KR102010833B1 - 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색 변형 기능 매발톱꽃 유래 신규 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색 변형 기능 매발톱꽃 유래 신규 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심의 색을 변형시키는 활성을 갖으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 매발톱꽃 유래의 신규 유전자, 이 유전자로 형질전환된 화훼식물, 및 이 유전자를 이용한 형질전환 화훼식물 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 유전자는 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색을 변형시킬 수 있어 형질전환을 통해 새로운 특징의 꽃을 피우는 화훼식물을 개발하는데 유용하다. 특히 페튜니아를 형질전환할 경우, 꽃잎이 진적색이며 암술기관이 자주색이고 화심색이 자주색 계열인 기존 페튜니아에서는 나타나지 않는 새로운 특징을 갖는 페튜니아를 얻을 수 있어, 화단, 가로변 등의 조경에 유용할 것으로 기대된다.
본 발명의 유전자는 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색을 변형시킬 수 있어 형질전환을 통해 새로운 특징의 꽃을 피우는 화훼식물을 개발하는데 유용하다. 특히 페튜니아를 형질전환할 경우, 꽃잎이 진적색이며 암술기관이 자주색이고 화심색이 자주색 계열인 기존 페튜니아에서는 나타나지 않는 새로운 특징을 갖는 페튜니아를 얻을 수 있어, 화단, 가로변 등의 조경에 유용할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색 변형 기능 매발톱꽃 유래 신규 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심의 색을 변형시키는 활성을 갖으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 매발톱꽃 유래의 신규 유전자, 이 유전자로 형질전환된 화훼식물, 및 이 유전자를 이용한 형질전환 화훼식물 제조방법에 관한 것이다.
꽃은 본래 곤충이나 새를 불러들여 수분을 매개하기 위한 목적으로 화려한 색상과 향기를 나타내는 것으로 알려져 있다. 하지만 사람 또한 이러한 꽃을 통해 아름다움을 느끼며 마음의 안정감을 찾기도 하므로, 꽃을 피우는 식물, 즉 화훼식물을 관상용으로 많이 이용하고 있다.
많은 천연의 꽃이 본연의 아름다운 색과 모양을 갖고 있지만, 보다 아름다운 꽃 또는 기존에는 없었던 특징을 갖는 새로운 꽃에 대한 요구가 있었고, 육종학의 발전으로 교배를 통한 새로운 화훼식물이 개발되어 상용화되고 있다.
그러나 이렇게 교배를 이용하는 방법은 교배가 가능한 식물이 매우 제한되고 또한 식물 고유의 유전적인 능력을 이용하는 것이므로 개발에 한계가 있다.
이에 유전공학을 이용한 새로운 방법이 시도되고 있으며, 그 중에 대표적인 것이 푸른 장미이다. 본래 장미는 푸른색을 나타내게 하는 색소를 생산할 수 없지만, 푸른색과 관련된 유전자를 도입하는 연구를 통해 푸른 장미가 개발되었다.
이와 같이 유전공학을 이용한 방법, 특히 외래 유전자를 도입하여 새로운 색이나 형태를 갖는 꽃을 생산하는 식물을 개발하는 것이 성공하면서 화훼분야에서 큰 이슈가 되었으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명자는 화훼식물의 색이나 형태를 변형시킬 수 있는 유전자원을 탐색하고 이를 이용하여 기존의 화훼식물과는 다른 특징의 꽃을 피우는 새로운 화훼식물을 개발하고자 하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 화훼식물의 색이나 형태를 변형시킬 수 있는 새로운 유전자원을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자원을 이용하여 기존의 화훼식물과는 다른 특징의 꽃을 피울 수 있는 새로운 화훼식물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 새로운 화훼식물을 제조하기 위한 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심의 색을 변형시키는 활성을 갖으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 매발톱꽃 유래의 신규 유전자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자로 형질전환되어 꽃잎, 암술기관 및 화심의 색이 변형된 형질전환 화훼식물을 제공한다.
