JP2003527842A - 組換えピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ、組換えディリジェントタンパク質および使用方法 - Google Patents

組換えピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ、組換えディリジェントタンパク質および使用方法

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JP2003527842A
JP2003527842A JP2001550362A JP2001550362A JP2003527842A JP 2003527842 A JP2003527842 A JP 2003527842A JP 2001550362 A JP2001550362 A JP 2001550362A JP 2001550362 A JP2001550362 A JP 2001550362A JP 2003527842 A JP2003527842 A JP 2003527842A
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ノルマン ジー． レウィス，
ローレンス ベー． ダバン，
アルベナ ティー． ディンコバ−コストバ，
政之 藤田
デイビッド アール． ギャング，
ジョシュア ディー． フォード，
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ワシントン ステイト ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション
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Abstract

(57)【要約】 ディリジェントタンパク質およびピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼを、ディリジェントタンパク質およびピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードするｃＤＮＡと合わせて単離した。したがって、ディリジェントタンパク質およびピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼの発現をコードする単離されたＤＮＡ配列が提供される。他の局面において、ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードするか、あるいはディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部に十分相補的であり、それとともにハイブリダイゼーションが可能である塩基配列をコードする、複製可能な組み換えクローニングビヒクルが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｍｅｄｉａ、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅ
ｒｏｐｈｙｌｌａおよびＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ由来の単離されたディリジ
ェント（ｄｉｒｉｇｅｎｔ）タンパク質およびピノレジノール（ｐｉｎｏｒｅｓ
ｉｎｏｌ）／ラリシレジノール（ｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）レダクターゼ、
Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙ
ｌｌａ、およびＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ由来のディリジェントタンパク質お
よびピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードする核酸配列、な
らびにこれらの配列を含むベクター、これらの配列を含む宿主細胞、ならびに組
換えピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ、組換えディリジェントタ
ンパク質およびこれらの変異体を生成するための方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） リグナンは、大きな、構造的に様々の、広範な生理学的機能および薬理学的に
重要な特性を有する維管束植物代謝産物のクラスである（Ａｙｒｅｓ，Ｄ．Ｃ．
，およびＬｏｉｋｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｌｉｇｎａｎｓ．Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒ
ｔｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）；Ｌｅｗｉｓら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ａｍａｚｏｎ，Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎａｔｕｒａｌ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｉｓｓｕｅｓ，５８
８，（Ｐ．Ｒ．Ｓｅｉｄｌ，Ｏ．Ｒ．ＧｏｔｔｌｉｅｂおよびＭ．Ａ．Ｃ．Ｋａ
ｐｌａｎ）１３５−１６７，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｗａ
ｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９９５））。これらの顕著な抗生物質特性（Ｍ
ａｒｋｋａｎｅｎ，Ｔ．ら、Ｄｒｕｇｓ Ｅｘｐｔｌ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．７：
７１１−７１８（１９８１））、抗酸化剤特性（Ｆａｕｒｅ，Ｍ．ら、Ｐｈｙｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：３７７３−３７７５（１９９０）；Ｏｓａｗａ，
Ｔ．ら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４９：３３５１−３３５２（１９８
５））および拒食剤特性（Ｈａｒｍａｔｈａ，Ｊ．，およびＮａｗｒｏｔ，Ｊ．
，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｙｓｔ．Ｅｃｏｌ．１２：９５−９８（１９８４））に起
因して、維管束植物におけるリグナンの主要な役割は、種々の日和見生物学的病
原体および肉食動物に対する抵抗性を与える補助をすることである。リグナンは
また、サイトカインとして（Ｂｉｎｎｓ，Ａ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：９８０−９８４（１９８７））、および木化に
おける中間体として（Ｒａｈｍａｎ，Ｍ．Ｍ．Ａ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２９：１８６１−１８６６（１９９０））提唱されており、このことは
、植物の成長および発達における、重要な役割を示唆する。フェニルアラニン（
チロシン）からのリグニン／リグナンおよび関連する物質への生化学的経路の仕
上げが、これらの維管束の乾燥地の対応物への水生植物の首尾よい移行のために
必須であったことは、広く支持されており（Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，およびＤａ
ｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎａｔｕｒ
ａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，５
６２（Ｗ．Ｄ．Ｎｅｓ編）２０２−２４６，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅ
ｒｉｅｓ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４））、いくつかは、４億８千
万年前である（Ｇｒａｈａｍ，Ｌ．Ｅ．，Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｌａｎｄ Ｐｌ
ａｎｔｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，ＮＹ（１９９３））。
【０００３】 既存の化学走性データに基づいて、リグナンは、「始原」植物（例えば、シダ
Ｂｌｅｃｈｎｕｍ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）（Ｗａｄａ，Ｈ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈ
ａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４０：２０９９−２１０１（１９９２））およびマツモ（例
えば、Ｄｅｎｄｒｏｃｅｒｏｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓおよびＭｅｇａｃｅｒｏｓ
ｆｌａｇｅｌｌａｒｉｓ）（Ｔａｋｅｄａ，Ｒ．ら、Ｂｒｙｏｐｈｙｔｅｓ．
Ｔｈｅｉｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍ
ｙ，第２９巻（Ｚｉｎｓｍｅｉｓｔｅｒ，Ｈ．Ｄ．およびＭｕｅｓ，Ｒ．編）２
０１−２０７頁，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９０）；Ｔａｋｅｄａ，Ｒ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．３１：４１５９−４１６２（１９９０））に存在し、後者は、近年
、シリル期に発生したと分類されている（Ｇｒａｈａｍ，Ｌ．Ｅ．，Ｊ．Ｐｌａ
ｎｔ Ｒｅｓ．１０９：２４１−２５２（１９９６））。興味深いことに、裸子
植物と被子植物との両方の進化が、リグナンの構造的複雑さおよび酸化的改変の
主要な変化に適合された（Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，およびＤａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．
，Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，５６２（Ｗ．Ｄ．Ｎ
ｅｓ編）２０２−２４６，ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ：Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９９４）；Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｏ．Ｒ．，およびＹｏ
ｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｗｏｏｄｙ Ｐ
ｌａｎｔｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｌｉ
ｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ（Ｒｏｗｅ，Ｊ．Ｗ．および
Ｋｉｒｋ，Ｃ．Ｈ．編）４３９−５１１頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：
Ｂｅｒｌｉｎ（１９８９））。実際に、いくつかの種（例えば、ベイスギ（Ｔｈ
ｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ））においては、リグナンは、得られる心材の色、品質
、香気および耐久性を増強することによって、心材の形成／発生に広範に寄与し
得る。
【０００４】 植物におけるそれらの機能に加えて、リグナンはまた、重要な薬理学的役割を
有する。例えば、ポドフィロトキシンは、そのエトポシドおよびテニポシドの誘
導体として、抗癌剤として首尾よく使用されてきた植物化合物の一例である。（
Ａｙｒｅｓ，Ｄ．Ｃ．，およびＬｏｉｋｅ，Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎ
ｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｌ
ｉｇｎａｎｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０））。抗ウイルス
特性もまた、選択されたリグナンに対して報告された。例えば、（−）−アルク
チゲニン（ａｒｃｔｉｇｅｎｉｎ）（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｚ Ｎ
ａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４５ｃ，１２１５−１２２１（１９９０））、（−）−
トラケロゲニン（ｔｒａｃｈｅｌｏｇｅｎｉｎ）（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｈ．Ｃ
．ら、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４５ｃ，１２１５−１２２１（１９９０）
）およびノルジヒドログアイアレチン酸（Ｇｎａｂｒｅ，Ｊ．Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１１２３９−１１２４３（１９
９５））は、それらの顕著な逆転写酵素阻害活性に起因して、それぞれＨＩＶに
対して効果的である。いくつかのリグナン（例えば、マタイレジノール）（Ｎｉ
ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９：３５８６−３５
９２（１９８１））は、ｃＡＭＰ−ホスホジエステラーゼを阻害し、一方で他の
もの（例えば、シリンガレジノール（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）（β−Ｄ
−グルコシド））は、心臓血管活性を増強する（Ｎｉｓｈｉｂｅ，Ｓ．ら、Ｃｈ
ｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８：１７６３−１７６５（１９９０））。治療
食における「哺乳動物」リグナンまたは「フィトエストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓ
ｔｒｏｇｅｎ）」、エンテロラクトン（ｅｎｔｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）およびエ
ンテロジオール（ｅｎｔｅｒｏｄｉｏｌ）（高繊維治療食の消化に続いて形成さ
れる）の存在と、乳癌および前立腺癌の減少した罹患率との間にはまた、高い相
関が存在する（いわゆる化学的予防）。（Ａｘｅｌｓｏｎ，Ｍ．，およびＳｅｔ
ｃｈｅｌｌ，Ｋ．Ｄ．Ｒ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１２３：３３７−３４２（１
９８１）；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．４１：３−８（１９９２）；Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚら
、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．５２：９７−
１０３（１９９５））。「哺乳動物リグナン」は、次に、マタイレジノールおよ
びセコイソラリシレジノールのようなリグナンから誘導されると考えられる（Ｂ
ｏｒｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，５８：３７−
４３（１９８５））。
【０００５】 リグナンへの生合成経路は、つい最近規定されたが、リグナン生合成経路に関
与する酵素または遺伝子の単離に関する先行技術の報告は、存在しない。Ｆｏｒ
ｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａからの粗製酵素抽出物を用いる放射線標識
実験に基づいて、８，８’−結合リグナンに入ることが最初に樹立され、これは
、公知の現在最も流行しているジリグノール結合（ｄｉｌｉｇｎｏｌ ｌｉｎｋ
ａｇｅ）の代表であり（Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．，およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，
Ｒｅｃ．Ａｄｖ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２６巻（Ｓｔａｆｆｏｒｄ
，Ｈ．Ａ．，およびＩｂｒａｈｉｍ，Ｒ．Ｋ．編），３２５−３７５頁，Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２））、酸素化されたフ
リーラジカルの形態で、２つのアキラルなコニフェリルアルコール分子の立体選
択的カップリングを介して起こり、フロフランリグナン（＋）−ピノレジノール
に影響を与える（Ｄａｖｉｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｂｅｄｇａｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｋａｔａｙ
ａｍａ，Ｔ．，およびＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｇ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３１：３８６９−３８７４（１９９２）；Ｐａｒｅ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３５：４７３１−４７３４（１９９４））（図１）。
【０００６】 二分子フェノキシラジカルカップリング反応（例えば、フロフランリグナン（
＋）−ピノレジノールを得るための、２つのアキラルなコニフェリルアルコール
分子の立体選択的カップリング）が、多数の生物学的プロセスに関与する。これ
らは、維管束植物におけるリグニン形成（Ｍ．Ｎｏｓｅら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３９：７１（１９９５））、維管束植物におけるリグナン形成（Ｎ
．Ｇ．ＬｅｗｉｓおよびＬ．Ｂ．Ｄａｖｉｎ，ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．５６
２：２０２（１９９４）；Ｐ．Ｗ．Ｐａｒｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．３５：４７３１（１９９４））、維管束植物におけるスベリン形成（Ｍ．
Ａ．Ｂｅｒｎａｒｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７３８２（１９９
５））、真菌における子実体発生（Ｊ．Ｄ．Ｂｕ’Ｌｏｃｋら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．２０８５（１９６２））、昆虫小皮のメラニン化および皮体化（Ｍ．Ｍ
ｉｅｓｓｎｅｒら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７４：１２０５（１９９１
）；Ｖ．Ｊ．Ｍａｒｍａｒａｓら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．３１：１１９（１９９６））、アブラムシ顔料の形成（Ｄ．Ｗ
．ＣａｍｅｒｏｎおよびＬｏｒｄ Ｔｏｄｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｕｂｓｔａｎ
ｃｅｓ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｒｉｇｉｎ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｃｏｕｐ
ｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｈｅｎｏｌｓ，Ｗ．Ｉ．ＴａｙｌｏｒおよびＡ．Ｒ．Ｂａｔ
ｔｅｒｓｂｙ編（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６７），第１巻，２０
３頁）、ならびに藻類の細胞壁ポリマーの形成（Ｍ．Ａ．Ｒａｇａｎ，Ｐｈｙｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：２０２９（１９８４））を誘導すると推定される
。
【０００７】 インビボにおいて、上記リグニンおよびリグナン物質の生合成において観察さ
れる、顕著な位置化学的特異性および／または立体化学的特異性とは対照的に、
以前に記載された全てのインビトロでの化学的（Ｊ．Ｉｑｂａｌら、Ｃｈｅｍ．
Ｒｅｖ．９４：５１９（１９９４））および酵素的（Ｋ．Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒ
ｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １４８：５９５（１９６５））二分子フェノキシラジカル
カップリング反応は、位置特異的および立体特異的な厳密な制御を欠く。すなわ
ち、インビトロでのカップリングの間にキラル中心が導入される場合には、この
生成物はラセミ体であり、そして１つより多い潜在的なカップリング部位が存在
する場合には、異なる位置異性化学が生じ得る。従って、特定のエナンチオマー
形態または特定のカップリング生成物をインビトロで生じる能力は、明白な制御
下にない。その結果、例えば、リグナンの形成を導く二分子フェノキシラジカル
カップリング反応の位置化学および立体化学を制御する機構が、インビボには存
在することが推論される。
【０００８】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、および恐らく他の種において、
（＋）−ピノレジノール（２つのＥ−コニフェリルアルコール分子の立体特異的
カップリングの生成物）は、連続的還元を起こして、（＋）−ラリシレジノール
を生じ、次いで、（−）−セコイソラリシレジノールを生じる（Ｋａｔａｙａｍ
ａ，Ｔ．ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５８１−５９１（１９９３
）；Ｃｈｕ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７０２６−２７０３
３（１９９３））（図１）。この連続的な工程を触媒するために１つより多いレ
ダクターゼが必要とされるか否かは現在明らかではないが、この還元は、ＮＡＤ
ＰＨのｐｒｏ−Ｒヒドリドの引抜を介して進行し、生成物のＣ７位とＣ７’位と
の両方において、立体配置の「反転」が生じる（（＋）−ラリシレジノールおよ
び（−）−セコイソラリシレジノール）（Ｃｈｕ，Ａ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６８：２７０２６−２７０３３（１９９３））。（−）−マタイレジ
ノールが、引き続いて、（−）−セコイソラリシレジノールの脱水を介して形成
され、これのさらなる代謝は恐らく、Ｉｐｏｍａｏｅａ ｃａｉｒｉｃａにおけ
る抗ウイルス性（−）−トラケロゲニンおよびＰｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｐｅｌ
ｔａｔｕｍにおける（−）−ポドフィロトキシンのようなリグナンを与える。
【０００９】 従って、（＋）−ピノレジノールの立体特異的形成、ならびに（＋）−ラリシ
レジノールおよび（−）−セコイソラリシレジノールを与える引き続く還元工程
は、リグナン代謝の旋回点である。なぜなら、これらは、フラノ、ビベンジルブ
タン、ジベンジルブチロラクトンおよびアリールテトラヒドロナフタレンのリグ
ナンサブクラスへの入口を代表するからである。さらに、リグナンは通常は光学
的に活性であるが、存在する特定のエナンチオマーは植物種間で異なり得ること
もまた、注目されるべきである。例えば、（−）−ピノレジノールは、Ｘａｎｔ
ｈｏｘｙｌｕｍ ａｉｌａｎｔｈｏｉｄｅｓにおいて生じ（Ｉｓｈｉｉら、Ｙａ
ｋｕｇａｋｕ Ｚａｓｓｈｉ，１０３：２７９−２９２（１９８３））、そして
（−）−ラリシレジノールは、Ｄａｐｈｎｅ ｔａｎｇｕｔｉｃａ（Ｌｉｎ−Ｇ
ｅｎ，ら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ，４５：１７２−１７６（１９８２））
に存在する。特定のリグナンの光学活性は、生物学的活性に関して重要な分枝を
有し得る。例えば、（−）−ｔｒａｃｈｅｌｏｇｅｎｉｎは、ＨＩＶ−１のイン
ビトロ複製を阻害し、一方でその（＋）エナンチオマーは、効果がずっと低い（
Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４５ｃ：１２１５−１２２１（
１９９０））。
【００１０】 （発明の要旨） 上記に従って、本発明の１つの局面において、７８ｋＤのディリジェントタン
パク質が、８，８’結合リグナン形成への立体特異性の付与に関与することが発
見された。このタンパク質は、検出可能な触媒的に活性な酸化的中心を有さず、
そして明らかに、コニフェリルアルコール由来のフリーラジカルを結合および配
向するのみのために作用し、これは次いで、立体選択的カップリングを起こして
（＋）−ピノレジノールを形成する。このフリーラジカルの形成は、第一の例に
おいては、非特異的オキシダーゼまたは非酵素的な電子酸化剤でさえのいずれか
の酸化能力を必要とする。本発明の別の局面において、単一の酵素（ピノレジノ
ール／ラリシレジノールレダクターゼと称する）が、ピノレジノールからラリシ
レジノールへ、次いでセコイソラリシレジノールへの転換を触媒することが発見
された。従って、本発明の１つの局面は、単離されたディリジェントタンパク質
および単離されたピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ（例えば、Ｆ
ｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａおよび
Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ由来のもの）に関する。
【００１１】 本発明の別の局面において、いくつかの植物種由来のディリジェントタンパク
質をコードするｃＤＮＡが単離され、そして配列決定され、そして対応するアミ
ノ酸配列が推定された。また、いくつかの植物種由来のピノレジノール／ラリシ
レジノールレダクターゼをコードするｃＤＮＡが、単離および配列決定され、そ
して対応するアミノ酸配列が推定された。
【００１２】 従って、本発明は、単離されたタンパク質およびディリジェントタンパク質ま
たはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼの発現をコードする、単離
されたＤＮＡ 配列に関する。他の局面において、本発明は、ピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質をコードする核
酸配列を含む、複製可能なベクターに関する。本発明はまた、ピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼ ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも一部、また
はディリジェントタンパク質ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも一部に十分に相
補的であり、これらとのハイブリダイゼーションが可能である、塩基配列に関す
る。上記相補的な塩基配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：アンチセンス ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ ＲＮＡ；
アンチセンス ディリジェントタンパク質ＲＮＡ；ピノレジノール／ラリシレジ
ノールレダクターゼ ＤＮＡ、またはディリジェントタンパク質ＤＮＡに相補的
であり、従ってポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして、またはピノレジノー
ル／ラリシレジノールレダクターゼ遺伝子、ディリジェントタンパク質遺伝子、
または関連する遺伝子に対するプローブとして有用な、ＤＮＡのフラグメント。
【００１３】 本発明のなお他の局面において、本発明の複製可能なベクターおよび／または
ＤＮＡ配列で形質転換、トランスフェクト、感染および／または注射された、改
変された宿主細胞が提供される。従って、本発明は、植物、動物、微生物および
細胞培養物において、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼおよびデ
ィリジェントタンパク質の組換え発現を提供する。本明細書中に記載される新規
な概念を使用して、植物、動物、微生物または細胞培養物における、有意な量の
組換えピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼまたはディリジェントタ
ンパク質、あるいはこれらの酵素産物の生成、単離および精製を容易にし得る。
【００１４】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本明細書中において使用される場合に、用語「アミノ酸（単数）」および「ア
ミノ酸（複数）」とは、天然に存在する全てのＬ−α−アミノ酸またはこれらの
残基をいう。アミノ酸は、１文字表記または３文字表記のいずれかによって、同
定される： Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸 Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン Ｔｈｒ Ｔ スレオニン Ｌｅｕ Ｌ ロイシン Ｓｅｒ Ｓ セリン Ｔｙｒ Ｙ チロシン Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸 Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン Ｐｒｏ Ｐ プロリン Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン Ｇｌｙ Ｇ グリシン Ｌｙｓ Ｋ リジン Ａｌａ Ａ アラニン Ａｒｇ Ｒ アルギニン Ｃｙｓ Ｃ システイン Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン Ｖａｌ Ｖ バリン Ｇｌｎ Ｑ グルタミン Ｍｅｔ Ｍ メチオニン Ａｓｎ Ｎ アスパラギン。
【００１５】 本明細書中において使用される場合に、用語「ヌクレオチド」とは、糖部分（
ペントース）、リン酸および窒素性複素環式塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡの
モノマー単位を意味する。この塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１’炭素
）を介して糖部分に結合し、そして塩基と糖のこの組み合わせは、ヌクレオシド
と呼ばれる。この塩基は、アデニン（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン
（「Ｃ」）およびチミジン（「Ｔ」）である、ＤＮＡの４つの塩基で、ヌクレオ
チドを特徴付ける。イノシン（「Ｉ」）は、これら４つの天然に存在する塩基（
Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）のいずれかを置換するために使用され得る、合成塩基であ
る。４つのＲＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。本明細
書中に記載されるヌクレオチド配列は、隣接するペントースの３’炭素と５’炭
素との間のホスホジエステル結合によって連結する、ヌクレオチドの線状アレイ
を含む。
【００１６】 用語「同一性の百分率（パーセント）」（％Ｉ）とは、２つのアミノ酸配列ま
たは２つの核酸配列が並列に整列される場合に、同じ相対位置を占めるアミノ酸
またはヌクレオチドの百分率を意味する。
【００１７】 用語「類似性の百分率（パーセント）」（％Ｓ）とは、２つの比較されるタン
パク質配列の関連性の程度の統計学的な測定値である。類似性の百分率は、化学
的類似性（例えば、比較されるアミノ酸が酸性であるか、塩基性であるか、疎水
性であるか、芳香族であるか、など）および／または比較されるアミノ酸の対の
一方のメンバーをコードするコドンをその対の他方のメンバーをコードするコド
ンに転換するために必要とされる塩基対変化の最少数によって測定される、進化
学的距離に基づいて、アミノ酸の各比較される対に数値を割り当てるコンピュー
タプログラムによって、算出される。算出は、全ての可能な整列の繰り返しの比
較によって実験的に２つの配列のベストフィット整列が作成された後に、行われ
る。（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．およびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９
９２））。
【００１８】 「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して連結したデオキ
シリボヌクレオチドの、短い一本鎖または二本鎖の配列をいう。オリゴヌクレオ
チドは、公知の方法によって化学的に合成され、そして例えば、ポリアクリルア
ミドゲルにおいて精製される。
【００１９】 用語「ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ」は、本明細書中にお
いて、以下の２つの還元反応を触媒し得る酵素を意味するために使用される：ピ
ノレジノールのラリシレジノールへの還元、およびラリシレジノールのセコイソ
ラリシレジノールへの還元、これらの反応の生成物である、ラリシレジノールお
よびセコイソラリシレジノールは、（＋）または（−）のエナンチオマーのいず
れかであり得る。
【００２０】 用語「ディリジェントタンパク質」は、本明細書中において、二分子フェノキ
シラジカルカップリング反応をガイドし、これによってこの反応の生成物および
／またはそのポリマー誘導体の立体化学および位置化学を決定し得る、タンパク
質を意味するために使用される。
【００２１】 用語「ストリンジェントな洗浄条件」とは、サザンブロットのような核酸ブロ
ットを洗浄するために使用される条件をいう。以下は、配列番号１２、１４、１
６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８およ
び１０５からなる群より選択される核酸分子、あるいは配列番号１２、１４、１
６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８およ
び１０５からなる群より選択される核酸分子のアンチセンス相補体にハイブリダ
イズし得る、本発明の核酸分子を、（例えば、サザンブロッティングによって）
同定するために有用な、代表的なハイブリダイゼーション条件およびストリンジ
ェントな洗浄条件である：６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％
ＳＤＳ中において５５〜５８℃で１２時間のハイブリダイゼーション、続いて２
×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳにおいて５５〜５８℃で３０分間の洗浄。任意のさ
らなる洗浄が、１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳにおいて５５−５８℃で３０分間
実施され得、続いて、さらなる任意の洗浄が、０．５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤ
Ｓにおいて５５〜５８℃で３０分間実施され得る。
【００２２】 以下は、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６５、
６７、６９、７１、１０７および１１７からなる群より選択される核酸分子、あ
るいは配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６５、６７
、６９、７１、１０７および１１７からなる群より選択される核酸分子のアンチ
センス相補体にハイブリダイズし得る、本発明の核酸分子を、（例えば、サザン
ブロッティングによって）同定するために有用な、代表的なハイブリダイゼーシ
ョン条件およびストリンジェントな洗浄条件である：６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ、０．５％ ＳＤＳにおける、５７〜５８℃で１２時間のハイブリ
ダイゼーション、続いて４×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳにおける室温（代表的に
は２０℃〜３０℃）で５分間の１回の洗浄、続いて２×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤ
Ｓにおける５７〜５８℃で２０分間の１回の洗浄。任意のさらなる洗浄が、１×
ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳにおいて５７〜５８℃で３０分間行われ得、続いてさ
らなる任意の洗浄が、０．５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳにおいて５７〜５８℃
で３０分間行われ得る。
【００２３】 用語「改変」、「アミノ酸配列改変」、「改変体」および「アミノ配列改変体
」とは、対応するネイティブのディリジェントタンパク質またはピノレジノール
／ラリシレジノールレダクターゼと比較してアミノ酸配列がいくらか異なる、デ
ィリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ
分子をいう。通常は、改変体は、対応するネイティブのディリジェントタンパク
質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼと少なくとも約７０％
の相同性を有し、そして好ましくは、これらは対応するネイティブのディリジェ
ントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼと少なく
とも約８０％相同である。本発明の範囲内であるディリジェントタンパク質また
はピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼのアミノ酸配列改変体は、特
定の位置において、置換、欠失、および／または挿入を有する。ディリジェント
タンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼの配列改変体
を使用して、所望の増強または減少された酵素活性、改変された位置化学または
立体化学、あるいは変更された基質利用または産物分布を与え得る。
【００２４】 置換によるディリジェントタンパク質改変体またはピノレジノール／ラリシレ
ジノールレダクターゼ改変体は、対応するネイティブのディリジェントタンパク
質配列またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ配列において少な
くとも１つのアミノ酸残基が除去されており、そして同じ位置に、そのアミノ酸
残基の代わりに異なるアミノ酸が挿入されているものである。置換は、その分子
中の１つのみのアミノ酸が置換されている単一であっても、同じ分子中で２つ以
上のアミノ酸が置換された複数であってもよい。ディリジェントタンパク質また
はピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ分子の活性の実質的な変化は
、ネイティブのアミノ酸とは電荷および／または構造が有意に異なる側鎖とアミ
