JP7122715B2

JP7122715B2 - 水酸化酵素遺伝子及びその使用

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Publication number: JP7122715B2
Application number: JP2021053581A
Authority: JP
Inventors: 鮮李; 夢雲刑; 運琳曹; 昌杰徐; 崇徳孫; 昆松陳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2022-08-22
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Description

本発明は、分子生物学の分野に属し、組み換えタンパク質と遺伝子工学に関し、具体的には、水酸化酵素遺伝子及びコ－ドするタンパク質とその使用に関する。

シトクロムＰ４５０は、ＣＹＰ４５０とも略称する。多くの物質の生合成に重要な役割を果たしており、例えば、二次生成物（例えば、フラボノイド）とホルモンの生合成に参与している。フラボノイド－３’５’－ヒドロキシラ－ゼ（Ｆ３’５’Ｈ）は、ＣＹＰ４５０７５Ａサブファミリ－に属し、フラボノイドＢ環のヒドロキシル化反応を触媒する。現在、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子の機能に関する研究は、主に植物紫色アントシアニン合成に集中しており、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子の他の機能に関する研究が比較的有限である。

ヤマモモ（ＭｏｒｅｌｌａＲｕｂｒａ）は、中国の特色のある果物であり、良好な薬学活性を有し、これはその比較的高いフラボノイド化合物の含有量と切り離せない緊密な関係があるが、ミリセチンがヤマモモ中の主要なフラボノイド化合物であり、初めて楊梅皮から分離し、且つこれによって命名され、通常、配糖体誘導体の形式で液胞に存在する。大量の研究によると、ミリセチンの抗酸化、抗腫瘍、心血管疾患予防、消炎などの薬学活性を報告した。ミリセチンが豊富に含まれる植物は、保健食品、医薬品の生産に使用することができ、大いなる開発応用将来性がある。

ミリセチンの生合成に参与する遺伝子Ｆ３’５’Ｈを同定することは、ミリセチンの生合成機序の解明に対して重要な意義があり、工学微生物菌の開発のために基礎を築き上げ、また、他の植物の遺伝子工学技術に基づくミリセチン成分の改良に適用可能であり、食品中のミリセチン含有量の向上、食品の保健機能の増加において重要な応用価値を有する。

本発明は、ヤマモモから新規の水酸化酵素遺伝子ＭｒＦ３’５’Ｈ（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ３’５’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｏｆＭｏｒｅｌｌａｒｕｂｒａ）を初めて単離し、ヤマモモにおけるミリセチン合成の重要な遺伝子である。他の植物で機能同定されたＦ３’５’Ｈ水酸化酵素と比較され（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０１４Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄ３′，５′－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｆｒｏｍｔｅａｐｌａｎｔ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）：ｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｉｎｓ．ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ．１４：３４７．）、ＭｒＦ３’５’Ｈは、相対的に強いミリセチン合成能力を示した。また、ＭｒＦ３’５’Ｈのケンペロ－ルに対する選好性及び相対的に強い触媒活性は、ヤマモモにはミリセチンが豊富に含まれる重要な要素である。

本発明は、Ｆ３’５’Ｈ水酸化酵素遺伝子をコ－ドする新規の単離されたヌクレオチドであって、以下の特徴のうちの少なくとも一つを有するヌクレオチド配列を含む、新規の単離されたヌクレオチドを提供する。

1）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．１のヌクレオチド配列；
2）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．２タンパク質配列をコ－ドするポリヌクレオチド配列；
3）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．１ヌクレオチド配列と８０％以上の相同性、又は８５％以上の相同性、又は９０％以上の相同性、又は９５％以上の相同性を有し、且つ同じ機能性タンパク質をコ－ドするヌクレオチド配列；
4）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．１に限定されるＤＮＡ配列とハイブリダイゼ－ションするヌクレオチド配列；
5）ＳＥＱＩＤＮＯ．１と同じ機能性タンパク質をコ－ドするヌクレオチド配列。

ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すヌクレオチド配列は、ヤマモモの果実から抽出精製されたものであり、すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すヌクレオチド配列に対して一つ又は複数塩基を置換、欠失、挿入及び／又は添加されたヌクレオチド配列であり、或いは、ＳＥＱＩＤＮＯ．１ヌクレオチド配列と８０％以上の相同性、又は８５％以上の相同性、又は９０％以上の相同性、又は９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列であり、Ｆ３’５’Ｈヒドロキシル化機能を有するタンパク質をコ－ドするヌクレオチド配列であれば、本発明に係る水酸化酵素遺伝子に含まれる。

