導入遺伝子の発現を安定
化する事が可能であり、本発明の顕著な効果となってい
る。
【００１２】実施例において示される様に、ＡＤＨ２０
０のＤＮＡ断片、外来遺伝子及び外来プロモーターを含
む、上記のベクターを植物に導入する事により、外来遺
伝子の発現を安定化する事が可能であり、その様な過程
より成る遺伝子の導入方法もまた、本発明の範囲内であ
る。更に、その様な方法により外来遺伝子を導入し、外
来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物もまた、本発
明の範囲内である。後に実施例において示す様に、本発
明のＡＤＨ２００を用いる事により、導入した外来遺伝
子が発現しない個体、又発現の程度が非常に低い個体が
見られなくなり、外来遺伝子の発現が安定化する。
０のＤＮＡ断片、外来遺伝子及び外来プロモーターを含
む、上記のベクターを植物に導入する事により、外来遺
伝子の発現を安定化する事が可能であり、その様な過程
より成る遺伝子の導入方法もまた、本発明の範囲内であ
る。更に、その様な方法により外来遺伝子を導入し、外
来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物もまた、本発
明の範囲内である。後に実施例において示す様に、本発
明のＡＤＨ２００を用いる事により、導入した外来遺伝
子が発現しない個体、又発現の程度が非常に低い個体が
見られなくなり、外来遺伝子の発現が安定化する。
【００１３】本発明の方法を用いて、種々の外来遺伝子
を安定に発現させる事が可能であり、理論的にはあらゆ
る遺伝子を導入する事が可能である。宿主植物に導入す
るのに好ましい遺伝子の例としては、ペルオキシダーゼ
遺伝子又はキチナーゼ遺伝子の様な病虫害耐性遺伝子、
エクトイン生合成系酵素又はベタイン合成酵素の様なス
トレス耐性遺伝子、及び脂肪酸合成酵素遺伝子等が挙げ
られる。更に、本発明の方法を用いて、種々の宿主に外
来遺伝子を導入する事が可能であり、理論的にはあらゆ
る宿主中に遺伝子を導入する事が可能である。宿主植物
として用いるのに好ましい植物の例としては、タバコ、
シロイヌナズナ又はペチュニアの様な有用栽培植物、イ
ネ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイズ、
イチゴ又はナスの様な農作物、及びユーカリ又はポプラ
等の樹木等が挙げられる。上記の記載及び下記の実施例
は、本発明の説明を行うための記載であり、本発明の範
囲を何ら限定するものではない。
を安定に発現させる事が可能であり、理論的にはあらゆ
る遺伝子を導入する事が可能である。宿主植物に導入す
るのに好ましい遺伝子の例としては、ペルオキシダーゼ
遺伝子又はキチナーゼ遺伝子の様な病虫害耐性遺伝子、
エクトイン生合成系酵素又はベタイン合成酵素の様なス
トレス耐性遺伝子、及び脂肪酸合成酵素遺伝子等が挙げ
られる。更に、本発明の方法を用いて、種々の宿主に外
来遺伝子を導入する事が可能であり、理論的にはあらゆ
る宿主中に遺伝子を導入する事が可能である。宿主植物
として用いるのに好ましい植物の例としては、タバコ、
シロイヌナズナ又はペチュニアの様な有用栽培植物、イ
ネ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、ダイズ、
イチゴ又はナスの様な農作物、及びユーカリ又はポプラ
等の樹木等が挙げられる。上記の記載及び下記の実施例
は、本発明の説明を行うための記載であり、本発明の範
囲を何ら限定するものではない。
【００１４】
【実施例】（プラスミドの構築）
本発明における実験に使用した融合遺伝子を図１に示
す。 （Ａ）ｐ３５Ｓ−ＧＵＳ：カリフラワーモザイクウイル
ス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター（ＣａＭＶ３５
Ｓ）の下流に大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ遺伝子
（ＧＵＳ）を連結した。 （Ｂ）ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：ＣａＭＶ３５Ｓコ
アプロモーター（９０ｂｐのコア配列）の下流にＧＵＳ
遺伝子を連結した。 （Ｃ）ｐＮｔＡＤＨ（２．５ｋｂ）−ＧＵＳ：タバコア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔＡＤＨ）プロモーター
にＧＵＳ遺伝子を連結した。 （Ｄ）ｐＮｔＡＤＨ（０．３ｋｂ）−ＧＵＳ：ＮｔＡＤ
ＨプロモーターのＴＡＴＡ ｂｏｘから２１４ｂｐ上流