본 발명의 형질전환 화훼식물에 있어서, 상기 화훼식물은 페튜니아인 것이 바람직하다.
본 발명의 형질전환 화훼식물에 있어서, 상기 유전자가 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터에 의해 전사가 조절되도록 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 화훼식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 꽃잎, 암술기관 및 화심의 색이 변형된 형질전환 화훼식물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 형질전환 화훼식물 제조방법에 있어서, 상기 화훼식물은 페튜니아인 것이 바람직하다.
본 발명의 형질전환 화훼식물 제조방법에 있어서, 상기 식물 발현 벡터는 상기 유전자가 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터에 의해 전사가 조절되도록 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자는 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색을 변형시킬 수 있어 형질전환을 통해 새로운 특징의 꽃을 피우는 화훼식물을 개발하는데 유용하다. 특히 페튜니아를 형질전환할 경우, 꽃잎이 진적색이며 암술기관이 자주색이고 화심색이 자주색 계열인 기존 페튜니아에서는 나타나지 않는 새로운 특징을 갖는 페튜니아를 얻을 수 있어, 화단, 가로변 등의 조경에 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에서 사용한 매발톱꽃(Aquilegia buergeriana)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 degenerate PCR (nested PCR)의 결과 (F-first PCR, S1~3-second PCR, 좌)와 E. coli DH5α에 형질전환 후, insert check PCR한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H의 아미노산 서열과 Aconitum carmichaelii의 F3'5'H의 아미노산 서열(AEY80043)을 비교(보라색-매발톱꽃 F3'5'H 서열과 상동성이 높은 영역)한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 5' RACE-PCR (1-first PCR, 2-Second PCR)의 결과(좌)와 E. coli DH5α에 형질전환한 후, T7과 M13R primer를 이용하여 insert check PCR한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H의 아미노산 서열과 Gossypium hirsutum의 F3'5'H의 아미노산 서열(ACH56524)을 비교(보라색-매발톱꽃 F3'5'H 서열과 상동성이 높은 영역)한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 3' RACE-PCR (3-first PCR, 4-Second PCR)의 결과(좌)와 E. coli DH5α에 형질전환한 후, T7과 M13R primer를 이용하여 insert check PCR한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H의 아미노산 서열과 Aconitum carmichaelii의 F3'5'H의 아미노산 서열(AEY80043)을 비교(보라색-매발톱꽃 F3'5'H 서열과 상동성이 높은 영역)한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 RT-PCR에 의해 증폭된 매발톱꽃 F3'5'H 유전자를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H 유전자가 pGEM-T easy vector 내에 삽입된 형태를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H 유전자 삽입 pGEM-T easy vector의 T7과 M13R primer를 이용한 insert check 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 아미노산 서열과 Aconitum vilmorinianum의 F3'5'H 유전자(AFL91704)의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃에서 동정된 AbF3'5'H 유전자 삽입 제작 벡터를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입 후 선발배지에서 재분화된 후 발근중인 페튜니아 식물체를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 페튜니아 식물체의 서던분석결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 형질전환체의 순화 과정(좌), 온실 이동한 장면(중) 및 화색 변형을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 페튜니아 형질전환체의 화심(좌) 및 암술기관(우)의 색 변형을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 형질전환 페튜니아의 도입유전자 발현분석(노던) 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 형질전환 페튜니아의 도입유전자 발현분석(RT-qPCR) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 degenerate PCR (nested PCR)의 결과 (F-first