前記水酸化酵素遺伝子は、ＭｒＦ３’５’Ｈであり、ＣＹＰ７５Ａとも呼ばれる。本願出願人は、ＭｒＦ３’５’Ｈ（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ３’５’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｏｆＭｏｒｅｌｌａｒｕｂｒａ）遺伝子の生物学的機能を体系的に研究することで、Ｂ環トリヒドロキシフラボノイド合成におけるＭｒＦ３’５’Ｈの独特な作用を初めて検証した。本願出願人は、ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子、すなわち、ＭｒＦ３’５’ＨのｃＤＮＡ配列（配列表のＳＥＱＩＤＮＯ．１のヌクレオチド配列を参照）を成功にクロ－ニンし、その後、ＭｒＦ３’５’ＨｃＤＮＡ配列に対する特異的プライマ－を用いてＰＣＲ増幅を行い、当該配列を真核発現ベクタ－に構築して（実施例３を参照）、真核細胞においてＭｒＦ３’５’Ｈポリペプチドやタンパク質を発見した（明細書の配列表のＳＥＱＩＤＮＯ．２配列及び実施例４を参照）。さらに、本願出願人は、酵母宿主菌に発見するＭｒＦ３’５’Ｈ（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ３’５’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｏｆＭｏｒｅｌｌａｒｕｂｒａ）タンパク質は、Ｂ環モノヒドロキシナリンゲニンを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシエリオジクチオ－ル（ＥＩＣ２８７）を生成し、また、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシの５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環モノヒドロキシジヒドロケンペロ－ルを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシジヒドロクエルセチン（ＥＩＣ３０３）を生成し、また、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環モノヒドロキシケンペロ－ルを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシケルセチン（ＥＩＣ３０１）を生成し、また、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのミリセチン（ＥＩＣ３１７）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環ジヒドロキシエリオジクチオ－ルを触媒して５’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシの５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環ジヒドロキシジヒドロクエルセチンを触媒して５’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環ジヒドロキシジヒドロクエルセチンを触媒して５’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのミリセチン（ＥＩＣ３１７）を生成することができる（図４及び図５を参照）。さらに、本願出願人は、また、異種過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子の煙草中のミリセチン及びケルセチンの含有量が著しく増加しており、異種過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子の煙草の花中のミリセチンとデルフィニジンの含有量が著しく増加することを発見した（図８を参照）。

本発明は、Ｆ３’５’Ｈ水酸化酵素遺伝子がコ－ドするポリペプチドやタンパク質であって、以下の特徴のうちの少なくとも一つを有するポリペプチドやタンパク質をさらに提供する。

１）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．２のアミノ酸配列；
２）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．２のアミノ酸残基配列と８０％以上の相同性、又は８５％以上の相同性、又は９０％以上の相同性、又は９５％以上の相同性を有し、且つヒドロキシ化機能を表するポリペプチドやタンパク質；
３）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．２のアミノ酸残基配列を、一つ又は複数のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加され、且つヒドロキシ化機能を表するタンパク質；
４）ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲＳ、ＣＲ、ＥＸＸＲとｈｅｍｅｂｉｎｄｉｎｇ保存構造ドメインを有する。

本明細書に記載されたポリペプチドやタンパク質は、細胞内の転写及び翻訳過程を経て前記ＭｒＦ３’５’Ｈによって発現される。前記転写とは、細胞が前記ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子のヌクレオチドを鋳型とし、ヌクレオチド相補的形成原則に基づいて、リボヌクレオチドを原料として、対応するＭｒＦ３’５’ＨｍＲＮＡを合成する過程である。前記翻訳とは、細胞がさらに前記ＭｒＦ３’５’ＨｍＲＮＡを鋳型とし、アミノ酸を原料として、ＭｒＦ３’５’Ｈに対応するポリペプチドやタンパク質を合成する過程である。系統樹上に、前記ＭｒＦ３’５’Ｈは、ＶｖＦ３’５’Ｈとの距離が最も近く、ヌクレオチド配列相同性が７８．２１％であり、アミノ酸配列相同性が８２．８７％であり、ＧｔＦ３’５’Ｈとの距離が最も遠く、ヌクレオチド配列相同性が６６．４１％であり、アミノ酸配列相同性が７１．７１％であり、いずれもＣＹＰ７５Ａファミリ－に属する（図３及び図６を参照）。ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈのタンパク質機能とを比較するに、ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈのタンパク質機能は、類似であり、いずれもＢ環モノヒドロキシフラボノイド及び／又はＢ環ジヒドロキシフラボノイドを触媒してＢ環トリスヒドロキシフラボノイドを合成することができることがわかった（図７を参照）。

本発明は、以下の１）～４）の特徴の少なくとも一つを有するアミノ酸配列を含み、ミリセチンを生成可能な植物から抽出された酵素である、ことを特徴とする水酸化酵素をさらに提供する。

1）ＳＥＱＩＤＮＯ．２で表示されるアミノ酸配列；
2）ＳＥＱＩＤＮＯ．２と８０％以上の相同性、且つヒドロキシ化機能を表するポリペプチドやタンパク質；
3）配列表中のＳＥＱＩＤＮＯ．２のアミノ酸残基配列を、一つ又は二つ以上のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加され、且つヒドロキシ化機能を表するタンパク質；
4）ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲＳ、ＣＲ、ＥＸＸＲとｈｅｍｅｂｉｎｄｉｎｇ保存構造ドメインを有するアミノ酸配列。

前記水酸化酵素は、フラボノイドを触媒して３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生させる機能を有する。好ましくは、前記水酸化酵素は、ＭｒＦ３’５’Ｈであり、Ｂ環モノヒドロキシ及び／又はＢ環ジヒドロキシフラボノイドを触媒して３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生させることができる。

本発明は、前述したようなＦ３’５’Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列又は前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列を含む遺伝子発現ベクタ－をさらに提供する。本明細書に記載される遺伝子は、既存の真核又は原核発現ベクタ－に挿入することができ、ここで、適切なベクタ－は、細菌プラスミド、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどを含む。前記ベクタ－は、環状ＤＮＡ分子であり、細胞内で自律的に複製と転写発現することができ、遺伝子工学において最もよく使われるツ－ルである。

本発明は、前述したようなＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を有する遺伝子発現ベクタ－を含む遺伝子組み換え細胞株又は宿主菌をさらに提供する。本明細書に記載されるＦ３’５’Ｈ遺伝子を含むベクタ－は、動物又は植物細胞、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞に由来する適切な細胞株又は宿主菌を形質転換するために使用することができ、前記宿主菌は、例えば酵母、大腸菌などの遺伝子工学菌であってもよい。