までのＤＮＡ断片にＧＵＳ遺伝子を連結した。 （Ｅ）ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：Ａ
ＤＨ２００をＣａＭＶ３５Ｓコアプロモーター（９０ｂ
ｐ）−ＧＵＳ融合遺伝子の５’上流に連結した。 （Ｆ）ＡＤＨ１００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：Ａ
ＤＨ２００の５’側の１１０ｂｐ（ＡＤＨ１００）をＣ
ａＭＶ３５Ｓコアプロモーター−ＧＵＳ融合遺伝子の
５’上流に連結した。 （Ｇ）ＰＥ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：ペク
チンエステラーゼ遺伝子のＴＡＴＡ ｂｏｘの５’上流
約２００ｂｐ（ＰＥ２００：参考文献：Shinmyoet al.,
Biotech,Bioeng.,1998,58:329-332）をＣａＭＶ３５Ｓ
コアプロモーターＧＵＳ融合遺伝子に連結した（負の対
照）。尚、図１の各融合遺伝子の構造において、それぞ
れの記号は下記の遺伝子を示している。 Ｒ：Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー配列 Ｌ：Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダー配列 Ｋｍ’：カナマイシン耐性遺伝子 ＴＥＲ：ｎｏｓ遺伝子のターミネーター
す。 （Ａ）ｐ３５Ｓ−ＧＵＳ：カリフラワーモザイクウイル
ス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター（ＣａＭＶ３５
Ｓ）の下流に大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ遺伝子
（ＧＵＳ）を連結した。 （Ｂ）ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：ＣａＭＶ３５Ｓコ
アプロモーター（９０ｂｐのコア配列）の下流にＧＵＳ
遺伝子を連結した。 （Ｃ）ｐＮｔＡＤＨ（２．５ｋｂ）−ＧＵＳ：タバコア
ルコールデヒドロゲナーゼ（ＮｔＡＤＨ）プロモーター
にＧＵＳ遺伝子を連結した。 （Ｄ）ｐＮｔＡＤＨ（０．３ｋｂ）−ＧＵＳ：ＮｔＡＤ
ＨプロモーターのＴＡＴＡ ｂｏｘから２１４ｂｐ上流
までのＤＮＡ断片にＧＵＳ遺伝子を連結した。 （Ｅ）ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：Ａ
ＤＨ２００をＣａＭＶ３５Ｓコアプロモーター（９０ｂ
ｐ）−ＧＵＳ融合遺伝子の５’上流に連結した。 （Ｆ）ＡＤＨ１００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：Ａ
ＤＨ２００の５’側の１１０ｂｐ（ＡＤＨ１００）をＣ
ａＭＶ３５Ｓコアプロモーター−ＧＵＳ融合遺伝子の
５’上流に連結した。 （Ｇ）ＰＥ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ：ペク
チンエステラーゼ遺伝子のＴＡＴＡ ｂｏｘの５’上流
約２００ｂｐ（ＰＥ２００：参考文献：Shinmyoet al.,
Biotech,Bioeng.,1998,58:329-332）をＣａＭＶ３５Ｓ
コアプロモーターＧＵＳ融合遺伝子に連結した（負の対
照）。尚、図１の各融合遺伝子の構造において、それぞ
れの記号は下記の遺伝子を示している。 Ｒ：Ｔ−ＤＮＡのライトボーダー配列 Ｌ：Ｔ−ＤＮＡのレフトボーダー配列 Ｋｍ’：カナマイシン耐性遺伝子 ＴＥＲ：ｎｏｓ遺伝子のターミネーター
【００１５】（タバコ培養細胞への導入）
各バイナリープラスミド（上記Ａ−Ｇ）を、アグロバク
テリウム感染法により、タバコ培養細胞（ＢＹ２）の染
色体上に、Gynheung et al.,Plant.Physiol.(1985) 79:
568-570)に記載されている方法により導入した。目的遺
伝子が導入されたと考えられる形質転換候補細胞は、カ
ナマイシン耐性の表現型によって選抜した。
テリウム感染法により、タバコ培養細胞（ＢＹ２）の染
色体上に、Gynheung et al.,Plant.Physiol.(1985) 79:
568-570)に記載されている方法により導入した。目的遺
伝子が導入されたと考えられる形質転換候補細胞は、カ
ナマイシン耐性の表現型によって選抜した。
【００１６】（ベータグルクロニダーゼ活性測定）
各遺伝子について独立した形質転換体を独立５０クロー
ンずつ取得し（Ａ−Ｆ）、ベータグルクロニダーゼ活性
（ＧＵＳ活性）の測定を行った。尚、負のコントロール
であるＧについてのみ、独立２５クローンずつ取得し