ノ酸とを置換することによって、得られ得る。この型の置換は、置換の領域にお
けるその分子のペプチド骨格の構造および／または電荷もしくは疎水性に影響を
与えると予測される。
【００２５】 ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクタ
ーゼ分子の活性の中程度の変化は、ネイティブな分子の側鎖と電荷および／また
は構造が類似している側鎖とアミノ酸とを置換することによって、予測される。
この型の置換は、保存的置換と呼ばれ、置換の領域において、その分子のポリペ
プチド骨格の構造も、電荷も疎水性もいずれも、さほど変化させないと予測され
る。
【００２６】 挿入によるディリジェントタンパク質改変体またはピノレジノール／ラリシレ
ジノールレダクターゼ改変体は、１つ以上のアミノ酸が、ネイティブのディリジ
ェントタンパク質分子またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクター分子
の特定の位置において、アミノ酸にすぐ隣接して挿入されるものである。アミノ
酸にすぐ隣接するとは、そのアミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ
官能基のいずれかに結合されることを意味する。挿入は、１つ以上のアミノ酸で
あり得る。通常は、挿入は、１つまたは２つの保存的アミノ酸からなる。挿入部
位に隣接するアミノ酸と電荷および／または構造が類似のアミノ酸は、保存的で
あると定義される。あるいは、本発明は、挿入部位に隣接するアミノ酸とは実質
的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の挿入を含む。
【００２７】 欠失による改変体は、ネイティブなディリジェントタンパク質またはピノレジ
ノール／ラリシレジノールレダクターゼ分子における１つ以上のアミノ酸が除去
されたものである。通常、欠失改変体は、ディリジェントタンパク質またはピノ
レジノール／ラリシレジノールレダクターゼ分子の特定の領域において、１つま
たは２つのアミノ酸が欠失している。
【００２８】 用語「アンチセンス」または「アンチセンスＲＮＡ」または「アンチセンス核
酸」は、本明細書中において、メッセンジャーＲＮＡ分子の全てまたは一部に相
補的な核酸分子を意味するために使用される。アンチセンス核酸分子は、代表的
に、インビボで、相補的な発現されるメッセンジャーＲＮＡ分子の発現を阻害す
るために使用される。
【００２９】 用語「生物学的活性」、「生物学的に活性な」、「活性」および「活性な」と
は、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ分子に関して使用される場
合には、以下の実施例８に記載されるアッセイのような酵素活性アッセイにおい
て測定される場合に、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ分子が、
ピノレジノールおよびラリシレジノールを還元して、それぞれラリシレジノール
およびセコイソラリシレジノールを与える能力をいう。
【００３０】 用語「生物学的活性」、「生物学的に活性な」、「活性」および「活性な」と
は、ディリジェントタンパク質に関して使用される場合には、ディリジェントタ
ンパク質が二分子フェノキシラジカルカップリング反応をガイドし、これによっ
てこの反応の生成物およびポリマー誘導体の立体化学および位置化学を決定する
能力をいう。
【００３１】 ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクタ
ーゼのアミノ酸配列改変体は、例えば変更された反応速度論、基質の利用、生成
物の分布または他の特徴（例えば、位置化学および立体化学）が挙げられる、所
望の変更された生物学的活性を有し得る。
【００３２】 用語「〜をコードするＤＮＡ配列」、「〜をコードするＤＮＡ」および「〜を
コードする核酸」とは、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチ
ドの順序または配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、翻訳
されるポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。ＤＮＡ配列は、この
ようにアミノ酸配列をコードする。
【００３３】 用語「複製可能なベクター」は、通常は二本鎖の、その中に外来ＤＮＡ断片を
挿入され得るＤＮＡの断片をいう。外来ＤＮＡは、異種ＤＮＡと定義され、これ
は、宿主に天然には見出されないＤＮＡである。ベクターは、外来または異種Ｄ
ＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞内に入ると、
このベクターは、宿主の染色体ＤＮＡから独立してか、または同時に複製し得、
そしてベクターおよびその挿入（外来）ＤＮＡの数コピーが生成され得る。用語
「複製可能なベクター」は、外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳することを可能に
する必須エレメントを含む複製可能な発現ベクターを含む。したがって、外来Ｄ
ＮＡによりコードされるポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。複
製可能なベクターはまた、宿主において通常見出されるインサートＤＮＡを含む
。
【００３４】 用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」、「形質転換」は、細
胞へのＤＮＡの導入をいう。この細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ、これは原核生
物細胞または真核生物細胞であり得る。代表的な原核生物宿主細胞として、Ｅ．
ｃｏｌｉの種々の株が挙げられる。代表的な真核生物宿主細胞は、植物細胞（例
えば、トウモロコシ細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞である。導入
されたＤＮＡは、通常、挿入されたＤＮＡ断片を含むベクターの形態で存在する
。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同種由来であり得るし、宿主細胞と異な
る種由来でもあり得、あるいは、いくつかの外来ＤＮＡといくつかの宿主種由来
のＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であり得る。
【００３５】 本発明に基き、数種の植物種（例えば、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａおよびＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌ
ｌａ）由来のディリジェントタンパク質およびピノレジノール／ラリシレジノー
ルレダクターゼをコードするｃＤＮＡが、以下の様式で単離され、配列決定され
、そして発現された。
【００３６】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のディリジェントタンパク質
をコードするｃＤＮＡに関して、経験的に決定された精製プロトコルを発展させ
て、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ディリジェントタンパク質を単離した。この手順は、
ディリジェントタンパク質の少なくとも６つのアイソフォームをもたらした。こ
れらのアイソフォームのそれぞれのアミノ末端のアミノ酸配列決定は、それぞれ
のアイソフォームの配列が同一であることを明らかにした。これらのアイソフォ
ームの混合物のＮ末端配列決定は、２８アミノ酸配列（配列番号１）をもたらし
た。これらのアイソフォーム混合物のトリプシン消化は、６つのペプチドフラグ
メントをもたらし、これらは十分な量で精製されて配列番号２〜７の配列決定を
可能にした。
【００３７】 ＰＳＩＮＴ１（配列番号８）と名付けられたプライマーを、Ｎ末端ペプチド（
配列番号１）のアミノ酸９〜１５の配列に基き合成した。ＰＳＩ１Ｒ（配列番号
９）と名付けられたプライマーを、（配列番号２）で示される内在ペプチド配列
のアミノ酸３〜９の配列に基き、合成した。ＰＳＩ２Ｒ（配列番号１０）と名付
けられたプライマーを、（配列番号２）で示される内在ペプチド配列のアミノ酸
１３〜２０の配列に基き、合成した。ＰＳＩ７Ｒ（配列番号１１）と名付けられ
たプライマーを、（配列番号３）で示される内在ペプチド配列のアミノ酸６〜１
２の配列に基き、合成した。
【００３８】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａの総ＲＮＡを、高濃度のポリフェノールを含有する木質組
織のために特別に設計された方法を順応させたプロトコルにより単離した。ポリ
Ａ＋ ＲＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡライブラリーを標準的な手段を用いて構
築した。プライマー（ＰＳＩＮＴ１（配列番号８）およびＰＳＩ７Ｒ（配列番号
１１）、ＰＳＩ２Ｒ（配列番号１０）、またはＰＳＩ１Ｒ（配列番号９）の中の
１つ）、および基質としてＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡのアリコートを用いた
ＰＣＲ反応は、それぞれ〜３７０ｂｐ、〜１５５ｂｐ、および〜１２５ｂｐの単
一のｃＤＮＡバンドをもたらした。ＰＳＩＮＴ１（配列番号８）〜ＰＳＩ７Ｒ（
配列番号１１）の反応の〜３７０ｂｐ産物を、ＰＣＲにより増幅し、そしてプロ
ーブとして用いておよそ６００，０００ＰＦＵのＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。２つの異なるｃＤ
ＮＡを同定した。これらは、ｐＰＳＤＦｉ１（配列番号１２）およびｐＰＳＤＦ
ｉ２（配列番号１４）と呼ばれる。ディリジェントタンパク質をコードするｃＤ
ＮＡインサートを、プラスミドｐＰＳＤＦｉ１から摘出し、そしてバキュロウイ
ルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４にクローン化した。得られた構築物を用い
て、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａを形質転換した。そしてこれ
より、機能性のディリジェントタンパク質を精製した。
【００３９】 別の局面において、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡをプローブとして用い、Ｔ
ｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａから２つのディリジェントタンパク質クロ
ーン（配列番号１６、１８）およびＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａから８つのディ
リジェントタンパク質ｃＤＮＡクローン（配列番号２０、２２、２４、２６、２
８、３０、３２、３４）を単離した。
【００４０】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来の（＋）−ピノレジノール／
（＋）−ラリシレジノールレダクターゼをコードするｃＤＮＡに関して、８つの
クロマトグラフィー工程からなる経験的に決定された精製プロトコルを発展させ
て、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ （＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノール
レダクターゼタンパク質を単離した。この手順は、２つの（＋）−ピノレジノー
ル／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼのアイソフォームをもたらした。こ
れらは両方とも（＋）−ピノレジノールおよび（＋）−ラリシレジノールの還元
を触媒し得た。３つのアイソフォームそれぞれのＮ末端の配列決定は、同一性の
３０アミノ酸配列（配列番号３６）をもたらした。これらのアイソフォームの両
方の混合物のトリプシン消化は、４つのペプチドフラグメントをもたらした。こ
れらは十分な量で精製され、配列決定（配列番号３７〜４０）を可能にした。さ
らに、これらのアイソフォームの両方の混合物の臭化シアン切断は、３つの異な
るペプチドフラグメントをもたらした。これらは、十分な量で精製され、配列決
定（配列番号４１〜４３）を可能にした。
【００４１】 ＰＬＲＮ５（配列番号４４）と名付けられたプライマーを、Ｎ末端ペプチド（
配列番号３６）のアミノ酸７〜１３の配列に基き、合成した。ＰＬＲ１４Ｒ（配
列番号４５）と名付けられたプライマーを配列番号３７で示される内在ペプチド
配列のアミノ酸２〜８の配列に基き、合成した。ＰＬＲ１５Ｒ（配列番号４６）
と名付けられたプライマーを、配列番号３７で示される内在ペプチド配列のアミ
ノ酸９〜１５の配列に基き、合成した。配列番号３７で示される内在ペプチド配
列のアミノ酸９〜１５の配列（プライマーＰＬＲ１５Ｒ（配列番号４６）の配列
はこの配列に基く）はまた、臭化シアンにより生成された、配列番号４１で示さ
れる内在フラグメントのアミノ酸４〜１０の配列に一致した。
【００４２】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａの総ＲＮＡを、高濃度のポリフェノールを含有する木質組
織のために特別に設計された方法を順応させたプロトコルにより単離した。ポリ
Ａ＋ ＲＮＡを単離し、そしてｃＤＮＡライブラリーを標準的な手段を用いて構
築した。ＰＬＲＮ５（配列番号４４）およびＰＬＲ１４Ｒ（配列番号４５）また
はＰＬＲ１５Ｒ（配列番号４６）のいずれか、ならびに基質としてＦｏｒｓｙｔ
ｈｉａ ｃＤＮＡのアリコートを用いたＰＣＲは、２つの、３８０ｂｐおよび４
００ｂｐの増幅されたバンドをもたらした。１つの４００ｂｐのｃＤＮＡインサ
ートをプローブとして用い、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングした。この４００ｂｐのプローブは、配列番号４７の塩基２２〜４２
３に一致した。６つのｃＤＮＡクローンを単離し、そして配列決定した（配列番
号４７、４９、５１、５３、５５、５７）。このクローンは、共通のコード領域
を共有し、多くは、異なる５’非翻訳領域およびそれぞれ異なる位置で終結する
３’非翻訳領域を有した。Ｅ．ｃｏｌｉ中でβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク
質として発現された、３つのｃＤＮＡの中の１つ（配列番号４７）は、ネイティ
ブの植物タンパク質と同じエナンチオマー特異的反応を触媒した。
【００４３】 別の局面において、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ由来の（＋）−ピノレジノー
ル／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼおよび（−）−ピノレジノール／（
−）−ラリシレジノールレダクターゼを、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ ｃＤＮ
Ａを合成することにより単離し、これをＰＣＲ反応においてテンプレートとして
用いた。このＰＣＲ反応において、プライマーは、３’リンカープライマー（配
列番号５９）およびＣＲ６−ＮＴ（配列番号６０）と名付けられた５’プライマ
ーであった。少なくとも２つの予想される長さの（１．２ｋｂ）バンドが得られ
、そしてこれをプラスミドベクターにクローン化した。ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番
号６１）と名付けられた１つのクローンを完全に配列決定し、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉにおいてβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質として発現させた。ｐｌｒ−Ｔ
ｐ１（配列番号６１）は、（−）−ピノレジノール／（−）−ラリシレジノール
レダクターゼをコードする。
【００４４】 クローンｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６１）のｃＤＮＡインサートを用いて、Ｔ
．ｐｌｉｃａｔａ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そしてｐｌｒ−
Ｔｐ２（配列番号６３）と名付けられたさらなる固有のクローンを同定した。ｐ
ｌｒ−Ｔｐ２（配列番号６３）は、ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６１）に対して高
い相同性を有するが、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダ
クターゼをコードする。ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６１）のｃＤＮＡインサート
を用いて、クローンＴ．ｐｌｉｃａｔａ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グし、さらなる２つのピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡ
（配列番号６５、６７）を同定した。
【００４５】 Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ由来のピノレジノール／ラリシレジノ
ールレダクターゼをコードする２つのｃＤＮＡ（配列番号６９、７１）を、ｐｌ
ｒ−Ｔｐ１ ｃＤＮＡインサート（配列番号６１）を用いてＴｓｕｇａ ｈｅｔ
ｅｒｏｐｈｙｌｌａ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単
離した。さらなるピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡおよ
びディリジェントタンパク質ｃＤＮＡを、本明細書の実施例１７〜２２に記載さ
れるようにして単離した。
【００４６】 ディリジェントタンパク質、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノ
ールレダクターゼおよび（−）−ピノレジノール／（−）−ラリシレジノールレ
ダクターゼをコードするｃＤＮＡの単離は、これらの機能性酵素に対する効果的
な発現系の開発を可能にし；リグナン生合成の発生的な調節を試験するための有
用なツールを提供し、そして他のディリジェントタンパク質およびピノレジノー
ル／ラリシレジノールレダクターゼの単離を可能にする。ディリジェントタンパ
ク質およびピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡの単離はま
た、リグナン生合成を増強または修飾するための、広範囲の生物の形質転換を可
能にする。
【００４７】 本発明のタンパク質および核酸を用いて、二分子フェノキシカップリング反応
の生成物（例えば、フロフラン、フラノ、およびジベンジルブタンリグナン）の
立体化学、位置化学またはその両方を前もって決定し得る。非限定的な例として
、本発明のタンパク質および核酸を用いて：健康保護リグナン（例えば、植物種
（野菜、穀物、および果物、ならびにこのような遺伝的に変更された植物由来の
物質が組み込まれた食用品目が挙げられるがこれらに限定されない）におけるポ
ドフィロトキシン）のレベルを上昇し得るか、そうでなければ変更し得る；遺伝
的に植物種を変更して、種々の目的（例えば、栄養補助食品（ｎｅｕｔｒｉｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）に有用な
豊富なリグナンの天然供給を提供し得る；生存生物を遺伝的に変更して、望まし
い生物学的特性（例えば、抗ウイルス特性を有する（−）−アルクチゲニン）を
有する光学的に純粋なリグナンの豊富な補給を生成し得る。特に、ディリジェン
トタンパク質結合部位および作用機構の特徴付けは、ディリジェントタンパク質
結合部位のアレイからなる合成タンパク質の開発を可能にする。そしてこれは、
立体化学的に制御されたポリマー性アセンブリーに対するテンプレートとして役
立つ。
【００４８】 当該分野で周知である（例えば、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ １８０：５３５−５４５（１９８９）；Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，７６９頁（１９８８）を参照のこと）Ｎ末端輸送配列は
、ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクタ
ーゼを、種々の細胞の位置または細胞外の位置に向けるのに用いられ得る。
【００４９】 欠失、置換、変異、および／または挿入により生成され得る野生型ディリジェ
ントタンパク質クローンおよびピノレジノール／ラリシレジノールクローンの配
列改変体は、先行技術により限定される範囲を除いて、本発明の範囲内にあるこ
とが意図される。ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジ
ノールレダクターゼアミノ酸配列改変体は、野生型ディリジェントタンパク質ま
たは野生型ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードするＤＮＡ
配列に変異を与えることにより（例えば、一般に部位特異的変異誘発と呼ばれる
技術を用いることにより）構築され得る。現在当該分野で周知の種々のポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｒａｎｓｆｏｒｍｅ
ｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキットのような２プ
ライマー系）が、この目的のために用いられ得る。
【００５０】 この系において標的プラスミドの変性の後、２つのプライマーをこのプラスミ
ドに同時にアニーリングする；これらのプライマーのうちの一方は、所望の部位
特異的変異を含み、他方は制限部位の除去を引き起こす、プラスミドの別の位置
での変異を含む。次いで第２の鎖の合成を実施し、これらの２つの変異体を緊密
に連結させ、そして生じたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉのｍｕｔＳ株を形質転換す
る。プラスミドＤＮＡを、形質転換された細菌から単離し、関連する制限酵素を
用いて制限し（これによって、非変異プラスミドを直鎖状にし）、次いでＥ．ｃ
ｏｌｉに再度形質転換する。この系は、サブクローニングの必要性または一本鎖
プラスミドの作製を伴わずに、発現プラスミドでの直接的な変異の生成を可能に
する。２つの変異体の緊密な連結およびそれに続く非変異プラスミドの直鎖化は
、高い変異効率をもたらし、そして最小限のスクリーニングを可能にする。最初
の制限部位プライマーの合成に続き、この方法は、変異部位あたり１つだけの新
たなプライマータイプの使用を必要とする。各位置ごとの変異を別々に調整する
よりも、「計画的変性（ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）」オリ
ゴヌクレオチドプライマーのセットが、所定の部位でのすべての所望の変異を同
時に導入するために、合成され得る。形質転換体は、変異を受けた領域を通じて
プラスミドＤＮＡを配列決定し、変異体クローンを同定および分類することによ
りスクリーニングされ得る。次いで各変異ＤＮＡは制限され得、そしてＭｕｔａ
ｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔゲル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋ
ｅｒ）での電気泳動により分析されて、（非変異コントロールとのバンドのシフ
トの比較により）その配列に他の変更が起こっていないことを確認され得る。
【００５１】 この型のベクターにまだクローニングされていない場合、検証された変異体二
重鎖は、複製可能な発現ベクターにクローン化され得、そして、変異タンパク質
の高レベルの産生のためのＥ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）ｐＬｙｓＳ）を形質転換するために、および引き続くその精製のために得
られた発現構築物が使用され得る。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法は、変異体発
現の忠実度を迅速にチェックするために使用され得る。この技術は、全タンパク
質にわたる配列決定セグメントを提供し、そして、配列アライメントにおいて必
要な信頼を提供する。この型のマッピング実験において、タンパク質は、プロテ
アーゼで消化される（このセグメントは、主要な目的であり、そして、残りのマ
ップは、未変異のタンパク質のマップと同一であるべきであるので、選択は、改
変されるべき特定の領域に依存する）。このセットの切断フラグメントは、ミク
ロボア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ）ＨＰＬＣ（逆相またはイオン交換、再び改変され
るべき特定の領域に依存する）によって分画され、各画分においていくらかのペ
プチドを提供し、そして、ペプチドの分子量は、ＦＡＢ−ＭＳによって決定され
る。次いで、この質量（ｍａｓｓｅ）を推定配列の消化から予想されたペプチド
の分子量と比較し、そして、配列の正確さを急速に確かめた。この変異誘発アプ
ローチは、タンパク質改変に指向しているので、変更されたペプチドの配列決定
は、ＭＳが推定と一致しない場合、必ずしも必要ではない。荷電残基を検証する
ことが必要な場合、ＣＡＤ−直列型ＭＳ／ＭＳが使用され、問題の混合物のペプ
チド、または差次的なＥｄｍａｎ分解のためかもしくは改変の位置に依存したカ
ルボキシペプチダーゼＹ消化のための精製された標的ペプチドを配列決定し得る
。
【００５２】 特定の部位特異的変異体の設計において、最初に非保存的置換（例えば、Ａｌ
ａをＣｙｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕに置換する）を作製し、そして、結果として活
性が大いに損なわれたか否かを決定する。次いで、変異誘発されたタンパク質の
性質を変更された関数の感受性の指標としてＫｍおよびｋｃａｔの速度パラメー
ターに特に注意して調査した。結合および／または触媒における変化が、ネイテ
ィブの酵素と比較して、事実上減少され得る。この手段によって、この残基が、
活性障害によって重要であるか、またはノックアウトであると実証される場合、
次いで、保存的な置換が作製され得る（例えば、側鎖長を変更するためにＡｓｐ
をＧｌｕ、ＳｅｒをＣｙｓ、またはＡｒｇをＨｉｓに置換する）。疎水性セグメ
ントについては、芳香属化合物はまたアルキル側鎖と置換され得るが、変更され
得るのはほとんどサイズである。正常な産物分布における変化は、反応配列の工
程が変異によって変更されていると示し得る。
【００５３】 他の部位特異的変異誘発技術はまた、本発明のヌクレオチド配列を用いて行な
われ得る。例えば、ライゲーション後にＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化を
使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８
９））の１５．３節に記載されるように、ディリジェントタンパク質またはピノ
レジノール／ラリシレジノールレダクターゼ欠損改変体を作製した。同様のスト
ラテジーを使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出の１５．３節に記載されるよう
に挿入改変体を構築した。
【００５４】 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発をまた、本発明の置換改変体を調製するた
めに使用し得る。これは、本発明の欠失改変体および挿入改変体を簡便に調製す
るために使用され得る。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ ２：１８３（
１９８３））によって記載されるように当該分野で周知である。一般的に、長さ
が少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用して、ディリジェン
トタンパク質遺伝子またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ遺伝
子における２つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失または置換し得る。最適なオリ
ゴヌクレオチドは、変異についてのヌクレオチドコードのいずれかの側に１２〜
１５の完全にマッチしたヌクレオチドを有する。野生型ディリジェントタンパク
質または野生型ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼを変異化するた
めに、適切なハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドを一本鎖Ｄ
ＮＡ鋳型分子にアニールした。次いで、ＤＮＡ重合化酵素（通常、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント）が添加される。この酵素
は、プライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用し、ＤＮＡの変異保有鎖の合成
を完成する。従って、ＤＮＡの一方の鎖が、ベクター中に挿入された野生型ディ
リジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼを
コードするようにヘテロ二重鎖分子が形成され、そして、ＤＮＡの２本目の鎖が
、同じベクターに挿入されたディリジェントタンパク質またはピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼの変異形態をコードする。次いで、ヘテロ二重鎖
分子は、適切な宿主細胞に形質転換される。
【００５５】 １つ以上のアミノ酸置換を有する変異体は、いくつかの方法のうちの１つによ
って作製され得る。アミノ酸がポリペプチド鎖中に共に近接して位置する場合、
それらは、所望のアミノ酸置換のすべてをコードする１つのオリゴヌクレオチド
を同時に使用して変異化され得る。しかし、アミノ酸がお互いにいくらか離れて
位置する場合（例えば、１０アミノ酸を超えて離れている場合）、所望の変化の
すべてをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより困難である
。その代わり、２つの代替的な方法のうちの１つが使用され得る。第１の方法に
おいて、別々のオリゴヌクレオチドが、置換されるべき各アミノ酸について作製
される。次いで、オリゴヌクレオチドは、一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールさ
れ、鋳型から合成されるＤＮＡの第２の鎖は、所望のアミノ酸置換の全てをコー
ドする。
【００５６】 代替的な方法は、所望の変異を生成する２回以上の変異誘発を包含する。１回
目は、単一変異について記載される通りである：野生型ディリジェントタンパク
質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼＤＮＡは、鋳型として
使用され、最初の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、この
鋳型にアニールされ、次いで、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子が作製される。２回目の
変異誘発は、鋳型としての１回目の変異誘発中に作製された変異ＤＮＡを利用す
る。従って、この鋳型はすでに１つ以上の変異を含む。次いで、さらなる所望の
アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、この鋳型にアニールされ、そ
して、得られたＤＮＡの鎖は、ここで、１回目および２回目の変異誘発の両方に
由来する変異をコードする。この得られたＤＮＡは、３回目の変異誘発などにお
ける鋳型として使用され得る。
【００５７】 任意の必要な転写後改変を行ない得、そして適切な膜位置に酵素を指向させ得
るので、真核生物発現系が、ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼ産生について利用され得る。この目的のための代
表的な真核生物発現系は、本発明のディリジェントタンパク質またはピノレジノ
ール／ラリシレジノールレダクターゼの発現のために組換えバキュロウイルス、
Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ
；Ｍ．Ｄ．ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ
Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（１９８６
）；Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９
８７））を使用する。組換えバキュロウイルスと昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種の細胞のような）との感染は、大量のディリジェン
トタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質
の産生を可能にする。さらに、バキュロウイルス系は、組換えディリジェントタ
ンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼの産生のための
他の重要な利点を有する。例えば、バキュロウイルスは、ヒトに感染せず、従っ
て、大量に安全に取り扱われ得る。バキュロウイルス系において、ディリジェン
トタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼおよびベク
ターをコードするＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ構築物が、調製される。このベ
クターは、バキュロウイルスのポリへドリン遺伝子プロモーター領域、組換え間
の適切な交差について必要なバキュロウイルス隣接配列（プロモーター配列に隣
接した約２００〜３００塩基対を含む隣接配列）および構築物が細菌において複
製可能にする細菌の複製起点を含み得る。（ｉ）ＤＮＡセグメントが、ポリへド
リン遺伝子プロモーターに隣接して位置し（あるいは、作動可能に連結されるか
または「下流」もしくは「制御下」にある）、そして（ｉｉ）プロモーター／ピ
ノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ、またはプロモーター／ディリジ
ェントタンパク質の組み合わせが、バキュロウイルスＤＮＡの２００〜３００塩
基対まで両側に隣接するように（隣接配列）、このベクターは構築される。
【００５８】 ディリジェントタンパク質ＤＮＡ構築物、またはピノレジノール／ラリシレジ
ノールレダクターゼＤＮＡ構築物を産生するために、全長ディリジェントタンパ
ク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードするｃＤＮ
Ａクローンを、本明細書中に記載されるような方法を使用して獲得される。ＤＮ
Ａ構築物が、組換えが行なわれるような条件下で適切なバキュロウイルスのバキ
ュロウイルスＤＮＡ（すなわち、構築物中にコードされるプロモーターと同一種
のバキュロウイルスＤＮＡ）と、宿主細胞中で接触させた。得られた組換えバキ
ュロウイルスは、完全なディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリ
シレジノールレダクターゼをコードする。例えば、昆虫宿主細胞は、ＤＮＡ構築
物および機能的なバキュロウイルスと同時トランスフェクトされるかまたは別々
にトランスフェクトされ得る。次いで、得られた組換えバキュロウイルスは、単
離され得、そして、ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレ
ジノールレダクターゼの産生を行なうための感染細胞に使用され得る。宿主昆虫
細胞としては、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞が挙
げられる。次いで、本発明の組換えバキュロウイルスで感染した昆虫宿主細胞を
、バキュロウイルスにコードされたディリジェントタンパク質またはピノレジノ
ール／ラリシレジノールレダクターゼの発現を可能にする条件下で培養する。従
って、組換えタンパク質を当該分野で公知の方法を使用して細胞から抽出した。
【００５９】 酵母のような他の真核生物微生物はまた、本発明を実施するために使用される
。ベーカーの酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが一般的
に酵母として使用されるが、いくつかの他の系統もまた利用可能である。プラス
ミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７
９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍ
ｐｅｒら、Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０））は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ中の発現ベクターとして一般的に使用されている。このプラスミドは、トリ
プトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株（例えば、株ＡＴＣＣ番号４４
，０７６およびＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１
９７７））についての選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含む。次いで、
酵母宿主細胞ゲノムに特徴的なｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの非存在
下での増殖によって、形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。酵母
宿主細胞は、Ｈｉｎｎｅｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５：１９２９（１９７８））によって記載されるように、一般的にポリエチレ
ングリコール方法を使用して形質転換される。さらなる酵母形質転換プロトコー
ルは、Ｇｉｅｔｚら、Ｎ．Ａ．Ｒ．２０（１７）；１４２５（１９９２）；Ｒｅ
ｅｖｅｓら、ＦＥＭＳ ９９：１９３−１９７（１９９２）に開示される。
【００６０】 酵母ベクターにおける適切な促進配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９
８０））または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ
．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
７：４９００（１９７８））（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホ
スホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリ
セリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホス
ホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）についてのプロモーターが
挙げられる。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子と関連した
末端配列がまた、ｍＲＮＡおよび末端のポリアデニル化を提供するために発現さ