本発明は、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む遺伝子発現ベクタ－を宿主菌に導入し、原料Ｂ環モノヒドロキシフラボノイド及び／又はＢ環ジヒドロキシフラボノイドを宿主菌に提供することにより、Ｂ環トリスヒドロキシフラボノイドを合成し、好ましくは、前記宿主菌からＢ環トリスヒドロキシフラボノイドを抽出することができるＢ環トリスヒドロキシフラボノイドの作製方法をさらに提供する。前記宿主菌は、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列の発現ベクタ－を含む。図５及び実施例４に示すように、酵母宿主菌を例にとると、ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質を発現する酵母宿主菌に原料ナリンゲニン及び／又はエリオジクチオ－ルを提供すると、５－ヒドロキシフラボンを生成し、ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質を発現する酵母宿主菌に原料ジヒドロケンペロ－ル及び／又はジヒドロクエルセチンを提供すると、ジヒドロミリセチンを生成し、ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質を発現する酵母宿主菌に原料ケンペロ－ル及び／又はクエルセチンを提供すると、ミリセチンを生成する。

さらに、本発明は、以下の方法のうちのいずれか一つから選択されるミリセチンの作製方法を提供する。方法１）：前述したようなＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む遺伝子発現ベクタ－を植物体又は植物組織に導入することにより、植物系ミリセチンの合成を実現する。好ましくは、前記植物体又は植物組織からミリセチンを抽出することができ、好ましくは、前記植物は、煙草である。方法２）：前述したようなＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む遺伝子発現ベクタ－を細胞株又は宿主菌に導入し、宿主菌に原料ケンペロ－ル及び／又はクエルセチンを提供することにより、ミリセチンを生成する。好ましくは、前記細胞株又は宿主菌からミリセチンを抽出することができる。実施例７で述べたように、ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子を煙草に導入すると、野生型煙草に比べて、過剰発現したＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子の煙草の花と葉におけるミリセチンの含有量が著しく増加した。図５及び実施例４に示すように、酵母宿主菌を例にとると、ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質を発現する酵母宿主菌に原料ケンペロ－ル及び／又はクエルセチンを提供すると、ミリセチンを生成した。

さらに、本発明は、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む遺伝子発現ベクタ－を宿主菌に導入し、原料ナリンゲニン及び／又はエリオジクチオ－ルを宿主菌に提供することにより、５－ヒドロキシフラボンを合成する５－ヒドロキシフラボンの作製方法を提供する。好ましくは、前記宿主菌から５－ヒドロキシフラボンを抽出することができる。図５及び実施例４に示すように、酵母宿主菌を例にとると、ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質を発現する酵母宿主菌に原料ナリンゲニン及び／又はエリオジクチオ－ルを提供すると、５－ヒドロキシフラボンを生成した。

さらに、本発明は、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む遺伝子発現ベクタ－を宿主菌に導入し、原料ジヒドロケンペロ－ル及び／又はジヒドロクエルセチンを宿主菌に提供することにより、ジヒドロミリセチンを合成する、ことを特徴とするジヒドロミリセチンの作製方法を提供する。好ましくは、前記宿主菌からジヒドロミリセチンを抽出することができる。実施例４に示すように、酵母宿主菌を例にとると、ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質を発現する酵母宿主菌に原料ジヒドロケンペロ－ル及び／又はジヒドロクエルセチンを提供すると、ジヒドロミリセチンを生成した。

本発明は、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子をコ－ドするヌクレオチド配列、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子発現ベクタ－、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む細胞株又は宿主菌の遺伝子工学における使用を提供する。前述遺伝子工学とは、ＭｒＦ３’５’Ｈヌクレオチド配列を含む発現ベクタ－を体外にて構築し、次に、生細胞に導入し、生物の本来の遺伝特性を変化させ、新規品種を獲得し、新規製品を生産するための遺伝技術である。前記遺伝子工学の応用としては、遺伝子工学薬品の作製、新規植物品種育成、食品工業開発などがある。

さらに、本発明は、特定のヌクレオチドを受容体植物に導入し、当該ヌクレオチドを受容体植物に発現させてトランスジェニック植物を獲得するトランスジェニック植物の育成方法を提供する。前記特定のヌクレオチドは、前述したようなＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子を含む発現ベクタ－から選択される。好ましくは、前記植物は、煙草である。実施例７で述べたように、ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子を煙草に導入すると、野生型煙草に比べて、過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子の煙草の花と葉の中のミリセチンの含有量が著しく増加した。

本発明は、請求項６に記載の遺伝子発現ベクタ－から選択された特定のヌクレオチドを導入さて発現される、ことを特徴とするトランスジェニック煙草をさらに提供する。

本発明は、ミリセチンの生合成に参与する水酸化酵素遺伝子Ｆ３’５’Ｈ及びそのコ－ドするタンパク質及びその使用を提供する。前記水酸化酵素遺伝子は、ＭｒＦ３’５’Ｈであり、ヤマモモのＣＹＰ４５０ファミリ－に由来し、ミリセチンの合成に参与する重要な遺伝子であり、ミリセチンの合成の工学化のために基礎を築き上げ、そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すとおりであり、そのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示すとおりである。酵母体内にて行われた組み換えタンパク質実験結果により、ＭｒＦ３’５’Ｈは、Ｐ４５０水酸化酵素機能を有し、ケンペロ－ルを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生してケルセチンを生成し、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生してミリセチンを生成することができ、ケルセチンを触媒して５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生してミリセチンを生成することもでき、また、ケンペロ－ルに対する触媒活性がその同源タンパク質ＶｖＦ３’５’Ｈよりも高いことがわかった（図４及び図７を参照）。遺伝子工学技術を用いて獲得した過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈのトランスジェニック煙草植株は、野生型に比べて、トランスジェニック植株の葉の中のミリセチン、ケルセチン及びケンペロ－ルの含有量が著しく増加しており、トランスジェニック植株の花の中のミリセチンとデルフィニジンの含有量が著しく増加したが、ケルセチンとケンペロ－ルの含有量が顕著な変化がなかった。