た。１ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−β−Ｄ−グ
ルクロニックアシッドを基質として添加して、３７℃で
３０分間反応させた。本反応により、ＧＵＳ活性を有す
るクローンは青色に染色される。ＧＵＳ活性の測定を行
った際の発色パターンを図２から図８に、また、ＧＵＳ
活性の結果を定量化してまとめたものを表１に示す。表
１においてＧＵＳ活性の強弱を、＋＋：高いＧＵＳ活
性、＋：低いＧＵＳ活性、−：検出限界以下、で示す。
表中の数値は、それぞれのＧＵＳ活性を示す形質転換個
体数を示す。
ンずつ取得し（Ａ−Ｆ）、ベータグルクロニダーゼ活性
（ＧＵＳ活性）の測定を行った。尚、負のコントロール
であるＧについてのみ、独立２５クローンずつ取得し
た。１ｍＭ ５−ブロモ−４−クロロ−３−β−Ｄ−グ
ルクロニックアシッドを基質として添加して、３７℃で
３０分間反応させた。本反応により、ＧＵＳ活性を有す
るクローンは青色に染色される。ＧＵＳ活性の測定を行
った際の発色パターンを図２から図８に、また、ＧＵＳ
活性の結果を定量化してまとめたものを表１に示す。表
１においてＧＵＳ活性の強弱を、＋＋：高いＧＵＳ活
性、＋：低いＧＵＳ活性、−：検出限界以下、で示す。
表中の数値は、それぞれのＧＵＳ活性を示す形質転換個
体数を示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】（ＮｔＡＤＨプロモーターによる遺伝子発
現の安定化） ＧＵＳ活性を指標として、導入遺伝子の発現の安定化に
ついて検討を行った。ｐ３５Ｓ−ＧＵＳ融合遺伝子（図
１Ａ）では、約３０％程度の割合で染色が見られない形
質転換体が生じる（図２、表１Ａ）。ＧＵＳ活性の検出
されない形質転換体については、ＰＣＲ法によって導入
遺伝子が染色体上に組み込まれていることを確認してい
る。これに対して、ｐＮｔＡＤＨ（２．５ｋｂ）−ＧＵ
Ｓ融合遺伝子（図１Ｃ）では、全クローンにおいて高い
ＧＵＳ活性が検出された（図４、表１Ｂ）。ｐ３５Ｓ−
ＧＵＳ融合遺伝子においては、数回同様の解析を行うこ
とによって、発現のバラツキが再現する事を確認した。
この結果は、ＮｔＡＤＨプロモーターは植物細胞の染色
体において、導入された遺伝子の発現を安定化する機構
を有する事を示している。
現の安定化） ＧＵＳ活性を指標として、導入遺伝子の発現の安定化に
ついて検討を行った。ｐ３５Ｓ−ＧＵＳ融合遺伝子（図
１Ａ）では、約３０％程度の割合で染色が見られない形
質転換体が生じる（図２、表１Ａ）。ＧＵＳ活性の検出
されない形質転換体については、ＰＣＲ法によって導入
遺伝子が染色体上に組み込まれていることを確認してい
る。これに対して、ｐＮｔＡＤＨ（２．５ｋｂ）−ＧＵ
Ｓ融合遺伝子（図１Ｃ）では、全クローンにおいて高い
ＧＵＳ活性が検出された（図４、表１Ｂ）。ｐ３５Ｓ−
ＧＵＳ融合遺伝子においては、数回同様の解析を行うこ
とによって、発現のバラツキが再現する事を確認した。
この結果は、ＮｔＡＤＨプロモーターは植物細胞の染色
体において、導入された遺伝子の発現を安定化する機構
を有する事を示している。
【００１９】（プロモーターの欠失解析）
そこでＮｔＡＤＨプロモーターの欠失解析を行う事によ
り、遺伝子発現の安定化に関与している部位の同定を行
った。その結果、ＮｔＡＤＨプロモーターのＴＡＴＡ
ｂｏｘから２１４ｂｐ上流までのＤＮＡ断片にＧＵＳを
連結した導入遺伝子（ｐＮｔＡＤＨ（０． ３ｋｂ）−Ｇ
ＵＳ：図１Ｄ）を導入したＢＹ２細胞において、全クロ
ーンにＧＵＳ染色が見られた（図５、表１Ｃ）。更に詳
細に部位を特定するために、５’上流から段階的に欠失
させたＤＮＡ断片について同様の解析を行った（図
９）。即ち、ＴＡＴＡ ｂｏｘから、それぞれ２１４ｂ
ｐ、１９５ｂｐ、１４６ｂｐ、１０４ｂｐ、３４ｂｐま
でのＤＮＡ断片にＧＵＳ遺伝子を連結して、ＢＹ２細胞
に導入し、それぞれ独立５０クローン中で高いＧＵＳ活
性を示すクローンの割合（ＧＵＳ＋％）をパーセンテー
ジで示した。その結果、ＴＡＴＡ ｂｏｘから１９５ｂ
ｐ上流までのＤＮＡ断片にＧＵＳを連結した融合遺伝子
の発現においてバラツキが起こり始め、高いＧＵＳ活性
を示すクローンの割合は９６％であった。ＴＡＴＡ ｂ
ｏｘからそれぞれ１４６ｂｐ，１０４ｂｐ、３４ｂｐ上
流と、更に欠失が増加したＤＮＡ断片にＧＵＳを連結し
た場合には、ＧＵＳ活性を示すクローンの割合は更に減
少した。
り、遺伝子発現の安定化に関与している部位の同定を行
った。その結果、ＮｔＡＤＨプロモーターのＴＡＴＡ
ｂｏｘから２１４ｂｐ上流までのＤＮＡ断片にＧＵＳを
連結した導入遺伝子（ｐＮｔＡＤＨ（０． ３ｋｂ）−Ｇ