れることが所望である配列の発現ベクターの３’側に連結され得る。増殖条件に
よって転写制御されるさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデ
ヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連した
分解酵素、および上述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、な
らびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモーター領
域である。酵母適合性プロモーター、複製の起点および末端配列を含む任意のプ
ラスミドベクターが適切である。
【００６１】 多細胞生物（例えば、植物）に由来する細胞培養物は、本発明を実施するため
の宿主として使用され得る。例えば、ピノレジノール／ラリシレジノールレダク
ターゼ、および／またはディリジェントタンパク質、ならびに選択マーカー遺伝
子（例えば、カナマイシンに対する耐性をコードするｋａｎ遺伝子）をコードす
るプラスミドを、Ｈｏｅｃｋｅｍａら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９−１８１
（１９８３）に記載されるようなヘルパーＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓに移入することによって、そしてＡｎら
、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８１：３０１−３０５（１９８６）によ
って記載されるように形質転換されるべき植物の葉の切片とＡｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ細胞を培養することによって、トランスジェニック植物が獲得され得る
。培養された植物細胞の形質転換は、上記のように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓを介して通常達成される。強固な細胞膜障害物を有
さない哺乳動物宿主細胞および他の宿主細胞の培養は、通常、Ｇｒａｈａｍおよ
びＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６（１９７８））によ
って本来記載されるようなリン酸カルシウム法、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、前
出の小節１６．３２−１６．３７において記載されるような改変法を使用して、
形質転換される。しかし、ポリブレン（ＫａｗａｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１１７２（１９８４））、プロトプラスト融
合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
７：２１６３（１９８０））、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．１：８４１（１９８２））、および核への直接的な微小注入（Ｃａ
ｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ２２：４７９（１９８０））のような、ＤＮＡを細胞
に導入するための他の方法もまた、使用され得る。さらに、動物形質転換ストラ
テジーが、Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ Ｇ．Ｍ．およびＲｏｂｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔ
ｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９５）におい
て総説される。形質転換された植物カルスは、例えば、カナマイシン、ならびに
カルスおよびシュートの誘導についてのナフタレン酢酸およびベンジルアデニン
のような適切の量の植物ホルモンを含む培地上で細胞を増殖することによって選
択マーカーを介して選択され得る。次いで、植物細胞は再生され、そして、得ら
れた植物を当業者に周知の技術を使用して土壌に移した。
【００６２】 さらに、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ産生またはディリジ
ェントタンパク質産生を調節する遺伝子は、誘導性の必要なプロモーターと共に
植物に取り込まれ得る。本発明の実施形態を実施する際、特定の外部または内部
刺激のみに対応するプロモーターは、標的ｃＤＮＡに融合される。従って、この
遺伝子は、特定の刺激に応答する場合を除いて、転写されない。この遺伝子が転
写されない限り、その遺伝子産物は産生されない。
【００６３】 本発明の実施において使用され得る応答性プロモーターシステムの例示的な例
は、トウモロコシ中のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）システ
ムである。ＧＳＴは、予め出現した除草剤としてしばしば使用される、複数の疎
水性求電子化合物を解毒し得る、酵素のファミリーである（Ｗｅｉｇａｎｄら、
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：２３５−２４３（１９
８６））。研究により、このＧＳＴが、増強した除草剤耐性を生じるのに直接的
に関連することを示した。この作用は、特定の１．１ｋｂのｍＲＮＡ転写産物を
介して主に媒介される。手短に、トウモロコシは、外部の刺激に応答し得、そし
て遺伝子産物を産生するために誘導され得る、天然に存在する静止性遺伝子を有
する。この遺伝子は、予め同定され、そしてクローニングされる。従って、本発
明の１実施形態において、このプロモーターは、ＧＳＴ応答性遺伝子から取り除
かれ、そして予め天然のプロモーターが除去された、ピノレジノール／ラリシレ
ジノールレダクターゼ遺伝子、またはディリジェントタンパク質遺伝子に結合さ
れる。この操作された遺伝子は、外部の化学的刺激に応答するプロモーターとピ
ノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質
に応答する遺伝子との組合せである。
【００６４】 上記の方法に加えて、数種の方法は、クローン化されたＤＮＡを広範な種々の
植物種（ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍｓ、ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ、ｍｏｎｏｃｏｔｓ
およびｄｉｃｏｔｓ）に移動させるための分野において公知である（例えば、Ｇ
ｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ ＭＯ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ
，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９９３）を参照のこと）。代表的な例としては、プロトプ
ラストによって取り込まれたエレクトロポレーション促進ＤＮＡ（Ｒｈｏｄｅｓ
ら．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（４８４９）：２０４−２０７（１９８８））；
ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストの処理（Ｌｙｚｎｉｋら，Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：１５１−１６１（１９８
９））；およびＤＮＡ含有マイクロ弾（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を用
いたボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：４
４０−４４４（１９８９）およびＢｏｙｎｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０（
４８５８）：１５３４−１５３８ （１ ９８８））が挙げられる。ここで、複
数の方法が、例えば、穀類の形質転換のために存在する（例えば、ＭｃＫｉｎｎ
ｏｎ，Ｇ．Ｅ．およびＨｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２２（３）：２０３−２１０（１９９５）；Ｍｅｎｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．および
Ｔｅｅｒｉ，Ｔ．Ｈ．，ＰｌａｎｔおよびＭｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，３：８１−９８，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；ＭｃＥｌｒｏｙ，
Ｄ．およびＢｒｅｔｔｅｌｌ，Ｒ．Ｉ．Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（２）：６２−６８（１９９４）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら
，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０（７）：２３９−２
４６（１９９２）；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，Ｐ．およびＦｏｒｄ，Ｔ．Ｌ．，Ａｎｎ
ａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ，７５（５）：４４９−４５４（１９９５）；Ｐａ
ｒｋら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２（６）：１１
３５−１１４８（１９９６）；Ａｌｔｐｅｔｅｒら，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ，１６：１２−１７（１９９６）を参照のこと）。さらに、植物の
形質転換戦略および技術は、Ｂｉｒｃｈ，Ｒ．Ｇ．，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎ
ｔ Ｐｈｙｓ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：２９７（１９９７）；Ｆ
ｏｒｅｓｔｅｒら，Ｅｘｐ．Ａｇｒｉｃ．３３：１５−３３（１９９７）におい
て総説される。少量の改変が、広範な植物種に対して適用可能なこれらの技術に
なされる。
【００６５】 これらの技術の各々は、利点および不都合を有する。この技術の各々において
、プラスミド由来のＤＮＡは、一般的に遺伝子組換えされ、その結果、目的の遺
伝子のみを含むだけでなく、選択可能な標識遺伝子およびスクリーニング可能な
標識遺伝子を含む。選択可能な標識遺伝子は、プラスミドのコピーを組み込んだ
、これらの細胞のみを選択するために使用される（この構築物は、目的の遺伝子
ならびに選択可能な遺伝子およびスクリーニング可能な遺伝が、１ユニットとし
て移動されるものである）。スクリーニング可能な遺伝子は、目的の遺伝子を有
するこれらの細胞のみを首尾よく培養するための別の点検を提供する。共通して
使用される選択可能な標識遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ
Ｉ（ＮＰＴ ＩＩ）である。この遺伝子は、カナマイシン（細胞が増殖する増殖
媒体に直接的に添加され得る化合物）に対する耐性を与える。植物細胞は、通常
、カナマイシンに感染されやすく、結果として死ぬ。ＮＰＴ ＩＩ遺伝子の存在
は、カナマイシン効果を克服し、そしてこの遺伝子を有する各細胞は、生存した
ままである。本発明の実施に使用され得る別の選択可能な標識遺伝子は、除草剤
グルホシネート（Ｂａｓｔａ）に対する耐性を与える遺伝子である。共通して使
用されるスクリーニング可能な遺伝子は、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ
）である。この遺伝子の存在は、推定して形質転換した細胞のサンプルを、ＧＵ
Ｓアッセイ溶液を用いて処理される組織化学的反応を使用して特徴付けされる。
適切なインキュベーション後に、ＧＵＳ遺伝子を含む細胞は、青に変わる。好ま
しくは、プラスミドは、選択可能な標識遺伝子およびスクリーニング可能な標識
遺伝子の両方を含む。
【００６６】 これらの遺伝子の１以上を含むプラスミドは、上記の任意の技術によって、植
物のプロトプラストまたはカルス細胞のいずれかに導入される。この標識遺伝子
は、選択可能な遺伝子である場合、ＤＮＡパッケージを取り込んだこれらの細胞
のみが、適切な植物毒性剤の選択下で生存する。一旦、適切な細胞が、同定およ
び増殖されると、植物が再生される。形質転換した植物由来の子孫は、ＤＮＡパ
ッケージングが植物のゲノムに首尾良く取り込まれることを保証するために試験
されなければならない。
【００６７】 哺乳動物の宿主細胞はまた、本発明の実施において使用され得る。適切な細胞
株の例としては、以下が挙げられる：ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓
ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株２９３Ｓ
（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビ
ーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムス
ター卵巣細胞（ＵｒｌａｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ
４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３（１９８０））；サ
ル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓
細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮癌細胞（ＨＥ
ＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４
）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；
ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ ０６０
５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ラット肝細胞（ＨＴＣ、ＭＩ．５４、Ｂａｕ
ｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８５：１（１９８０））；およびＴＲＩ
細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４
４（１９８２））。これらの細胞に対する発現ベクターは、（必要な場合）複製
起点、発現されるべき遺伝子の前方に配置されたプロモーター、リボソーム結合
部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結部位に関す
るＤＮＡ配列を含む。
【００６８】 哺乳動物の発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは、しばしば、ウイ
ルス起源である。これらのウイルスプロモーターは、共通して、ポリオーマウイ
ルス、アデノウイルス２、および最もしばしば、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０
（ＳＶ４０）由来である。このＳＶ４０ウイルスは、早期ポロモーターおよび後
期プロモーターと呼ばれる２種のプロモーターを含む。これらのプロモーターの
両方は、複製起点をも含む１つのＤＮＡフラグメントとして、ウイルスから容易
に得られるので、特に有用である（Ｆｅｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１
３（１９７８））。より小さいか、またはより大きなＳＶ４０ ＤＮＡフラグメ
ントがまた、使用され得る。ただし、このフラグメントは、ウイルス性の複製起
点に配置された、ＨｉｎｄＩＩＩからＢｇｌＩ部位へ伸びる、約２５０−ｂｐ配
列を含む。
【００６９】 あるいは、外来遺伝子と天然に関連するプロモーター（異種プロモーター）が
使用され得る。ただし、このプロモーターは、形質転換のために選択された宿主
細胞株と適合性である。
【００７０】 複製起点は、外来供給源（例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、Ｐ
ｏｌｙｏｍａ、Ａｄｅｎｏ、ＶＳＶ、ＢＰＶ））から得られ得、そしてクローニ
ングベクターに挿入される。あるいは、この複製起点は、宿主細胞の染色体複製
機構によって提供され得る。外来遺伝子を含むベクターが、宿主細胞の染色体に
取り込まれる場合、この宿主細胞の染色体は、しばしば、十分な量である。
【００７１】 第２のＤＮＡコード配列の使用は、形質転換された細胞株中の、ピノレジノー
ル／ラリシレジノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質の発現レベ
ルを増強し得る。この第２のコード配列は、代表的に、酵素ジヒドロ葉酸レダク
ターゼ（ＤＨＦＲ）によって正常に阻害される。ＤＨＦＲの野生型形態は、化学
的なメトトレキサート（ＭＴＸ）によって通常阻害される。細胞中でのこのＤＨ
ＦＲの発現レベルは、培養された宿主細胞に添加したＭＴＸの量に依存して変化
する。第２の配列として特に有用にするＤＨＦＲのさらなる特徴は、このＤＧＦ
Ｒが、形質転換した細胞を同定するために選択標識として使用され得ることであ
る。ＤＨＦＲの２つの形態は、第２の配列、野生型ＤＨＦＲおよびＭＴＸ耐性Ｄ
ＨＦＲとしての使用のために利用可能である。特定の宿主細胞に使用されるＤＨ
ＦＲの型は、この宿主細胞がＤＨＦＲ欠失であるかどうかに依存する（ＤＨＦＲ
は、外因的に非常に低いレベルのＤＨＦＲを産生するか、またはＤＨＦＲフラグ
メントを全く産生しない）。ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（前出）によって
記載されるＣＨＯ細胞株のようなＤＨＦＲ欠失細胞株は、野生型ＤＨＦＲコード
配列で形質転換される。形質転換後、これらのＤＨＦＲ欠失細胞株は、ＤＨＦＲ
フラグメントを発現し、そして栄養分のヒポキサンチン、グリシンおよびチミジ
ンを欠く培養培地中で増殖され得る。形質転換されていない細胞は、この培地中
で生存しない。
【００７２】 ＤＨＦＲのＭＴＸ−耐性形態は、ＭＴＸ感受性である正常な量のＤＨＦＲフラ
グメントを外因的に産生するこれらの宿主細胞中で、形質転換された宿主細胞を
選択する手段として使用され得る。このＣＨＯ−ＫＩ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＬ
６１）は、これらの性質を有し、従って、この目的のために有用な細胞株である
。ＭＴＸの細胞培養培地への添加により、ＭＴＲ耐性ＤＨＦＲをコードするＤＮ
Ａで形質転換されたこれらの細胞のみが増殖することを可能にする。形質転換し
ていない細胞は、この培地中で生存することができない。
【００７３】 原核生物がまた、本発明のクローニングの開始段階のための宿主細胞として使
用され得る。これらは、大量のＤＮＡの迅速な産生のため、部位特異的変異誘発
のために使用される単鎖ＤＮＡ鋳型の産生のため、多くの変異体を同時にスクリ
ーニングするため、および産生された変異体のＤＮＡスクリーニングのために使
用される。適切な原核生物宿主細胞としては、以下が挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１，４４６），Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１ １
０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２７，３２５）Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ
．３１，５３７），およびＥ．ｃｏｌｉ Ｂ；しかし、Ｅ．ｃｏｌｉの多くの他
の種（例えば、ＢＢ１０１，ＪＭ１０１、ＮＭ５２２，ＮＭ５３８，ＮＭ５３９
，ならびに原核生物の多くの他の種および属（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、他の腸内細菌科（Ｓａｌｌｎｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕ
ｒｉｕｍ）またはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓを含む）、そして種々
のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種は、全て、宿主として使用され得る。堅い細胞壁を
有する、原核生物宿主細胞または他の宿主細胞は、好ましくは、前出のＳａｍｂ
ｒｏｏｋらの第１．８２節に記載されるような塩化カルシウム方法を使用して形
質転換される。あるいは、エレクトロポレーションは、これらの細胞の形質転換
のために使用され得る。原核細胞の形質転換技術は、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，ｉ
ｎＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓおよびＭｅ
ｔｈｏｄｓ，１２：２７５−２９６，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｒｐ．（１９９０）；Ｈａｎａｈａｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｘｙｍｏｌ．，２０
４：６３（１９９１）に記載されている。
【００７４】 代表的な例として、ディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシ
レジノールレダクターゼをコードするｃＤＮＡ配列は、異種宿主細胞としてＥ．
ｃｏｌｉ中での過剰発現に商業的に利用可能（Ｎｏｖａｇｅｎ）な（Ｈｉｓ）６ ・Ｔａｇ ｐＥＴベクターに移され得る。このｐＥＴ発現プラスミドは、高レベ
ルの異種発現系において種々の利点を有する。所望のｃＤＮＡ挿入物は、６個の
ヒスチジンをコードするプラスミドベクター配列にインフレームで連結され、続
いて、標的タンパク質のアミノ末端コドンに結合される高度に特異的なプロテア
ーゼ認識部位（トロンビン）に連結される。発現した融合タンパク質のヒスチジ
ン「遮断」は、免疫化金属イオンに対して非常に強固な結合を促進し、そして免
疫化金属イオン親和性クロマトグラフィーによって、組換えタンパク質の迅速な
精製を可能にする。次いで、このヒスチジンリーダー配列は、トロンビン、およ
び溶出されたディリジェントタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノー
ルレダクターゼを用いて精製したタンパク質の処理によって、特異的なタンパク
質分解部位で切断される。この過剰発現精製系は、高い容量、優れた分解能を有
し、高速であり、そして同様な結合挙動を示すＥ．ｃｏｌｉタンパク質で汚染さ
れる機会（トロンビンタンパク質分解の前および後）が、極端に減る。
【００７５】 当該分野で明らかであるように、宿主細胞と適合性の種から誘導されたレプリ
コンおよびコントロール配列を含む、任意のプラスミドベクターは、本発明の実
施において使用され得る。このベクターは、通常、複製部位、形質転換された細
胞において表現型選択を提供する標識遺伝子、および外来遺伝子の挿入のために
種々の制限部位を含むポリリンカー領域を有する。代表的に、Ｅ．ｃｏｌｉの形
質転換に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｍ１３（これ
は、前出のＳａｍｂｒｏｏｋらの第１．１２−１．２０節に記載される）が挙げ
られる。しかし、多くの他の適切なベクターは、同様に利用可能である。これら
のベクターは、アンピシリン耐性および／またはテトラサイクリン耐性に関する
コード遺伝子を含み、これにより、これらのベクターで形質転換された細胞がこ
れらの抗体の存在下で増殖し得る。
【００７６】 原核生物ベクターにおいて、最も一般的に使用されるプロモーターとしては、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａ
ｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ３７５：６１５（１９７８）；Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ １９８：１０５６（１９７７）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ２
８１：５４４（１９７９））およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（
Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）
）；ＥＰＯ Ａｐｐｌ．Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．３６，７７６、およびアルカリホスフ
ァターゼ系が挙げられる。これらは、最も一般的に使用されるが、他の微生物の
プロモーターが利用され、そしてこれらのヌクレオチドに関する詳細は、発表さ
れており、当業者が、プロモーターをプラスミドベクターに機能的に連結させる
ことを可能にする（例えば、Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ２０：２６９（
１９８０）を参照のこと）。
【００７７】 この細胞から通常選択された、多くの原核生物のタンパク質は、アミノ酸配列
の一部として外因性分泌シグナル配列を含む。従って、原形質中で通常見出され
るタンパク質は、シグナル配列をタンパク質に連結することによって、分泌のた
めに標的され得る。このことは、シグナル配列をコードするＤＮＡを、タンパク
質をコードするＤＮＡの５’末端に連結し、次いで、適切な宿主細胞中で融合タ
ンパク質を発現することによって容易に達成される。シグナル配列をコードする
ＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子から、制
限フラグメントとして得られ得る。従って、原核生物、酵母、および真核生物の
シグナル配列は、本発明を実施するために利用される宿主細胞の型に依存して、
本明細書中で使用され得る。例えば、ヒト増殖ホルモン、プロインスリン、およ
びプレアルブミンを含む、数種の真核生物の遺伝子のシグナル配列部分をコード
する、ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、公知であり（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，ＮＹ，第７６９頁（１９８８））、そして適切な真核細胞宿主細胞中に
おいてシグナル配列として使用され得る。酵母のシグナル配列（例えば、酸ホス
ファターゼ（Ａｒｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１６
５７（１９８３））、α−因子、アルカリホスファターゼおよびインベルターゼ
）は、酵母宿主細胞から分泌を指向するために使用され得る。例えば、ＬａｍＢ
もしくはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ ６８：１９３（１９８８）、Ｍａｌ
Ｅ、ＰｈｏＡ、もしくはβ−ラクタマーゼ、ならびに他の遺伝子）をコードする
遺伝子由来の、原核生物のシグナル配列は、原核生物細胞から培養培地にタンパ
ク質を標的化するために使用され得る。
【００７８】 植物、動物および微生物由来の輸送配列は、本発明の実施において使用され、
遺伝子産物を、原形質、小胞体、ミトコンドリアまたは他の細胞成分に指向する
か、または培地への搬出のためにタンパク質を標的化する。これらの考察を、ピ
ノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼまたはディリジェントタンパク質
の過剰発現に、および任意の所望の位置おいて遺伝子の発現機能を可能にするた
めに、細胞またはインタクトな生物内での発現の方向付けに適用する。
【００７９】 複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子をコードするＤＮＡおよび目的のディ
リジェントタンパク質のＤＮＡまたはピノレジノール／ラリシレジノールレダク
ターゼのＤＮＡを含む、適切なベクターの構築物は、標準的な組換えＤＮＡ産物
を使用して調製される。単離したプラスミドおよびＤＮＡフラグメントを、当該
分野で周知であるように、特異的に所望のベクターを産生するために、切断し、
調整し、そして共に連結させる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこ
と）。
【００８０】 上記のように、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ改変体、また
はディリジェントタンパク質改変体は、好ましくは、部位特異的変異誘発の方法
を使用して産生される変異の手段によって産生される。この方法は、所望の変異
の配列および十分な数の隣接するヌクレオチドの両方をコードする、特定のヌク
レオチドの合成および使用を必要とし、このオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型に
対して安定的にハイブリダイズすることを可能にする。
【００８１】 ディリジェントタンパク質遺伝子および／またはピノレジノール／ラリシレジ
ノールレダクターゼ遺伝子、あるいはディリジェントタンパク遺伝子および／ま
たはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ遺伝子の全てまたは一部に
対して相補的なアンチセンス核酸フラグメントは、以下を含むが、これらに限定
されない種々の目的のために、任意の植物種に適切に導入され得る：木の組織（
特に、芯材の組織）の色、構造、耐久性、および害虫耐性を変えるか、または改
良すること；動物の飼料として有用である植物種（例えば、コーン）中のリグナ
ンおよび／またはリグニンの形成を減少させ、これにより、植物材料を摂取する
動物の消化系に対して、植物材料のセルロース画分の利用可能性を増強すること
；パルプおよび紙の製造に利用可能な植物種のリグナン／リグニンを減少させ、
これにより、パルプおよび紙製品をより簡単にかつ安価で製造すること；防御的
なリグナンまたはリグニンの製造を強化することによって、肉食動物および病原
体に対する、植物の防御的能力を改良すること；リグナンまたはリグニンによっ
て媒介される他の生態学的な相互作用の変換；医薬または食品添加物として、リ
グナンの光学純度の高いレベルのエナンチオマーを産生すること；ディリジェン
トタンパク質またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼおよびそれ
らの誘導体を導入、増強または阻害すること。ディリジェントタンパク質および
／またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ遺伝子は、ディリジェ
ントタンパク質および／またはピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ
の産生、あるいはピノレジノールまたはラリシレジノールおよびそれらの誘導体
の産生を導入、増強または阻害することを含むが、これらに限定されない目的の
ために、任意の生物に導入され得る。
【００８２】 上記は、以下の代表的な例と組合せてより十分に理解され得るが、ここで「プ
ラスミド」は、英文字表記に従って、英小文字ｐによって表される。本発明にお
いて使用される出発プラスミドは、非制限的基準に基づいて市販、公に利用可能
であるか、または公表された手順を使用して利用可能なプラスミドから構築され
得るかのいずれかである。さらに、他の等価なプラスミドは、当該分野で公知で
あり、そして当業者に明らかである。
【００８３】 ＤＮＡの「消化」、「切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）」または「切断（ｃｌｅａｖｉ
ｎｇ）」は、ＤＮＡの特定の部位でのみ作用する酵素を用いた、ＤＮＡの触媒的
切断をいう。これらの酵素は、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれており、各酵素
が切断するＤＮＡ配列に沿った部位は、制限部位と呼ばれる。本発明において使
用される制限酵素は、市販されており、そして製造業者によって供給される指示
に従って使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の節１．６０−１．６１およ
び節３．３８−３．３９をまた参照のこと）。
【００８４】 制限消化から得られたＤＮＡのフラグメントの「回収」または「単離」は、電
気泳動によるポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上での得られたＤＮＡフ
ラグメントの分離、既知の分子量の標識ＤＮＡフラグメントの移動度に対して移
動度を比較することによる目的のフラグメントの同定、所望のフラグメントを含
むゲル部分の除去、ならびにＤＮＡからＤＮＡの分離を意味する。この手順は、
一般的に公知である。例えば、Ｌａｗｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． ９．６１０３−６１１４（１９８２））、およびＧｏｅｄｄｅｌら（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、前出）を参照のこと。
【００８５】 以下の実施例は、本発明を実施するために意図されたベストモードを単に例示
するのみであり、本発明を限定することを意図しない。本明細書中の全ての引用
文献は、参考として明確に援用されている。
【００８６】 （実施例１） （Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のディリジェントタンパク
質の精製） （植物材料）Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ植物は、Ｂａｉｌｅ
ｙ’ｓ Ｎｕｒｓｅｒｙ（ｖａｒ．Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｔ．，Ｐａｕ
ｌ，ＭＮ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの温室
施設において維持されている）か、または地域社会からの寄贈物のいずれかであ
った。
【００８７】 （最初の抽出および硫酸アンモニウムの沈殿）結合したタンパク質の可溶化は
、４℃で実施された。凍結乾燥したＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
幹（２ｋｇ）は、液体窒素の存在下でＷａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｏｒ（Ｍｏｄｅ
ｌ ＣＢ６）において粉砕された。５ｍＭのジチオトレイトールを含む、０．１
ＭのＫＨ２ＰＯ４−Ｋ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ、４リットル）を用いて、得られ
た粉末をホモジェネートとして、４層のチーズクロスを介して濾過した。引き続
いて、不溶性の残渣を、以下のように、２５０ｒｐｍで連続的に攪拌した状態で
抽出した：凍結（−２０℃）した再蒸留したアセトン（４リットル、３×３０分
）；０．１％のβ−メルカプトエタノールを含む、０．１ＭのＫＨ２ＰＯ４−Ｋ２ ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．５）（溶液Ａ、８リットル、３０分）；１％のＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ１００を含む溶液Ａ（８リットル、４時間）および最後に溶液Ａ（
８リットル、１６時間）。各抽出物間で、この残渣を、１層のＭｉｒａｃｌｏｔ
ｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を介して濾過した。（＋）−ピノレジノール形成系
の可溶化は、１ＭのＮａＣｌを含む溶液（８リットル、４時間）中で、残渣を機
械的に攪拌することによって達成された。ホモジェネートをデカントして、そし
て得られた溶液を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびガラス
ファイバー（Ｇ６、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉ．）を介して連続的に濾過した。濾液
を、Ａｍｉｃｏｎ細胞（Ｍｏｄｅｌ ２０００、ＹＭ３０膜）中で濃縮した、約
８００ｍｌの最終体積にして、そして（ＮＨ４）２ＳＯ４分別に供した。４０％
と８０％との間で飽和で沈殿するタンパク質は、遠心分離（１５，０００ｇ、３
０分）によって回収され、そして（ＮＨ４）２ＳＯ４ペレットは、必要とされる
まで−２０℃で保存される。
【００８８】 （Ｍｏｎｏ Ｓカラムクロマトグラフィー）７８−ｋＤのディリジェントタン
パク質の精製およびオキシダーゼの部分精製。この硫酸アンモニウムペレット（
２ｋｇのＦ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ幹から得られる）を、６ＭのＮａＯＨ（溶液
Ｂ、３０ｍｌ）を用いてｐＨ５．０に調整した４０ｍＭのＭＥＳ［２−（Ｎ−モ
ルホリノ）エタンスルホン酸］緩衝液中において再構成させ、このスラリーを遠
心分離（３，６００ｇ、５分）し、そしてこの上清を、溶液Ｂ（４リットル）に
対して一晩透析した。この透析した抽出物を濾過（０．２２μｍ）し、そしてこ
のサンプル（３５〜４０ｍｇのタンパク質）を、４℃で溶液Ｂ中で平衡化したＭ
ｏｎｏ Ｓ ＨＲ５／５（５０ｍｍ×５ｍｍ）カラムに適用した。溶液Ｂ（１３
ｍｌ）で溶出（流速５ｍｌ 分−１ ｃｍ−１）した後、０〜１００ｍＭ（８ｍ
ｌ中）の直線勾配を使用するＮａ２ＳＯ４（溶液Ｂ中）でタンパク質を脱着し、
そして３２ｍｌの濃度で保持し、次いで、一連の工程勾配（１３３ｍＭ（５０ｍ
ｌ）、１６６ｍＭ（５０ｍｌ）、２００ｍＭ（４０ｍｌ）、２３３ｍＭ（４０ｍ
ｌ）および最後に３３３ｍＭＮａ２ＳＯ４（４０ｍｌ））を充填する。Ｅ−コニ
フェニルアルコールから（＋）−ピノレジノールを形成し得る画分を、３３３ｍ
ＭのＮａ２ＳＯ４で溶出し、合わせて、そして必要とされるまで保存した（−８
０℃）。
【００８９】 （ＰＯＲＯＳ ＳＰ−Ｍ基質カラムクロマトグラフィー（第１カラム））Ｍｏ
ｎｏＳ ＨＲ５／５カラム（３３ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４）からの１５個の溶出液の
画分（１８．５ｍｇのタンパク質、１８０ｍｌ）を合わせて、そして溶液Ｃに対
して一晩透析した。この透析した酵素溶液（１９０ｍｌ）を、濾過し（０．２２
μｍ）、そしてアリコート（４７ｍｌ）を、ＰＯＲＯＳ ＳＰ−Ｍカラムに適用
した。２５ｍＭのＭＥＳ−ＨＥＰＥＳ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０、溶液
Ｃ）中で予め平衡化された、ＰＯＲＰＳ ＳＰ−Ｍ基質上の全分離を、６０ｍｌ
分−１ ｃｍ−１の流速および室温で実施した。溶液Ｃ（１２ｍｌ）で溶出後
に、タンパク質を、溶液Ｃにおける直線Ｎａ２ＳＯ４勾配（０〜０．７Ｎ（６６
．５ｍｌ））で脱着し、確立した濃度を、さらに１６．６ｍｌに対して保持した
。これらの条件下で、４つの画分（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）の分離を、そ
れぞれ、約４０、４７、５５および６１ｍＳでそれぞれ達成した。この精製工程
を、残りの透析した酵素抽出物を用いて３回繰返し、そして各実験からの画分Ｉ