PCR, S1~3-second PCR, 좌)와 E. coli DH5α에 형질전환 후, insert check PCR한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H의 아미노산 서열과 Aconitum carmichaelii의 F3'5'H의 아미노산 서열(AEY80043)을 비교(보라색-매발톱꽃 F3'5'H 서열과 상동성이 높은 영역)한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 5' RACE-PCR (1-first PCR, 2-Second PCR)의 결과(좌)와 E. coli DH5α에 형질전환한 후, T7과 M13R primer를 이용하여 insert check PCR한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H의 아미노산 서열과 Gossypium hirsutum의 F3'5'H의 아미노산 서열(ACH56524)을 비교(보라색-매발톱꽃 F3'5'H 서열과 상동성이 높은 영역)한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 3' RACE-PCR (3-first PCR, 4-Second PCR)의 결과(좌)와 E. coli DH5α에 형질전환한 후, T7과 M13R primer를 이용하여 insert check PCR한 결과(우)를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H의 아미노산 서열과 Aconitum carmichaelii의 F3'5'H의 아미노산 서열(AEY80043)을 비교(보라색-매발톱꽃 F3'5'H 서열과 상동성이 높은 영역)한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 RT-PCR에 의해 증폭된 매발톱꽃 F3'5'H 유전자를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H 유전자가 pGEM-T easy vector 내에 삽입된 형태를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H 유전자 삽입 pGEM-T easy vector의 T7과 M13R primer를 이용한 insert check 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 아미노산 서열과 Aconitum vilmorinianum의 F3'5'H 유전자(AFL91704)의 아미노산 서열을 비교한 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 매발톱꽃에서 동정된 AbF3'5'H 유전자 삽입 제작 벡터를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입 후 선발배지에서 재분화된 후 발근중인 페튜니아 식물체를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 페튜니아 식물체의 서던분석결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 형질전환체의 순화 과정(좌), 온실 이동한 장면(중) 및 화색 변형을 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 페튜니아 형질전환체의 화심(좌) 및 암술기관(우)의 색 변형을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 형질전환 페튜니아의 도입유전자 발현분석(노던) 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 AbF3'5'H 형질전환 페튜니아의 도입유전자 발현분석(RT-qPCR) 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 유전자는 매발톱꽃(Aquilegia buergeriana)으로부터 유래된 유전자로 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하고 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자는 Aconitum vilmorinianum의 flavonoid-3',5'-hydroxylase 유전자(AFL91704)의 아미노산 서열과 80%의 상동성을 갖는다.
본 발명의 유전자는 매발톱꽃의 유전체를 주형으로 하는 PCR을 통해 수득할 수 있으며, 통상의 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 통해서도 수득할 수 있다.
본 발명의 유전자로 화훼식물을 형질전환하면 꽃잎, 암술기관 및 화심의 색이 변형된 형질전환 식물체를 수득할 수 있다. 특히 본 발명의 유전자로 페튜니아를 형질전환하면 꽃잎이 진적색이며 암술기관이 자주색이고 화심색이 자주색 계열인 형질전환 페튜니아를 수득할 수 있다.
상기 형질전환은 통상의 식물 형질전환 방법을 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 아그로박테리움 매개 형질전환(agrobacterium-mediated transformation) 방법을 이용할 수 있다. 또한 상기 형질전환을 위해 본 발명의 유전자가 함유된 재조합 벡터를 이용할 수 있다. 이때 벡터는 형질전환시킬 식물의 종류 또는 프로모터, 선별마커 등을 고려하여 기존에 알려진 다양한 종류의 벡터 중에서 선택하여 적용할 수 있다. 상기 벡터로 식물의 형질전환에 많이 이용되는 아그로박테리움 바이너리 벡터(Agrobacterium binary vector)인 pCAMBIA2300을 이용할 수 있다. 이 벡터는 카나마이신 저항 유전자(kanamycin-resistance gene)를 함유하고 있어 이를 선별마커로 사용할 수 있다.