ＵＳ：図１Ｄ）を導入したＢＹ２細胞において、全クロ
ーンにＧＵＳ染色が見られた（図５、表１Ｃ）。更に詳
細に部位を特定するために、５’上流から段階的に欠失
させたＤＮＡ断片について同様の解析を行った（図
９）。即ち、ＴＡＴＡ ｂｏｘから、それぞれ２１４ｂ
ｐ、１９５ｂｐ、１４６ｂｐ、１０４ｂｐ、３４ｂｐま
でのＤＮＡ断片にＧＵＳ遺伝子を連結して、ＢＹ２細胞
に導入し、それぞれ独立５０クローン中で高いＧＵＳ活
性を示すクローンの割合（ＧＵＳ＋％）をパーセンテー
ジで示した。その結果、ＴＡＴＡ ｂｏｘから１９５ｂ
ｐ上流までのＤＮＡ断片にＧＵＳを連結した融合遺伝子
の発現においてバラツキが起こり始め、高いＧＵＳ活性
を示すクローンの割合は９６％であった。ＴＡＴＡ ｂ
ｏｘからそれぞれ１４６ｂｐ，１０４ｂｐ、３４ｂｐ上
流と、更に欠失が増加したＤＮＡ断片にＧＵＳを連結し
た場合には、ＧＵＳ活性を示すクローンの割合は更に減
少した。
【００２０】上記の結果より、ＮｔＡＤＨ遺伝子のＴＡ
ＴＡボックスの直前５’上流２１４ｂｐが発現安定化に
機能するのに十分な、最小の領域であると結論した。当
該遺伝子領域が、本発明の遺伝子であるＡＤＨ２００で
ある。ＮｔＡＤＨプロモーター遺伝子中における、ＡＤ
Ｈ２００領域の位置及びＡＤＨ２００の塩基配列を図１
０に示す。尚、図１０の塩基配列中、末端に存在するＴ
ＡＴＡ ｂｏｘはＡＤＨ２００に含まれない。図１０に
おいて、ＴＡＴＡはＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＯＲＦは翻訳可
能領域を示す。ＡＤＨ２００の塩基配列の特徴として
は、４−５塩基連続したアデニン（Ａ）またはチミン
（Ｔ）が繰り返し存在しており、この様な配列を有する
領域は一般にＤＮＡが折れ曲がり構造をとると言われて
いる。この塩基配列上の特徴が、遺伝子発現の安定化に
寄与していると考えられる。
ＴＡボックスの直前５’上流２１４ｂｐが発現安定化に
機能するのに十分な、最小の領域であると結論した。当
該遺伝子領域が、本発明の遺伝子であるＡＤＨ２００で
ある。ＮｔＡＤＨプロモーター遺伝子中における、ＡＤ
Ｈ２００領域の位置及びＡＤＨ２００の塩基配列を図１
０に示す。尚、図１０の塩基配列中、末端に存在するＴ
ＡＴＡ ｂｏｘはＡＤＨ２００に含まれない。図１０に
おいて、ＴＡＴＡはＴＡＴＡ ｂｏｘ、ＯＲＦは翻訳可
能領域を示す。ＡＤＨ２００の塩基配列の特徴として
は、４−５塩基連続したアデニン（Ａ）またはチミン
（Ｔ）が繰り返し存在しており、この様な配列を有する
領域は一般にＤＮＡが折れ曲がり構造をとると言われて
いる。この塩基配列上の特徴が、遺伝子発現の安定化に
寄与していると考えられる。
【００２１】（ＡＤＨ２００による異種プロモーター発
現の安定化） 次にＡＤＨ２００が異種プロモーターの発現を安定化で
きるかどうかを調べた。ＡＤＨ２００をカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓコアプロモーター
（９０ｂｐ）−ＧＵＳ融合遺伝子の５’上流に連結した
ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ（図１
Ｅ）、ＢＹ２細胞へ導入し、ＧＵＳ活性を指標としてＣ
ａＭＶプロモーターの発現を評価した。ｐ３５Ｓ ｃｏ
ｒｅ−ＧＵＳ融合遺伝子（図１Ｂ）を導入した形質転換
体では発現のバラツキが見られること（図３）に対し、
ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ融合遺伝子
では全クローンで高いＧＵＳ活性が検出された（図
６）。ＡＤＨ２００の５’側１１０ｂｐ（ＡＤＨ１０
０）をＣａＭＶ３５ＳコアプロモーターＧＵＳ融合遺伝
子の５’上流に連結したＡＤＨ１００−ｐ３５Ｓ ｃｏ
ｒｅ−ＧＵＳの場合（図１Ｆ）では、ＧＵＳ活性が低い
クローンが存在し、遺伝子発現を安定化することはでき
なかった（図７、表１Ｆ）。
現の安定化） 次にＡＤＨ２００が異種プロモーターの発現を安定化で
きるかどうかを調べた。ＡＤＨ２００をカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓコアプロモーター
（９０ｂｐ）−ＧＵＳ融合遺伝子の５’上流に連結した
ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ（図１
Ｅ）、ＢＹ２細胞へ導入し、ＧＵＳ活性を指標としてＣ
ａＭＶプロモーターの発現を評価した。ｐ３５Ｓ ｃｏ
ｒｅ−ＧＵＳ融合遺伝子（図１Ｂ）を導入した形質転換
体では発現のバラツキが見られること（図３）に対し、
ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ融合遺伝子
では全クローンで高いＧＵＳ活性が検出された（図
６）。ＡＤＨ２００の５’側１１０ｂｐ（ＡＤＨ１０
０）をＣａＭＶ３５ＳコアプロモーターＧＵＳ融合遺伝
子の５’上流に連結したＡＤＨ１００−ｐ３５Ｓ ｃｏ
ｒｅ−ＧＵＳの場合（図１Ｆ）では、ＧＵＳ活性が低い
クローンが存在し、遺伝子発現を安定化することはでき
なかった（図７、表１Ｆ）。
【００２２】更に、負の対照としてＰＥ２００を連結し
たＰＥ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ融合遺伝子
（図１Ｇ）では、ＧＵＳ活性の低いクローンが認めら
れ、発現のバラツキが生じた（図８）。図８において、
２５サンプル中６サンプルが検出限界以下であった。こ
れらの結果は、ＡＤＨ２００ＤＮＡ断片を５’上流に連
結することによって、染色体に組み込まれたプロモータ
ーの発現を安定化できることを示している。
たＰＥ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ融合遺伝子
（図１Ｇ）では、ＧＵＳ活性の低いクローンが認めら
れ、発現のバラツキが生じた（図８）。図８において、
２５サンプル中６サンプルが検出限界以下であった。こ
れらの結果は、ＡＤＨ２００ＤＮＡ断片を５’上流に連
結することによって、染色体に組み込まれたプロモータ
ーの発現を安定化できることを示している。
【００２３】上記のＡＤＨ２００によるプロモーターの
発現安定化を更に詳細に検討するため、図１に示す融合
遺伝子のうち、Ａ、Ｂ、Ｅを保有する形質転換ＢＹ２ク
ローンより、それぞれ無作為に１０クローンを選び、Ｇ
ＵＳ活性の定量測定を行った（図１１）。図１１におい
て、Ａはｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ａ）、Ｂはｐ３５Ｓ
ｃｏｒｅ−ＧＵＳ（図１Ｂ）、ＣはＡＤＨ２００−ｐ３
５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ（図１Ｅ）を導入したクローン
における結果を示す。図１１のＡ、Ｂ、Ｃにおいて、そ
れぞれ図２、図３、図６で選抜した５０クローンから無
作為に１０クローンを選び、各細胞の粗抽出液をＧＵＳ
活性標品として、４−メチル−ウンベリフェリルグルク
ロニドを基質とした酵素反応を行った。図１１におい
て、単位時間および単位蛋白質重量あたりの反応生成物
量（ｐｍｏｌ）を比活性としている。
発現安定化を更に詳細に検討するため、図１に示す融合
遺伝子のうち、Ａ、Ｂ、Ｅを保有する形質転換ＢＹ２ク
ローンより、それぞれ無作為に１０クローンを選び、Ｇ
ＵＳ活性の定量測定を行った（図１１）。図１１におい
て、Ａはｐ３５Ｓ−ＧＵＳ（図１Ａ）、Ｂはｐ３５Ｓ
ｃｏｒｅ−ＧＵＳ（図１Ｂ）、ＣはＡＤＨ２００−ｐ３
５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳ（図１Ｅ）を導入したクローン
における結果を示す。図１１のＡ、Ｂ、Ｃにおいて、そ
れぞれ図２、図３、図６で選抜した５０クローンから無
作為に１０クローンを選び、各細胞の粗抽出液をＧＵＳ
活性標品として、４−メチル−ウンベリフェリルグルク
ロニドを基質とした酵素反応を行った。図１１におい
て、単位時間および単位蛋白質重量あたりの反応生成物
量（ｐｍｏｌ）を比活性としている。
【００２４】その結果、３５Ｓプロモータ−、および３
５Ｓコアプロモータ−では、ＧＵＳ活性が検出限界以下
から極めて低レベルの活性を示すクローンが存在した。
即ち、３５Ｓ−ＧＵＳにおいては１０００ｐｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ未満が３クローン存在し（図１１Ａ）、ｐ３
５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳにおいては１００ｐｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ未満が４クローン存在した（図１１Ｂ）。こ
れに対して、５’上流にＡＤＨ２００を連結したＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター（ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏ
ｒｅ−ＧＵＳ）では、すべてのクローンが１００００ｐ
ｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上のＧＵＳ活性を有し（図１１
Ｃ）ていた。以上の結果より、ＡＤＨ２００を付加する
事により、導入したＧＵＳ遺伝子が活性を示さないクロ
ーン又は活性が非常に低いクローンが見られなくなり、
遺伝子の発現が安定化している事が示された。
５Ｓコアプロモータ−では、ＧＵＳ活性が検出限界以下
から極めて低レベルの活性を示すクローンが存在した。
即ち、３５Ｓ−ＧＵＳにおいては１０００ｐｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ未満が３クローン存在し（図１１Ａ）、ｐ３
５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳにおいては１００ｐｍｏｌ／ｍ
ｉｎ／ｍｇ未満が４クローン存在した（図１１Ｂ）。こ
れに対して、５’上流にＡＤＨ２００を連結したＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター（ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏ
ｒｅ−ＧＵＳ）では、すべてのクローンが１００００ｐ
ｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ以上のＧＵＳ活性を有し（図１１
Ｃ）ていた。以上の結果より、ＡＤＨ２００を付加する
事により、導入したＧＵＳ遺伝子が活性を示さないクロ
ーン又は活性が非常に低いクローンが見られなくなり、
遺伝子の発現が安定化している事が示された。
【００２５】
【発明の効果】本発明のＡＤＨ２００のＤＮＡ断片を導
入遺伝子に連結することによって、形質転換植物を作製
する際に、導入遺伝子発現が活性化しないという発現の
バラツキが回避され、安定な遺伝子の発現が可能とな
る。本技術は、植物の形質転換技術が必須となっている
有用植物の分子育種や植物における有用物質生産などに
おいて、威力を発揮することが期待できる。言い換える
と、ＡＤＨ２００の連結によって導入遺伝子の発現を、
周囲の染色体の転写環境に左右されず、正確に制御する
ことが可能となり、遺伝子発現植物の安全性を高めるこ
とにも寄与できる。
入遺伝子に連結することによって、形質転換植物を作製
する際に、導入遺伝子発現が活性化しないという発現の
バラツキが回避され、安定な遺伝子の発現が可能とな
る。本技術は、植物の形質転換技術が必須となっている
有用植物の分子育種や植物における有用物質生産などに
おいて、威力を発揮することが期待できる。言い換える
と、ＡＤＨ２００の連結によって導入遺伝子の発現を、
周囲の染色体の転写環境に左右されず、正確に制御する
ことが可能となり、遺伝子発現植物の安全性を高めるこ
とにも寄与できる。
【００２６】
【配列表】＜１１０＞出願人氏名：奈良先端科学技術大
学院大学長 ＜１２０＞発明の名称： 植物において外来遺伝子の発
現を安定化させるＤＮＡ断片、外来遺伝子を植物におい
て安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定
に発現させた形質転換植物 ＜１６０＞配列の数：１ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：２１４ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：タバコアルコールデヒドロゲナーゼプ
ロモーター ＜４００＞配列 GGGTCAAAAC ATCGTTAGGT TTAATAAATC AAATCGATTT TTCTCTTGAA ATATTACCAC 60 CACCTTTTTC TTATTACTCG ACAAAAACTC AAACAGTAAC ACAAAACAAA CAGCCAAAAA 120 CCGGTTTCGA AAACCCAGCG ACCAAAACAT GGAAATGGTT TTACTTTGGC CTGTTGTATT 180 CAACTTTTCG ATTTCACGAT TCTATATTTT CAGG 214
学院大学長 ＜１２０＞発明の名称： 植物において外来遺伝子の発
現を安定化させるＤＮＡ断片、外来遺伝子を植物におい
て安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定
に発現させた形質転換植物 ＜１６０＞配列の数：１ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：２１４ ＜２１２＞配列の型：核酸 ＜２１３＞起源：タバコアルコールデヒドロゲナーゼプ