本発明の他の目的は、Ｂ環トリスヒドロキシフラボノイド合成に参与する遺伝子ＭｒＦ３’５’Ｈ及びそのコ－ドするタンパク質とその使用を提供することにある。酵母にて行われた体外機能検証結果により、ＭｒＦ３’５’Ｈは、それぞれＢ環モノヒドロキシナリンゲニン、ジヒドロケンペロ－ル、ケンペロ－ルによる合成したＢ環ジヒドロキシエリオジクチオ－ル、ジヒドロキシケルセチン、ケルセチンとＢ環トリスヒドロキシの５－ヒドロキシフラボン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチンを触媒することができ、Ｂ環ジヒドロキシエリオジクチオ－ル、ジヒドロケルセチン、ケルセチンによる合成したＢ環トリスヒドロキシの５－ヒドロキシフラボン、ジヒドロケルセチン、ジヒドロミリセチンを触媒することもでき、他のＢ環トリスヒドロキシの合成のために中間生成物を提供することがわかった。

本発明が提供する遺伝子の特徴は、以下のとおりである：
（1）遺伝子配列特徴：ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子のコ－ド可能なｃＤＮＡ配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すように、コ－ド配列の全長は、１５３０個ヌクレオチドであり、５０９個のアミノ酸を含むタンパク質をコ－ドすることができる。そのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．２に示すように、保存的なｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲＳ、ＣＲ、ＥＸＸＲとｈｅｍｅｂｉｎｄｉｎｇ構造ドメインを含み、ＣＹＰ４５０ファミリ－に属する。
（2）遺伝子機能特徴：酵母にて行われた体外機能検証結果により、ＭｒＦ３’５’Ｈは、Ｐ４５０水酸化酵素機能を有し、ケンペロ－ルとケルセチンをミリセチンにそれぞれ触媒され、また、ケンペロ－ルに対する触媒活性がその同源タンパク質ＶｖＦ３’５’Ｈよりも高いことがわかった。遺伝子工学技術を用いて過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈのトランスジェニック煙草植株を獲得し、野生型に比べて、トランスジェニック植株の葉の中のミリセチン、ケルセチン及びケンペロ－ルの含有量が著しく増加しており、トランスジェニック植株の花の中のミリセチンとデルフィニジンの含有量が著しく増加したが、ケルセチンとケンペロ－ルの含有量が顕著な変化がなかった。

本発明は、ミリセチンの分流メカニズムの研究に対して指導的な意義があり、工学微生物菌又は遺伝子工学技術に基づく植物ミリセチン成分の改良開発のために基礎を築き上げた。

フラボノイドの基本構造図、フラボノイドの基本構造は、Ａ環、Ｂ環とＣ環からなる。ナズナ（Ｂｉｑｉ）と東魁楊梅（Ｄｏｎｇｋｕｉ）の異なる組織におけるミリセチンとケルセチンの含有量の分析図である。ＭｒＦ３’５’Ｈアミノ酸配列の対比結果であり、ＳｌＦ３’５’Ｈ（ＡＣＦ３２３４６）、ＰｈＦ３’５’Ｈ－Ｈｆ１（ＣＡＡ８０２６６）、ＰｈＦ３’５’Ｈ－Ｈｆ２（ＣＡＡ８０２６５）、Ｆ３’５’Ｈタンパク質は、保存的なｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲＳ、ＣＲ、ＥＸＸＲとｈｅｍｅｂｉｎｄｉｎｇ構造ドメインを含む。組み換えタンパク質ＭｒＦ３’５’Ｈ体外活性ＬＣ－ＭＳスペクトル分析図である。図４は、ＭｒＦ３’５’Ｈが３’遺伝子座及び／又は５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を触媒する機能を有することを示す。ＭｒＦ３’５’Ｈは、Ｂ環モノヒドロキシフラボノイドナリンゲニン、ジヒドロケンペロ－ルとケンペロ－ルを触媒し、それぞれ３’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシフラボノイドエリオジクチオ－ル（ＥＩＣ２８７）、ジヒドロケルセチン（ＥＩＣ３０３）とケルセチン（ＥＩＣ３０１）を生成し、それぞれ３’遺伝子座及び５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシフラボノイドの５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）、ジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）とミリセチン（ＥＩＣ３１７）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈは、Ｂ環ジヒドロキシフラボノイドエリオジクチオ－ル、ジヒドロケルセチンとケルセチンを触媒して５’遺伝子座のヒドロキシル化反応をそれぞれ発生し、Ｂ環トリスヒドロキシフラボノイドの５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）、ジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）とミリセチン（ＥＩＣ３１７）を生成することができる。Ｎａｒ：ナリンゲニン；Ｅｒｉ：エリオジクチオ－ル（ＥＩＣ２８７）；ＰＨＦ：５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）；ＤＨＫ：ジヒドロケンペロ－ル；ＤＨＱ：ジヒドロケルセチン（ＥＩＣ３０３）；ＤＨＭ：ジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）；Ｋ：ケンペロ－ル；Ｑ：ケルセチン（ＥＩＣ３０１）；Ｍ：ミリセチン（ＥＩＣ３１７）。組み換えタンパク質ＭｒＦ３’５’Ｈ触媒基質及び生成物の構造式である。ナリンゲニン、ジヒドロケンペロ－ル、ケンペロ－ルは、Ｂ環モノヒドロキシのフラボノイドに属し、エリオジクチオ－ル、ジヒドロケルセチン、ケルセチンは、Ｂ環ジヒドロキシのフラボノイドに属し、５－ヒドロキシフラボン、ジヒドロミリセチン、ミリセチンは、Ｂ環トリヒドロキシのフラボノイドに属する。ＭｒＦ３’５’Ｈの系統樹分析図である。ＣｒＦ３’５’Ｈ（Ｑ９ＺＲＹ０）、ＧｈＦ３’５’Ｈ（ＡＡＰ３１０５８）、ＧｍＦ３’５’Ｈ（ＡＡＭ５１５６４）、ＧｔＦ３’５’Ｈ（Ｑ９６５８１）、ＮｔＦ３’５’Ｈ（ＸＰ＿０１６４５２５９９）、ＰｈＦ３’５’Ｈ（Ｈｆ１）（ＣＡＡ８０２６６）、ＰｈＦ３’５’Ｈ（Ｈｆ２）（ＣＡＡ８０２６５）、ＳｌＦ３’５’Ｈ（ＡＣＦ３２３４６）、ＳｔＦ３’５’Ｈ（ＮＰ＿００１２７４８０７）、ＶｍＦ３’５’Ｈ（ＢＡＣ９７８３１）、ＶｖＦ３’５’Ｈ（ＣＡＩ５４２７７）。ＭｒＦ３’５’Ｈ及びＶｖＦ３’５’Ｈの基質触媒特性分析図である。過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈの煙草表現型とフラボノイド含有量の分析図である。ここで、（ａ）は、過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈ煙草の花色の変化を表す。（ｂ）は、過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈにより煙草の葉のミリセチン、ケルセチンとケンペロ－ルの含有量が著しく高め、花のミリセチンとデルフィニジンの含有量が著しく高めたことを表す。

