CN111518818B

CN111518818B - 一个参与杨梅素生物合成的羟化酶基因及其应用

Info

Publication number: CN111518818B
Application number: CN202010223426.9A
Authority: CN
Inventors: 李鲜; 邢梦云; 曹运琳; 徐昌杰; 孙崇德; 陈昆松
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: CN111518818A; WO2021190632A1; JP7122715B2; JP2021168646A

Abstract

本发明公开了一个参与杨梅素生物合成的羟化酶基因及其应用，所述羟化酶MrF3’5’H，所述羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，通过PCR扩增获得MrF3’5’H全长序列，其编码蛋白序列如SEQ:NO.2所示，通过序列比对得到其具有CYP45075A家族的proline‑rich、SRS、CR、EXXR和heme binding保守结构域。本发明验证了MrF3’5’H基因的功能，在酵母中进行的体外功能验证表明，MrF3’5’H具有P450羟化酶功能，可以将山奈酚和槲皮素分别催化为杨梅素。本发明对研究杨梅素分流机制具有指导意义，为杨梅素合成的工程化奠定了基础。

Description

一个参与杨梅素生物合成的羟化酶基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及重组蛋白和基因工程，具体涉及一个参与杨梅素生物合成的羟化酶MrF3’5’H基因包括该基因编码蛋白及其应用。

技术背景

细胞色素P450，简称CYP450，在许多物质的生物合成中起着重要作用，比如参与次生产物(如类黄酮)和激素的生物合成。类黄酮3’5’-羟化酶(F3’5’H)属于CYP45075A亚家族，参与类黄酮B环上3’5’位点羟化。目前，有关F3’5’H基因功能的研究主要集中在植物紫色花色苷合成，有关F3’5’H基因的其他功能研究比较有限。

杨梅(Morella rubra)属于我国特色水果，具有很好的医药学活性，这与其较高的黄酮类化合物含量密不可分，而杨梅素是杨梅中主要的黄酮类化合物，首次从杨梅树皮中分离并以此命名，通常以糖苷衍生物形式存在于液泡中。大量研究报道了杨梅素抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、消炎等医药学活性。富含杨梅素的植物可用于生产保健食品、药品，具有广阔的开发应用前景。

鉴别出杨梅中参与杨梅素生物合成的基因MrF3’5’H，对于阐明杨梅中杨梅素生物合成机制具有重要意义，为开发工程微生物菌奠定基础，且可用于其他植物基于基因工程技术的杨梅素组分改良，对提高食物中的杨梅素含量，增加食物的保健功能，有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一个参与杨梅素生物合成的羟化酶基因，是一个杨梅中参与杨梅素生物合成基因MrF3’5’H及其编码蛋白，来源于杨梅的CYP450家族，是一个参与杨梅素生物合成的关键基因，所述羟化酶为MrF3’5’H，所述羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示，所述羟化酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示。该蛋白序列具有CYP45075A家族的proline-rich、SRS、CR、EXXR和heme binding保守结构域。

本发明的另一个目的是提供所述的一个参与杨梅素生物合成的羟化酶(MrF3’5’H)基因及其编码蛋白在植物杨梅素含量和组分改良的基因工程中的应用。在酵母中进行的体外功能验证表明，MrF3’5’H具有P450羟化酶功能，可以将山奈酚和槲皮素分别催化为杨梅素，且对山奈酚的催化活性显著高于槲皮素。本发明为杨梅素合成的工程化奠定基础。

本发明提供的基因特征如下：

(1)基因序列特征：MrF3’5’H基因的可编码CDS序列如SEQ:NO.1所示，编码序列全长为1530个核苷酸，可编码一个含509个氨基酸的蛋白。其蛋白序列如SEQ:NO.2所示，含有保守的proline-rich、SRS、CR、EXXR和heme binding结构域，属于CYP450家族。

(2)基因功能特征：在酵母中进行的体外功能验证表明，MrF3’5’H具有P450羟化酶功能，可以将山奈酚和槲皮素分别催化为杨梅素，且对山奈酚的催化活性显著高于槲皮素。

本发明提供了一个杨梅中参与杨梅素生物合成的关键基因MrF3’5’H，具有如SEQ:NO.1所示的核苷酸序列，SEQ:NO.2所示的氨基酸序列。酵母体外功能验证表明，MrF3’5’H具有P450羟化酶功能，可以将山奈酚和槲皮素分别催化为杨梅素，且对山奈酚的催化活性显著高于槲皮素。本工作对研究杨梅素分流机制具有指导意义，为开发工程微生物菌奠定基础。