ロモーター ＜４００＞配列 GGGTCAAAAC ATCGTTAGGT TTAATAAATC AAATCGATTT TTCTCTTGAA ATATTACCAC 60 CACCTTTTTC TTATTACTCG ACAAAAACTC AAACAGTAAC ACAAAACAAA CAGCCAAAAA 120 CCGGTTTCGA AAACCCAGCG ACCAAAACAT GGAAATGGTT TTACTTTGGC CTGTTGTATT 180 CAACTTTTCG ATTTCACGAT TCTATATTTT CAGG 214
【図１】 図１は、構築したバイナリープラスミドのＴ
−ＤＮＡの構造を、模式的に示した図である。
−ＤＮＡの構造を、模式的に示した図である。
【図２】 図２は、ｐ３５Ｓ−ＧＵＳを導入したＢＹ２
細胞のＧＵＳ活性染色の写真である。
細胞のＧＵＳ活性染色の写真である。
【図３】 図３は、ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−ＧＵＳを導入
したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真である。
したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真である。
【図４】 図４は、ｐＮｔＡＤＨ（２．５ｋｂ）−ＧＵ
Ｓを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真であ
る。
Ｓを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真であ
る。
【図５】 図５は、（ｐＮｔＡＤＨ（０．３ｋｂ）−Ｇ
ＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真であ
る。
ＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真であ
る。
【図６】 図６は、ＡＤＨ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ
−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真
である。
−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真
である。
【図７】 図７は、ＡＤＨ１００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ
−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真
である。
−ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真
である。
【図８】 図８は、ＰＥ２００−ｐ３５Ｓ ｃｏｒｅ−
ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真で
ある。
ＧＵＳを導入したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性染色の写真で
ある。
【図９】 図９は、５’側を段階的に欠失して作製した
各ＡＤＨプローモーターの模式図、及び各プロモーター
のＧＵＳ陽性クローンのパーセンテージを示した図であ
る。
各ＡＤＨプローモーターの模式図、及び各プロモーター
のＧＵＳ陽性クローンのパーセンテージを示した図であ
る。
【図１０】 図１０は、ＮｔＡＤＨ遺伝子におけるＡＤ
Ｈ２００領域の模式図、及びＡＤＨ２００の塩基配列を
示した図である。
Ｈ２００領域の模式図、及びＡＤＨ２００の塩基配列を
示した図である。
【図１１】 図１１は、構築した各遺伝子ＤＮＡを導入
したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性値を示したグラフである。
したＢＹ２細胞のＧＵＳ活性値を示したグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 長屋 進吾
奈良県生駒市高山町8916−５ 学生宿舎
１−229
(72)発明者 柴田 道夫
三重県津市岩田14−２
(72)発明者 間 竜太郎
三重県津市南新町13−１ 古河住宅２−
102
(56)参考文献 ＧＡＬＬＩ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐ
ｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１， ｐ