본 발명의 유전자로 화훼식물을 형질전환할 때 본 발명의 유전자가 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터에 의해 전사가 조절되도록 구성하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도 12와 같은 구성으로 형질전환용 재조합 벡터를 제작하고, 이 재조합 벡터로 형질전환하는 방법을 사용할 수 있다. 또한 상기와 같은 구성은 통상의 유전자 재조합 방법을 이용하여 달성할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. RT-PCR을 이용한 매발톱꽃의 플라보노이드 3', 5'-하이드록실레이즈(Flavonoid 3',5'-hydroxylase) 유전자의 클로닝
기존에 보고되어 있지 않은 매발톱꽃의 플라보노이드 3', 5'-하이드록실레이즈(이하, F3'5'H로 약기) 유전자의 염기서열을 동정하기 위해, Aquilegia buergeriana (도 1 참조) 꽃잎의 cDNA, degenerate PCR과 RACE-PCR을 이용하여 F3'5'H 유전자의 부분 염기서열을 확인하고, 부분 염기서열을 바탕으로 설계한 gene-specific primer와 PCR을 이용하여 매발톱꽃의 F3'5'H 유전자의 염기서열을 동정하였다.
1-1. 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 중간영역 염기서열 동정
매발톱꽃의 F3'5'H 염기서열을 동정하기 위해, 매발톱꽃의 꽃잎의 cDNA와 degenerate primer를 이용하여 중간영역의 염기서열을 동정한 후, 미국 국립생물정보센터(NCBI)에서 제공하는 blastx로 검색한 결과, Aconitum carmichaelii (AEY80043)의 F3'5'H의 아미노산 서열과 81%의 상동성이 확인되었다(도 2 및 3 참조).
1-2. 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 5' 영역의 염기서열 동정
매발톱꽃의 F3'5'H 유전자의 중간영역 염기서열을 바탕으로 설계한 gene-specific primer와 RACE-PCR kit를 이용하여 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 5' 영역 염기서열을 동정한 후, NCBI의 blastx로 검색한 결과, Gossypium hirsutum (ACH56524)의 F3'5'H의 아미노산 서열과 78%의 상동성이 확인되었다(도 4 및 5 참조).
1-3. 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 3' 영역 염기서열 동정
매발톱꽃의 F3'5'H 유전자의 중간영역 염기서열을 바탕으로 설계한 gene-specific primer와 RACE-PCR kit를 이용하여 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 3' 영역 염기서열을 동정한 후, NCBI의 blastx로 검색한 결과, Aconitum carmichaelii (AEY80043)의 F3'5'H의 아미노산 서열과 85%의 상동성이 확인되었다(도 6 및 7 참조).
1-4. 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 전체영역 염기서열 동정
매발톱꽃의 F3'5'H 유전자의 5′ 및 3′ 영역의 염기서열을 바탕으로 설계한 gene-specific primer를 이용하여 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 전체 염기서열을 동정하였다(도 8 내지 10 참조). 전체 염기서열을 NCBI의 blastx로 검색한 결과, Aconitum vilmorinianum의 F3'5'H 유전자(AFL91704)의 아미노산 서열과 80%의 상동성이 확인되었다(도 11 참조).
실시예 2. 페튜니아에 매발톱꽃 F3'5'H 유전자의 도입
2-1. 식물 형질전환용 벡터 제작
매발톱꽃에서 동정한 F3'5'H 유전자(이하, AbF3'5'H로 약기) 전장의 암호화 영역의 유전자를 binary vector pCAMBIA2300의 cloning site에 삽입하였으며(도 12 참조), 숙주로는 Agrobacterium tumefaciens GV3101을 이용하였다.