、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶをそれぞれ合わせた。プロテアーゼインヒビター［
すなわち、フェニルメタンスルホニルフロリド（０．１ｍｍｏｌ ｍｌ−１），
ＥＤＴＡ（０．５ｎｍｏｌ ｍｌ−１）、ペプスタチンＡ（１μｇ ｍｌ−１）
、およびアンチパイン（１μｇ ｍｌ−１）］を、可溶化および続く精製工程の
間に添加した場合、画分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶの溶出プロフィールにおい
て、違いが観測されなかった。
【００９０】 （ＰＯＲＯＳ ＳＰ−Ｍ基質カラムクロマトグラフィー（第２カラム））第１
ＰＯＲＯＳ ＳＰ−Ｍ基質カラムクロマトグラフィー工程からの画分Ｉ（２．６
２ｍｇのタンパク質、４０ｍｌ、約２４．６ｍＳ）を、伝導率が約８ｍＳ（最終
体積＝１５０ｍｌ）に到達するまで、濾過した冷却蒸留水中に希釈した。次いで
、この希釈したタンパク質溶液を、ＰＯＲＯＳ ＳＰ−Ｍカラム（１００ｍｍ×
４．６ｍｍ）に適用した。溶液Ｃ（１２ｍｌ）を用いて溶出後、画分Ｉを、直線
Ｎａ２ＳＯ４勾配（０〜０．２５Ｍ（２０ｍｌ中））で脱着し、確立した濃度を
、別の２５ｍｌに対して保持した。続いて、これを、別の直線Ｎａ２ＳＯ４勾配
（０〜０．７Ｎ（２６ｍｌ））で脱着し、次いで、これを、さらなる１６．６ｍ
ｌに対して０．７Ｍで保持した。約３０ｍＳで溶出する画分（この溶出液のイオ
ン強度は、フロー−スルー検出器を用いて測定される）を組合せて（１５ｍｌ、
１．３ｍｇ）、水で希釈し、そして再びクロマトグラフィーにかけた。得られた
タンパク質（上記の勾配を用いて約３０ｍＳで溶出）を、必要とされるまで保存
した（−８０℃）。
【００９１】 （ゲル濾過）画分Ｉのアリコート（５９５．５μｇのタンパク質、３ｍｌ、約
３０ｍＳで溶出）を、０．６ｍｌまで濃縮し（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０、Ａｍｉ
ｃｏｎ）、そして４℃で５０ｍＭのＮａ２ＳＯ４を含む０．１Ｍ ＭＥＳ−ＧＥ
ＯＥＳ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）中で平衡化された、Ｓ２００（７
３．２ｃｍ×１．６ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）ゲルクロマトグラフィ
ーカラムに充填した。明らかに均質な７８−ｋＤディリジェントタンパク質（２
４２μｇ）を、１３３ｍｌ（Ｖｏ＝１０５ｍｌ）で単一成分として溶出した（流
速０．２５ｍｌ 分−１ ｃｍ−２）。分子量を、標準タンパク質（β−アミロ
ース（２００，０００）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０，０００）、ウ
シ血清アルブミン（６６，０００）、オボアルブミン（４５，０００）、カルボ
ニックアンヒドラーゼ（２９，０００）およびシトクロムｃ（１２，４００））
を含む溶出プロフィールを比較することによって見積もった。
【００９２】 （実施例２） （精製したディリジェントタンパク質の特徴付け） （分子量および等電点の決定）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
を、Ｌｅａｍｍｌｉ緩衝系で、勾配（４〜１５％アクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）ゲルを用いて、変性条件および還元条件下で実施した。タンパク質を、銀染
色によって可視化した。画分Ｉのゲル濾過（Ｓ２００）クロマトグラフィーによ
り、ネイティブの分子量が約７８ｋＤのタンパク質を得、ここで、ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動は、約２７ｋＤに単一のバンドを示し、このことは、
このネイティブのタンパク質が三量体として存在することを示す。ポリアクリル
アミドゲルでのネイティブのタンパク質の等電集束法（ｐＨ３〜１０の勾配）は
、６つのバンドの存在を示した。等電集束法の後、これらのバンドの各を、ポリ
ビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロブロットし、そしてアミノ末
端配列決定に供し、これにより全てが一連のアイソフォームを示す類似の配列を
有することを証明した。このタンパク質の紫外線−可視光スペクトルは、約３３
０ｎｍにわずかに知覚できるショルダーを有する２８０ｎｍにおける特徴的なタ
ンパク質の吸収のみを有した。誘導結合型結晶（ＩＣＰ）分析は、このタンパク
質中に存在するいずれの金属の指標も示さなかった。従って、この７８ｋＤのデ
ィリジェントタンパク質は、いずれの検出可能な触媒活性の酸化中心も欠く。
【００９３】 （Ｅ−コニフェリルアルコールから（＋）ピノレジノールを形成する精製した
ディリジェントタンパク質の能力のアッセイ）第１のＰＯＲＯＳ ＳＰ−Ｍクロ
マトグラフィー工程（実施例１）からの４つの画分（Ｉ〜ＩＶ）を、別々に再び
クロマトグラフィーにかけ、続いて、各画分を、一時間、基質としてＥ−［９−３ Ｈ］コニフェリルアルコールを使用して、（＋）−ピノレジノール形成活性に
ついてアッセイした。画分Ｉ（ディリジェントタンパク質を含む）は、非常にわ
ずかな（＋）−ピノレジノール形成活性（全活性の５％未満は、ＰＯＲＯＳ Ｓ
Ｐ−Ｍカラムに負荷した）を示し、一方、画分ＩＩＩは、非特異的酸化的カップ
リングを触媒して、（±）−デヒドロジコニフェリルアルコール、（±）−ピノ
レジノール、および（±）エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール ８−Ｏ−
４’−コニフェリルアルコールエーテルを生成した。従って、画分ＩＩＩは、内
在性植物酸化タンパク質を含むようであった。
【００９４】 推定オキシダーゼ調製物（画分ＩＩＩ）は、電気泳動的に均一になるまで精製
されなかったが、このタンパク質調製物の電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）スペクトル
は、代表的な植物ラッカーゼ（すなわち、天然に存在する植物オキシダーゼタン
パク質のクラス）と類似していた。次いで、本発明者らは、それぞれ、オキシダ
ーゼ（画分ＩＩＩ）、７８ｋＤディリジェントタンパク質（画分Ｉ）、および画
分ＩＩと７８ｋＤタンパク質の両方の存在下における、Ｅ−［９−３Ｈ］コニフ
ェリルアルコール（２μｍｏｌ／ｍｌ、１４．７ｋＢｑ）の発生運命を研究した
。画分ＩＩＩの調製物のみを用いた場合、非特異的な生体分子ラジカルカップリ
ングのみが起こり、（±）−デヒドロジコニフェリルアルコール、（±）−ピノ
レジノールおよび（±）−エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール ８−Ｏ−
４’−コニフェリルアルコールエーテルを生じた。７８ｋＤタンパク質自体を用
いた場合、少量の（＋）−ピノレジノール形成（１０時間にわたって５％未満）
が観察され、これは、この調製物の酸化能力の微量の残留から生じると推定され
る。画分ＩＩＩと７８ｋＤタンパク質との両方を合わせた場合、生成物の十分な
触媒活性、ならびに位置特異性および立体特異性が再回復され、それにより本質
的に（＋）−ピノレジノールのみが形成した。さらに、画分ＩＩＩのみを用い、
そして画分ＩＩＩを７８ｋＤタンパク質と合わせた場合、基質消費速度および二
量体生成物形成速度はほとんど同じであった。さらに、試験した時間（８時間）
にわたって、オキシダーゼの存在下におけるいずれの場合においても、本質的に
二量体リグナン生成物のターンオーバーは起こらなかった：引き続く二量体の酸
化は、Ｅ−コニフェリルアルコールの場合には起こらず、好ましい基質はアッセ
イ混合物中になお存在する。従って、７８ｋＤタンパク質は、生体分子フェノキ
シラジカルカップリング反応の特異性を決定するようである。
【００９５】 任意の検出可能なタンパク質−タンパク質相互作用が立体選択性に起因し得る
か否かを確認するために、ゲル濾過研究をまた、ディリジェントタンパク質およ
び画分ＩＩＩのタンパク質の混合物を用いて行った。しかし、複合体形成（すな
わち、大きな分子サイズ実体）を支持する証拠は観察されなかった。
【００９６】 （実施例３） （植物ラッカーゼ触媒モノリグノール（ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌ）カップリング
に対する７８ＫＤディリジェントタンパク質の効果） （Ｅ−コニフェリルアルコールカップリングアッセイ）Ｅ−［９−３Ｈ］コニ
フェリルアルコール（４μｍｏｌ／ｍｌ、２９．３ｋＢｑ）を、以下のとおり、
ディリジェントタンパク質の存在下および非存在下で、２４時間にわたって、１
２０ｋＤのラッカーゼ（先にＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ幹組織
から精製した）と共にインキュベートした。各アッセイは、２５０μｌの総容量
までの緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ−ＨＥＰＥＳ−酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）
中のＥ−［９−３Ｈ］コニフェリルアルコール（４μｍｏｌ／ｍｌ、２９．３ｋ
Ｂｑ、７．３ＭＢｑ ｍｏｌ／ｌ；または２μｍｏｌ／ｍｌ、１４．７ｋＢｑ（
画分ＩＩＩを含む）、７８ｋＤディリジェントタンパク質、オキシダーゼまたは
酸化剤、またはその両方［最終濃度：７７０ｐｍｏｌ／ｍｌのディリジェントタ
ンパク質；１０．７ｐｍｏｌタンパク質／ｍｌのＦｏｒｓｙｔｈｉａラッカーゼ
；１２μｇタンパク質／ｍｌの画分ＩＩＩ；０．５μｍｏｌ／ｍｌのＦＭＮ；０
．５μｍｏｌ／ｍｌのＦＡＤ；１および１０μｍｏｌ／ｍｌのペルオキシ二硫酸
アンモニウム］からなった。Ｅ−［９−３Ｈ］コニフェリルアルコールを添加す
ることによって、酵素反応を開始した。コントロールは、緩衝液のみの存在下で
行った。
【００９７】 撹拌しながら３０℃で１時間インキュベートした後、このアッセイ混合物を（
±）ピノレジノール（７．５μｇ）、（±）−デヒドロジコニフェリルアルコー
ル（３．５μｇ）および放射化学的キャリアとしてのエリスロ／スレオ（±）−
グアヤシルグリセロール ８−Ｏ−４’−コニフェリルアルコールエーテル（７
．５μｇ）、および内部標準としてのフェルラ酸（１５．０μｇ）を含む酢酸エ
チル（ＥｔＯＡｃ、５００μｌ）で抽出した。遠心分離（１３，８００ｇ、５分
）の後、このＥｔＯＡｃに可溶な成分を除去し、そしてＥｔＯＡｃ（５００μｌ
）を用いる抽出手順を繰り返した。各アッセイからのＥｔＯＡｃに可溶な成分を
合わせ、この溶液を減圧下で乾固するまでエバポレートし、それらのアリコート
（５０μｌ）を含むメタノール−水溶液（１：１、１００μｌ）に再溶解し、逆
相カラムクロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ，Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ１８、１５
０ｍｍ×３．８ｍｍ）にかけた。溶離条件は以下のとおりであった：５．５ｍｌ
／分・ｃｍ２の流速で、０分から５分まで、水中アセトニトリル／３％酢酸、次
いで分と２０分との間、１０：９０の比まで直線勾配、次いで２０分と４５分と
の間２０：８０、最後に４５分と６０分との間５０：５０。
【００９８】 Ｅ−コニフェリルアルコール、エリスロ／スレオ（±）−グアヤシルグリセロ
ール ８−Ｏ−４’−コニフェリルアルコールエーテル、（±）−デヒドロジコ
ニフェリルアルコール、および（±）−ピノレジノールに相当する画分を別々に
回収し、アリコートを液体シンチレーションカウンターで除去し、そして残りを
凍結乾燥した。ピノレジノールを含有する画分をメタノール（１００μｌ）に再
溶解し、そしてヘキサンおよびエタノール（１：１）の溶液を移動相として使用
するキラルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｃｅｌ，Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ Ｏ
Ｄ、５０ｍｍ×４．６ｍｍ）（流速３ｍｌ／分・ｃｍ２）にかけ、一方、デヒド
ロジコニフェリルアルコールの画分をＣｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＦ（２５０ｍｍ×
４．６ｍｍ）カラムクロマトグラフィーにかけ、移動相としてのヘキサンおよび
イソプロパノール（９：１）の溶液で溶出（流相 ２．４ｍｌ／分・ｃｍ２）し
、溶離液の放射能を、フロースルーディテクター（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ
ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ，Ｍｏｄｅｌ Ａ１２０）で測定し
た。
【００９９】 （Ｅ−コニフェリルアルコールカップリングアッセイの結果）ラッカーゼのみ
と共にインキュベーションすることにより、ラセミ体の二量体生成物のみを、（
±）−デヒドロジコニフェリルアルコールと共に優勢に得た。しかし、ディリジ
ェントタンパク質の存在下において、このプロセスはここでは主に立体選択的で
あり、ラッカーゼのみが存在する場合に観察されたように、むしろ非特異的であ
る（＋）−ピノレジノールを与えた。Ｅ−コニフェリルアルコール（基質）の消
費速度および二量体リグナンの生成速度の両方は、ディリジェントタンパク質を
用いても用いなくても類似していた。実質的な差違は、Ｅ−コニフェリルアルコ
ール消費の後に観察されるリグナン生成物の後のターンオーバーにおいて示され
た。ラッカーゼのみを用いた場合、ターンオーバーは起こらなかったが、両方の
タンパク質が存在する場合、生成物の消失は顕著であった。この差違を理解する
ために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびオボアルブミンを別々に、ラッカ
ーゼ含有溶液に、ディリジェントタンパク質の重量濃度と一致するレベルで添加
した。このように、生成物のターンオーバーの差違は、単に高いタンパク質濃度
におけるラッカーゼの活性の安定化に起因するが、興味深いことに、ディリジェ
ントタンパク質、ＢＳＡおよびオボアルブミンは、いくぶん異なる程度の保護を
与えた。真菌ラッカーゼ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ由来）が植
物ラッカーゼの代わりに使用される場合、この知見は非常に比較可能であった。
酸化能力（すなわち、ラッカーゼ濃度）が５倍低くなる場合、(+)-ピノレジノー
ル形成のみが観察された。従って、完全な立体選択性は、酸化能力が、ディリジ
ェントタンパク質が飽和される点を超えない場合に保存される。
【０１００】 （立体選択的Ｅ−コニフェリルアルコールカップリング）Ｅ−［９−２Ｈ２，
ＯＣ２Ｈ３］コニフェリルアルコールおよびディリジェントタンパク質をラッカ
ーゼの存在下で用いて、以下のようにアッセイを行った。２５０μｌの総容量中
、Ｅ−［９−２Ｈ２，ＯＣ２Ｈ３］コニフェリルアルコール（２μｍｏｌ／ｍｌ
）を、ディリジェントタンパク質（７７０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、精製した植物ラッ
カーゼ（４．１ｐｍｏｌ／ｍｌ）、および緩衝液（０．１Ｍ ＭＥＳ−ＨＥＰＥ
Ｓ−酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）の存在下でインキュベートした。１時間のイ
ンキュベーションの後、この反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出したが、内部標準お
よび放射性キャリアは省いた。逆相カラムクロマトグラフィーの後、酵素的に形
成されたピノレジノールを収集し、凍結乾燥し、メタノール（１００μｌ）に再
溶解し、そしてキラルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｃｅｌ，Ｃｈｉｒａｌ
ｃｅｌ ＯＤ，５０ｍｍ×４．６ｍｍ）にかけ、２８０ｎｍで検出し、そしてＥ
Ｉモードの質量スペクトル分離（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｓｙｓｔ
ｅｍ）により分析した。得られた（＋）−ピノレジノール（９９％より大きい鏡
像体過剰率）の液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＬＣ−ＭＳ）分析は、質
量対電荷比（ｍ／ｚ）２６８を有する分子イオンを与え、従って、１０の２Ｈ原
子の存在を証明し、そしてＥ−［９−２Ｈ２，ＯＣ２Ｈ３］コニフェリルアルコ
ールのラッカーゼおよびディリジェントタンパク質触媒立体選択的カップリング
を共に確証した。
【０１０１】 他の補助的な一電子酸化剤はまた、ディリジェントタンパク質との立体選択的
カップリングを促進し得る。ペルオキシ二硫酸アンモニウムは、ホモリテック開
裂を容易に受け（Ａ．Ｕｓａｉｔｉｓ，Ｒ．Ｍａｋｕｓｋａ，Ｐｏｌｙｍｅｒ
３５：４８９６（１９９４））、そしてアクリルアミド重合において一電子酸化
剤として慣用的に使用される。ペルオキシ二硫酸アンモニウムを、初めにＥ−［
９−３Ｈ］コニフェリルアルコール（４μｍｏｌ／ｍｌ，２９．３ｋＢｑ）と共
に、上記のＥ−コニフェリルアルコールカップリングアッセイを使用して、６時
間インキュベートした。非特異的生体分子ラジカルカップリングが観察され、（
±）−デヒドロジコニフェリルアルコールならびに他のラセミ体のリグナンが優
先的に得られた（表１）。しかし、ディリジェントタンパク質が添加された場合
、カップリングの立体選択性は、劇的に変化して、両方の濃度において、少量の
ラセミ体のリグナンと共に、（＋）−ピノレジノールが主に得られた。これは、
無機酸化剤（例えば、ペルオキシ二硫酸アンモニウム）が、画分ＩＩＩオキシダ
ーゼまたはラッカーゼの場合と同様に、選択的にモノリグノールに酸化される場
合でさえ、これはディリジェントタンパク質の存在下において（＋）−ピノレジ
ノール合成を促進し得ることを証明した。
【０１０２】
【表１】 （Ｅ−コニフェリルアルコールから（＋）−ピノレジノールへの立体特異的変
換に対する他の酸化剤の効果）フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびフラ
ビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）と共にＥ−コニフェリルアルコール（
４μｍｏｌ／ｍｌ、２９．３ｋＢｑ）をインキュベートする効果を研究した。な
ぜなら、それらの酵素補因子としての役割に加えて、これらはまた様々な有機基
質を酸化し得るからである（Ｔ．Ｃ．Ｂｒｕｉｃｅ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ
．１３：２５６（１９８０））。Ｅ−［９−３Ｈ］コニフェリルアルコールを、
それぞれ、ＦＭＮおよびＦＡＤと共に、４８時間インキュベートした。ＦＭＮを
得るために、ヘビ（Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ、Ｆｏｒｍｏｓａｎコブラ）
の毒液を、ＦＡＤ（Ｈ２Ｏ中５μｍｏｌ／ｍｌ）に添加し、そして３０℃で３０
分間インキュベートした後、酵素的に形成したＦＭＮを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１
０（Ａｍｉｃｏｎ）マイクロ濃縮機を通して濾過することによって、このタンパ
ク質混合物から分離した。全ての場合において、Ｅ−コニフェリルアルコールの
酸化は、ＦＡＤよりＦＭＮの存在下でより迅速であった。Ｅ−コニフェリルアル
コール酸化のＦＭＮＳＨＫ触媒速度とＦＡＤ触媒速度との間のこれらの差違は予
測されなかったが、一貫したパターンが確認された：ラセミ体のリグナン生成物
が、下記のように、（±）−デヒドロジコニフェリルアルコールと共に優先的に
得られた。時間経過がディリジェントタンパク質の存在下で繰り返された場合、
立体選択性の劇的な変化が観察され、ここで、実質的に（＋）−ピノレジノール
形成のみが起こった。また、Ｅ−コニフェリルアルコール消費の速度は、ディリ
ジェントタンパク質調製物中におけるわずかな残りの酸化能力（１０時間にわた
って５％未満）について調整した場合、これは形成された二量体の総量であるよ
うに、［ＦＭＮ］および［ＦＡＤ］にのみ依存した。Ｅ−コニフェリルアルコー
ルの十分な消費が起こる場合、対応するリグナン二量体は時間の関数として酸化
的変化を受け始め得た；Ｅ−コニフェリルアルコールが十分にされた後に、開放
溶液（ｏｐｅｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）において、特に、ＦＭＮがピノレジノール
を続いて酸化し得る。
【０１０３】 （基質特異的立体選択性の研究）カップリングの立体選択性は基質特異的であ
った。Ｅ−ｐ−［９−３Ｈ］クマリル（４μｍｏｌ／ｍｌ、４４．５ｋＢｑ）も
Ｅ−［８−１４Ｃ］シナピルアルコール（４μｍｏｌ／ｍｌ、８．３ｋＢｑ）（
これらは芳香族環上のメトキシ基置換基だけＥ−コニフェリルアルコール異なる
）も、ディリジェントタンパク質の存在下および非存在下においてそれぞれＦＭ
Ｎおよびペルオキシ二硫酸アンモニウムと共に６時間インキュベートした場合、
立体選択的生成物を生成しなかった。インキュベーションは、以下のように変更
して、上記のようにして行った：Ｅ−ｐ−［９−３Ｈ］クマリル（４μｍｏｌ／
ｍｌ、４４．５ｋＢｑ）またはＥ−［８−１４Ｃ］シナピルアルコール（４μｍ
ｏｌ／ｍｌ、８．３ｋＢｑ）を基質として使用し、そして３０℃で６時間インキ
ュベートした後、この反応混合物をＥｔＯＡｃで抽出したが、放射性キャリアは
添加しなかった。Ｅ−シナピルアルコールは、容易にカップリングを受けて、シ
リングアレジノール（ｓｙｒｉｎｇａｒｅｓｉｎｏｌ）を与えたが、キラルＨＰ
ＬＣ分析は、得られた生成物は、全ての場合において、ラセミ体であることを示
した（表２）。興味深いことに、７８ｋＤディリジェントタンパク質調製物自体
は、上記のように、低レベルの二量体形成を触媒したが、ラセミ体の（±）−シ
リングアレジノール形成のみを生じ、これはおそらく、タンパク質調製物中に存
在する残りの微量の混入酸化能力の結果である。
【０１０４】 類似の様式において、Ｅ−ｐ−クマリルアルコールを基質として使用した場合
には、立体選択的カップリングは観察されなかった。すなわち、Ｅ−コニフェリ
ルアルコールは、ディリジェントタンパク質の存在下で立体選択的カップリング
を受ける。Ｅ−コニフェリルアルコールに対するディリジェントタンパク質の著
しい基質特異性を仮定すると、将来的に、Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ
において（＋）−シリングアレジノールを与えるものとどのように異なるかを決
定することに非常に興味が持たれる（Ｔ．Ｄｅｙａｍａ，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ
．Ｂｕｌｌ．３１，２９９３（１９８３））。
【０１０５】 （表２） （Ｅ−シナピルアルコールのカップリングに対するディリジェントタンパク質
の効果（６時間のアッセイ））
【０１０６】
【表２】 本発明は、立体選択的カップリングの任意の特定の機構によって束縛されるこ
とを意図しないが、３つの異なる可能性が考えられ得る。おそらく、オキシダー
ゼまたは酸化剤がＥ−コニフェリルアルコールからフリーラジカル種を生成し、
そして後者は、カップリングの前にディリジェントタンパク質に結合する真の基
質である。他の２つの可能性は、Ｅ−コニフェリルアルコール分子が結合しそし
てディリジェントタンパク質上で配向され、それにより（＋）−ピノレジノール
形成が引き続く酸化カップリングの際に起こることを必要とする：これは両方の
基質のフェノールヒドロキシル基が、オキシダーゼまたは酸化剤によって容易に
酸化され得るように暴露された場合、またはオキシダーゼまたは酸化剤とディリ
ジェントタンパク質の電子受容部位（単数または複数）との間で電子移動機構が
作用する場合のいずれかで起こり得る。
【０１０７】 これら３つの代替の機構の中で、３つのラインの証拠は、タンパク質によるフ
ェノキシラジカル中間体の「捕獲」を支持する。第１に、基質消費および生成物
形成の両方の速度は、ディリジェントタンパク質の存在によって大きくは影響さ
れない。フリーラジカル中間体の捕獲が作用的な機構である場合、このディリジ
ェントタンパク質は、コニフェリルアルコールの一電子酸化が律速である場合の
カップリングの特異性に影響を与えるに過ぎない。第２に、電子移動機構は現在
除外されている。なぜなら、本発明者らは、酸化条件下で、補助的なオキシダー
ゼまたは酸化剤の存在下または非存在下のいずれかで新しい紫外線−可視光発色
団を観察しなかったからである。第３に、予備的な動力学的データ（実施例４に
開示されるような）は、ディリジェントタンパク質のみを用いた場合、および様
々なオキシダーゼまたは酸化剤の存在下における、Ｅ−コニフェリルアルコール
から（＋）−ピノレジノールへの変換を特徴付けるミハエリス定数（Ｋｍ）およ
び最大速度（Ｖｍａｘ）の形式値に基づくフリーラジカル捕獲の概念を支持する
。
【０１０８】 （実施例４） （ディリジェントタンパク質および酸化剤の存在下におけるＥ−コニフェリル
アルコールから（＋）−ピノレジノールへの変換の動力学的特徴付け） 一連のＥ−［９−３Ｈ］コニフェリルアルコールの濃度（８．００μｍｏｌ／
ｍｌと０．１３μｍｏｌ／ｍｌとの間、７．３ＭＢｑｍｏｌ／ｌ）をディリジェ
ントタンパク質（７７０ｐｍｏｌ／ｍｌ）のみと共に、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａラッ
カーゼ（２．１ｐｍｏｌ／ｍｌ）、画分ＩＩＩ（１２μｇタンパク質／ｍｌ）、
またはＦＭＮ（０．５μｍｏｌ／ｍｌ）の存在下でインキュベートすることによ
って、実施例３に記載されるようなアッセイを実施した。ディリジェントタンパ
ク質と共にＦＭＮの存在下または非存在下でアッセイを、３０℃で１時間インキ
ュベートし、一方、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａラッカーゼまたは画分ＩＩＩと共にディ
リジェントタンパク質の存在下または非存在下でアッセイを、３０℃で１５分間
インキュベートした。ディリジェントタンパク質によるフリーラジカル捕獲は、
作用的機構であり、得られるミカエリス−メンテンパラメーターは、真の値より
も形式的な値のみを表した。なぜなら、Ｅ−コニフェリルアルコールから（＋）
−ピノレジノールの変換の間の最も高い自由エネルギー中間状態は、未だ知られ
ておらず、そして開放溶液中の基質の濃度と対応する中間体のフリーラジカルの
濃度との間の関係は、示されていないからである。
【０１０９】 これらの限定に留意して、本発明者らは、ディリジェントタンパク質調製物の
形式Ｋｍ値およびＶｍａｘ値を推測した。上記のように、微量の混入酸化能力の
ために、低レベルのＥ−コニフェリルアルコールからの（＋）−ピノレジノール
、およびＥ−シナピルアルコールからの（±）−シリングアレジノールの両方の
生成を生じることが可能である。この調製物（表３）を用いて、１０±６ｍＭの
形式Ｋｍおよび０．０２±０．０２ｍｏｌ／ｓのＶｍａｘが得られた。しかし、
画分ＩＩＩ、ラッカーゼおよびＦＭＮを添加した場合、形式Ｋｍ値（ｍＭ）は、
それぞれ、１．６±０．３、０．１００±０．００３、および０．１０±０．０
１に減少し、一方、Ｖｍａｘ値は、補助的なオキシダーゼ／酸化剤のこれらの濃
度においてはそれほど影響を受けなかった。
【０１１０】 形式Ｋｍ値およびＶｍａｘ値を、ラッカーゼ３つのラセミ体のリグナンへのＥ
−コニフェリルアルコールの変換に関して、ラッカーゼおよび画分ＩＩＩオキシ
ダーゼについて計算した。しかし、７８ｋＤタンパク質との直接比較は行わない
。なぜなら、この形式Ｋｍ値は、対応するオキシダーゼのみを含むからである。
完全性のために、このＫｍ（ｍＭ）およびＶｍａｘ（ｍｏｌ／ｓ・ｍｏｌ酵素）
は以下のとおりである：ラッカーゼについて、０．２００±０．００１およびエ
リスロ／スレオグアヤシルグリセロール ８−Ｏ−４’−コニフェリルアルコー
ルエーテルについて、３．９±０．２、（±）−デヒドロジコニフェリルアルコ
ールについて、０．３０００±０．０００３および１３．１±０．６、ならびに
（±）−ピノレジノールについて、０．３００±０．００２および７．５４±０
．５０；画分ＩＩＩオキシダーゼ（８０ｋＤａの本来の分子量を有すると予測さ
れる）について、（±）−エリスロ／スレオグアヤシルグリセロール ８−Ｏ−
４’−コニフェリルアルコールエーテルについて、２．２±０．３および０．２
０±０．０３、（±）−デヒドロジコニフェリルアルコールについて２．２±０
．２および０．７±０．１、ならびに（±）−ピノレジノールについて３．７±
０．７および０．６±０．１。
【０１１１】 これらの予備的な動力学的パラメーターは、ディリジェントタンパク質が画分
ＩＩＩ、ラッカーゼおよびＦＭＮの存在下におけるＥ−コニフェリルアルコール
の消費速度に実質的に影響を与えないという知見と一致する。両方の結果のセッ
トは共に、フリーラジカル中間体（これは次いで、立体選択的カップリングを受
ける）を捕獲することによって、ディリジェントタンパク質が機能する作用機構
に従う。
【０１１２】 （表３） Ｅ−コニフェリルアルコールからの（＋）−ピノレジノール形成の間のディリ
ジェントタンパク質（７７０ｐｍｏｌ／ｍｌ）の形式ＫｍおよびＶｍａｘに対す
る様々な酸化剤の効果
【０１１３】
【表３】 （実施例５） （Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のディリジェントタンパク
質ｃＤＮＡのクローニング） 植物材料−Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ植物は、Ｂａｉｌｅｙ
’ｓ Ｎｕｒｓｅｒｙ（ｖａｒ．Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｔ．，Ｐａｕｌ
，ＭＮ）から入手し、そしてＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙの温室施設で維持するか、または地域社会からの贈り物であるかのいず
れかであった。
【０１１４】 材料−使用した全ての溶媒および化学物質は、試薬またはＨＰＬＣ等級であっ
た。Ｔａｑ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをＰｒｏｍｅｇａから入手し、一方、制限
酵素をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＨａｅＩＩＩ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ（Ｓａｕ３ａ）およびＰｒｏｍｅｇａ（ＴａｑＩ）から入手した。ｐＴ
７Ｂｌｕｅ Ｔベクターおよび成分ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞をＮｏｖａｇｅｎから
購入し、そして放射標識ヌクレオチド（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）をＤｕＰｏｎ
ｔ ＮＥＮから購入した。
【０１１５】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定のためのオリゴヌクレオチド
プライマーを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによ
って合成した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ（登録商標）キット（ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．）を、ＰＣＲフラグメントの精製に使用し、ゲル精製ＤＮＡの濃度を
、１．５％アガロースゲル中のｌｏｗ ＤＮＡ ｍａｓｓ ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉ
ｂｃｏ ＢＲＬ）との比較によって決定した。
【０１１６】 計器−ＵＶ（ＯＤ２６０でのＲＮＡおよびＤＮＡの決定を含む）スペクトルを
、λ６ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計に記録した。Ｔｅｍｐｔｒｏｎｉｃ ＩＩサー
モサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）を、全てのＰＣＲ増幅のために使用した
。配列決定のためのＤＮＡの精製には、ＱＩＡｗｅｌｌ Ｐｌｕｓプラスミド精
製システム（ＱＩＡＧＥＮ）、続いてＰＥＧ沈澱を用い（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ
．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９９４）Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，３ ｖｏｌｕｍｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、
ＤＮＡ配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３７３Ａ自動配
列決定装置を使用して決定した。アミノ酸配列を、製造者の指示に従って、オン
ラインＨＰＬＣ検出を用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓタンパク質
配列決定装置を使用して得た。
【０１１７】 ディリジェントタンパク質アミノ酸の配列決定−ディリジェントタンパク質の
Ｎ末端アミノ酸配列（配列番号１）を、オンラインＨＰＬＣ検出を用いてＡｐｐ
ｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓタンパク質配列決定装置を使用して、精製タン
パク質から得た。トリプシン消化のために、精製した酵素（１５０ｐｍｏｌ）を
０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０μｌ，ｐＨ８．５，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ，配列決定等級）中に懸濁し、７７．５μｌ中８Ｍの最終濃度
を得るように尿素を添加した。この混合物を５０℃で１５分間インキュベートし
、続いて１００ｍＭのヨードアセトアミド（２．５μｌ）を添加し、この全体を
室温で１５分間維持した。次いで、トリプシン（２０μｌ中１μｇ）を添加し、
この混合物を３７℃で２４時間消化し、続いて酵素反応を止めるためにＴＦＡ（
４μ１）を添加した。得られた混合物を、逆相ＨＰＬＣ分析（Ｃ−８カラム，Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）に供し、これを０〜１００％のアセトニト
リル（０．１％ＴＦＡ中）の直線勾配で、０．２ｍｌ／分の流速で２時間にわた
って溶出し、２８０ｎｍで検出した。個々のオリゴペプチドピークを含む画分を
手動で集め、そして直接アミノ酸配列決定に供した（配列番号２〜７）。
【０１１８】 Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの幹ｃＤＮＡライブラリーの合成
−総ＲＮＡ（新鮮な質量１ｇ当たり〜３００μｇ）を、温室で成長したＦｏｒｓ
ｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ植物（ｖａｒ．Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ）
の若い緑色の幹から得た（Ｄｏｎｇ，Ｚ．Ｄ．，およびＤｕｎｓｔａｎ，Ｄ．Ｉ
．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １５：５１６−５２１
）。Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ幹ｃＤＮＡライブラリーを、最
初のライブラリーについて１．２×１０６ＰＦＵの力価で、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（
登録商標）合成キット、Ｕｎｉ−ＺＡＰＴＭ ＸＲベクターおよびＧｉｇａｐａ
ｃｋ（登録商標）ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）を用いて、５μｇの精製したポリＡ＋ｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴＴＭ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，ＱＩＡＧＥＮ）を使用して構築した。増幅したライブ
ラリー（１．２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ；合計１５８ｍｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，Ｊ．ら，前出）の一部（３０ｍｌ）を、ＰＣＲのための純粋なｃＤＮＡライブ
ラリーＤＮＡを得るために使用した（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，
Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｎａｍ，
Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，およびＳｔｒｕｈｌ，Ｋ．（１９９１）Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，２ ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）。
【０１１９】 ディリジェントタンパク質ＤＮＡプローブの合成−Ｎ末端および内部のペプチ
ドアミノ酸配列を、変性オリゴヌクレオチドプライマーを構築するために使用し
た。精製したＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ（５ｎｇ
）を、プライマーＰＳＩＮＴ１（配列番号８）（１００ｐｍｏｌ）、およびプラ
イマーＰＳＩ７Ｒ（配列番号１１）（２０ｐｍｏｌ）、プライマーＰＳＩ２Ｒ（
配列番号１０）（２０ｐｍｏｌ）またはプライマーＰＳＩ１Ｒ（配列番号９）（
２０ｐｍｏｌ）のいずれかと共に、１００μｌのＰＣＲ反応物（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］，５０ｍＭ ＫＣｌ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００，２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２，各０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５単位
のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）中でテンプレートとして使用した。ＰＣＲ増幅
を、サーモサイクラーで以下のように行った：９４℃で１分、５０℃で２分、７
２℃で３分の３５サイクル；７２℃で５分、および最終サイクルの後に４℃で漠
然と（ｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅ）保持した。単一プライマー、テンプレートのみ、
およびプライマーのみの反応を、コントロールとして行った。ＰＣＲ産物を、１
．５％アガロースゲルに溶解し、ここで各反応について単一のバンド（それぞれ
、〜３７０ｂｐ、〜１５５ｂｐまたは〜１２５ｂｐ）が観察された。
【０１２０】 増幅したバンドのヌクレオチド配列を決定するために、５つの１００μｌのＰ
ＣＲ反応を、ＰＳＩＮＴ１（配列番号８）＋ＰＳＩ７Ｒ（配列番号１１）、ＰＳ
ＩＮＴ１（配列番号８）＋ＰＳＩ２Ｒ（配列番号１０）およびＰＳＩＮＴ１（配
列番号８）＋ＰＳＩ１Ｒ（配列番号９）プライマー対を用いて上記のように行っ
た。各プライマー対からの５つの反応物を濃縮し（Ｍｉｃｒｏｎ ３０，Ａｍｉ
ｃｏｎ Ｉｎｃ．）、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ；２×２００μｌ）で洗浄し、このＰＣＲ産物を引き