ｐ．166−172 （1998)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/09
A01H 5/00
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に示す塩基番号１−
２１４で示される塩基配列、又は当該塩基配列と９１％
以上の相同性を有し且つ外来遺伝子の発現を安定化させ
る塩基配列からなることを特徴とする、ＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ断片、導入するべ
き外来遺伝子、及び請求項１記載のＤＮＡ断片と当該外
来遺伝子の間に挟まれる位置に存在し、当該外来遺伝子
の発現を調節する外来プロモーター、を含む融合遺伝子
を連結した、ベクター。 - 【請求項３】 外来遺伝子を植物において安定に発現さ
せるために、請求項２記載のベクターを植物に導入する
事を特徴とする、遺伝子導入方法。 - 【請求項４】 請求項３記載の導入方法により、外来遺
伝子を安定に発現させた、形質転換植物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32940099A JP3507858B2 (ja) | 1999-11-19 | 1999-11-19 | 植物において外来遺伝子の発現を安定化させるｄｎａ断片、外来遺伝子を植物において安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物 |
| US09/711,933 US6573429B1 (en) | 1999-11-19 | 2000-11-15 | DNA fragment for stable expression of an exogenous gene in a plant |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32940099A JP3507858B2 (ja) | 1999-11-19 | 1999-11-19 | 植物において外来遺伝子の発現を安定化させるｄｎａ断片、外来遺伝子を植物において安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物 |
| US09/711,933 US6573429B1 (en) | 1999-11-19 | 2000-11-15 | DNA fragment for stable expression of an exogenous gene in a plant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001145491A JP2001145491A (ja) | 2001-05-29 |
| JP3507858B2 true JP3507858B2 (ja) | 2004-03-15 |
Family
ID=27666129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32940099A Expired - Lifetime JP3507858B2 (ja) | 1999-11-19 | 1999-11-19 | 植物において外来遺伝子の発現を安定化させるｄｎａ断片、外来遺伝子を植物において安定に発現させる遺伝子導入方法、外来遺伝子を安定に発現させた形質転換植物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6573429B1 (ja) |
| JP (1) | JP3507858B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005263745A (ja) * | 2004-03-19 | 2005-09-29 | Research Institute Of Biomolecule Metrology Co Ltd | 核酸化合物、核酸格子及び核酸多面体 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1395669B1 (en) * | 2001-01-26 | 2009-07-22 | Selexis S.A. | Matrix attachment regions and methods for use thereof |
| IN2014DN02483A (ja) | 2003-10-24 | 2015-05-15 | Selexis Sa | |
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