2-2. 아그로박테리움 공동배양에 의한 페튜니아 형질전환
기내 파종 후 80 ~ 90일 경과한 페튜니아 'Dream's Red' 묘의 어린잎을 5㎜×5㎜로 절단한 170개의 절편체를 전배양 배지에서 1일간 배양한 후, AbF3'5'H 유전자가 삽입된 아그로박테리움과 공동배양을 실시하였다. 2일 후, 영양배지로 옮겨 7일간 배양하였고, 이후 각각 kanamycin 50㎎/ℓ와 100㎎/ℓ이 포함된 1, 2차 선발배지로 옮겨 재분화 식물체를 선발하였다. 단계별 배양에 사용된 배지의 조성 및 배양기간은 표 1과 같다. 2차 선발배지에서 발근된 38개체의 목표유전자 도입여부를 확인하기 위하여 PCR 분석을 실시하였고, 도입유전자 copy 수를 확인하고자 서던분석을 실시하였다. PCR분석을 위한 DNA 추출은 DNeasy Mini Plant Kit(Qiagen, USA)를 이용하였고, 정량은 NanoVue (GE imagination at work)를 이용하였다. PCR 반응은 DNA 40 ~ 100ng, dNTP 0.2mM, primer 10pmoles, Taq 0.2U 등을 혼합한 20㎕를 95℃ 1분, 55℃ 또는 60℃ 1분, 72℃ 1분으로 35 또는 40회 증폭한 후, loading star(DYNE BIO, Korea)를 섞어 1% agarose gel에 전기영동하여 UV 하에서 유전자 도입여부를 확인하였다. 서던분석을 위한 DNA농도는 NanoVue(GE healthcare)로 측정하였고, 각 샘플당 40㎍의 DNA를 사용하였고, 100units의 EcoRI으로 자른 후 DNA를 0.9% agarose gel에 0.5X TBE 용액에 30V로 17시간 running하였다. DNA는 nylon HybondTM-N+ membrane(Amersham Life science, UK)에 capillary transfer 방법으로 블롯팅하였다. 목표유전자 탐침은 유전자 유래 PCR 산물 DNA 30ng을 시료로 RedyprimeIITM Random Prime labeling System(Amersham Life science, UK)을 사용하여 제작(labeling) 하였다. Hybridization과 blot 세척은 표준화된 방법에 따랐다. 표지인식을 위해서는 BAS-1800II Bio-Imaging analyzer (FUJIFILM, Japan)을 사용하였다. PCR 분석 결과, 38개체 중 15개체가 목표유전자가 도입되었음을 확인하였으며, 서던분석 결과, 15개체 모두 2 ~ 6개의 유전자가 도입되었음을 확인하였다(표 2, 도 13 및 14 참조).
| 구분 | 조성 | 배양기간 |
| 전배양 | MS배지 +IAA 2 mg/L + BAP 1 mg/L (pH 5.7) | 1일 |
| 공동배양 | 전배양 배지 (pH 5.2) | 2일(암배양) |
| 영양배양 | 전배양 배지 + cefotaxime 400mg/L (pH 5.7) | 7일 |
| 1차 선발 | 영양선발 배지 + kanamycin 50mg/L (pH 5.7) | 4주 |
| 2차 선발 | 영양선발 배지 + kanamycin 100mg/L (pH 5.7) | 2~4주 |
| 발근 | MS배지+ cefotaxime 200mg/L | 2~3주 |
| 2차 선발배지에서 발근된 식물체 수 | PCR분석 | 서던분석 | ||
| 분석 식물체 수 | AbF3‘5’H 도입 확인 식물체 수 | 분석 식물체 수 | 도입 유전자 copy 수 | |
| 38 | 38 | 15 | 15 | 2~6 |
2-3. AbF3'5'H 유전자 도입 페튜니아 형질전환체의 개화특성 확인
PCR 및 서던분석에 의해 AbF3'5'H 유전자 도입이 확인된 15개체를 순화시킨 후 온실로 이동하였으며(도 15 참조), 재배관리를 통해 개화 시 특성을 조사하였다. Color Chart (Royal Horticultural Society, Fifth Edition)를 이용하여 비형질전환체와 개화 특성을 비교한 결과, AbF3'5'H 유전자가 도입된 형질전환체들의 화색이 Red group (45B)에서 Red group (46A 또는 46B)로, 화심색이 Red purple (59A)에서 Purple group (77A, 79B)로, 암술머리 색이 White group (155C)에서 Purple group (77C, 77D, 79B, 79D)로 변형되었음을 확인할 수 있었다(도 16 및 표 3 참조).