以下、図面と具体的な実施例を参照しながら、本発明について詳細に説明する。
なお、本発明に係る目的遺伝子プライマ－設計、完全長クロ－ン、発現ベクタ－構築、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、シ－クエンシング分析と同定、及びＰＣＲ生成物の分離精製などの基本操作は、当該技術分野において周知の技術によって行うことができ、別途明記されない限り、実施例における技術手段は、当業者が周知の従来の手段である。

実施例１：ヤマモモの異なる組織中のフラボノ－ル含有量の検出
1、ヤマモモの組織材料
当日採集したナズナと東魁楊梅の組織（果実、花、葉身）、液体窒素で冷凍した後－８０℃の冷蔵庫に保管し、各組織試料は、三つの生物学的反復を設置し、１回に７～８個の果実を繰り返し、１回の繰り返し用花の質量が５００ｇ以上とし、１回当たり１０～１５枚全葉を繰り返した。
２、フラボノ－ル含有量の検出。
０．３ｇ程度の生の試料粉末をそれぞれ秤量し、１：１０（ｇ：ｍＬ）で８０％メタノ－ル（１％ＨＣＬ）に溶け、２時間漬け、超音波３０分間、３回繰り返し、上澄み液を混合し、粗抽出液６ｍＬを得た。抽出液１ｍＬを３０℃で水相のみに回転真空濃縮し、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２００μＬメチルアルコ－ル（１％ＨＣＬ）に定容し、０．２２μＭ水系ろ過膜（ＬＡＢＭＡＸ）ろ過した。検出カラム：固定相（ＳｕｎｆｉｒｅＣ１８５μｍ（４．６＊２５０ｍｍ））、移動相Ａ：（０．１％ギ酸）Ｂ：アセトニトリル：水（０．１％ギ酸）＝１：１、試料注入体積１０μＬ、流速１ｍＬ／分間、カラム温度２５℃、体系：０－２０分間２８％Ｂ、２０－２５分間２８－３６％Ｂ、２５－４０分間３６％Ｂ、４０－４５分間３６－５０％Ｂ、４５－６０分間５０－１００％Ｂ、６０－６５分間１００％Ｂ、６５－７０分間１００－２８％Ｂ、７０－７５分間２８％Ｂ。移動相は、いずれもクロマトグラムであった。
ナズナと東魁楊梅の葉身及び花の中に、ミリセチンの含有量が１０ｍｇｇ^－１ＦＷに達し、果実の発育過程において、ミリセチンの含有量は、減少傾向をを呈した（図２）。