附图说明

图1.MrF3’5’H氨基酸序列比对结果；SlF3’5’H(ACF32346)，PhF3’5’H-Hf1(CAA80266)，PhF3’5’H-Hf2(CAA80265)。

图2.重组蛋白MrF3’5’H对山奈酚和槲皮素体外酶活分析LC-MS图谱。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

说明：本发明中涉及的目的基因引物设计、全长克隆、表达载体构建、RNA提取、cDNA合成、测序分析和鉴定以及PCR产物的分离纯化等基本操作，可按照本领域已知的技术进行，若未特别说明，实施例中的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。

实施例1：MrF3’5’H基因全长获得及鉴定

1.杨梅组织材料

荸荠和东魁杨梅组织(果实、花、叶片)当天采收，经液氮冷冻后存放于-80℃冰箱，每个组织样品设置3个生物学重复，每个重复7-8个果实，每个重复花的质量在500g以上，每个重复10-15片整叶。

2.RNA提取和cDNA合成

杨梅组织样品在液氮环境中研磨成粉末，利用普通CTAB法提取总RNA，经电泳检测合格后，参照TURBO DNAase Kit(Ambion)说明书，去除DNA，根据iScript cDNA SynthesisKit(Bio-Rad)要求，取1.0μg RNA，反转录成cDNA。

3.MrF3’5’H基因全长获得

在荸荠杨梅的RNA-Seq数据库中，以Flavonoid 3',5'-hydroxylase为关键词搜索与杨梅素合成相关的基因，并以葡萄中功能明确的SlF3’5’H氨基酸序列为参考，通过CLUSTALX软件同源比对，筛选出一个可能参与杨梅果实杨梅素合成的基因Unigene5190(MrF3’5’H)，应用序列为：SEQ:NO.1，并通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析，确认其为全长序列。设计全长克隆引物：SEQ:NO.3和SEQ:NO.4，PCR反应体系为50μL，成分分别为：0.5μL Roche高保真酶，5μL缓冲液(10×)，4μL dNTP(2.5mM)，上下游引物(10μM，Hua Gene)各2μL，4μL cDNA，32.5μL H₂O。反应程序为：预变性95℃，2min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，90min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4.MrF3’5’H基因全长鉴定及序列分析

将PCR扩增产物连接到T-easy载体，转化大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR验证，获得阳性菌落进行测序。克隆结果经测序验证，获得与转录组数据库相匹配的MrF3’5’H全长序列如SEQ:NO.1所示含有1530个核苷酸。在线翻译成氨基酸序列(http://web.expasy.org/translate/)，即：SEQ:NO.2。利用MrF3’5’H氨基酸序列与已发表具有3’5’-羟化的P45075A家族羟化酶比对，结果如图1所示。

实施例2：pYES2-MrF3’5’Hs表达载体的构建

根据pYES2 NT/C(Invitrogen)载体多克隆位点序列及MrF3’5’H(SEQ:NO.1)全长基因序列，设计包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物序列：SEQ:NO.5和SEQ:NO.6，该引物设计包含起始密码子和终止密码子，扩增得到含有BamHI和EcoRI酶切位点的MrF3’5’H序列。PCR反应体系为50μL，成分分别为：1μL Phanta高保真酶(Vazyme)，25μL缓冲液(2×)，1μL dNTP(10mM)，上下游引物(10μM，Hua Gene)各2μL，1μL cDNA，18μL H₂O。反应程序为：预变性95℃，2min；变性95℃，15s；退火58℃，15s；延伸72℃，1min，35个循环；72℃彻底延伸5min，4℃保存。分别用BamHI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切pYES2载体，使用

II连接酶(Vazyme)将目的基因片段连接到pYES2载体上。连接反应体系为10μL，成分分别为：1μL

II连接酶(Vazyme)，2μL缓冲液(5×)，1μL PCR回收产物，3μL载体，3μL H₂O。混匀后，37℃连接0.5h后冰上放置5min。将连接产物转化到DH5а感受态(Takara)中,涂布于含有Amp的培养板上37℃过夜培养，挑取阳性克隆菌株，送往上海Hua Gene测序，分析测序结果，含有正确目的基因序列的载体，则为构建成功的pYES2-MrF3’5’H重组质粒。