| 구분 | 화색 | 화심색 | 암술기관 색 |
| 형질전환체 | Red group (46A 또는 46B) | Purple group (77A, 79B) | Purple group (77C, 77D, 79B, 79D) |
| 비형질전환체 | Red group (45B) | Red purple (59A) | White group (155C) |
2-4. AbF3'5'H 유전자 도입 페튜니아 형질전환체의 도입 유전자 발현분석
도입유전자의 정상적인 발현을 확인하기 위하여 노던분석을 실시하였다. RNA 추출은 Trizol(Invitrogen)을 이용하여 형질전환 8계통의 잎으로부터 추출하였다. RNA농도는 NanoVue(GE healthcare)로 측정하였고, 각 샘플당 30㎍의 RNA를 1× MOPS buffer와 6.3%(w/v) formaldehyde가 포함된 1%(w/v) agarose gel에서 100V로 1시간 전개시켰다. RNA는 nylon HybondTM-N+ membrane (Amersham Life science, UK)에 capillary transfer 방법으로 블롯팅하였다. 30ng의 AbF3'5'H 유전자로부터 유래한 PCR 산물 DNA는 RedyprimeIITM Random Prime labeling System (Amersham Life science, UK)을 사용하여 labeling 하였다. Hybridization과 blot 세척은 표준화된 방법에 따랐다(Sambrook et al. 1989). 표지인식을 위하여 BAS-1800II Bio-Imaging analyzer (FUJI FILM)를 사용하여 분석한 결과, 8계통 모두 AbF3'5'H의 정상적인 발현을 확인할 수 있었다(도 17 참조).
AbF3'5'H 페튜니아 형질전환체의 화색, 화심 및 암술기관 색의 변형된 특성이 도입유전자인 AbF3'5'H의 발현에 의한 것인지를 확인하고자 실시간 유전자 발현분석(RT-qPCR)을 실시하였다. RNeasy Mini Plant Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 형질전환체와 AbF3'5'H 형질전환체의 7계통의 꽃잎, 화심, 암술기관(암술머리~암술대)으로부터 total RNA를 추출한 후, 추출액에 혼입된 genomic DNA(gDNA) 제거 및 cDNA를 합성하기 위해 RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, Japan)를 사용하였다. gDNA를 제거하기 위하여 매뉴얼의 지시에 따라 반응액 10㎕에 1㎍의 total RNA, 1㎕ 5× gDNA Erager, 2㎕ RNase-Free DNase을 혼합하여 42℃에서 2분 처리하였다. gDNA를 제거한 total RNA를 이용하여 매뉴얼의 지시에 따라 20㎕의 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 50배 희석하여 Reverse Transcription-quantitative PCR (RT-qPCR)에 이용하였다. 기존에 보고된 서열을 기반으로 프라이머를 다자인하여 발현분석에 이용하였다. 최종 반응액 20㎕에 1× SYBR premix EX taq Ⅱ(TaKaRa, Japan), 0.25μM 포워드 프라이머, 0.25μM 리버스 프라이머, 3㎕의 희석 cDNA를 혼합하여 준비한 후 CFX96(BioRad, USA)을 이용하여 RT-qPCR을 수행하였다. 반응조건은 95℃에서 30초간 initial denaturation을 수행 후, 95℃ 5초, 58℃ 30초 과정을 45반복하였다. 그 후 95℃에서 30초 premelting과 65℃에서 95℃까지 5초마다 0.5℃씩 온도를 높여가며 melting curve 분석을 수행하였다. Housekeeping 유전자 ACTIN의 Ct값으로 normalization하였으며, 상대정량값의 계산은 ΔΔCt법을 이용하였고, 식물 3반복의 상대정량값으로 평균과 표준오차를 계산하였다. RT-qPCR 결과, 형질전환체 7계통 모두 비 형질전환체보다 꽃잎, 화심, 암술기관에서의 AbF3'5'H 유전자의 발현이 훨씬 높음을 확인할 수 있었다(도 18 참조). 꽃잎이 화심이나 암술기관보다 AbF3'5'H 유전자의 평균 발현값이 높았고, 꽃잎과 화심의 7계통 발현 평균값은 차이가 거의 없었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Novel gene from Aquilegia buergeriana having function of
differentiating petal, pistil and center color of flowering plant
<130> PA-D17318
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 514
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Aquilegia buergeriana
<400> 1
Met Tyr Ser Thr Arg Val Ile Ser Met Phe Gly Leu Thr Val Ser Asp
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Val Ile Leu Phe Phe Ser Ala His Phe Ile Ile Arg
20 25 30
Ser Leu Leu Leu Lys His Glu His Lys Leu Pro Pro Gly Pro Asn Gly
35 40 45
Trp Pro Val Leu Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Thr Met Pro His Val
50 55 60