実施例２：ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子完全長獲得及び同定
1、ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成。
ヤマモモ組織試料を液体窒素環境で粉末に研磨し、普通のＣＴＡＢ法を用いて総ＲＮＡを抽出し、電気泳動検査に合格した後、ＴＵＲＢＯＤＮＡａｓｅＫｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）の説明書を参照し、ＤＮＡを除去し、ｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の要求により、１．０μｇのＲＮＡを取り、ｃＤＮＡに逆転写した。
２、ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子完全長獲得
ナズナ楊梅のＲＮＡ－Ｓｅｑデ－タベ－スにおいて、Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ３’，５’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅをキ－ワ－ドとしてミリセチンの合成に関連する遺伝子を検索し、トマト中の機能が明確であるＳｌＦ３’５’Ｈアミノ酸配列を参照として、ＣＬＵＳＴＡＬＸソフトウェアの相同性比較を経て、ヤマモモ果実のミリセチン合成に参与する可能性のある遺伝子Ｕｎｉｇｅｎｅ５１９０（ＭｒＦ３’５’Ｈ）をスクリ－ニングし、応用配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１であった。ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）オンライン分析を経て、完全長配列であることを確認した。完全長クロ－ンプライマ－の設計：ＳＥＱＩＤＮＯ．３とＳＥＱＩＤＮＯ．４、ＰＣＲ反応系は、５０μＬであり、成分は、それぞれ０．５μＬＲｏｃｈｅ高忠実度酵素、５μＬ緩衝液（１０×）、４ μＬｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）、上下流プライマ－（１０μＭ、ＨｕａＧｅｎｅ）各２μＬ、４μＬｃＤＮＡ、３２．５ μＬＨ_２Ｏであった。反応手順は、初期変性９５℃、２分間；変性９５℃、３０秒間；アニ－ル５８℃、３０秒間；伸長７２℃、９０分間、３５サイクル；７２℃伸長１０分間、４℃保管であった。
2、ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子完全長同定及び配列分析
ＰＣＲでの増幅産物をＴ－ｅａｓｙベクタ－に連結し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、コロニ－ＰＣＲ検証を行い、陽性コロニ－を得てシ－クエンシングを行った。シ－クエンシングによりクロ－ン結果を検証され、獲得したトランスクリプト－ムデ－タベ－スに一致するＭｒＦ３’５’ＨＨ完全長配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示すように１５３０個のヌクレオチドを含む。オンラインでアミノ酸配列（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｒａｎｓｌａｔｅ／）、すなわち、ＳＥＱＩＤＮＯ．２に翻訳する。ＭｒＦ３’５’Ｈアミノ酸配列を用いて、発表された３’５’遺伝子座のヒドロキシル化を有するＰ４５０７５Ａファミリ－水酸化酵素と比較すると、その結果を図３に示す。
本願出願人は、ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子、すなわち、ＭｒＦ３’５’ＨのｃＤＮＡ配列を成功にクロ－ニングした（ＳＥＱＩＤＮＯ．１を参照）。ＭｒＦ３’５’Ｈ遺伝子は、細胞内の転写および翻訳過程を経て、対応するポリペプチドやタンパク質、すなわち、ＭｒＦ３’５’Ｈのアミノ酸配列を合成する（ＳＥＱＩＤＮＯ．２を参照）。アミノ酸配列分析の結果により、ＳＥＱＩＤＮＯ．２は、典型的なｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲＳ、ＣＲ、ＥＸＸＲとｈｅｍｅｂｉｎｄｉｎｇ保存構造ドメインを有することがわかった。

実施例３：ｐＹＥＳ２－ＭｒＦ３’５’Ｈ発現ベクタ－の構築
ｐＹＥＳ２ＮＴ／Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクタ－ポリクロ－ナル遺伝子座配列及びＭｒＦ３’５’Ｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）完全長遺伝子配列に基づいて、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ酵素切断部位を含むプライマ－配列：ＳＥＱＩＤＮＯ．５とＳＥＱＩＤＮＯ．６を設計し、当該プライマ－配列を開始コドン及び停止コドンを含むように設計され、増幅することでＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ酵素切断部位を含むＭｒＦ３’５’Ｈ配列を得た。ＰＣＲ反応系は、５０μＬであり、成分は、それぞれ１ μＬＰｈａｎｔａ高忠実度酵素（Ｖａｚｙｍｅ）、２５μＬ緩衝液（２×）、１ μＬｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、上下流プライマ－（１０ μＭ、ＨｕａＧｅｎｅ）各２ μＬ、１ μＬｃＤＮＡ、１８ μＬＨ_２Ｏであった。反応手順は、初期変性９５℃、２分間；変性９５℃、１５秒間；アニ－ル５８℃、１５秒間；伸長７２℃、１分間、３５サイクル；７２℃徹底伸長５分間、４℃保管であった。ｐＹＥＳ２ベクタ－に対してそれぞれＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）とＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）で二重酵素切断し、Ｅｘｎａｓｅ（登録商標）ＩＩリガ－ゼ（Ｖａｚｙｍｅ）を用いて目的遺伝子フラグメントをｐＹＥＳ２ベクタ－に連結した。連結反応系は、１０μＬであり、成分は、それぞれ１ μＬＥｘｎａｓｅ（登録商標）ＩＩリガ－ゼ（Ｖａｚｙｍｅ）、２μＬ緩衝液（５×）、１μＬＰＣＲ回収生成物、３μＬベクタ－、３μＬＨ_２Ｏであった。混合後、３７℃で０．５時間連結した後、氷上に５分間放置した。連結生成物をＤＨ５аコンピテント（Ｔａｋａｒａ）に形質転換し、Ａｍｐを含む培養プレ－ト上に３７℃で一晩培養し、陽性クロ－ン菌株を採取し、上海ＨｕａＧｅｎｅに送ってシ－クエンシングを行い、シ－クエンシング結果を分析すると、正確な目的遺伝子配列を含むベクタ－は、構築に成功したｐＹＥＳ２－ＭｒＦ３’５’Ｈ組み換えプラスミドとなった。