实施例3：酿酒酵母异源表达MrF3’5’H

1.重组载体酵母转化

将构建成功的pYES2-MrF3’5’H重组质粒或pYES2空载体，通过酵母转化试剂盒(Clontech)用LiAC法转化至酿酒酵母株系INVScI(Invitrogen)。然后涂布于SD/-Ura的培养板上30℃培养3天，挑取单菌落，PCR检测重组质粒或空载。选取PCR条带正确的单菌落，则为含有pYES2-MrF3’5’H重组质粒的酿酒酵母INVScI，用25％甘油保存于-80℃冰箱备用。

2.MrF3’5’H诱导表达

挑取单菌落于5mL SD/-Ura+20g/L glucose培养液，在30℃，250rpm摇床上培养12h。室温条件下700g离心5min收集酵母菌体，然后加入SD/-Ura+20g/L galactose培养液重悬浮菌体至OD₆₀₀为0.4。取2mL重悬浮菌体后的培养液至两个新的离心管，各自加入1mMNADPH(Sigma)和5mM反应底物(山奈酚或者槲皮素)，16℃，250rpm摇床上培养12h。以上操作均以空载酵母作为对照。

3.杨梅素检测

诱导完成后，加入1：1体积的乙酸乙酯溶液终止反应，涡旋混匀，1000g离心5min，取上清到新的10mL离心管，重复操作一次，合并上清，真空旋转蒸干有机相，加入150μL的色谱甲醇溶解备用。液相色谱检测流动相：A：水(0.1％甲酸)B：乙腈(0.1％甲酸)；进样体积：10μL；流速：0.3mL/min；柱温：25℃；检测波长为370nm洗脱梯度：0-7min 90％-50％A，7-10min 50％A，10-15min 50％-0％A，15-15.1min 0-90％A，15.1-21min 90％A。

检测结果表明，MrF3’5’H具有P45075A家族羟化酶的活性，可将山奈酚和槲皮素分别催化为杨梅素，且对山奈酚的催化活性更高(附图2)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述，需要理解的是，对于本领域普通技术人员来说，在权利要求范围内，可以根据上述说明加以改进或变换，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一个参与杨梅素生物合成的羟化酶基因及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1530

<212> DNA

<213> 杨梅(Morella rubra)

<400> 1

atggccgtag acatgttcct cctcagagaa cttgttgtgg cgattgtcct cttcttcata 60

acccgctttt ctatccagtt actatttaaa aaaccttctc gaaaacttcc acctggccct 120

aaaggttggc cttttcttgg ggcccttaca attctaggag ctatgcctca tgtaacctta 180

gcccagatgg ccaagaaata tggacccgtc atgtacctga aaatgggcac ttgtaacatg 240

gtcgtggcct ctactccaga tgcagcacga gcgttcttga aaacgctaga cctgaatttc 300

tcgaaccgtc caccgaacgc tggcgcaacc cacttagcct atgatgctca ggacatggtg 360

tttgcggact atggagcaag gtggaagttg cttagaaagt tgagcaacct acacatgctt 420

ggagggaagg ctctcgaaga ctgggctcag gttcgagcat ttgagctagg ccacatgctt 480

agagccatgt gtgagtctag caagagagcc gagcctgtgg tgataccaga gatgttgact 540

tatgccatgg caaacatgat cggacaggtg atactaagtc gccgtgtgtt cgtgactaag 600

ggctcggagt ctaacgagtt taaggacatg gtggtggagc tcatgacatc agctgggtac 660

ttcaacatcg gcgatttcat accatccatc gcgtggatgg acttgcaagg aattgagcgc 720

ggaatgaagc gcctgcacaa acgcttcgac gtgctactga caaagatgat tgaggagcat 780

actgcttctg cccgtgaccg caagggaaag ccagatttct tggatgtcgt catggctaac 840

agagaaaact ccgagggcga gaggcttagt ttgactaaca ttaaggcact cctgttgaac 900

ttatttactg ccggcaccga cacatcatca agcattatag aatgggcact tgcggagatg 960

ttgagcaacc ccagcatcct taggcgggct cacgaggaga tggatcaagt gattggcagg 1020

aacagacgcc tcgaggaggc agacatatca aagctaccat atctccaagc catatgcaaa 1080

gaaaccatgc ggaagcaccc ttccacgcca ctcaacctgc cccgggtttc aaccgaagca 1140

tgcgaagtga atggctacta cattccaaag aacaccaggc ttagcgtgaa catatgggga 1200

atagggagag accctgatgt gtgggaaaac ccgctggatt tcacgccaga aagatttttg 1260

tctgggagaa atgccaagat cgatccaaga gggaatgatt tcgagctgat tccattcggg 1320

gctggaagga ggatttgtgc agggaccagg atgggaatta cgctggtgga gtacattctc 1380

ggcacgttgg tgcactcctt tgactggaaa ttgcccaatg gagttgataa gctagacatg 1440

caggagtcct ttggacttgc gttgcaaaag agtgtgccac ttgcggctct agttacccca 1500

cgcctatctt taagcgcata tgcttcttaa 1530

<210> 2

<211> 509

<212> PRT

<213> 杨梅(Morella rubra)