Ala Leu Ala Glu Met Ser Lys Lys Tyr Gly Pro Val Met Tyr Leu Lys
65 70 75 80
Leu Gly Ala His Gly Met Val Val Ala Ser Thr Pro Asp Ala Ala Arg
85 90 95
Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn Phe Ser Asn Arg Pro Thr Asp
100 105 110
Ala Gly Ser Thr His Leu Ala Tyr Asn Arg Gln Asp Met Val Phe Ala
115 120 125
Asp Tyr Gly Pro Lys Trp Lys Leu Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His
130 135 140
Met Leu Gly Gly Lys Ala Ile Glu Asp Trp Ser Ala Val Arg Arg Ile
145 150 155 160
Glu Leu Gly Tyr Met Leu Gln Ala Met Tyr Glu Ser Ser His Lys Gly
165 170 175
Glu Ala Val Val Val Pro Glu Met Leu Ala Leu Ala Met Ala Asn Met
180 185 190
Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Thr
195 200 205
Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser Ala
210 215 220
Gly Leu Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp
225 230 235 240
Met Gln Gly Ile Val Gly Arg Met Lys Asn Leu His Lys Lys Phe Asp
245 250 255
Ala Leu Leu Asp Lys Met Phe Lys Glu His Arg Ala Thr Arg Asn Asp
260 265 270
Arg Lys Asp Lys Pro Asp Phe Leu Asp Val Leu Met Asn Asn Met Asn
275 280 285
Asn Pro Gly Glu Glu Lys Leu Ser Asp Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu
290 295 300
Leu Asn Leu Phe Ser Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ser Val Glu
305 310 315 320
Trp Ala Leu Thr Glu Met Ile Asn Asn Pro Ser Ile Leu Arg Arg Ala
325 330 335
His Ala Glu Met Asp Gln Val Ile Gly Arg Asn Arg Arg Leu Glu Glu
340 345 350
Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Cys Lys Glu Ser
355 360 365
Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Val Ser Arg
370 375 380
Glu Pro Cys Glu Val Asn Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Gly Thr Arg Leu
385 390 395 400
Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn
405 410 415
Pro Leu Glu Phe Asn Pro Asp Arg Phe Leu Asn Glu Lys Asn Ala Lys
420 425 430
Ile Asp Pro Arg Gly Asn Asn Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ser Gly
435 440 445
Arg Arg Ile Cys Ala Gly Val Arg Met Gly Ile Val Leu Val Glu Tyr
450 455 460
Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly
465 470 475 480
Glu Lys Leu Asn Met Asp Glu Ala Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala
485 490 495
Val Pro Leu Ala Ala Val Val Thr Ser His Leu Pro Pro Ser Ala Tyr
500 505 510
Glu Val
<210> 2
<211> 1545
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Aquilegia buergeriana
<400> 2
atgtacagta ccagagtcat cagcatgttt ggtcttactg tcagtgatct gtttctttca 60
gttattctct tcttcagcgc acatttcatc atacgtagct tactcttgaa gcatgagcac 120
aaacttcctc caggtccaaa tggttggcca gttcttggag cattacctct tcttggaact 180
atgcctcatg ttgcattagc tgaaatgtcc aaaaaatatg gacctgttat gtacctaaaa 240
ttaggtgctc atggtatggt ggtcgcgtct acaccagatg cagcgagggc attcctcaaa 300
acactagact taaatttctc aaatcgtcca actgatgcag gctcaaccca tcttgcatac 360
aacaggcaag acatggtgtt tgcagattat ggaccaaagt ggaagttgct acgtaaattg 420