実施例４：醸造酵母異種発現ＭｒＦ３’５’Ｈ
1、構築に成功したｐＹＥＳ２－ＭｒＦ３’５’Ｈ組み換えプラスミド又はｐＹＥＳ２空ベクタ－を酵母形質転換キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を介して、ＬｉＡＣ法により醸造酵母株ＩＮＶＳｃＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。次に、ＳＤ／－Ｕｒａの培養プレ－トに塗布して３０℃で３日間培養し、シングルコロニ－を採取し、組み換えプラスミド又は空ベクタ－をＰＣＲで検出した。ＰＣＲバンドの正確なシングルコロニ－を選択すると、ｐＹＥＳ２－ＭｒＦ３’５’Ｈ組み換えプラスミドを含む醸造酵母ＩＮＶＳｃＩとなり、２５％グリセリンで－８０℃冷蔵庫に保管した。
2、ＭｒＦ３’５’Ｈ誘導発現
シングルコロニ－を採取して５ｍＬＳＤ／－Ｕｒａ＋２０ｇ／Ｌｇｌｕｃｏｓｅ栄養液にて３０℃、２５０ｒｐｍ振とう機上で１２時間培養した。室温で７００ｇ５分間遠心分離し、酵母菌体を採取し、ＳＤ／－Ｕｒａ＋２０ｇ／Ｌｇａｌａｃｔｏｓｅ栄養液を加えてＯＤ_６００が０．４になるまで再懸濁した。２ｍＬの菌体再懸濁後の栄養液を２つの新しい遠沈管に取り、それぞれ１ｍＭＮＡＤＰＨ（Ｓｉｇｍａ）と１００ μＭ反応基質をそれぞれ加え、１６℃、２５０ｒｐｍ振とう機上で１２時間培養した。以上の操作は、いずれも空ベクタ－酵母を対照とした。
3、フラボノイド検出
誘導完了後、１：１体積の酢酸エチル溶液を加えて反応を終了し、渦巻き混合し、１０００ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を新しい１０ｍＬ遠沈管に取り、１回繰り返し、上澄み液を混合し、有機相を真空回転蒸発乾固し、１５０ μＬのメチルアルコ－ルを加えて溶解した。液体クロマトグラム移動相：Ａ：水（０．１％ギ酸）Ｂ：アセトニトリル（０．１％ギ酸）、試料注入体積：１０μＬ、流速：０．３ｍＬ／分間、カラム温度：２５℃、検出波長３７０ｎｍ、溶離勾配：０－７分間９０％－５０％Ａ、７－１０分間５０％Ａ、１０－１５分間５０％－０％Ａ、１５－１５．１分間０－９０％Ａ、１５．１－２１分間９０％Ａ。

検出結果により、ＭｒＦ３’５’Ｈは、Ｐ４５０７５Ａファミリ－水酸化酵素の活性があり、Ｂ環モノヒドロキシナリンゲニンを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシエリオジクチオ－ル（ＥＩＣ２８７）を生成し、また、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシの５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環モノヒドロキシジヒドロケンペロ－ルを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシジヒドロクエルセチン（ＥＩＣ３０３）を生成し、また、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環モノヒドロキシケンペロ－ルを触媒して３’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環ジヒドロキシケルセチン（ＥＩＣ３０１）を生成し、また、３’遺伝子座と５’遺伝子座のヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのミリセチン（ＥＩＣ３１７）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環ジヒドロキシエリオジクチオ－ルを触媒して５’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシの５－ヒドロキシフラボン（ＥＩＣ３０３）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環ジヒドロキシジヒドロクエルセチンを触媒して５’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのジヒドロミリセチン（ＥＩＣ３１９）を生成することができる。ＭｒＦ３’５’Ｈタンパク質は、Ｂ環ジヒドロキシジヒドロクエルセチンを触媒して５’遺伝子座ヒドロキシル化反応を発生し、Ｂ環トリスヒドロキシのミリセチン（ＥＩＣ３１７）を生成することができることがわかった（図４及び図５を参照）。

実施例５：ＭｒＦ３’５’Ｈ系統樹の構築
系統樹の構築はＭＥＧＡ７．０（ＭｅｇａＳｏｆｔｗａｒｅ、米国）ソフトウェアによって行われる。まず、ＭＥＧＡ７．０内蔵の内蔵ＣｌｕｓｔａｌＷツ－ルを用いて、Ｆ３’５’Ｈのアミノ酸配列を照合した後、近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）により系統樹体系を構築し、系統樹の品質をブ－トストラップ法（ＢｏｏｔｓｔｒａｐＭｅｔｈｏｄ）で評価し、検定回数を１０００とした。

結果により、ＭｒＦ３’５’Ｈは、確実にＰ４５０７５Ａファミリ－タンパク質に属し、系統樹の上に、葡萄ＶｖＦ３’５’Ｈとの距離が最も近く、ヌクレオチド配列相同性が７８．２１％であり、アミノ酸配列相同性が８２．８７％であり、ＧｔＦ３’５’Ｈとの距離が最も遠く、ヌクレオチド配列相同性が６６．４１％であり、アミノ酸配列相同性が７１．７１％であることがわかった（図６）。

実施例６：醸造酵母異種発現ＶｖＦ３’５’Ｈ
葡萄ＶｖＦ３’５’Ｈは、「夏黒」の果皮から分離し、具体的な操作は実施例３と同様である。醸造酵母異種発現ＶｖＦ３’５’Ｈの操作は、実施例４と同様である。
結果により、ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈは、ナリンゲニン、エリオジクチオ－ル、ジヒドロケンペロ－ル、ジヒドロケルセチン、ケンペロ－ルとケルセチンに対する触媒特性と若干異なり、ケンペロ－ルに対する触媒活性に関してＭｒＦ３’５’Ｈは、ＶｖＦ３’５’Ｈより明らかに強いことが分かった（図７）。