<400> 2

Met Ala Val Asp Met Phe Leu Leu Arg Glu Leu Val Val Ala Ile Val

1 5 10 15

Leu Phe Phe Ile Thr Arg Phe Ser Ile Gln Leu Leu Phe Lys Lys Pro

20 25 30

Ser Arg Lys Leu Pro Pro Gly Pro Lys Gly Trp Pro Phe Leu Gly Ala

35 40 45

Leu Thr Ile Leu Gly Ala Met Pro His Val Thr Leu Ala Gln Met Ala

50 55 60

Lys Lys Tyr Gly Pro Val Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr Cys Asn Met

65 70 75 80

Val Val Ala Ser Thr Pro Asp Ala Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu

85 90 95

Asp Leu Asn Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu

100 105 110

Ala Tyr Asp Ala Gln Asp Met Val Phe Ala Asp Tyr Gly Ala Arg Trp

115 120 125

Lys Leu Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala

130 135 140

Leu Glu Asp Trp Ala Gln Val Arg Ala Phe Glu Leu Gly His Met Leu

145 150 155 160

Arg Ala Met Cys Glu Ser Ser Lys Arg Ala Glu Pro Val Val Ile Pro

165 170 175

Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu

180 185 190

Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Ser Glu Ser Asn Glu Phe Lys

195 200 205

Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly

210 215 220

Asp Phe Ile Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg

225 230 235 240

Gly Met Lys Arg Leu His Lys Arg Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met

245 250 255

Ile Glu Glu His Thr Ala Ser Ala Arg Asp Arg Lys Gly Lys Pro Asp

260 265 270

Phe Leu Asp Val Val Met Ala Asn Arg Glu Asn Ser Glu Gly Glu Arg

275 280 285

Leu Ser Leu Thr Asn Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala

290 295 300

Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met

305 310 315 320

Leu Ser Asn Pro Ser Ile Leu Arg Arg Ala His Glu Glu Met Asp Gln

325 330 335

Val Ile Gly Arg Asn Arg Arg Leu Glu Glu Ala Asp Ile Ser Lys Leu

340 345 350

Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Cys Lys Glu Thr Met Arg Lys His Pro Ser

355 360 365

Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Val Ser Thr Glu Ala Cys Glu Val Asn

370 375 380

Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Gly

385 390 395 400

Ile Gly Arg Asp Pro Asp Val Trp Glu Asn Pro Leu Asp Phe Thr Pro

405 410 415

Glu Arg Phe Leu Ser Gly Arg Asn Ala Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn

420 425 430

Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly

435 440 445

Thr Arg Met Gly Ile Thr Leu Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val

450 455 460

His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Asp Lys Leu Asp Met

465 470 475 480

Gln Glu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ser Val Pro Leu Ala Ala

485 490 495

Leu Val Thr Pro Arg Leu Ser Leu Ser Ala Tyr Ala Ser

500 505

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

atggccgtag acatgttcct c 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

ttaagaagca tatgcgctta aag 23

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

tgacgataag gtacccggat ccatggccgt agacat 36

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

gtgctggata tctgcagaat tcttaagaag catatgc 37

Claims

1.一种羟化酶基因，其特征在于，所述羟化酶为MrF3’5’H，所述羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。

2.一种羟化酶基因编码的蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ:NO.2所示，具有proline-rich、SRS、CR、E××R和heme binding保守结构域。

3.一种杨梅素合成的方法，其特征在于：所述的方法是向酵母菌中导入带有特定的羟化酶基因的基因表达载体，并向酵母菌提供原料山奈酚和/或槲皮素，从而合成杨梅素；所述的特定的羟化酶基因选自权利要求1所述核苷酸序列。

4.一种用于杨梅素合成的基因表达载体，其特征在于：所述的表达载体是在pYES2载体中连接了权利要求1所述的基因。

5.一种用于杨梅素合成的工程微生物菌株，其特征在于：所述的菌株为含有权利要求4所述的基因表达载体的酵母菌。

6.一种生物催化底物合成杨梅素的方法，其特征在于：所述的生物催化利用权利要求5所述的酵母菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的底物选自山奈酚和槲皮素的至少一种。