agcaacttgc atatgcttgg tggtaaggct attgaagatt ggagtgctgt gaggaggatc 480
gaacttggtt acatgcttca agccatgtat gagtccagcc ataaaggaga ggccgtggtg 540
gtgccagaaa tgttagcgct cgctatggct aatatgattg gccaggtgat attgagtcgt 600
cgtgtgtttg ttactaaggg cacagaatca aatgagttca aggacatggt ggttgagctt 660
atgacatctg ctggactatt taatatcggt gatttcattc catccattgc atggatggat 720
atgcaaggga ttgtgggaag aatgaagaat ttgcacaaga agtttgatgc actcttggat 780
aaaatgttca aggaacacag ggcaacaagg aatgatagaa aagataagcc agactttctg 840
gatgttttga tgaacaatat gaacaaccct ggggaggaga agctcagtga caccaacatc 900
aaggctcttt tgctgaactt attttcagca ggaactgaca catcctcaag ttcggttgaa 960
tgggcactca ctgagatgat aaataaccca agcatccttc gccgtgcaca tgcagaaatg 1020
gatcaggtca ttggaaggaa ccgaagactt gaagaatccg acatacccaa tctgccatat 1080
ttacaagcaa tctgcaaaga atcattcaga aaacacccat caacacctct caatcttcca 1140
agagtatcca gagaaccatg tgaagtaaat ggttactaca tacccaaggg tacaagactc 1200
agtgtcaaca tatgggctat tggacgagac ccgaacgtgt gggagaatcc acttgagttc 1260
aatccagata gattcttgaa cgaaaaaaat gcaaaaatcg atccacgtgg caataatttt 1320
gagcttatac catttggttc tggaagaaga atatgtgcag gggtgagaat gggaattgtt 1380
cttgttgagt atatcttggg aactcttgtg cattcatttg attggaaact ccctgatgga 1440
gaaaaactaa acatggatga agcatttgga ctagcacttc agaaagctgt accacttgct 1500
gctgtcgtga ctagtcactt gccacccagt gcttatgaag tttga 1545
Claims (7)
- 매발톱꽃 유래의 신규 유전자에 있어서,
상기 유전자는 페튜니아의 꽃잎, 암술기관 및 화심을 변형시키는 활성을 나타내고,
상기 변형에 의해 상기 꽃잎의 색이 진적색을 나타내고,
상기 변형에 의해 상기 암술기관의 색이 자주색을 나타내고,
상기 변형에 의해 상기 화심의 색이 자주색을 나타내고,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인
매발톱꽃 유래의 신규 유전자. - 제 1항의 유전자로 형질전환된 형질전환 페튜니아.
- 삭제
- 제 2항에 있어서,
상기 유전자는 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터에 의해 전사가 조절되는 것인 형질전환 페튜니아. - 제 1항의 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 페튜니아를 형질전환하는 단계;
를 포함하는 형질전환 페튜니아의 제조방법. - 삭제
- 제 5항에 있어서,
상기 유전자는 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터에 의해 전사가 조절되는 것인 형질전환 페튜니아.
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| KR20190052230A KR20190052230A (ko) | 2019-05-16 |
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|---|---|---|---|---|
| CN111518818B (zh) * | 2020-03-26 | 2021-11-30 | 浙江大学 | 一个参与杨梅素生物合成的羟化酶基因及其应用 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR101100930B1 (ko) | 2003-08-13 | 2012-01-02 | 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 | 꽃의 색상이 변경된 장미의 제조 방법 |
| KR101168421B1 (ko) | 2007-06-20 | 2012-07-25 | 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 | 플라본 및 말비딘을 함유하는 장미 및 그 생산 방법 |
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|---|---|---|---|---|
| CA2759258C (en) * | 2009-04-24 | 2016-05-17 | Incorporated Administrative Agency National Agriculture And Food Research Organization | Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals |
-
2017
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