実施例７：トランスジェニック煙草過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈによるミリセチンの累積促進
１、トランスジェニックベクタ－の構築
ＳＥＱＩＤＮＯ．７とＳＥＱＩＤＮＯ．８プライマ－の組合を用いて、Ｆ３’５’Ｈ（ＳＥＱＩＤＮＯ．１）の完全長配列を増幅し、ｐＧｒｅｅｎII ００２９６２－ＳＫ発現ベクタ－に搭載し、組み換え発現ベクタ－ＳＫ－Ｆ３’５’Ｈを構築した。当該ＰＣＲ反応系は、実施例３のＰＣＲ反応系と同様である。最終的に正確に構築された発現ベクタ－を電気ショック法によりアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１::ｐＳｏｕｐに転入し、３つの陽性クロ－ン菌株を選び、最終濃度２５％滅菌グリセリンで－８０℃に保管した。
２、トランスジェニック植株同定
遺伝子工学技術により煙草の普通植株を形質転換してトランスジェニック植株を獲得した後、さらに、ＰＣＲ手段で検証する必要がある。ＣＴＡＢ法により、煙草の葉身の総ＤＮＡを抽出し、プライマ－と結合してＳＥＱＩＤＮＯ．９とＳＥＱＩＤＮＯ．１０に対してＰＣＲ増幅を行い、トランスジェニック煙草植株を同定し、獲得した陽性植株に対して後続培養を行い、２世代のスクリ－ニングを経て、Ｔ１世代のトランスジェニック煙草植株を獲得した。
３、フラボノ－ル含有量の検出
煙草の花を十分に研磨し、０．１ｇの粉末を正確に秤量して１ｍＬ５０％メタノ－ル水溶液に加え、超音波３０分間、次に、１１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、７００μＬ上澄み液を新しい管に採取し、３００μＬの３ＮＨＣＬ溶液を加え、７０℃水浴１時間。次に、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、１００μＬ上澄み液をＨＰＬＣ分析のために使用された。検出過程は、実施例５におけるフラボノ－ル検出と同様である。

結果により、野生型煙草に比べて、トランスジェニック植株の葉中のミリセチン、ケルセチンとケンペロ－ルの含有量が著しく増加しており、トランスジェニック植株の花の色は、深くなり、ミリセチンとデルフィニジンが著しく誘導され、ＭｒＦ３’５’Ｈでコ－ドするタンパク質は、植物体内で生物学的機能を有し、ミリセチンとデルフィニジンの生合成に参与していることが証明された（図８）。茶由来のＣｓＦ３’５’Ｈを煙草に異種発現し、トランスジェニック植株系花中のデルフィニジン含有量が著しく増加しており、検出されたミリセチンの含有量が低すぎるので、定量できなかった（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０１４Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄ３′，５′－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｆｒｏｍｔｅａｐｌａｎｔ（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）：ｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｔｅｃｈｉｎｓ．ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌ．１４：３４７）。これは、ＭｒＦ３’５’Ｈのミリセチンの合成能力が高いことを示している。

本願出願人は、ミリセチン合成におけるＭｒＦ３’５’Ｈの独特な作用を初めて検証した。ＭｒＦ３’５’Ｈは、系統樹上でＣＹＰ７５Ａファミリ－にクラスタリングされ、ＶｖＦ３’５’Ｈとの距離が最も近く、ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈのヌクレオチド配列相同性は、７８．２１％であり、ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈのアミノ酸配列相同性は、８２．８７％であった（図３及び図６）。ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈのタンパク質機能とを比較するに、ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈのタンパク質機能は、類似であり、いずれもＢ環モノヒドロキシフラボノイド及び／又はＢ環ジヒドロキシフラボノイドを触媒してＢ環トリスヒドロキシフラボノイドを合成することができ（図７）、同一ファミリ－にクラスタリングされたヒドロキシラ－ゼタンパク質機能が類似していることを説明した。しかし、ＭｒＦ３’５’ＨとＶｖＦ３’５’Ｈの基質触特性は異なり、ケンペロ－ルに対する触媒活性に関してＭｒＦ３’５’Ｈは、ＶｖＦ３’５’Ｈより明らかに強い（図７）。遺伝子工学技術を用いて獲得した過剰発現ＭｒＦ３’５’Ｈのトランスジェニック煙草植株は、野生型に比べて、トランスジェニック植株の葉の中のミリセチン、ケルセチン及びケンペロ－ルの含有量が著しく増加しており、トランスジェニック植株の花の中のミリセチンとデルフィニジンの含有量が著しく増加したが、ケルセチンとケンペロ－ルの含有量が顕著な変化がなかった。本発明は、ミリセチンの分流メカニズムの研究に対して指導的な意義があり、工学微生物菌又は遺伝子工学技術に基づく植物ミリセチン成分の改良開発のために基礎を築き上げた。

以上、本発明の具体的な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、この技術分野の当業者であれば、請求項の範囲で上記の説明に基づいて改良又は変更が可能であり、これは、本発明の実質的な内容に影響を与えないことが理解できるであろう。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ．１である
ことを特徴とする水酸化酵素遺伝子。
ＳＥＱＩＤＮＯ．２で表され、かつ
ｐｒｏｌｉｎｅ－ｒｉｃｈ、ＳＲＳ、ＣＲ、ＥＸＸＲとｈｅｍｅｂｉｎｄｉｎｇ保存構造ドメインを有する
ことを特徴とする水酸化酵素遺伝子にコードされるタンパク質。
ＳＥＱＩＤＮＯ．１で表される水酸化酵素遺伝子を有する遺伝子発現ベクター、を酵母宿主菌に形質導入するステップと、
原料ナリンゲニン及び／又はエリオジクチオ－ルを酵母宿主菌に提供するステップと、を含む
ことを特徴とするミリセチンの作製方法。
ｐＹＥＳ２ベクターに請求項１に記載の遺伝子が連結される
ことを特徴とするミリセチンを合成するための遺伝子発現ベクター。
請求項４に記載の遺伝子発現ベクターを含む酵母菌である
ことを特徴とする工学微生物菌。
請求項５に記載の酵母菌を利用し、基質を反応させる
ことを特徴とするミリセチンの合成方法。
前記基質は、ナリンゲニン及び／又はエリオジクチオ－ルである
ことを特徴とする請求項６に記載のミリセチンの合成方法。