続いてＴＥ緩衝液（２×５０μｌ）に戻した。これらを、調製用１．５％アガロ
ースゲルに溶解した。次いで、各々のゲル精製したＰＣＲ産物（〜０．２ｐｍｏ
ｌ）を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクターに連結し、そしてＮｏｖａｇｅｎの指示に
従って成分ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換した。挿入サイズを、急速沸騰溶解
およびＰＣＲ技術（Ｒ２０マーおよびＵ１９マーのプライマーを用いる）を使用
して、製造者の指示に従って決定した。上記のプライマー対の各々を用いる産物
由来の全ての挿入物が同じであるか否かを決定するために、制限分析を以下のよ
うに行った：１００μｌのＰＣＲ反応物（Ｒ２０マー（配列番号７４）およびＵ
１９マー（配列番号７５）のプライマーを用いて増幅された目的の挿入物）の各
々２０μｌに、４単位のＨａｅＩＩＩ、１．５単位のＳａｕ３ａ、または５単位
のＴａｑＩ制限酵素を添加した。ＨａｅＩＩＩおよびＳａｕ３Ａについては３７
℃、そしてＴａｑＩ反応物については６５℃で、６０分間制限消化を行った。制
限産物を１．５％アガロースゲルに溶解して、試験した各挿入物について１つの
制限グループを生じた。ＰＳＩＮＴ１（配列番号８）＋ＰＳＩ７Ｒ（配列番号１
１）由来の５つの組換えプラスミド（ｐＴ７ＰＳＩ１−ｐＴ７ＰＳＩ５という）
、およびＰＳＩＮＴ１（配列番号８）＋ＰＳＩ２Ｒ（配列番号１０）ＰＣＲ産物
由来の２つの組換えプラスミド（ｐＴ７ＰＳＩ６およびｐＴ７ＰＳＩ７という）
を、ＤＮＡ配列決定のために選択した；この全ては、同じオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）（配列番号６９）を含んだ。次に、このディリジェントタン
パク質プローブを、以下のように構築した：５つの１００μｌのＰＣＲ反応を、
プライマーＰＳＩＮＴ１（配列番号８）およびＰＳＩ７Ｒ（配列番号１１）を用
いて、１０ｎｇのｐＴ７ＰＳＩ１ ＤＮＡ（配列番号６９）を使用して上記のよ
うに行った。ＰｈａｒｍａｃｉａのＴ７ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅ（登録商標）キッ
トおよび［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いて、キットの指示書に従って、ゲル精製
したｐＴ７ＰＳＩ１挿入物（５０ｎｇ）を使用して、放射標識プローブ（０．１
ｍｌ中）を生成し、これをＢｉｏＳｐｉｎ ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で精
製し、そしてキャリアＤＮＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ共有サケ精子ＤＮＡ［Ｓｉｇｍ
ａ］、０．９ｍｌ）に加えた。
【０１２１】 ライブラリーのスクリーニング−６００，０００ＰＦＵのＦ．ｉｎｔｅｒｍｅ
ｄｉａ増幅ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの指示に従って最初
のスクリーニングのためにプレーティングした。プラークを、Ｍａｇｎａ Ｎｙ
ｌｏｎ膜サークル（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）にブロ
ットし、次いでこれを風乾した。この膜をＷｈａｔｍａｎ（登録商標）３ＭＭ
Ｃｈｒ紙の２つの層の間に配置した。ｃＤＮＡライブラリーのファージＤＮＡを
この膜に固定し、そして１００℃で２分間オートクレービングし、急速に排気す
ることによって、１工程で変性した。この膜を６×標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ
）および０．１％のＳＤＳ中、３７℃で３０分間洗浄し、そして結晶化皿（１９
０×７５ｍｍ）中の予熱した６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳおよび５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ試薬（ハイブリダイゼーション溶液，３００ｍｌ）中、５７〜５８℃で
、緩やかに振盪しながら５時間プレハイブリダイズした。この［３２Ｐ］放射標
識プローブを変性し（沸騰、１０分）、急速に冷却し（氷、１５分）、そして結
晶化皿（１５０×７５ｍｍ）中の予熱した新鮮なハイブリダイゼーション溶液（
６０ｍｌ，５８℃）に添加した。このプレハイブリダイズした膜を、次にこの皿
に加え、次いでこれをラップで覆った。ゆっくり振盪しながら、ハイブリダイゼ
ーションを５７〜５８℃で１８時間行った。この膜を、室温で４×ＳＳＣおよび
０．５％ ＳＤＳで５分間洗浄し、２×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤＳ（室温）
に移し、そして乾燥を防ぐためにラップで覆い、ゆっくり振盪しならが５７〜５
８℃で２０分間インキュベートし、そして最後に増感スクリーンを用いて−８０
℃で２４時間、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに暴露した。２０の陽
性プラークを、上記のようなハイブリダイゼーション条件で、さらに２ラウンド
のスクリーニングを介して精製した。
【０１２２】 ディリジェントタンパク質ｃＤＮＡ含有プラスミドのインビボ切除および配列
決定−精製したｃＤＮＡクローンを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのインビボ切除プロ
トコル後のファージからレスキューした。ディリジェントタンパク質をコードす
るいくつかの異なるｃＤＮＡの両方の鎖を、重複する配列決定プライマーを使用
して完全に配列決定した。２つの異なるｃＤＮＡを同定し、ｐＰＳＤ＿Ｆｉ１（
配列番号１２）およびｐＰＳＤ＿Ｆｉ２（配列番号１４）と呼ぶ。
【０１２３】 配列分析−ＤＮＡおよびアミノ酸配列の分析を、Ｕｎｉｘ（登録商標）ベース
のＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａ
ｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ
８，１９９４年９月，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７
５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳ
Ａ ５３７１１；Ｒｉｃｅ，Ｐ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ
ｆｏｒ ｔｈｅ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ，Ｔｈｅ
Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｈａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ
，ＣＢ１０ １Ｒｑ，Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉ
ｄｅ Ｗｅｂの分子生物学サーバー（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈ
ｏｓｐｉｔａｌおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖ
ａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して行った。
【０１２４】 （実施例６） （Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおける機能的なディリジェ
ントタンパク質の発現） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける機能的なディリジェントタンパク
質を発現させる試みは失敗に終わった。結果的に、本発明者らは、バキュロウイ
ルス発現系を用いて、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａにおいてデ
ィリジェントタンパク質を発現した。５’および３’の両方の非翻訳領域を含む
、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ中のディリジェントタンパク質（ＰＳＤ）のための
全長１．２ｋｂのｃＤＮＡクローンを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ Ｉお
よびＸｈｏ Ｉを使用して、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
誘導体化プラスミドｐＰＳＤ＿Ｆｉ１（配列番号１２）から切除した。この１．
２ｋｂのフラグメントを、バキュロウイルス転移ベクターｐＢｌｕｅＢａｃ４（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の多重クローニング部位の
これらの同じ制限部位に特異的にサブクローニングした。これは、非融合ディリ
ジェントタンパク質を生成する６．０ｋｂの構築物ｐＢＢ４／ＰＳＤを生成し、
翻訳はこのディリジェントタンパク質のｃＤＮＡ開始コドンで始まる。次いで、
この構築物を、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクションの技術によって
、直線化されたＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞に同時トランスフェ
クトして、相同組換えによって組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ核の多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡ Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅデ
ィリジェントタンパク質（ＢＢ／ＰＳＤ）を生成し、これをＩｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎによって記載される手順に従ってプラークから精製した。この最終組換えＡｃ
ＭＮＰＶ−ＢＢ／ＰＳＤは、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモータ
ーの制御下でＰＳＤ遺伝子を含み、そして組換えウイルスの複製に必要な必須配
列を含む。ディリジェントタンパク質が昆虫細胞培養物において首尾良く発現さ
れることを確認するために、ＡｃＭＮＰＶ−ＰＳＤ組換えウイルス高力価ストッ
クに感染した誘導期Ｓｆ９細胞を使用して、異種タンパク質産生物を得た。ディ
リジェントタンパク質の最大産生は、感染後４８〜７０時間で起こった。ＳＤＳ
−ＰＡＧＥおよび（＋）−ピノレジノール形成活性によって決定されるように、
このタンパク質が培地に分泌されたことが見出され、そして分子量およびＦｏｒ
ｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａから本来単離される常在タンパク質に対応
する活性を示す。
【０１２５】 （実施例７） （Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａおよびＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ
からのディリジェントタンパク質クローンの単離） Ｆｏｒｓｙｔｈｉａディリジェントタンパク質ｃＤＮＡ、ｐｓｄ−Ｆｉ１（配
列番号１２）のコード領域を、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａおよびＴｓｕｇａ
ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａからｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため
に使用した。ハイブリダイゼーションを４５〜５０℃で行ったことを除いて、こ
の条件および方法は実施例５に開示の通りである。２つのディリジェントタンパ
ク質ｃＤＮＡを、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａから単離し（配列番号
１６、１８）、そして８つのディリジェントタンパク質ｃＤＮＡをＴｈｕｊａ
ｐｌｉｃａｔａから単離した（配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、
３２、３４）。
【０１２６】 （実施例８） （Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａからのピノレジノール／ラリシ
レジノールレダクターゼの精製） （植物材料）Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ植物は、Ｂａｉｌｅ
ｙ’ｓ Ｎｕｒｓｅｒｙ（ｖａｒ．Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｔ．，Ｐａｕ
ｌ，ＭＮ）から入手し、そしてＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙの温室設備で維持するか、または地域社会からの贈り物であるかのい
ずれかであった。
【０１２７】 （材料）使用した全ての材料および化学物質は、試薬またはＨＰＬＣ等級であ
った。非標識（±）−ピノレジノールおよび（±）−ラリシレジノールを、記載
されるように合成した（Ｋａｔａｙａｍａ，Ｔ．ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ３２：５８１−５９１（１９９３））。［４Ｒ−３Ｈ］ＮＡＤＰＨを、Ｍ
ｏｒａｎらの手順（Ｍｏｒａｎ，Ｒ．Ｇ．ら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３
８：１９６−２０４（１９８４））の改変によって、以前に報告される（Ｃｈｕ
，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７０２６−２７０３３（１９９
３））ように入手し、そして［４Ｒ−２Ｈ］ＮＡＤＰＨを、Ａｎｄｅｒｓｏｎお
よびＬｉｎ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．，およびＬｉｎ Ｂ．Ｋ．，Ｐｈｙｔ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：８１１−８１２（１９９３））に従って調製した
。酵母グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＸ型，２２．３２．
ｍｍｏｌ ｈ−１ｍｇ−１）および酵母ヘキソキナーぜ（Ｆ３００型，１５．１
２ ｍｍｏｌ−１ ｍｇ−１）をＳｉｇｍａから購入し、そしてジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ，３３．４８ｍｍｏｌ
ｈ−１ ｍｇ−１）をＢｉｏｐｕｒｅ Ｃｏから入手した。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ
Ｂｌｕｅ Ｇｅｌ（１００−２００メッシュ）およびＢｉｏ−Ｇｅｌ ＨＴヒド
ロキシアパタイトを、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入し、一方、フェニルセファロース
ＣＬ−４Ｂ、ＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５、ＭｏｎｏＰ ＨＲ ５／２０、Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、ＰＤ−１
０カラム、分子量標準物質およびＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ ７４を、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃから入手した。アデノシ
ン２’，５’−ジホスフェートセファロースおよびＲｅａｃｔｉｖｅ Ｙｅｌｌ
ｏｗ ３アガロースを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から得た。
【０１２８】 （計器）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（３００および５００ＭＨｚ）を、それぞ
れＣＤＣｌ３を溶媒として用いてＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ３００およびＶａｒｉａ
ｎ ＶＸＲ５００Ｓ分光計で記録し、化学シフト（δ ｐｐｍ）を、テトラメチ
ルシラン（内部標準物質）からの低磁場で記録した。ＵＶ（ＯＤ２６０でのＲＮ
ＡおよびＤＮＡの決定を含む）および質量スペクトルを、それぞれλ６ ＵＶ／
ＶＩＳおよびＶＧ ７０７０Ｅ（イオン化電圧７０ｅＶ）分光光度計で得た。高
速液体クロマトグラフィーは、逆層カラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｎｏｖａ−ｐａｋ
Ｃ１８，１５０×３．９ｍｍの内径）またはキラルカラム（Ｄａｉｃｅｌ，Ｃｈ
ｉｒａｌｃｅｌ ＯＤまたはＣｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＣ，２４０×４．６ｍｍの
内径）のいずれかを使用して行い、２８０ｎｍで検出した（Ｃｈｕ，Ａ．ら，Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７０２６−２７０３３（１９９３））。放射
活性サンプルを、Ｅｃｏｌｕｍｅ（ＩＣＮ）において分析し、そして液体シンチ
レーションカウンターを使用して測定した（Ｐａｃｋａｒｄ，Ｔｒｉｃａｒｂ
２０００ ＣＡ）。アミノ酸配列を、オンラインＨＰＬＣ検出を用いてＡｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓタンパク質配列決定装置を使用して、製造者の指
示に従って得た。
【０１２９】 （酵素アッセイ）ピノレジノールおよびラリシレジノールレダクターゼ活性を
、（＋）−［３Ｈ］ラリシレジノールおよび（−）−［３Ｈ］セコイソラリシレ
ジノールの形成をモニタリングすることによってアッセイした（Ｃｈｕ，Ａ．ら
，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７０２６−２７０３３（１９９３））。
【０１３０】 手短に言うと、ピノレジノールレダクターゼ活性についての各アッセイは、（
±）−ピノレジノール（ＭｅＯＨ中の５ｍＭ、２０μｌ）、対応する純度の段階
での酵素調製物（１００μｌ）、および緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ８．０，１１０μｌ）からなる。この酵素反応を、［４Ｒ−３Ｈ］ＮＡＤＰ
Ｈ（２０μｌの二重蒸留Ｈ２Ｏ中の１０ｍＭ，６．７９ｋＢｑ／ｍｍｏｌ）の添
加によって開始した。振盪しながら３０℃で３０分間インキュベートした後、こ
のアッセイ混合物を、放射化学キャリアとして（±）−ラリシレジノール（２０
μｇ）および（±）−セコイソラリシレジノール（２０μｇ）を含むＥｔＯＡｃ
（５００μｌ）で抽出した。遠心分離（１３，８００×ｇ、５分）の後、ＥｔＯ
Ａｃ溶解物を取り出し、そして抽出手順を繰り返した。各アッセイについて、こ
のＥｔＯＡｃ溶解物を、液体シンチレーション計数を用いる放射活性の決定のた
めに取り出したアリコート（１００μｌ）と合わせた。合わせたＥｔＯＡｃ溶解
物の残りを減圧下で乾燥するまでエバポレートし、Ｈ２Ｏ中のＭｅＯＨ／３％酢
酸（７０：３０、１００μｌ）中で再構成し、そして逆相カラムおよびキラルカ
ラムのＨＰＬＣに供した。コントロールを、変性酵素（１０分間沸騰）を使用し
て、または基質としての（±）−ピノレジノールの非存在下でのいずれかで行っ
た。
【０１３１】 ラリシレジノールレダクターゼ活性を、（−）−［３Ｈ］セコイソラリシレジ
ノールの形成をモニタリングすることによってアッセイした。これらのアッセイ
を、（±）−ラリシレジノール（ＭｅＯＨ中５ｍＭ、２０μｌ）を基質として使
用し、（±）−セコイソラリシレジノール（２０μｇ）を放射化学キャリアとし
て加えたことを除いて、上記に記載されるように正確に行った。
【０１３２】 （酵素精製のための一般的手順）タンパク質の精製手順を、他に述べない限り
、２８０ｎｍでモニターするクロマトグラフィー溶出を用いて、４℃で行った。
タンパク質の濃度を、γ−グロブリンを標準物質として使用して、Ｂｒａｄｆｏ
ｒｄの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：
２４８−２５４（１９７６））によって決定した。ポリアクリルアミドゲル電気
泳動は、変性および還元条件下で勾配（４〜１５％，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ゲルを使
用し、これらはＬａｅｍｍｌｉの緩衝系で行った（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，
Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０））。タンパク質を、銀染色
によって可視化した（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１１７：３０７−３１０（１９８１））。
【０１３３】 （粗製抽出物の調製）Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの幹（２０ｋｇ）を収穫し、
３〜６ｃｍの切片に切断し、そして必要になるまで−２０℃で保存した。幹のバ
ッチ（２ｋｇ）を、液体窒素中で凍結し、そしてＷａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｏｒ
中で微粉砕した。得られた粉末を、５ｍＭのジチオトレイトールを含むリン酸カ
リウム緩衝液（０．１ｍＭ，ｐＨ７．０，４Ｌ）でホモジェナイズした。このホ
モジネートを、４層のチーズクロスを通して、１０％（ｗ／ｖ）のポリビニルポ
リピロリドンを含むビーカーに濾過した。この濾液を遠心分離した（１２，００
０×ｇ，１５分）。得られた上清を、（ＮＨ４）２ＳＯ４を用いて分画し、飽和
の４０％と６０％との間を沈澱するタンパク質を、遠心分離（１０，０００×ｇ
，１時間）によって回収した。次に、このペレットを、５ｍＭのジチオトレイト
ールを含む最小量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ８．０）（緩衝液
Ａ）中で再構成し、そして、緩衝液Ａで平衡化した、プレパックした（ｐｒｅｐ
ａｃｋｅｄ）ＰＤ−１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５媒体）を使用して
脱塩した。
【０１３４】 （アフィニティー（Ａｆｆｉ Ｂｌｕｅ Ｇｅｌ）クロマトグラフィー）粗製
の酵素調製物（緩衝液Ａ中１９１ｍｇ、５ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を、緩
衝液Ａで平衡化したＡｆｆｉ Ｂｌｕｅ Ｇｅｌカラム（２．６×７０ｃｍ）に
適用した。このカラムを２００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した後、ピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼを、１ｍｌ 分−１の流速で、緩衝液Ａ中のＮａ
Ｃｌの直線勾配（３００ｍｌ中１．５〜５Ｍ）で溶出した。活性画分を、必要に
なるまで保存（−８０℃）した。
【０１３５】 （疎水性相互作用クロマトグラフィー（フェニルセファロース））解凍後、Ａ
ｆｆｉ Ｂｌｕｅクロマトグラフィー工程から得られた１０の調製物（１５０ｍ
ｇ，５１ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を合わせ、そして５ＭのＮａＣｌを含む
緩衝液Ａで平衡化したフェニルセファロースカラム（１×１０ｃｍ）に適用した
。このカラムを２総容量の同じ緩衝液で洗浄した。ピノレジノール／ラリシレジ
ノールレダクターゼを、１ｍｌ 分−１の流速で、緩衝液Ａ中の減少する濃度の
ＮａＣｌ（４０ｍｌ中５〜０Ｍ）の直線勾配を使用して溶出した。ピノレジノー
ル／ラリシレジノール還元を触媒する画分を合わせ、そしてプールした。
【０１３６】 （ヒドロキシアパタイトＩクロマトグラフィー）フェニルセファロース精製工
程からの活性タンパク質（３１ｍｇ，９１ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を、５
ｍＭのジチオトレイトールを含むｐＨ７．０の１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（緩衝液Ｂ）中で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（１．６×７０ｃｍ）
に適用した。ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼを、１ｍｌ 分− １ の流速で、ｐＨ７．０のリン酸カリウム緩衝液の直線勾配（２００ｍｌ中０．
０１〜０．４Ｍ）で溶出した。活性画分を合わせた。次いで、この緩衝液を、プ
レパックしたＰＤ−１０カラムを使用して緩衝液Ａに交換した。
【０１３７】 （アフィニティー（２’，５’−ＡＤＰセファロース）クロマトグラフィー）
次に、ヒドロキシアパタイト精製工程から得られた酵素溶液（６．５ｍｇ，４６
３ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む緩衝液Ａ（緩
衝液Ａ’）中で予め平衡化した２’，５’−ＡＤＰセファロース（１×１０ｃｍ
）カラムにロードし、次いで２５ｍｌの緩衝液Ａ’で洗浄した。ピノレジノール
／ラリシレジノールレダクターゼを、０．５ｍｌ 分−１の流速で、緩衝液Ａ’
中のＮＡＤＰ＋（１０ｍｌ中０．３ｍＭ）の段階勾配で溶出した。［ＮＡＤ＋（
３ｍＭまで）は、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ活性を溶出し
ない］。ＮＡＤＰ＋の吸光度の干渉のために、溶離液を２８０ｎｍで直接モニタ
ーすることは可能ではない。各画分のタンパク質の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（
Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５
４（１９７６））に従って、分光光度的に決定した。
【０１３８】 （ヒドロキシアパタイトＩＩクロマトグラフィー）２’，５’−ＡＤＰセファ
ロースカラムからの画分（これは、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクタ
ーゼ活性を示す）（０．８５ｍｇ，１０５１ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を合
わせ、そして緩衝液Ｂで平衡化した第２のヒドロキシアパタイトカラム（１×３
ｃｍ）に直接適用し、この酵素を、１ｍｌ 分−１の流速で、ｐＨ７．０のリン
酸カリウム緩衝液の直線勾配（４５ｍｌ中０．０１〜０．４Ｍ）で溶出した。
【０１３９】 アフィニティー（Ａｆｆｉ Ｙｅｌｌｏｗ）クロマトグラフィー−次に、第２
のヒドロキシアパタイトカラム精製工程からの活性画分（１６０μｇ，７９６０
ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を、緩衝液Ａで平衡化したＲｅａｃｔｉｖｅ Ｙ
ｅｌｌｏｗ ３アガロースカラム（１×３ｃｍ）に適用した。ピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼを、１ｍｌ 分−１の流速で、直線ＮａＣｌ勾配
（１００ｍｌ中０〜２．５Ｍ）で溶出した。
【０１４０】 高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２クロマトグ
ラフィー）−Ａｆｆｉ Ｙｅｌｌｏｗ精製工程からの、最も高い活性を有する合
わせた画分（５０μｇ，１０，９４０ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）をプールし
、そしてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０微小濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を使
用して、１ｍｌまで濃縮した。次いでこの酵素溶液を、２００μｌの部分で高速
タンパク質液体クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２，ＨＲ １
０／３０）に適用した。ゲル濾過を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭのジチオトレイトールを含む緩衝液中で
、０．４ｍｌ 分−１の流速で行った。ピノレジノール／ラリシレジノールレダ
クターゼを、１２．８ｍｌの移動相で溶出した。ＵＶプロフィール（２８０ｎｍ
での吸光度）と一致する活性画分をプールし（２０μｇ、１５，３００ｎｍｏｌ
ｈ−１ ｍｇ−１）、そして脱塩した（ＰＤ−１０プレパックカラム）。
【０１４１】 上記の精製プロトコルは、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノー
ルレダクターゼの３０６０倍の精製を生じた。フェニルプロパノイド代謝に関与
する酵素の多くの場合、このタンパク質は非常に存在比が低かった（すなわち、
２０ｋｇのＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ幹は、わずかに〜２０μｇの精製（＋）−
ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼをもたらした）。
【０１４２】 （実施例９） （Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来の精製ピノレジノール／ラ
リシレジノールレダクターゼの特徴付け） （等電点電気泳動およびｐＩ決定）精製プロトコルの全ての段階において、（
＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼ活性を共溶出し
た。この知見を考慮すると、このタンパク質の１つより多くの形態が存在するか
否か（すなわち、このタンパク質の１つの形態が、ピノレジノールの還元を触媒
するか否か）、およびこのタンパク質の別の形態がラリシレジノールの還元を触
媒するか否かを明確に確認することが必要である。このために、ピノレジノール
／ラリシレジノールレダクターゼの等電点を、ＭｏｎｏＰ ＨＲ ５／２０ Ｆ
ＰＬＣカラム上の等電点電気泳動によって推定した。
【０１４３】 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ゲル濾過カラム（実施例１）からの活性画分をプール
し、そして同じ緩衝液中で平衡化したプレパックＰＤ−１０カラムを用いて、緩
衝液を２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．１）に交換した。このようにして
得られた調製物を、等電点電気泳動カラムにロードし、そしてＰｏｌｙｂｕｆｆ
ｅｒ ７４を溶離液として０．５ｍｌ 分−１の流速で使用して、７．１と３．
９との間のｐＨ勾配を形成した。各画分のアリコート（２００μｌ）を、ピノレ
ジノール／ラリシレジノールレダクターゼ活性についてアッセイした。この画分
の残りを、ｐＨ勾配を決定するために使用した。
【０１４４】 （分子量決定）ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼのＭｏｎｏＰ
ＨＲ ５／２０ ＦＰＬＣカラム調製物の、ＳＤＳ−勾配ゲル電気泳動（４〜
１５％ポリアクリルアミド）への適用は、見かけ上類似の分子量を有する２つの
タンパク質バンドの存在を明らかにし、この２つのタンパク質の分離は、Ｍｏｎ
ｏＱ ＨＲ ５／５ ＦＰＬＣマトリックス上の陰イオン交換クロマトグラフィ
ーによって達成された。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １２精製工程（実施例１）からの
プールした画分を、緩衝液Ａ中で平衡化したＭｏｎｏＱ ＨＲ ５／５カラム（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。このカラムを、１０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し
、そしてピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ活性を、０．５ｍｌ
分−１の流速で、緩衝液Ａ中の直線ＮａＣｌ勾配（５０ｍｌ中０〜５００ｍＭ）
を使用して溶出した。集めた画分のアリコート（３０μｌ）を、勾配（４〜１５
％のアクリルアミド）ゲルを使用して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって分析した。タンパク質を、銀染色によって可視化した。活性画分３４〜
３７（２７，７６０ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）および３８〜４１（３０，７
９０ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）を別々にプールし、そして直ちに特徴付けに
使用した。
【０１４５】 従って、変性条件下で分解したこの２つのタンパク質バンドは、それぞれ〜３
６および〜３５ｋＤａの見かけ上の分子量を有した。この２つのレダクターゼ形
態の各々は、ｐＩ〜５．７を有した。
【０１４６】 各レダクターゼアイソフォームの未変性の分子量を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２
、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過ＦＰＬＣカラム
上でのその溶出挙動と、較正した分子量標準物質の溶出挙動との比較を介して推
定した。ゲル濾過を、実施例８に示すように行った。各レダクターゼについて、
５９，０００の見かけ上の未変性分子量を、〜３６，０００および〜３５，００
０のものと対比して、その溶出体積に基づいてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって計算した。ゲル濾過からの分子量とＳＤＳ−ＰＡＧＥからの分子
量との間の矛盾は未知のままであるが、以下のことが試験的に提案され得る：未
変性のタンパク質はおそらく二量体として存在しているが、これは非対称形状の
モノマーでもあり得、これによって、ヒトチオレドキシンレダクターゼ（Ｏｂｌ
ｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：７２７１−７２７７（
１９９３））および酵母メタロエンドペプチダーゼ（Ｈｒｙｃｙｎａ，Ｃ．Ａ．
およびＣｌａｒｋｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１１２９３−１
１３０１（１９９３））に関して報告されるように、その有効なＳｔｏｋｅｓ半
径が変化する（Ｃａｎｔｏｒ，Ｃ．Ｒ．，およびＳｈｉｍｍｅｌ，Ｐ．Ｒ．，Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ ＩＩ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅ
ｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９
８０）；Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ １８２：３１７−３２８（１９９０））。
【０１４７】 （至適ｐＨおよび至適温度）ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼ
の至適ｐＨを決定するために、ゲルＳｕｐｅｒｏｓｅ １２濾過工程（実施例８
）からの酵素調製物を、緩衝液を６．３〜９．４のｐＨ範囲の５０ｍＭ Ｂｉｓ
−Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液で置換したこと以外は標準アッセイ条件（実
施例８）を利用してアッセイした。至適ｐＨは、ｐＨ７．４であることがわかっ
た。
【０１４８】 ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼの至適温度を、ゲル濾過工程
（実施例８）からの酵素調製物を利用して、標準アッセイ条件（実施例８）下で
４℃と８０℃との間の範囲で調べた。至適ｐＨでは、レダクターゼ活性について
の至適温度は、約３０℃であることが立証された。
【０１４９】 （反応速度パラメーター）速度研究を行って、２つのレダクターゼアイソフォ
ームが別の還元（すなわち、それぞれ、（＋）−ラリシレジノールへの（＋）−
ピノレジノールの変換という還元、および（−）−セコイソラリシレジノールへ
の（＋）−ラリシレジノールの変換という還元）を触媒するか否か、またはいず
れかが（＋）−ピノレジノールもしくは（＋）−ラリシレジノールについての基
質としての優先度を提示するか否かを確認した。初速度研究を、この酵素の２つ
のアイソフォームを個々に利用して、そして（＋）−ピノレジノールおよび（＋
）−ラリシレジノールの両方を基質として個々に用いて行った。初速度研究を、
５ｍＭジチオトレイトール、純粋な酵素（ＭｏｎｏＱ陰イオン交換クロマトグラ
フィー後）を含有する５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）を用いて、１０種の異なる基質濃度（８．８μＭと１６０μＭとの間
）で、定常ＮＡＤＰＨ濃度（８０μＭ）で３連実験において行った。インキュベ
ーションを、３０℃で１０分間（線形反応速度の範囲内）実施した。反応速度パ
ラメーターを、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから決定した。
【０１５０】 重要なことには、反応速度パラメーターは、３５ｋＤａ形態および３６ｋＤａ
形態の両方のこの酵素について本質的に同じであった（すなわち、ピノレジノー
ルについてのＫｍ：３５ｋＤａ形態のこの酵素について２７±１．５μｍ、そし
て３６ｋＤａ形態のこの酵素について２３±１．３μＭ；ラリシレジノールにつ
いてのＫｍ：３５ｋＤａ形態のこの酵素について１２１±５．０μＭ、そして３
６ｋＤａ形態のこの酵素について１２３±６．０μＭ）。同様の様式で、見かけ
の最大速度（μｍｏｌ ｈ−１ タンパク質のｍｇ−１として表される）もまた
本質的に同一であった（すなわち、ピノレジノールについてのＶｍａｘ：３５ｋ
Ｄａ形態のこの酵素について１６．２±０．４、そして３６ｋＤａ形態のこの酵
素について１７．３±０．５；ラリシレジノールについて：３５ｋＤａ形態のこ
の酵素について２５．２±０．７、そして３６ｋＤａ形態のこの酵素について２
９．９±０．７）。従って、全ての利用可能な証拠は、（＋）−ピノレジノール
／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼが、２つのアイソフォームとして存在
し、各々が両方の基質の還元を触媒し得ることを示唆する。この還元がどのよう
にして行われているか、すなわち、両方の還元が、キノン環またはフラノ環のい
ずれかの形態でタンデムに行われているかについては、より多量のタンパク質供
給源を用いたさらなる研究を待つばかりの状態にある。
【０１５１】 （（＋）−［７’Ｒ−２Ｈ］ラリシレジノールの酵素的形成）この２つの（＋
）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼアイソフォームが
本質的に同一の触媒特徴を示すので、両方のアイソフォームを含有するＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ １２酵素調製物（実施例８）を用いて、水素化物転移（ｈｙｄｒｉ
ｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）の立体特異性を調べた。このストラテジーは、ＮＡＤ
Ｐ２Ｈを（＋）−ピノレジノールの還元についての補因子として用いる利用され
た選択的重水素標識を採用し、酵素産物（＋）−ラリシレジノールを１Ｈ ＮＭ
Ｒおよび質量分析法によって分析した。従って、（±）−ピノレジノールの溶液
（ＭｅＯＨ中５．２ｍＭ、４ｍｌ）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ
８．０、５ｍＭジチオトレイトールを含有する、２２ｍｌ）およびＡｎｄｅｒｓ
ｏｎおよびＬｉｎ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ａ．およびＬｉｎ Ｂ．Ｋ．，Ｐｈ
ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：８１１−８１２（１９９３））の方法によっ
て調製した立体特異的に重水素で標識された［４Ｒ−２Ｈ］ＮＡＤＰＨ（Ｈ２Ｏ
中２０ｍＭ、４ｍｌ）に添加し、、全量を酵素調製物（２０ｍｌ）に添加した。
攪拌しながら３０℃にて１時間のインキュベーション後、このアッセイ混合物を
ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ可溶性画分を合わせ、飽和
ＮａＣｌ（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下で乾燥
するまでエバポレートした。得られた抽出物を最少量のＥｔＯＡｃ中で再構築し
、シリカゲルカラム（０．５×７ｃｍ）に適用し、そしてＥｔＯＡｃ／ヘキサン
（１：２）で溶出させた。酵素産物を含有する画分を合わせ、そして乾燥するま
でエバポレートした。
【０１５２】 この酵素産物は、Ｃ−７での１つの重水素原子の存在に対応する、重水素およ
び（ｍ／ｚ）３６１（Ｍ＋＋１）のその分子イオンによるその置換に起因したδ
２．５１ｐｐｍでの７’−プロＲ陽子の消失によって証明されたように、（＋）
−［７’Ｒ−２Ｈ］ラリシレジノールであることが立証された。１Ｈ ＮＭＲ（
３００ＭＨｚ）（ＣＤＣｌ３）：２．３９（ｍ，１Ｈ，Ｃ８Ｈ），２．７１（ｍ
，１Ｈ，Ｃ８’Ｈ），２．８８（δ，１Ｈ，Ｊ７’Ｓ，８’＝５．０Ｈｚ，Ｃ７
’ＨＳ），３．７３（δδ，１Ｈ，Ｊ８’，９’ｂ＝７．０Ｈｚ，Ｊ９’ａ，９
’ｂ＝８．５Ｈｚ，Ｃ９’Ｈβ），３．７６（δδ，１Ｈ，Ｊ８，９Ｓ＝６．５
Ｈｚ，Ｊ９Ｒ，９Ｓ＝８．５Ｈｚ，Ｃ９ＨＳ），３．８６（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３ ），３．８８（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ３），３．９２（δδ，１Ｈ，Ｊ８，９Ｒ＝６
．０Ｈｚ，Ｊ９Ｒ，９Ｓ＝９．５Ｈｚ，Ｃ９ＨＲ），４．０４（δδ，１Ｈ，Ｊ
８’，９’ａ＝７．０Ｈｚ，Ｊ９’ａ９’ｂ＝８．５Ｈｚ，Ｃ９’Ｈａ），４．
７７（δ，１Ｈ，Ｊ７，８＝６．６Ｈｚ，Ｃ７Ｈ），６．６８−６．７０（ｍ，２ Ｈ，ＡｒＨ），６．７５−６．８５（ｍ，４Ｈ，ＡｒＨ）；ＭＳ ｍ／ｚ（％
）：３６１（Ｍ＋＋１，７１．２），３６０（Ｍ＋，３１．１），２３７（１１
．１），１５３（４１．５），１５２（２０．２），１５１（６７．０），１３
８（１００），１３７（７１．１）。
【０１５３】 従って、（＋）−ピノレジノールから（＋）−ラリシレジノールへの水素化物
転移は、それによって（＋）−ラリシレジノールの７’−プロＲ水素位置のみが
重水素化される様式で生じた。同様な結果が（−）−セコイソラリシレジノール
への（＋）−ラリシレジノールの変換について観察され、それによって、全体的
な水素化物転移は完全に立体特異的であることが立証された。
【０１５４】 （実施例１０：Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来の精製された
ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼのアミノ酸配列分析） （ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼのアミノ酸配列決定）（＋
）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼのＮ末端アミノ酸
配列を、精製されたタンパク質の各々および両方の混合物から、オンラインＨＰ
ＬＣ検出しながらＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのタンパク質配列決定
機を用いて得た。Ｎ末端配列は、両方のアイソフォームについて同じであった（
配列番号３６）。
【０１５５】 トリプシン消化のために、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ １２カラムから精製した酵素
（実施例８）１５０ｐｍｏｌを０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０μｌ、ｐＨ８
．５）中に懸濁し、尿素を添加して、７７．５μｌ中の最終濃度を８Ｍにした。
この混合物を、５０℃で１５分間インキュベートし、次いで１００ｍＭヨードア
セトアミド（２．５μｌ）を添加し、全体を室温で１５分間保持した。次いで、
トリプシン（２０μｌ中１μｇ）を添加し、この混合物を３７℃で２４時間消化
し、その後、ＴＦＡ（４μｌ）を添加して酵素反応を停止させた。
【０１５６】 得られた混合物を逆相ＨＰＬＣ分析（Ｃ−８カラム，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ
ｓｙｔｅｍｓ）に供し、これを０％〜１００％アセトニトリル（０．１％ ＴＦ
Ａ中）の２時間かけた線形勾配で、０．２ｍｌ／分の流速で溶出させ、２８０ｎ
ｍで検出した。個々のオリゴペプチドピークを含む画分を手で収集し、そしてア
ミノ酸配列決定に直接提出した。４つのトリプシン処理フラグメントを、アミノ
酸配列決定を可能にするに十分な量で分離した（配列番号３７〜４０）。
【０１５７】 臭化シアン消化を、７０％ギ酸中の０．５Ｍ臭化シアンを伴ったＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ １２カラムから精製されたレダクターゼ（実施例８）１５０ｐｍｏｌの
３７℃にて４０時間のインキュベーションによって行い、その後、臭化シアンお
よびギ酸を減圧下（ＳｐｅｅｄＶａｃ）での遠心分離によって除去した。得られ
たオリゴペプチドフラグメントをＨＰＬＣによって分離し、そして３つを、配列
決定を可能にするに十分な量で分離した（配列番号４１〜４３）。
【０１５８】 （実施例１１：Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ由来のピノレジノ
ール／ラリシレジノールレダクターゼのクローニング） （植物材料）Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの植物は、Ｂａｉｌ
ｅｙ’ｓ Ｎｕｒｓｅｒｙ（ｖａｒ．Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｔ．，Ｐａ
ｕｌ，ＭＮ）から入手してＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙの温室施設で維持したか、または地域団体からの贈与物であるかのいずれ
かであった。
【０１５９】 （材料）使用した全ての溶媒および化学物質は、試薬等級またはＨＰＬＣ等級
であった。ＯＤ２６０でのＵＶ ＲＮＡ決定およびＤＮＡ決定を、Ｌａｍｂｄａ
６ ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計で達成した。Ｔｅｍｐｔｒｏｎｉｃ ＩＩ ｔｈ
ｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）を、全てのＰＣＲ増幅のために
用いた。Ｔａｑ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをＰｒｏｍｅｇａから入手し、一方、
制限酵素をＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＨａｅＩＩＩ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ（Ｓａｕ３ａ）およびＰｒｏｍｅｇａ（ＴａｑＩ）から入手した。
ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクターおよびコンピテントＮｏｖａＢｌｕｅ細胞をＮｏ
ｖａｇｅｎから購入し、そして放射標識ヌクレオチド（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ
および［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ）をＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮから購入した。
【０１６０】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定のためのオリゴヌクレオチド
プライマーを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによ
って合成した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ（登録商標）キット（ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．）をＰＣＲフラグメントの精製のために用い、ゲル精製したＤＮＡの
濃度を、１．５％アガロースゲルにおける低ＤＮＡ量ラダー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲ
Ｌ）に対する比較によって決定した。
【０１６１】 （Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ＲＮＡ単離）機能的Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＲＮ
Ａを、迅速に生長する緑色茎組織から単離するという最初の試みは、その植物の
フェノール性構成成分による容易な酸化によって遭遇した困難に起因して、不成
功であった。しかし、この問題は、木本植物組織について特に設計されたＲＮＡ
単離手順の利用によって成功裡に克服された。この手順は、酸化を防ぐために、
抽出緩衝液において低ｐＨおよび還元条件を使用する（Ｄｏｎｇ，Ｚ．Ｄ．およ
びＤｕｎｓｔａｎ，Ｄ．Ｉ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １５：
５１６−５２１（１９９６））。
【０１６２】 （Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの茎のｃＤＮＡライブラリー合
成）総ＲＮＡ（約３００μｇ／ｇ新鮮重量）を、温室で生育させたＦｏｒｓｙｔ
ｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ植物（ｖａｒ．Ｌｙｎｗｏｏｄ Ｇｏｌｄ）（Ｄ
ｏｎｇ，Ｚ．Ｄ．およびＤｕｎｓｔａｎ，Ｄ．Ｉ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒ
ｅｐｏｒｔｓ １５：５１６−５２１（１９９６））の若い緑色の茎から得た。
Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの茎のｃＤＮＡライブラリーを、Ｚ
ＡＰ ＤＮＡ（登録商標）合成キット、Ｕｎｉ−ＺＡＰＴＭ ＸＲベクターおよ
びＧｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ＩＩ Ｇｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）と共に、５μｇの精製ポリＡ＋ｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−
ｄＴＴＭ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いて構築し、一次ライブ
ラリーについての力価は１．２×１０６ＰＦＵであった。増幅したライブラリー
（１．２×１０１０ＰＦＵ／ｍｌ；計１５８ｍｌ）のうちの一部（３０ｍｌ）を
用いて、ＰＣＲのための純粋なｃＤＮＡライブラリーのＤＮＡを得た（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３巻，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１
９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｉｎｇ ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９１））。
【０１６３】 ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼのＤＮＡプローブ合成−Ｎ末
端および内部のペプチドアミノ酸配列を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプライ
マーを構築した。特に、プライマーＰＬＲＮ５（配列番号４４）は、Ｎ末端ペプ
チド（配列番号３６）のアミノ酸７〜１３の配列に基づいていた。プライマーＰ
ＬＲ１４Ｒ（配列番号４５）は、（配列番号３７）に示す内部ペプチド配列のア
ミノ酸２〜８の配列に基づいていた。プライマーＰＬＲ１５Ｒ（配列番号４６）
は、（配列番号３７）に示す内部ペプチド配列のアミノ酸９〜１５の配列に基づ
いていた。配列番号３７に示す内部ペプチド配列のアミノ酸９〜１５の配列（こ
の配列にプライマーＰＬＲ１５Ｒ（配列番号４６）の配列が基づいている）もま
た、配列番号４１に示す、臭化シアンによって生成された内部フラグメントのア
ミノ酸４〜１０の配列に対応した。
【０１６４】 精製したＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ（５ｎｇ）
を、プライマーＰＬＲＮ５（配列番号４４）（１００ｐｍｏｌ）およびプライマ
ーＰＬＲＩ５Ｒ （配列番号４６）（２０ｐｍｏｌ）またはプライマーＰＬＲＩ
４Ｒ（配列番号４５）（２０ｐｍｏｌ）のいずれかを伴った１００ｕｌのＰＣＲ
反応物（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ９．０］、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．
１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄ
ＮＴＰおよび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）中のテンプレートとし
て用いた。ＰＣＲ増幅を、サーモサイクラー中で以下の通りに実施した：９４℃
にて１分間、５０℃にて２分間および７２℃にて３分間を３５サイクル；最後の
サイクルの後、７２℃にて５分間および４℃での無期限の保持。単一プライマー
の反応、テンプレートのみの反応およびプライマーのみの反応を、コントロール
として行った。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲルにおいて分離した。プラ
イマーＰＬＲＮ５（配列番号４４）とプライマーＰＬＲＩ４Ｒ（配列番号４５）
との組合わせは、配列番号４７の塩基２２〜３９３に対応する３８０ｂｐの単一
バンドを生じた。プライマーＰＬＲＮ５（配列番号４４）とプライマーＰＬＲＩ
５Ｒ（配列番号４６）との組合わせは、配列番号４７の塩基２２〜４２３に対応
する４００ｂｐの単一バンドを生じた。
【０１６５】 ２つの増幅したバンドのヌクレオチド配列を決定するために、５つの１００μ
ｌ ＰＣＲ反応をテンプレートおよびプライマーの以下の組合わせの各々につい
て上記の通りに行った：３８０ｂｐの増幅産物＋プライマーＰＬＲＮ５（配列番
号４４）およびプライマーＰＬＲＩ４Ｒ（配列番号４５）；４００ｂｐの増幅産
物＋プライマーＰＬＲＮ５（配列番号４４）およびプライマーＰＬＲＩ５Ｒ（配
列番号４６）。プライマーおよびテンプレートの各々の組合わせからの５つの反
応物を濃縮し（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ３０，Ａｍｉｃｏｎ Ｉｎｃ．）、そしてＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ；２×
２００μｌ）で洗浄し、続いてＰＣＲ産物をＴＥ緩衝液（２×５０μｌ）中に回
収した。これらを、分取用１．５％アガロースゲル中で分離した。次いで、各ゲ
ル精製したＰＣＲ産物（約０．２ｐｍｏｌ）をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター中
に連結し、そしてＮｏｖａｇｅｎの使用説明書に従ってコンピテントなＮｏｖａ
Ｂｌｕｅ細胞中に形質転換した。挿入物の大きさを、迅速煮沸溶解およびＰＣＲ
技術（Ｒ２０マー（配列番号７４）プライマーおよびＵ１９マー（配列番号７５
）プライマーを製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ）の使用説明書に従って利用する）を
用いて決定した。
【０１６６】 制限分析を行って、プライマーおよびテンプレートの全ての組合わせについて
の全ての挿入物が同じであるか否かを決定した。制限分析を以下の通りに行った
：挿入物の各々を、Ｒ２０（配列番号７４）プライマーおよびＵ１９（配列番号
７５）プライマーを利用したＰＣＲによって増幅した。１００μｌのＰＣＲ反応
物のうちの各２０μｌに、４単位のＨａｅＩＩＩ、１．５単位のＳａｕ３ａまた
は５単位のＴａｑＩ制限酵素を添加した。制限消化を、ＨａｅＩＩＩおよびＳａ
ｕ３Ａについては３７℃で、そしてＴａｑＩ反応物については６５℃で、６０分
間進行させた。制限産物を１．５％アガロースゲル中で分離して、試験した全て
の挿入物について１つの制限群を得た。
【０１６７】 得られた組換えプラスミドのうちの５つを、ＤＮＡ配列決定のために選択した
。組換えプラスミド（ｐＴ７ＰＬＲ１−ｐＴ７ＰＬＲ３と呼ばれる）のうちの３
つ由来の挿入物を、プライマーＰＬＲＮ５（配列番号４４）およびプライマーＰ
ＬＲＩ５Ｒ（配列番号４６）と基質としての４００ｂｐのＰＣＲ産物との組合わ
せによって生成した。残りの２つの組換えプラスミド（ｐＴ７ＰＬＲ４およびｐ
Ｔ７ＰＬＲ５と呼ばれる）由来の挿入物を、プライマーＰＬＲＮ５（配列番号４
４）およびプライマーＰＬＲＩ４Ｒ（配列番号４５）と基質としての３８０ｂｐ
のＰＣＲ産物との組合わせから生成した。５つの配列決定したＰＣＲ産物の全て
が、同じオープンリーディングフレームを含んでいた。
【０１６８】 （＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼプローブを
、以下の通りに構築した：５つの１００μｌ ＰＣＲ反応を、プライマーＰＬＲ
Ｎ５（配列番号４４）およびプライマーＰＬＲＩ５Ｒ（配列番号４６）と共に１
０ｎｇ ｐＴ７ＰＬＲ３ ＤＮＡを用いて上記の通りに行った。ゲル精製したｐ
Ｔ７ＰＬＲ３ ｃＤＮＡ挿入物（５０ｎｇ）を、ＰｈａｒｍａｃｉａのＴ７Ｑｕ
ｉｃｋＰｒｉｍｅ（登録商標）キットおよび［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰと共に、キ
ットの使用説明書に従って用いて放射標識プローブ（０．１ｍｌ中）を生成し、
これをＢｉｏＳｐｉｎ ６カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製し、そしてキャリア
ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａから入手した０．９ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子Ｄ
ＮＡ）に添加した。
【０１６９】 （ライブラリーのスクリーニング）６００，０００ＰＦＵのＦ．ｉｎｔｅｒｍ
ｅｄｉａ増幅ｃＤＮＡライブラリーを、一次スクリーニングのために、Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅの使用説明書に従ってプレーティングした。プラークを、Ｍａｇｎ
ａ Ｎｙｌｏｎメンブレンサークル（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ
Ｉｎｃ．）にブロッティングし、次いでこれを風乾させた。このメンブレンを２
層のＷｈａｔｍａｎ（登録商標）３ＭＭ Ｃｈｒ紙の間に置いた。ｃＤＮＡライ
ブラリーのファージＤＮＡをこのメンブレンに固定し、そして１００℃で２分間
オートクレーブすることによって一工程で変性させ、迅速に排気した。このメン
ブレンを６×標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）および０．１％ ＳＤＳ中で３
７℃にて３０分間洗浄し、そして結晶化皿（１９０×７５ｍｍ）中で予め加熱し
た６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳおよび５×デンハルト試薬（ハイブリダイゼー
ション溶液、３００ｍｌ）中で５７℃〜５８℃で穏やかに振盪しながら５時間に
わたってプレハイブリダイズした。
【０１７０】 ［３２Ｐ］放射標識プローブを変性させ（煮沸、１０分間）、迅速に冷却し（
氷、１５分間）そして結晶化皿（１５０×７５ｍｍ）中の予め加熱した新鮮なハ
イブリダイゼーション溶液（６０ｍｌ、５８℃）中に添加した。次いで、プレハ
イブリダイズしたメンブレンをこの皿に添加し、次いでこれをプラスチックラッ
プで覆った。ハイブリダイゼーションを、穏やかに攪拌しながら５７〜５８℃で
１８時間にわたって行った。このメンブレンを４×ＳＳＣおよび０．５％ ＳＤ
Ｓ中で室温にて５分間洗浄し、２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ（室温にて）に
移し、そして穏やかに攪拌しながら２０分間、５７〜５８℃でインキュベートし
、プラスチックラップでラップして乾燥を予防し、そして最終的にＫｏｄａｋ
Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに−８０℃にて２４時間、増感スクリーンを伴って
暴露した。
【０１７１】 このスクリーニング手順は、３５０個より多くのポジティブプラークをもたら
し、（異なるシグナル強度の）２０個をさらに２回のスクリーニングに供した。
最後の精製後、２０個のうちの６個のｃＤＮＡを、インビボ切り出しによってｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローニングした。これらの６個のｃＤＮＡを、
ｐｌｒ−Ｆｉ１〜ｐｌｒ−Ｆｉ６（配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５
７）と呼んだ。
【０１７２】 （ｐｌｒ−Ｆｉ１〜ｐｌｒ−Ｆｉ６ファージミドのインビボでの切り出しおよ
び配列決定）６個の精製されたｃＤＮＡクローンを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅのイ
ンビボ切り出しプロトコルに従ってファージからレスキューした。（＋）−ピノ
レジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼをコードする、６個の異な
るｃＤＮＡ（ｐｌｒ−Ｆｉ１〜ｐｌｒ−Ｆｉ６）の両鎖を、重複する配列決定プ
ライマーを用いて完全に配列決定した。
【０１７３】 配列決定のためのＤＮＡの精製は、ＱＩＡｗｅｌｌ Ｐｌｕｓプラスミド精製
系（ＱＩＡＧＥＮ）を、続いてＰＥＧ沈澱（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３
巻，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９４））を用い、ＤＮＡ配
列を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ自動化配
列決定機を用いて決定した。ＤＮＡ配列分析およびアミノ酸配列分析を、Ｕｎｉ
ｘ（登録商標）ベースのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏ
ｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇ
ｅ，第８版，１９９４年９月，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕ
ｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ，ＵＳＡ ５３７１１；Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ，Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ
Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｎｘｔｏｎ Ｈａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１０ １
Ｒｑ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９６））およびＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄ
ｅ Ｗｅｂ分子生物学サーバー（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓ
ｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖ
ａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて行った。
【０１７４】 ６個全てのｃＤＮＡは、同じコード領域であるが異なる５’非翻訳領域を有し
ていた。一方、６個のｃＤＮＡの各々の３’非翻訳領域の分析によって、いずれ
も最長のｃＤＮＡの３’領域の短縮化バージョンであることが立証された。温室
で生長させた植物の茎の先端由来の総ＲＮＡを用いた予備的ＲＮＡゲルブロット
分析によって、約１．２ｋｂの長さを有する単一転写物が確認された。
【０１７５】 （ＲＮＡゲルブロット分析）ＲＮＡゲルブロット分析のために、Ｆ．ｉｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａの茎の先端由来の総ＲＮＡ（１レーンあたり３０μｇ）を、変性ア
ガロースゲル電気泳動によって大きさによって分離した。このＲＮＡを、荷電し
たナイロンメンブレン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ｄｕｐ
ｏｎｔ ＮＥＮ）に転写し、メンブレン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＳｔｒａｔ
ａｌｉｎｋｅｒ）に架橋し、プレハイブリダイズし、ｃＤＮＡクローニングの間
にｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いたのと同じプローブで
ハイブリダイズし、そして水性ハイブリダイゼーション条件についての製造業者
の使用説明書に従って洗浄した。次いで、このメンブレンを、Ｋｏｄａｋ Ｘ−
ＯＭＡＴフィルムに、−８０℃にて４８時間、増感スクリーンを伴って暴露した
。
【０１７６】 （実施例１２：Ｅ．ｃｏｌｉ中での（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシ
レジノールレダクターゼｃＤＮＡ ｐｌｒ−Ｆｉ１（配列番号４７）の発現） （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける発現）推定（＋）−ピノレジノ
ール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡが機能的な（＋）−ピノ
レジノール／（＋）ラリシレジノールレダクターゼをコードすることを確認する
ために、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼを恐
らくコードするｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて異種発現させた。異種発現は
また、将来の（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼ
の正確な生化学的機構の系統的研究を可能にするに十分なタンパク質を得るため
に必要であった。
【０１７７】 ６個の推定（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼ
クローンの調査は、１つのクローンｐｌｒ−Ｆｉ１（配列番号４７）がｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ中のβ−ガラクトシダーゼのα相補粒子とインフレームであるこ
とを示した。これは偶然であった。なぜなら、これは、完全に機能的な融合タン
パク質を発現する簡便な手段を潜在的に提供し、それゆえ、クローニングされた
配列が正しいという証明を提供したからである。
【０１７８】 ｐｌｒ−Ｆｉ１（配列番号４７）からの精製されたプラスミドＤＮＡを、Ｎｏ
ｖａｇｅｎの使用説明書に従ってＮｏｖａＢｌｕｅ細胞中に形質転換した。形質
転換された細胞（５ｍｌ培養物）を、１２．５μｇ ｍｌ−１テトラサイクリン
および５０μｇ ｍｌ−１アンピシリンを補充したＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ，第３巻，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９９４）
）中で、攪拌（２２５ｒｐｍ）しながら、対数増殖期中期（ＯＤ６００＝０．５
）になるまで３７℃で増殖させた。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−
チオグルコピラノシド）を、１０ｍＭの最終濃度になるまで添加し、そしてこの
細胞を２時間にわたって増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、そして５
００μｌ（５ｍｌ培養チューブあたり）緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、５ｍＭジチオトレイトール）中に再懸濁した。次いで、リゾチーム
（５μｌの０．１ｍｇ ｍｌ−１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎ
ｃ．）を添加し、そして次いで１０分間インキュベーションし、この細胞を超音
波破砕（３×１５秒間）によって溶解した。４℃で１０分間の１４，０００×ｇ
での遠心分離の後、上清を取り出し、そして実施例８に記載のように（＋）−ピ
ノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼ活性（１アッセイあたり
２１０μｌの上清）についてアッセイした。
【０１７９】 触媒活性を、３０℃にて２時間にわたって無細胞抽出物を（±）−ピノレジノ
ール（０．４ｍＭ）および［４Ｒ−３Ｈ］ＮＡＤＰＨ（０．８ｍＭ）と共に標準
条件下でインキュベートすることによって立証した。インキュベーション後、非
標識（±）−ラリシレジノールおよび（±）−セコイソ−ラリシレジノールを放
射化学キャリアとして添加し、各リグナン（ｌｉｇｎａｎ）を逆相ＨＰＬＣによ
って単離した。コントロールは、全てのアッセイ構成成分およびｐｌｒ−Ｆｉ１
（配列番号４７）を有する、フレームがずれた（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｒａｍｅ）ｃ
ＤＮＡ挿入物を含むピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡの
アッセイ、ならびに［４Ｒ−３Ｈ］ＮＡＤＰＨ以外の基質を含まないフレームの
ずれたピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡのアッセイを含
んでいた。産物の分離およびキラル同定を、以前に記載された通りにＨＰＬＣに
よって行った（Ｃｈｕ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２７０２６
−２７０３３（１９９３））。
【０１８０】 その後のキラルＨＰＬＣ分析によって、（＋）−ラリシレジノールおよび（−
）−セコイソラリシレジノールの両方が放射標識されるが、対応する対掌体は放
射標識されない（総活性：５４ｎｍｏｌ ｈ−１ ｍｇ−１）ことが示された。
対照的に、（±）−ピノレジノールの非存在下、またはｃＤＮＡ挿入物がβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子とインフレームでないプラスミドを含むコントロール細胞
を用いた場合のいずれでも、触媒活性は検出されなかった。従って、異種発現さ
れた（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼおよび植
物タンパク質は、正確に同じ立体特異的様式で機能する。
【０１８１】 （実施例１３：（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクタ
ーゼをコードするクローンｐｌｒ−Ｆｉ１（配列番号４７）のｃＤＮＡ挿入物の
配列および相同性分析） （配列分析）クローニングした（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジ
ノールレダクターゼｐｌｒ−Ｆｉ１（配列番号４７）の全長配列は、消化フラグ
メントのＥｄｍａｎ分解によって決定されたペプチド配列の全てを含んでいた。
【０１８２】 単一のＯＲＦは、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダク
ターゼの２つのアイソフォームについてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって以前に見積も
られた値（約３５ｋＤａまたは約３６ｋＤａ）と極めて一致した３４．９ｋＤａ
の計算分子量を有する、３１２アミノ酸（配列番号４８）のポリペプチドを予測
する。等電点電気泳動によって実験的に得られた等電点（ｐＩ約５．７）とは対
照的に、７．０９の理論的等電点（ｐＩ）を有する、等しい数の酸性残基および
塩基性残基もまた存在する。
【０１８３】 このアミノ酸組成は、７個のメチオニン残基を示す。興味深いことに、植物か
ら精製した酵素のＮ末端は、最初のメチオニンを欠き、これは、知られているう
ちで最も通常の翻訳後タンパク質修飾である。その結果、ｃＤＮＡ中の最初のメ
チオニンは、翻訳開始部位とみなされ得る。配列分析はまた、可能なＮ−グリコ
シル化部位を残基２１５に示し（しかし、分泌標的化シグナルは存在しない）、
そして７個の可能なタンパク質リン酸化部位を残基５０および２２８（プロテイ
ンキナーゼＣ型）、残基２２８、２５０、３０２および３０３（カゼインキナー
ゼＩＩ型）ならびに残基３０１（チロシンキナーゼ型）を示す。
【０１８４】 ＮＡＤＰＨ結合に関連した保存された配列を含む、ピノレジノール／ラリシレ
ジノールポリペプチド鎖（配列番号４８）の領域もまた同定された（Ｊｏｅｒｎ
ｖａｌｌ，Ｈ．，Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ Ｎｉｃ
ｏｔｉｎａｍｉｄｅ Ｃｏｅｎｚｙｍｅｓ（Ｊｅｆｆｅｒｙ，Ｊ．編）１２６−
１４８頁，Ｂｉｒｋｈａｅｕｓｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂａｓｅｌ（１９８０）；
Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．およびＴｏｏｚｅ，Ｊ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔ
ｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４１−１５９頁，Ｇａｒｌａｎｄ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ
（１９９１）；Ｗｉｅｒｅｎｇａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７
：１０１−１０８（１９８６））。ＮＡＤＰＨ結合部位の指標と見られる、異な
るレダクターゼの配列において制限された数の不変アミノ酸が存在する。これら
は、配列Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ（配列番号７６）（ここで、Ｘは任意の残基で
ある）という、３個の保存されたグリシン残基、および６個の保存された疎水性
残基を含む。グリシンリッチ領域は、ＮＡＤＰＨをその正しいコンホメーション
に配置する際に中心的役割を果たすと考えられる。このことについては、（＋）
−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールレダクターゼのＮ末端領域と、Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒアルコールデヒドロゲナーゼ（
Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．およびＴｏｏｚｅ，Ｊ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔ
ｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４１−１５９頁，Ｇａｒｌａｎｄ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ
（１９９１））、Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａシンナミルアルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＭａｃＫａｙ Ｊ．Ｊ．ら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４７：５３７
−５４５（１９９５））、ドッグフィッシュ（ｄｏｇｆｉｓｈ）筋肉乳酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．およびＴｏｏｚｅ，Ｊ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４１−１５９頁，Ｇ
ａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ
Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１））およびヒト赤血球グルタチオンレダクターゼ（Ｂｒ
ａｎｄｅｎ，Ｃ．およびＴｏｏｚｅ，Ｊ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４１−１５９頁，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ（１
９９１））の保存されたＮＡＤＰＨ結合領域のＮ末端領域との比較は、いくつか
の興味深い相似を示した。不変グリシン残基は、ドメインの形成における正確な
パッケージングに必要とされる６個のうちの４個の疎水性残基と同様に、全ての
場合に整列される。それゆえ、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノ
ールレダクターゼアイソフォームのＮＡＤＰＨ結合部位は、このＮ末端に近接し
て局在される。
【０１８５】 （相同性分析）：イソフラボンレダクターゼとの比較。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ
ｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎの
非重複性（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）ペプチドデータベースに対して、（＋
）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールリダクターゼの翻訳されたアミ
ノ酸配列（配列番号４８）を用いて、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．
Ｆ．らＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）を実施した
。以下由来の種々のイソフラボンリダクターゼを用いて、（＋）−ピノレジノー
ル／（＋）−ラリシレジノールリダクターゼに対する有意な相同性が示された：
豆果であるＣｉｓｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ（Ｔｉｅｍａｎｎ，Ｋら．，Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：７５１〜７５７（１９９１））（類似性６３．
５％、同一性４４．４％）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖｅ（Ｐａｉｖａ、Ｎ
．Ｌら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：６５３〜６６７（１９９１））
（類似性６２．６％、同一性４２．０％）およびＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（
Ｐａｉｖａ、Ｎ．Ｌ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１２
：５０１〜５１０（１９９４））（類似性６１．６％、同一性４１．３％）。こ
の観察はかなり興味深い。なぜなら、イソフラボンは、フェニルプロパノイドア
セテート経路代謝の関連する分枝を介して形成されるからである。詳細には、イ
ソフラボンリダクターゼは、イソフラボノイド形成の間のα，β−不飽和ケトン
の還元を触媒する。例えば、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖｅ Ｌ．イソフラボ
ンリダクターゼは、フィトアレキシン、（−）−メジカルピン（ｍｅｄｉｃａｒ
ｐｉｎ）の生合成において２’−ヒドロキシホルモノネチン（ｈｙｄｒｏｘｙｆ
ｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）の（３Ｒ）−ベスチトン（ｖｅｓｔｉｔｏｎｅ）への
立体特異的変換を触媒する（Ｐａｉｖａ，Ｎ．Ｌ．ら．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１７：６５３〜６６７（１９９１））。この配列類似性は、もしリグ
ナンおよびイソフラボノイドの両方が一般的フェニルプロパノイド代謝の派生物
（例えば、「植物エストロゲン」として、匹敵し得る植物防御機能および薬理学
的役割を有する）であれば有意であり得る。結果として、両方のリダクターゼは
非常に類似の反応を触媒するので、イソフラボンリダクターゼが、（＋）−ピノ
レジノール／（＋）−ラリシレジノールリダクターゼから発達したものであり得
ることが推測されている。これはありそうである。なぜなら、このリグナンは、
シダ植物、マツモ、裸子植物および被子植物に存在するからである；これにより
これらの経路は、明らかに、イソフラボノイドの前に発達した（Ｇａｎｇら、Ｐ
ｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｏｒ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｈｅｄｉｎ
ら、編、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
Ｄ．Ｃ．，６５８；５８〜５９（１９９７））。
【０１８６】 以下由来の推定イソフラボンリダクターゼ「ホモログ（相同体）」を用いて、
匹敵する相同性がまた観察された：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
（Ｂａｂｉｙｃｈｕｋ，Ｅら、Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ（２５−Ｍ
ＡＹ−１９９５）ｔｏ ｔｈｅ ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ｄｅｔ
ａｂａｓｅ（１９９５））（類似性６５．９％、同一性５０．８％）、Ｎｉｃｏ
ｔｉｎａ ｔａｂａｃｕｍ（Ｈｉｂｉ，Ｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：７２
３〜７３５（１９９４））（類似性６４．６％、同一性４７．２％）、Ｓｏｌａ
ｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（ｖａｎ Ｅｌｄｉｋ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９５）Ｄ
ｉｒｅｃｔ ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ（０６−ＯＣＴ−１９９５）ｔｏ ＥＭＢＬ
／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅ）（類似性６５．５％、同一性
４７．４％）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（Ｐｅｔｒｕｃｃｏ，Ｓら．，Ｐｌａｎｔ Ｃ
ｅｌｌ ８：６９〜８０（１９９６））（類似性６１．６％、同一性４４．９％
）および特にはＬｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ（Ａｔｔｕｃｈｉ，Ｓら、Ｐｅｒｓ
ｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｓｕｂ
ｍｉｓｓｉｏｎ（０６／６／９６）ｔｏ ｔｈｅ ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／
ＤＤＢＪ ｄａｔａｂａｓｅ（１９９６）（類似性８５．９％、同一性６６．２
％）。
【０１８７】 対照的に、他のＮＡＤＰＨ依存性リダクターゼとの相同性は、有意に低かった
：例えば、Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ（Ｂｅｌｄ，Ｍら、Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：４９１〜５０２（１９８９））（類似性４３．２％、同
一性２１．５％）およびＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓ
ｅｎ，Ｋ．Ｎ．およびＲｏｈｄｅ，Ｗ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３０
：４９〜５９（１９９１））（類似性４６．２％、同一性２１．１％）由来のジ
ヒドロフラボノールリダクターゼ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ由来のカル
コンリダクターゼ（Ｂａｌｌａｎｃｅ、Ｇ．Ｍ．およびＤｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．，
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０７：１０２７〜１０２８（１９９５）（類似
性３９．５％、同一性１５．８％）、Ｓｅｓｂａｎｉａ ｒｏｓｔｒａｔａ由来
のカルコンリダクターゼ「ホモログ（相同体）」（Ｇｏｏｒｍａｃｈｉｎｇ，Ｓ
ら（１９９５）Ｄｉｒｅｃｔ Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ（１３−ＭＡＲ−１９９５
）ｔｏ ｔｈｅ ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ｄｅｔａｂａｓｅ）（
類似性４７．６％、同一性２４．１％）、Ｎｉｃａｒｄｉａ種由来のコレステロ
ールデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：１３８６〜１３９３（１９９１））（類似性４
６．６％、同一性２１．０％）、およびＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ由
来の３−β−ヒドロキシ−５−エン ステロイド デヒドロゲナーゼ（Ｚｈａｏ
，Ｈ．Ｆ．ら．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７：３２
３７〜３２３９（１９９０））（類似性４３．５％、同一性２０．６％）。
【０１８８】 従って、配列分析によって、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノ
ールリダクターゼと、イソフラボンリダクターゼと、推定イソフラボンリダクタ
ーゼ「ホモログ（相同体）」（イソフラボンリダクターゼ活性を有さない）との
間に有意な相同性が確立される。
【０１８９】 （実施例１４） （（−）−ピノレジノール／（−）−ラリシレジノールリダクターゼのｃＤＮ
Ａクローニング） （植物材料）ウエスタンレッドシダー（ｗｅｓｔｅｒｎ ｒｅｄ ｃｅｄｅｒ
）（西洋赤スギ）（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）をワシントン州立大学のグリ
ーンハウス研究所（ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｆａｃｉｌｉｔｙ）で育てた。
【０１９０】 材料。用いた全ての溶媒および化学物質は、試薬またはＨＰＬＣ等級であった
。Ｔａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび制限酵素（ＳａｃＩおよびＸｂａＩ
）をＰｒｏｍｅｇａから入手した。ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクターおよびコンピ
テントなＮｏｖａＢｌｕｅ細胞をＮｏｖａｇｅｎから購入し、そして放射線標識
したヌクレオチド（［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ）を、Ｄｕｐｏｎｔ ＮＥＮから購
入した。
【０１９１】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および配列決定のためのオリゴヌクレオチド
プライマーを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによ
って合成した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ（登録商標）キット（ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．）を、ＰＣＲフラグメントの精製のために用いた。このフラグメント
は、１．３％アガロースゲル中の低ＤＮＡ分子量ラダー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
に比較して決定した、ゲル精製したＤＮＡ濃度を有する。
【０１９２】 （計器）ＵＶ（ＯＤ２６０でのＲＮＡおよびＤＮＡ決定を含む）スペクトルを
、Ｌａｍｂｄａ ６ ＵＶ／ＶＩＳスペクトロフォトメーターで記録した。Ｔｅ
ｍｐｔｒｏｎｉｃ ＩＩサーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ）を、全ての
ＰＣＲ増幅に用いた。配列決定のためのプラスミドＤＮＡの精製は、ＱＩＡ Ｐ
ｌｕｓ プラスミド精製システム（Ｑｉａｇｅｎ）、続いて、ＰＥＧ沈殿（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、３巻、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１
９９４））、またはＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅ
ｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ自動シーケンサ
ーを用いて決定したＤＮＡ配列を用いる）を使用した。
【０１９３】 （Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ ｃＤＮＡライブラリー合成）。Ｌｅｗｉｎｓ
ｏｈｎら（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ，Ｅら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ
．１２：２０〜２５（１９９４））の方法に従って、グリーンハウスで育てたウ
エスタンレッドシダー（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）の若い新しい葉（葉柄を
含む）から、総ＲＮＡ（新鮮重量６．７μｇ／ｇ）を得た。Ｔ．ｐｌｉｃａｔａ
のｃＤＮＡライブラリーを３μｇの精製ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（Ｏｌｉｇｏｔｅ
ｘ−ｄＴＴＭＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ，Ｑｉａｇｅｎ）を用いて構築した。これに
は、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット、Ｕｎｉ ＺＡＰＴＭＸＲベクタ
ー、およびＧｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ＩＩ Ｇｏｌｄ パッケージング抽出
物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（主なライブラリーについては１．２×１０５ｐｆ
ｕの力価を有する）を用いた。増幅したライブラリー（７．１×１０８ｐｆｕ／
ｍｌ；総量２８ｍｌ）を、スクリーニングに用いた（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、第３巻、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９４））。
【０１９４】 （Ｔ．ｐｌｉｃａｔａ（−）−ピノレジノール／（−）−ラリシレジノールリ
ダクターゼｃＤＮＡ合成）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）ストラ
テジーによってｍＲＮＡから、Ｔ．ｐｌｉｃａｔａ（−）−ピノレジノール／（
−）−ラリシレジノールリダクターゼｃＤＮＡを得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、第３巻、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９４））。上記
のＴ．ｐｌｉｃａｔａ ｃＤＮＡライブラリーの合成のために以前に用いた精製
したｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。精製したｍＲＮＡ（１５０ｎｇ）
を、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）由来の
リンカープライマー（１．４μｇ）と混合し、１０分間７０℃に加熱し、そして
氷上で迅速に冷却した。次いで、変性したｍＲＮＡテンプレートおよびリンカー
プライマーの混合物をＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭ ＤＴＴ、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、およ
び２００単位のＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ）と混合した（最終用量２０μｌ）。この反応を、５０分間４２℃で
実行し、次いで加熱（７０℃、１５分間）によって停止した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒ
Ｎａｓｅ Ｈ（１．５単位、１μｌ）をこの溶液に添加し、そして３７℃で２０
分間インキュベートした。
【０１９５】 第一鎖反応（２μｌ）を次にテンプレートとして１００μｌＰＣＲ反応物（１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ、およ
び５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）中で、プライマーＣＲ６−ＮＴ（５’
ＧＣＡＣＡＴＡＡＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＡＡＧ３’）（配列番号６０）（１０ｐ
ｍｏｌ）およびプライマーＸｈｏＩ−ポリ（ｄＴ）（５’ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’）（配列番号５９）（１０ｐｍｏｌ）と
ともに用いた。アニーリング温度を５２℃で行ったこと以外は、記載（Ｄｉｎｋ
ｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ、Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９
４７３〜２９４８２（１９９６））のように、サーモサイクラー中で、ＰＣＲ増
幅を実行した。ＰＣＲ産物を１．３％アガロースゲルに溶解した。ここでは、予
期される長さ（約１，２００ｂｐ）を有する少なくとも２つのバンドが観察され
た。このバンドを、ゲルから抽出した。次いで、ゲル精製したＰＣＲ産物（５６
ｎｇ）をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（５０ｎｇ）に連結して、Ｎｏｖａｇｅ
ｎの指示に従って、コンピテントなＮｏｖａＢｌｕｅ細胞中に形質転換した。
【０１９６】 製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ）の指示に従って、迅速煮沸溶解およびＰＣＲ技術
を用いて、挿入されたｃＤＮＡのサイズおよび方向を決定した。これには、以下
のプライマーの組み合わせを用いた：Ｒ２０マー（配列番号７４）とＵ１９マー
（配列番号７５）；Ｒ２０マー（配列番号７４）とＣＲ６−ＮＴ（配列番号６０
）；Ｕ１９マー（配列番号７５）とＣＲ６−ＮＴ（配列番号６０）。この挿入さ
れたＤＮＡのＣＲ６−ＮＴプライマー末端は、ＴベクターのＵ１９マープライマ
ー側に隣接していた。このＴベクター（挿入されたｃＤＮＡを含む）を、Ｗｉｚ
ａｒｄ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて精製した。５つの挿入されたｃＤＮＡを
重複する配列決定プライマーを用いて完全に配列決定し、そしてポリアデニル化
部位が異なること意外は同一であることが示された。従って、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ発現システムを用いる酵素活性の検出のため、ｐｌｒ−Ｔｐ１と名づけら
れた最長のｃＤＮＡ（配列番号６１）を用いた。
【０１９７】 配列分析：Ｕｎｉｘ（登録商標）−ベースのＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐ
ａｃｋａｇｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎ
ｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，第８バージョン、１９９４年９月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａ
ｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１（１９９６）；Ｒｉｃｅ
，Ｐ．，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＥＧＣＧ Ｐａｃｋ
ａｇｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｒｉｃｅ，Ｔｈｅ Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｉｎ
ｘｔｏｎ Ｈａｌｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＣＢ１０ １Ｒｑ，Ｅｎｇｌａｎｄ
）、およびＥｘＰＡＳｙ Ｗｏｌｒｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ分子生物学サーバー（
Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｇｅｎｅｖａ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、ＤＮ
Ａおよびアミノ酸配列分析を実施した。
【０１９８】 （実施例１５） （Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジ
ノールリダクターゼのｃＤＮＡクローニングおよび発現） （Ｔ．ｐｌｉｃａｔａ（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールリ
ダクターゼｃＤＮＡクローニング）ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６１）をクローニ
ングおよび配列決定した後、ｐｌｒ−Ｔｐ１ ｃＤＮＡインサート（配列番号６
１）全体をプローブとして用いること以外は、実施例１１に記載のように、全長
クローンを用いてＴ．ｐｌｉｃａｔａ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。いくつかの陽性のクローンを配列決定した。これは、ｐｌｒ−Ｔｐ２と呼
ばれる、１つの新しい特有のｃＤＮＡ（配列番号６３）を表す。このｃＤＮＡは
、以下に記載のように、ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６２）と高い配列類似性を有
する（アミノ酸レベルで約８１％の類似性）が、ただし元のＦｏｒｓｙｔｈｉａ
ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａリダクターゼと同一の基質特異性特徴を有する、リダク
ターゼ（配列番号６４）をコードする。
【０１９９】 （酵素アッセイ）実施例８に記載するように（ただし以下の改変を伴い）、［３ Ｈ］ラリシレジノールおよび［３Ｈ］セコイソラリシレジノール（ｓｅｃｏｉ
ｓｏｌａｒｉｃｉｒｅｓｉｎｏｌ）の形成をモニタリングすることによって、ピ
ノレジノール（ｐｉｎｏｒｅｓｉｎｏｌ）およびラリシレジノールリダクターゼ
活性をアッセイした。簡略には、ピノレジノールリダクターゼ活性の各アッセイ
は、（±）−ピノレジノール（２０μｌ、ＭｅＯＨ中、５ｍＭ）および酵素調製
物（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ、２１０μｌ由来の総タンパク質抽出物）からなっ
た。この酵素反応は、［４Ｒ−３Ｈ］ＮＡＤＰＨ（蒸留水２０ｋμｌ中に１０ｍ
Ｍ、６．７９ｋＢｑ／ｍｍｏｌ）の添加によって開始された。振盪しながら３０
℃での３時間のインキュベーション後、このアッセイ混合物を、放射性化学キャ
リアとして、（±）−ラリシレジノール（２０μｇ）および（±）−セコイソラ
リシレジノール（２０μｇ）を含有するＥｔＯＡｃ（５００μｌ）で抽出した。
遠心分離（１３，８００×ｇ，５分）後、ＥｔＯＡｃ溶解物を取り出し、そして
抽出手順を繰り返した。各アッセイについて、液体シンチレーションカウンティ
ングを用いるその放射活性の決定のために取り出したアリコート（１００μｌ）
とＥｔＯＡｃ溶解物を合わせた。合わせたＥｔＯＡｃ溶解物の残滓をエバポレー
トして真空中で乾燥し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（３０：７０、１００μｌ）中に再構
成し、そして逆相カラムおよびキラルカラムＨＰＬＣに供した。
【０２００】 ラリシレジノールリダクターゼ活性を（＋）−［３Ｈ］セコイソラリシレジノ
ールの形成をモニタリングすることによってアッセイした。これらのアッセイを
、（±）−ラリシレジノール（５ｍＭ ＭｅＯＨ、２０μｌ）を基質として用い
たこと意外は、正確に上記の通り実行した。これには放射性化学キャリアとして
（±）−セコイソラリシレジノール（２０μｇ）を添加した。
【０２０１】 （Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６１）の発現）ｐｌｒ−Ｔ
ｐ１（配列番号６１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）のβガラクトシダーゼ遺伝子α相補性粒子とインフ
レームとなるように、ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６１）を、ＳａｃＩおよびＸｂ
ａＩを用いて、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクターから切り出し、ゲル精製し、次いで
これらの同じ酵素で消化した発現ベクターに連結した。このプラスミドであるｐ
ＰＣＲ−Ｔｐ１を、Ｎｏｖａｇｅｎの指示に従って、ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞中に
形質転換した。この形質転換した細胞（５ｍｌ培養物）を、５０μｇ／ｍｌのカ
ルベニシリンを補充したＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３巻、第３
版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９４））中で振盪（２２５ｒｐｍ）
しながら、３７℃で、中対数期まで（Ａ６００＝０．５〜０．７）増殖した。次
に、この細胞を遠心分離（１０００×ｇ、１０分）によって回収し、そして１０
ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル β−Ｄ−チオグルコピラノシド）および５０μ
ｇ／ｍｌカルベニシリンを補充した新鮮ＬＢ培地中に０．６の吸収（６００ｎｍ
で）まで再懸濁した。この細胞（一晩増殖させた）を、遠心分離によって回収し
、そして５００〜７００μｌ（５ｍｌの培養チューブあたり）の緩衝液（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ および５ｍＭ ＤＴＴ
）に再懸濁した。次に、この細胞を超音波（５×４５秒）によって溶解し、そし
て遠心分離（１７５００×ｇ、４℃、１０分）後、この上清を取り出して、そし
て上記のように、（−）−ピノレジノール／（−）−ラリシレジノールリダクタ
ーゼ活性についてアッセイした。コントロールは、インサートＤＮＡ（ネガティ
ブコントロールとして）なしに、または立体特異的コントロールとしてｐＰＬＲ
−Ｆｉ１（配列番号４７）（インフレームで標準のＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔ
ｅ（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレジノールリダクターゼのｃＤＮＡ
）を用いる、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ（−））、ならびにｐＰＬＲ−Ｔｐ
１（配列番号６１）（（４Ｒ）−３ＨＮＡＤＰＨ以外の基質を用いない）のアッ
セイを含んだ。
【０２０２】 この結果は、（−）−ラリシレジノールおよび（＋）−セコイソラリシレジノ
ールの両方が、放射線標識されたこと、そして放射線活性の取り込みが（−）−
セコイソラリシレジノールでは見いだされなかったことを示した。しかし、（＋
）−ラリシレジノールへの放射線標識の蓄積がまた観察された。ただし、（−）
−ラリシレジノールで観察された蓄積よりはかなり遅い速度であった。これらの
結果は、ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番号６２）が、基質として、（−）−ピノレジノ
ールおよび（＋）−ピノレジノールの両方を用い得ることを示す。前者は、（−
）−ラリシレジノールを介して完全に（＋）−セコイソラリシレジノールに変換
されており、後者は、（＋）−ラリシレジノールにかなり緩徐に変換されている
が、（−）−セコイソラリシレジノールにはさらに変換されていない。
【０２０３】 （Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐｌｒ−Ｔｐ２（配列番号６３）の発現）ｐｌｒ−Ｔ
ｐ２（配列番号６３）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）中のβガラクト
シダーゼ遺伝子α相補性粒子とインフレームであることが見出された。上記のよ
うに、活性および基質特異性について評価した場合、ｐｌｒ−Ｔｐ２（配列番号
６４）は、少量の（−）−ラリシレジノールがまた検出されたこと以外は、元の
Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａリダクターゼ（Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋ
ｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４７３〜２
９４８２（１９９６））と同じ基質特異性および産物形成を有することが見出さ
れた。これは、興味深いことである、なぜならｐｌｒ−Ｔｐ２（配列番号６４）
は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａリダクターゼに対してよりも、ｐｌｒ−Ｔｐ１（配列番
号６２）に対してより高い配列類似性を有するからである。
【０２０４】 上記の観察の全ては、対応するリグナンの単離を伴う、二重標識（ｄｅｕｔｅ
ｒｏｌａｂｅｌｅｄ）基質（±）−［９，９’−２Ｈ２、ＯＣ２Ｈ３］ピノレジ
ノールを用いて、確認した；次いで、それぞれを、キラルカラムクロマトグラフ
ィーおよびＨＰＬＣ質量スペクトル分析に供してこれらの知見を確認した。
【０２０５】 （実施例１６） （Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａおよびＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ
由来のさらなるピノレジノール／ラリシレジノールリダクターゼのクローニング
） ｐｌｒ−Ｔｐ２（配列番号６３）のクローニングについて実施例１５に記載し
たように、Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ若年株ｃＤＮＡライブラリーから、２つ
のさらなるピノレジノール／ラリシレジノールリダクターゼをクローニングした
。この２つのさらなるピノレジノール／ラリシレジノールリダクターゼを、ｐｌ
ｒ−Ｔｐ３（配列番号６５）およびｐｌｒ−Ｔｐ４（配列番号６７）と名付けた
。
【０２０６】 ｐｌｒ−Ｔｐ２（配列番号６３）のクローニングについて実施例１５に記載し
たように、Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ若年株ｃＤＮＡライブラリー
から、２つのさらなるピノレジノール／ラリシレジノールリダクターゼをクロー
ニングした。Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ由来のこの２つのさらなる
ピノレジノール／ラリシレジノールリダクターゼを、ｐｌｒ−Ｔｐ３（配列番号
６９）およびｐｌｒ−Ｔｐ４（配列番号７１）と名付けた。
【０２０７】 （実施例１７） （Ｔｈｕｊａ ｐｉｃａｔａ由来のさらなるディリジェントタンパク質ｃＤＮ
Ａをクローニングする） ディリジェントタンパク質（配列番号７８）をコードする、さらなるｃＤＮＡ
（Ｔｐ９（配列番号７７）と呼ばれる）を、以下の様式でウエスタンレッドシダ
ー（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）から抽出したｍＲＮＡからクローニングした
。他のウエスタンレッドシダーディリジェントタンパク質アイソフォームに見出
された高度に保存された配列モチーフから誘導されたプライマーＣＳ１−８９５
Ｎ（５’−ＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＴＡ−３’）（配
列番号７９）を用いて、ウエスタンレッドシダーｃａｍｂｉｕｍ ＲＮＡから一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＮＡｓｅ Ｈ
逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ
）を用いて、製造業者のプロトコールに従って、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次
いで、この一本鎖ｃＤＮＡの３’末端を、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用
いて、ｄＡＴＰでテーリングした。以下のプライマーを用いて、ＥｘｐａｎｄＴ Ｍ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって、テーリングしたｃ
ＤＮＡを増幅した：一回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとして、オリゴｄ
Ｔアンカープライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３’（配列番号８０）（ここで、オリゴ
ｄＴ−アンカープライマーの３’末端の「Ｖ」は、Ａ，Ｃ，またはＧを示す）を
、そして３’プライマーとしてプライマーＣＳ１−８９５Ｎ（配列番号７９）を
利用した：二回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとして、ＰＣＲアンカープ
ライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−３’（配列
番号８１）を、そして３’アンチセンスプライマーとしてプライマーＣＳ１−８
７４Ｎ（５’−ＡＧＴＡＡＴＡＧＧＡＴＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣ−３’）（配列番
号８２）を利用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：第一サイクル、９４℃
１分；２６サイクルの第二サイクル、９４℃３０秒、次いで５６℃４５秒、次い
で７２℃２分；２７サイクル、７２℃７分間。得られたＰＣＲ産物（配列番号７
７の核酸残基１〜２５３に相当する）を、ゲル精製し、ＴＡクローニングキット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてクローニングし、
そして配列決定してディリジェントタンパク質遺伝子を同定した。
【０２０８】 ＰＣＲ産物の３末領域（配列番号７７の核酸残基１〜２５３に相当する）を完
成するため、オリゴｄＴアンカープライマー（配列番号８０）を用いて、一本鎖
ｃＤＮＡを生成した。以下のＰＣＲプライマーを用いて、全長Ｔｐ９ ｃＤＮＡ
（配列番号７７）をクローニングした：一回目のＰＣＲは、５’センスプライマ
ーとして、プライマーＲＴ−ＣＳ−Ｃ１（−）５０ｓ（５’−ＣＣＡＡＣＴＴＣ
ＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＡＧＡＡ−３’（配列番号８３）を、そして３’アン
チセンスプライマーとしてオリゴｄＴアンカープライマー（配列番号８０）を利
用した：二回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとして、プライマーＲＴ−Ｃ
Ｓ−Ｃ１（−）３１ｓ（５’−ＣＡＧＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡ
ＴＴ−３’（配列番号８４）を、そして３’アンチセンスプライマーとしてＰＣ
Ｒアンカープライマー（配列番号８１）を利用した；３回目のＰＣＲは、５’セ
ンスプライマーとして、プライマーＲＴ−ＣＳ−Ｃ１（−）１３ｓ（５’−ＴＴ
ＴＡＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＴＣＴ−３’（配列番号８５）を、そ
して３’アンチセンスプライマーとしてＰＣＲアンカープライマー（配列番号８
１）を利用した。各回のＰＣＲの反応条件は以下の通りであった：第一サイクル
、９４℃１分；２６サイクルの第二サイクル、９４℃３０秒、次いで５６℃４５
秒、次いで７２℃２分；２７サイクル、７２℃７分間。全長Ｔｐ９ ｃＤＮＡ配
列（配列番号７７）を、ＥｘｐａｎｄＴＭＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ
システムを用いるＴｐ９遺伝子の直接ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２０９】 （実施例１８） （Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ由来のディリジェントタンパク質クローンＴｐ
３（配列番号２４）およびＴｐ４（配列番号２６）の５’末端を完成する） Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ ディリジェントタンパク質クローンＴｐ３（配
列番号２４）およびＴｐ４（配列番号２６）のヌクレオチド配列は、その５’末
端で不完全であった。ゲノムＤＮＡ分析によって、ウエスタンレッドシダーディ
リジェントタンパク質遺伝子が、イントロンを含まないことが示された。結果と
して、製造業者の指示に従って、Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＰＣＲ
Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を利用することによ
り、Ｔｐ３（配列番号２４）およびＴｐ４（配列番号２６）の部分的ｃＤＮＡ配
列を完成することが可能であった。
【０２１０】 全長Ｔｐ３ ｄｉｒｉｇｉｅｎｔタンパク質（配列番号８７）をコードするｃ
ＤＮＡクローン（配列番号８６）を、テンプレートとしてＴｈｕｊａ ｐｌｉｃ
ａｔａゲノムＤＮＡを、そして以下のプライマーを用いるＰＣＲによってクロー
ニングした：一回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとして、プライマーＡＰ
１（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号８
８）を、そして３’アンチセンスプライマーとしてプライマーＴｐＳ４−２１３
ｎ（５’−ＡＧＡＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡ−３’
）（配列番号８９）を利用した：二回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとし
て、プライマーＡＰ２（５’−ＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＧＣＧＴＧＧＴ−３’
（配列番号９０）を、そして３’アンチセンスプライマーとしてプライマーＴｐ
Ｓ４−１９９ｎ（５’−ＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴ
ＧＣＡ−３’）（配列番号９１）を利用した；３回目のＰＣＲは、５’センスプ
ライマーとして、ＡＰ２（配列番号９０）を、そして３’アンチセンスプライマ
ーとして、プライマーＴｐＳ４−１８８ｎ（５’−ＣＡＡＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴ
ＧＴＴＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＡＴ−３’（配列番号９２）を利用した。
【０２１１】 全長のＴｐ４ ｄｒｉｇｅｎｔタンパク質（配列番号９４）をコードするｃＤ
ＮＡクローン（配列番号９３）を、テンプレートとしてＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａ
ｔａゲノムＤＮＡを、そして以下のプライマーを用いるＰＣＲによってクローニ
ングした：一回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとして、プライマーＡＰ１
（配列番号８８）を、そして３’アンチセンスプライマーとしてプライマーＣＳ
１０−８２６Ｎ（５’−ＣＡＧＴＣＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣ
ＣＴ−３’）（配列番号９５）を利用した：二回目のＰＣＲは、５’センスプラ
イマーとして、プライマーＡＰ２（配列番号９０）を、そして３’アンチセンス
プライマーとしてプライマーＣＳ１０−８１４Ｎ（５’−ＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣ
ＴＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡ−３’）（配列番号９６）を利用した；３
回目のＰＣＲは、５’センスプライマーとして、ＡＰ２（配列番号９０）を、そ
して３’アンチセンスプライマーとして、プライマーＣＳ１０−７９５Ｎ（５’
−ＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＣＡＴＴ−３’（配列番号
９７）を利用した。
【０２１２】 配列番号８６および配列番号９３に示される核酸配列を有する全長Ｔｐ３およ
びＴｐ４ ｄｒｉｇｉｅｎｔタンパク質クローンをクローニングするための反応
条件は以下の通りであった：１回目のＰＣＲは、９４℃１分の第一サイクル、第
二サイクル８回、９４℃２５秒、次いで７２℃１２分からなる一次ＰＣＲ、続い
て９４℃１分の第一サイクル、９４℃２０秒の第二サイクル、ついで７２℃６分
の３３サイクルからなる二次ＰＣＲ、ならびに最後に６８℃１２分の３４サイク
ルを含んだ；ＰＣＲの２回目および３回目は各々、９４℃１分間の第一サイクル
、次いで９４℃３０秒、次いで６０℃４５秒、次いで７２℃２分の２６サイクル
の第二サイクル、次いで７２℃７分の２７サイクル、からなった。
【０２１３】 ゲノムＤＮＡ由来の全長Ｔｐ３（配列番号８６）およびＴｐ４（配列番号９３
）の配列を完成する能力は、ｃＤＮＡプールからの全長配列を完成する難しさを
克服する。ＲＮＡの不安定性またはＲＮＡの二次構造に起因して、標的ｃＤＮＡ
の一本鎖ｃＤＮＡの不完全な合成がしばしが生じ、そしてこれは一本鎖ｃＤＮＡ
の不完全な合成を生じる。
【０２１４】 （実施例１９） （Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓからディリジェントタンパク質ｃＤＡ
Ｎをクローニングする） ウエスタンレッドシダーのＴｐ９ ｃＤＮＡ（配列番号７７）のクローニング
のために用いたストラテジーを利用して、Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ
からディリジェントタンパク質（配列番号９９）をコードするｃＤＮＡ（配列番
号９８）を単離した。オリゴｄＴアンカープライマー（配列番号８０）を用いて
、Ｅ．ｕｌｍｏｉｄｅｓ ｌｅａｆ ＲＮＡから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅで、一本
鎖ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡから、３００ｂｐのｃＤＮＡフラグメン
ト（配列番号９８のヌクレオチド１５２〜４５２に相当する）を、他のｄｉｒｉ
ｇｉｅｎｔタンパク質アイソフォームの中でも高度に保存された配列から誘導さ
れた、Ｎ末端プライマー５’−ＧＡＲＴＴＧＧＴＧＴＴＣＴＡＴＴＴＣＣＡＣＧ
ＡＣＡＴＭＣ−３’（配列番号１００）（ここで「Ｒ」は、ＡまたはＧを示し、
そして「Ｍ」は、ＡまたはＣを示す）、およびＣ末端プライマー５’−ＣＡＡＡ
ＧＴＧＧＣＡＡＣＣＣＣＴＧＴＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１０１）を用い
て増幅した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：第一サイクル９４℃１分、
第二サイクルは以下、２６回サイクル、９４℃３０秒、次いで５０℃４５秒、次
いで７２℃２分、および７２℃７分の２７サイクル。
【０２１５】 ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてＴＡクローニングキットを用いてクローニン
グした。次いで、このフラグメントを用いて遺伝子特異的プライマーを設計して
完全な配列をクローニングした。失われた５’領域をクローニングするため、遺
伝子特異的３’−アンチセンスＳｐ２プライマー（５’−ＣＣＣＣＣＧＴＴＣＣ
ＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＧ−３’）（配列番号１０２）を用いて、ＳｕｐｅｒＳ
ｃｒｉｐｔＴＭＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ａｓｅで、一本鎖ｃＤＮＡを合成し、そしてこの一本鎖ｃＤＮＡの３’末端をタ
ーミナルトランスフェラーゼを用いてｄＡＴＰでテーリングした。オリゴｄＴ−
アンカープライマー（配列番号８０）およびＳｐ２プライマー（配列番号１０２
）を用いるＥｘｐａｎｄ ＴＭ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム
によって、このテーリングしたｃＤＮＡを増幅した。次いで、ＰＣＲアンカープ
ライマー（配列番号８１）およびＳｐ２プライマー（配列番号１０２）を用いて
、２回目のＰＣＲを実施した。このＰＣＲ産物をゲル精製し、ＴＡクローニング
キットを用いてクローニングした。得られた部分的ｃＤＮＡは、配列番号９８の
核酸残基１〜４１３に相当した。ＰＣＲ反応条件は、第一回目および２回目のＰ
ＣＲと同じであり、そして以下のとおりであった：第一サイクル９４℃１分、第
二サイクルは以下、２６回のサイクルの９４℃３０秒、次いで５０℃４５秒、次
いで７２℃２分、そして７２℃７分の２７サイクル。
【０２１６】 失われた３’領域を得るため、オリゴｄＴアンカープライマー（配列番号８０
）を用いて、一本鎖ｃＤＮＡを生成した。全長Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｃＤＮＡ（配
列番号９８）を、以下の１セットのネスト化プライマーを用いるＰＣＲの連続し
た２回によって増幅した：５’センスプライマーＳｐＮ１（５’−ＧＧＣＣＣＡ
ＴＧＣＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＡＴＴＣＴＣＣ−３’）（配列番号１０３）および
ＳｐＮ２（５’−ＣＣＴＣＴＡＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣ
Ｃ−３’）（配列番号１０４）、および３’アンチセンスプライマーとして、配
列番号８０および配列番号８１に示される核酸配列を有するプライマー。第一回
および第二回の両方のＰＣＲについての反応条件は以下のとおりであった：第一
サイクル９４℃１分、第二サイクルは以下、２６回のサイクルの９４℃３０秒、
次いで５０℃４５秒、次いで７２℃２分、７２℃７分の２７サイクル。
【０２１７】 このＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてＴＡクローニングキットを用いてクロー
ニングした。対応するＥｕｃｏｍｍｉａ ｄｉｒｉｇｉｅｎｔタンパク質遺伝子
の配列決定および直接ＰＣＲ増幅によって、全長ｃＤＮＡの同一性（配列番号９
８）を確認した。
【０２１８】 （実施例２０） （Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓからのディリジェントタンパク
質ｃＤＮＡのクローニング） ディリジェントタンパク質（配列番号１０６）をコードするｃＤＮＡを、以下
の様式でＳｃｈｉｓａｎｄｒａ Ｃｈｉｎｅｎｓｉｓから抽出したｍＲＮＡから
クローニングした。ｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ Ｃｈｉｎ
ｅｎｓｉｓの葉および茎組織から作製した。ｃＤＮＡライブラリーを、３２Ｐ−
ＣＴＰ−標識Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａディリジェントタンパク質遺伝子（Ｐｓ
ｄ−Ｆｉｌ）（配列番号１２）をプローブとして使用して、同種ディリジェント
タンパク質クローンについてプローブした。３ラウンドのスクリーニングを使用
した。各スクリーニングについて、プラークをナイロン輸送膜に３分間置き、次
いで、移されたＤＮＡを、１００℃で３分間のオートクレービングにより膜に固
定し、そして細片を、３７℃で３０分間２Ｘ ＳＳＣを用いて膜から洗浄した。
プレハイブリダイゼーション溶液は、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試
薬、および０．５％ ＳＤＳからなった。５０μｌのプローブ（配列番号１２）
をＴ７ Ｑｕｉｃｋ−Ｐｒｉｍｅ Ｋｉｔを用いて作製した。１００μｌの５ｍ
ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、および８５０μｌの脱イオン化蒸留水を、次いで、
このプローブに添加した。ハイブリダイゼーション溶液は、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ
Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ ＳＤＳおよびプローブ（配列番号１２）か
らなった。
【０２１９】 第一のスクリーニングについて、プラークを有するナイロン膜フィルターを４
８〜４９℃で、７．５時間、プレハイブリダイズした。次いで、このフィルター
を、１．１３×１０７ｃｐｍ放射標識プローブ（配列番号１２）の存在下、４９
℃で、一晩（約１７時間）ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、こ
のフィルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで１０分間洗浄し、次いで、
２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで室温（約２０℃〜約２４℃）で９分間洗浄し
、次いで、２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで、室温（約２０℃〜約２４℃）から
４９℃に温めて、５０分間洗浄した。最後に、このフィルターを、６Ｘ ＳＳＣ
で簡単にリンスし、その後、１．５日間フィルムに曝露した。
【０２２０】 第二のスクリーニングについて、プラークを有するナイロン膜フィルターを、
４９℃で８時間プレハイブリダイズした。次いで、これらのフィルターを、３．
９×１０６ｃｐｍ放射標識プローブ（配列番号１２）の存在下、４９℃で、一晩
（約１６時間）ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、これらのフィ
ルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで、室温で５〜２０分間洗浄し、次
いで、６Ｘ ＳＳＣで簡単にリンスし、その後、一晩フィルムに曝露した。
【０２２１】 第三のスクリーニングについて、プラークを有するナイロン膜フィルターを４
５℃で一晩ハイブリダイズした。次いで、これらのフィルターを、１．２×１０６ ｃｐｍ放射標識プローブ（配列番号１２）の存在下、４５℃で、一晩（約１８
時間）ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、これらのフィルターを
、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで、１０分間洗浄し、次いで、２Ｘ ＳＳＣ
、０．５％ ＳＤＳで、室温（約２０℃〜約２４℃）で２分間洗浄した。最後に
、これらのフィルターを、６Ｘ ＳＳＣで簡単にリンスし、その後４日間フィル
ムに曝露した。
【０２２２】 ３つのラウンドのスクリーニングの後、１つの陽性プラークを単離した。この
プラークからのｃＤＡＮを、続いて、切断し、そしてＳＯＬＲ細胞（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏ
ｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ ９２０３７）にク
ローニングした。配列分析は、それが全長クローンであることを示し、そして相
同性分析は、それが、アミノ酸レベルで、他の既知のディリジェントタンパク質
に、５１〜７２％同一であり、そして６３〜８０％類似することを確立した。
【０２２３】 （実施例２１） （Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍからの、ピノレジノール／ラリシ
レジノールレダクターゼｃＤＮＡのクローニング） ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質（配列番号１０８
）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１０７）を、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓ
ｓｉｍｕｍ（Ｆｌａｘ）から抽出したｍＲＮＡから、以下の様式でクローニング
した。全ＲＮＡを、温室で成長されたＬ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ植物の２
週齢の輪生体（各々は、１０の発達中のアマの種を含む）から得た。ポリ（Ａ）＋ ｍＲＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ（登録商標）ｍＲＮＡ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して精製した。Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓ
ｓｉｍｕｍの種のｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＺＡＰ−ｃ
ＤＮＡ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＫｉｔおよびＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録
商標）Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ＩＩＩ Ｇｏｌｄクローニングキットを共
に５μｇの精製ｍＲＮＡを使用して、主要ライブラリーについて２．８×１０５ ｐｆｕ（プラーク形成単位）の力価で、構築した。増幅されたライブラリー（２
．８×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）からの約３５ｍｌの液体ファージ溶解物を、ＰＣＲ
スクリーニングについて、純粋なｃＤＮＡライブラリーＤＮＡを得るために使用
した。
【０２２４】 以下の縮重プライマーを、Ｎ末端、Ｃ末端、およびＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉａおよびＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ（Ｗｅａｔｅｒｎ ｒｅｄ
ｃｅｄａｒ）ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼクローンにおい
て見出される類似性の内部領域に基づいて設計した：ＰＬＲ４正方向プライマー
（５’−ＣＣＩＴＣＩＧＡＧＴＴＣＧＧＩＡＴＧＧＡＴＣＣＩ−３’）（配列番
号１０９）、およびＰＬＲ６逆方向プライマー（５’−ＩＧＴＡＴＡＴＴＴＩＡ
ＣＴＴＣＩＧＧＧＴＡ−３’）（配列番号１１０）。純粋なＬ．ｕｓｉｔａｔｉ
ｓｓｉｍｕｍ ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡ（約５ｎｇ）を、４５μｌＰＣＲ反
応におけるプライマーとして、種々のプライマーとの組合せで使用した。ＰＣＲ
増幅を、以下のように、Ａｍｐｌｉｔｒｏｎ（登録商標）ＩＩサーモサイクラー
において実施した：９４℃で１分間、次いで３７℃で１分間、次いで７２℃で３
分間の５サイクル、次いで９４℃で２５秒、次いで４８℃で１分間、および７２
℃で３分間の２５サイクル；７２℃で１０分間、および最後のサイクル後に４℃
で無制限に保持した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで分離した。それらの
各々のプライマーの組合せによって予測された正確なサイズの単一バンドを生成
する反応物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴｏｐｏ−ＴＡクローニング（登録商標
）Ｋｉｔを使用してクローニングし、そして配列決定した。このラウンドのＰＣ
Ｒにより、約６００ｂｐの部分長ｃＤＮＡクローン（配列番号１１１）を得た。
【０２２５】 部分長クローン（配列番号１１１）を、３２Ｐ放射標識プローブとして、全長
配列を単離するために、使用した。Ｌ．ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍの増幅ｃＤ
ＮＡライブラリーの５００，０００ｐｆｕをプレートし、プラークを、Ｍａｇｎ
ａ Ｎｙｌｏｎ膜サイクル上にブロットし、そしてこのライブラリーを以下のよ
うにスクリーニングした。ブロットした膜をＷｈａｔｍａｎ ３ＭＭ Ｃｈｒ．
Ｐａｐｅｒの２つの層の間に配置した。ｃＤＮＡライブラリーファージＤＮＡを
、これらの膜に固定し、そして高速排気の、１００℃で４分間のオートクレービ
ングによって、１工程で変性させた。これらの膜を、３７℃で穏やかに振盪しな
がら、６Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で３０分間洗浄し、そして結晶化
皿（１９０Ｘ７５ｍｍ）において、予め温められた６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ Ｓ
ＤＳおよび５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（ハイブリダイゼーション溶液、２２０
ｍｌ）中で、５７℃で穏やかに振盪しながら５時間プレハイブリダイズした。
【０２２６】 ３２Ｐ放射標識プローブ（配列番号１１１）を変性し（９８℃で１０分間）、
急速に冷却し（氷上で１５分間）、そして結晶化皿（１５０Ｘ７５ｍｍ）中の予
め加熱されたハイブリダイゼーション溶液（５７℃で５０ｍｌ）に添加した。次
いで、このプレハイブリダイズされた膜を、この皿に添加し、次いでこの皿をプ
ラスティックのラップで覆った。ハイブリダイゼーションを５7℃で１７時間、
穏やかに振盪しながら行った。これらの膜を、４Ｘ ＳＳＣおよび０．５％ Ｓ
ＤＳ（２５０ｍｌ）中で、室温で得５分間洗浄し、予め温められた２Ｘ ＳＳＣ
および０．５％ ＳＤＳ（２５０ｍｌ）に移し、そして５７℃で２０分間、穏や
かに振盪しながらインキュベートした。これらの膜を皿から取り除き、そしてプ
ラスティックラップでラップした後、それらを、増感スクリーンに間で、−８０
℃で２４時間Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＡＲフィルムに曝露した。より大きい
ｃＤＡＮクローン（配列番号１１２）が得られたが、Ｌ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
ｃＤＮＡ ｐｌｒ−Ｆｉｌ（配列番号４７）と比較して、それは、なお、Ｎ末
端において約２５８ｂｐを欠いた。
【０２２７】 全長クローンを達成するために、遺伝子特異的プライマー１（５’−ＡＡＣＡ
ＴＴＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＣ−３’）（配列番号１
１３）および遺伝子特異的プライマー２（５’−ＡＡＧＧＴＡＧＡＴＣＡＴＣＡ
ＧＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＣＧ−３’）（配列番号１１４）を設計し、そし
てＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｕｎｉ−ＺＡＰ（登録商標）ＸＲベクターＴ７（５’
−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’）（配列番号１１５）
およびＴ３（５’−ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３’）（配列
番号１１６）プライマーと組合せて使用した。９３６ｂｐ遺伝子（配列番号１０
７）（これは、全ての以前の短縮型クローンからの同一な配列情報を含む）は、
アミノ酸レベルで、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡ ｐｌｒ−Ｆｉｌ（配
列番号４７）に対して、約７４％の類似性および約６１％の同一性を示した。
【０２２８】 （実施例２２） （Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓからのピノレジノール／ラリシ
レジノールレダクターゼｃＤＮＡのクローニング） ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質（配列番号１１８
）をコードするｃＤＮＡ（配列番号１１７）を、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉ
ｎｅｎｓｉｓから抽出したｍＲＮＡから、以下の様式でクローニングした。縮重
プライマーＰＬＲ４（配列番号１０９）およびＰＬＲ（配列番号１１０）を、既
知のレダクターゼクローンの間の高い相同性の領域から作製し、そしてこれらを
、ＰＣＲによりガイドされたストラテジーを使用して、Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ
ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ葉および茎組織ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ために使用した。Ｓｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ葉ｃＤＮＡライブ
ラリーを最初に、以下の条件下でテンプレートとして使用した：９５℃で１分間
、３７℃で１分間および７２℃で３分間の５サイクル、次いで、９４℃２５分間
、４８℃で１分間および７２℃で２分間の２５サイクル。得られた産物のゲル分
析において、ｃＤＮＡバンドは見られず、次いで、この得られた産物は、以下の
条件下での、別のラウンドのＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。９５
℃で１分間、３７℃で１分間、７２℃で３分間の５サイクル、次いで、９４℃で
２５分間、４８℃で１分間、７２℃で２分間の２５サイクル。
【０２２９】 ６００ｂｐのＰＣＲ産物を得、これを次いで、ＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクロ
ーニングし、そして部分的に配列決定して、配列番号１１９の配列を得た。配列
分析は、それが、アミノ酸レベルで、Ｆ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｃＤＮＡ ｐ
ｌｒ−Ｆｉｌ（配列番号４７）に対して、５５．７％同一であり、そして６７．
０％類似することを示した。このＰＣＲ産物（配列番号１９に記載される核酸配
列を含む）は、次いで、３２Ｐ−ＣＴＰプローブを作製するために使用され、そ
してこのｃＤＮＡライブラリーが、再度、３ラウンドのスクリーニングを使用し
てプローブされた。
【０２３０】 第一のスクリーニングについて、ｃＤＮＡライブラリープラークを、ナイロン
輸送膜に３分間移し、次いで、１００℃で３分間のオートクレービングによって
膜に固定した。細片を、２Ｘ ＳＳＣを用いて、３７℃で３０分間、膜から洗浄
し、次いで、これらの膜を、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬および
０．５％ ＳＤＳからなるプレハイブリダイゼーション溶液中で、４８℃で６時
間インキュベートした。フィルターを次いで、ハイブリダイゼーション溶液（６
Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ ＳＤＳ）（１００μｌの
５ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、８５０μｌのｄｄＨ２Ｏおよび９．６×１０５ ｃｐｍのプローブを含む）中で、４５℃で２４時間ハイブリダイズした。次いで
、これらのフィルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで５分間、次いで２
Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで２０分間洗浄し（室温で）、次いで４ＸＳＳＣ
で簡単にリンスし、そしてオートラジオグラフィーフィルムに５日間曝露した。
【０２３１】 第二のスクリーニングを、フィルターを４８℃で２４時間プレハイブリダイズ
し、次いで１．３７×１０６ｃｐｍのプローブの存在下で、４８℃で２４時間ハ
イブリダイズすることを除いて、第一のスクリーニングと同じ条件下で行った。
このフィルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで、室温で５分間洗浄し、
次いで、室温で６Ｘ ＳＳＣ中で簡単にリンスし、そしてフィルムに一晩曝露し
た。
【０２３２】 第三のスクリーニングを、フィルターを４８℃で２４時間プレハイブリダイズ
し、次いで２．２×１０６ｃｐｍのプローブの存在下で、４８℃で３７時間ハイ
ブリダイズすることを除いて、第一のスクリーニングと同じ条件下で行った。こ
のフィルターを、以下の条件下、室温で洗浄した：４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ Ｓ
ＤＳで５分間、次いで、２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで５分間、６Ｘ ＳＳ
Ｃ中で簡単にリンスし、そしてフィルムに一晩曝露した。
【０２３３】 １つの陽性プラークを、先の３ラウンドのスクリーニングの後に同定および単
離した。このプラークを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに切断し、ＳＯＬ
Ｒ細胞にクローニングし、そして配列決定した（配列番号１１９）。配列分析は
、このクローン（配列番号１１９）が部分長のレダクターゼタンパク質（配列番
号１２０）をコードすることを示し、この部分長のレダクターゼタンパク質は、
ペプチドレベルでＦ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＰＬＲに５７．４％同一であり、
７８．７％類似した。しかし、１塩基フレーム−シフト変異（位置５７９でのア
デニンの欠失）が、全長タンパク質の発現を阻害する全長クローン（配列番号１
１９）に存在した。
【０２３４】 次いで、この全長クローン（配列番号１１９）を、３２Ｐ−ｄＣＴＰプローブ
を作製するために使用し、そしてこのライブラリーを以下の様式でさらにスクリ
ーニングした。第一のスクリーニングにおいて、ｃＤＮＡライブラリープラーク
をナイロン輸送膜に３分間移し、次いで１００℃３分間、オートクレービングに
よって膜に固定した。細片を、２Ｘ ＳＳＣを用いて、３７℃で３０分間膜から
洗浄し、次いでこの膜を、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５
％ ＳＤＳからなるプレハイブリダイゼーション溶液中で、４７℃で１８時間イ
ンキュベートした。このフィルターを次いで、ハイブリダイゼーション溶液（６
Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ ＳＤＳ）（１００μｌの
５ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、８５０μｌの脱イオン化蒸留水および９．３×
１０６ｃｐｍのプローブを含む）中で、４７℃で２４時間ハイブリダイズした。
次いで、これらのフィルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで５〜１０分
間室温で洗浄し、次いで室温で６Ｘ ＳＳＣで簡単にリンスし、そしてオートラ
ジオグラフィーフィルムに一晩曝露した。
【０２３５】 第二のスクリーニングを、フィルターを４５〜４７℃で８時間２０分間プレハ
イブリダイズし、次いで７．５×１０６ｃｐｍのプローブの存在下で、４０〜４
７℃で一晩ハイブリダイズすることを除いて、第一のスクリーニングと同じ条件
下で行った。このフィルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで、１０分間
洗浄し、次いで、その期間の間、温度を４２℃に上昇させつつ２．５Ｘ ＳＳｃ
、０．５％ ＳＤＳで１０分間洗浄し、そして最後に、室温で６Ｘ ＳＳＣ中で
簡単にリンスして、そしてフィルムに一晩曝露した。
【０２３６】 第三のスクリーニングを、フィルターを４７℃で１１時間プレハイブリダイズ
し、次いで１．８×１０６ｃｐｍのプローブの存在下で、４７℃で一晩（約１４
時間）ハイブリダイズすることを除いて、第一のスクリーニングと同じ条件下で
行った。このフィルターを、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳで室温で１０分間
、次いで、室温で６Ｘ ＳＳＣ中で簡単にリンスし、そしてフィルムに約２４時
間曝露した。
【０２３７】 ２つの陽性プラークを、先の３ラウンドのスクリーニングの後に同定した。各
々を切断し、ＳＯＬＲ細胞にクローニングし、そして配列決定した。もちろん、
１つのクローン（配列番号１１７）は、それがインフレームであることを除いて
、配列番号１１９に記載される配列を有するクローンに同一である全長レダクタ
ーゼであった。他のクローンは、全長ではなかった。全長レダクターゼｃＤＮＡ
（配列番号１１９）は、ｐＢａｄ−ＴＯＰＯ−ＴＡ発現ベクターにクローニング
された。
【０２３８】 先のピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼｃＤＮＡおよびタンパク
質の特性および配列比較に基づいて、本発明の現在のところ好ましいピノレジノ
ール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質は、ＮＡＤＰＨを補助因子とし
て利用し、そして保存的アミノ酸配列ドメインＧｌｙ Ｘａａ Ｇｌｙ Ｘａａ
Ｘａａ Ｇｌｙ（配列番号７６）を含む。
【０２３９】 （実施例２３） （ディリジェントタンパク質をコードするさらなる核酸分子のクローニング） ディリジェントタンパク質をコードするさらなる核酸分子は、種々のストラテ
ジーを利用してクローニングされ得る。１つのアプローチにおいて、ゲノムＤＮ
ＡまたはｃＤＮＡは、以下のプライマー対を使用して、ＰＣＲによって増幅され
得る：プライマーＰＳ−６Ｆｏｒ ５’−ＫＧＴＧＴＴＹＧＡＹＧＡＴＣＣＹＡ
ＴＴＡＣＹＢＴＷＧＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１２０）およびプライマーＰＳ
−２Ｒｅｖ ５’−ＴＧＲＣＴＡＭＧＴＡＷＡＣＴＹＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡ
ＡＡＧ−３’（配列番号１２１）。ＰＣＲ反応の配列が、以下の表４に記載され
る。代表的なＰＣＲ反応条件は、以下の表６に記載される通りであるが、プライ
マーＰＳ−６Ｆｏｒ（配列番号１２０）およびＰＳ−６Ｒｅｖ（配列番号１２１
）が、プライマーＰＬＲ４正方向（配列番号１０９）およびＰＬＲ６逆方向（配
列番号１１０）の代わりに利用されることを除く。
【０２４０】
【表４】 得られた核酸分子は、全長または実質的に全長のディリジェントタンパク質ｃ
ＤＮＡまたは遺伝子を単離するために、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。代表的なライブラリ
ーのスクリーニング条件は、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．
５％ ＳＤＳ中での、５５〜５８℃で１２時間のハイブリダイゼーション、続く
２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中での、５５〜５８℃で３０分間の洗浄である
。任意のさらなる洗浄は、１Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で、５５〜５８℃
で３０分間、所望ならば、次いで、さらなる任意の０．５Ｘ ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳ中での５５〜５８℃で３０分間の洗浄が実施され得る。
【０２４１】 別のアプローチにおいて、ディリジェントタンパク質をコードするゲノムＤＮ
Ａ分子は、プライマーＰＳ−６Ｆｏｒ（配列番号１２０）またはプライマーＰＳ
−２Ｒｅｖ（配列番号１２１）のいずれか、およびアダプタープライマー（これ
は、ＰＣＲ反応における核酸分子の標的集団を形成するゲノムＤＮＡフラグメン
トの末端に連結されたオリゴヌクレオチドアダプターの１つの鎖に相補的である
）を利用するＰＣＲによってクローニングされ得る。アダプター分子は、当業者
に周知であり、そして例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、第８
章（この章は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。表５は、３
つの代表的な、ＰＣＲサイクリング様式を記載し、この様式は、ディリジェント
タンパク質をコードするゲノムＤＮＡ分子をクローニングするために、本発明の
この局面において使用され得る。代表的なＰＣＲ反応条件が表６に記載されるが
、プライマーＰＳ−６Ｆｏｒ（配列番号１２０）またはプライマーＰＳ−２Ｒｅ
ｖ（配列番号１２１）、およびアダプター配列が、プライマーＰＬＲ４正方向（
配列番号１０９）およびＰＬＲ６逆方向（配列番号１１０）の代わりに利用され
ることを除く。
【０２４２】
【表５】 なお別のアプローチにおいて、ディリジェントタンパク質をコードする核酸分
子は、テンプレートとしてのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡおよび縮重プライマー
のプールを利用するＰＣＲによってクローニングされ得る。本発明のこの局面に
有用な例示的なＰＣＲサイクリング様式は、アニーリング温度が、４５℃〜５０
℃であることを除いて、上の表５のプログラムＩのように記載されるものである
。代表的なＰＣＲ反応条件が表６に記載されるが、縮重プライマーのプールが、
プライマーＰＬＲ４正方向（配列番号１０９）およびＰＬＲ６逆方向（配列番号
１１０）の代わりに利用されることを除く。
【０２４３】 さらなるアプローチにおいて、ディリジェントタンパク質をコードするｃＤＮ
Ａ分子が、最初にｃＤＮＡ分子の標的集団をベクターにクローニングすることに
よって、クローニングされ得、このベクターは、各ｃＤＮＡ挿入物に隣接するＴ
３プライマー（配列番号１１６）およびＴ７プライマー（配列番号１１７）につ
いての結合部位を含む。次いで、ｃＤＮＡ分子のクローン化集団が、ＰＣＲ反応
におけるテンプレートとして利用され、このＰＣＲ反応は、プライマーＰＳ−６
Ｆｏｒ（配列番号１２０）またはプライマーＰＳ−２Ｒｅｖ（配列番号１２１）
のいずれか、およびＴ３プライマー（配列番号１１６）またはＴ７プライマー（
配列番号１１７）のいずれかを利用する。代表的なＰＣＲサイクリング様式は、
上の表５のプログラムＩのように記載される。代表的なＰＣＲ反応条件は、表６
に記載されるが、プライマーＰＳ−６Ｆｏｒ（配列番号１２０）またはプライマ
ーＰＳ−２Ｒｅｖ（配列番号１２１）、およびＴ３プライマー（配列番号１１６
）またはＴ７プライマー（配列番号１１７）のいずれかが、プライマーＰＬＲ４
正方向（配列番号１０９）およびＰＬＲ６逆方向（配列番号１１０）の代わりに
利用されることを除く。
【０２４４】 従って、１つの局面において、本発明は、ディリジェントタンパク質をコード
する単離されたヌクレオチド配列を提供し、このヌクレオチド配列は、１Ｘ Ｓ
ＳＣの５８℃での洗浄条件下で、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２
、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８および１０５からなる群か
ら選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補体にハイブリタイズしたまま
であり得る。本発明はまた、ベクター（例えば、複製可能な発現ベクターなど）
および本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供し、ここで、このベク
ターは、本発明の１つ以上の核酸分子を含む。
【０２４５】 本発明はまた、宿主細胞中でのディリジェントタンパク質の発現を増強する方
法を提供する。適切な宿主細胞において、ディリジェントタンパク質の発現を増
強する方法は、以下の工程を包含する：（ａ）宿主細胞に複製可能な発現ベクタ
ーを導入する工程であって、この発現ベクターは、ディリジェントタンパク質を
コードする核酸配列を含み、この核酸配列は、ストリンジェントな洗浄条件下で
、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７
７、８６、９３、９８および１０５からなる群から選択される核酸配列のアンチ
センス相補体にハイブリタイズしたままであり得る、工程、および（ｂ）このコ
ードされたディリジェントタンパク質を発現させる工程。
【０２４６】 本発明はまた、宿主細胞におけるディリジェントタンパク質の発現を阻害する
方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）宿主細胞に複製可
能な発現ベクターを導入する工程であって、この発現ベクターは、ストリンジェ
ントな洗浄条件下で、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３
０、３２、３４、７７、８６、９３、９８および１０５からなる群から選択され
る核酸配列にハイブリタイズし得る核酸配列を含む、工程、および（ｂ）この核
酸配列を転写する工程。
【０２４７】 別の局面において、本発明は、必要に応じて、純粋なリガンドを作製する方法
を提供する。この方法は、（ａ）宿主細胞に発現ベクターを導入する工程であっ
て、この発現ベクターは、必要に応じて純粋なリガンドを生成するために二分子
性フェノキシカップリング反応を指向しうるディリジェントタンパク質をコード
する核酸配列を含み、この核酸配列は、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列
番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８
６、９３、９８および１０５からなる群から選択される核酸配列のアンチセンス
相補体にハイブリタイズしたままであり得る、工程、（ｂ）このコードされたデ
ィリジェントタンパク質を発現させる工程、および（ｃ）必要に応じて純粋なリ
ガンドを宿主細胞から精製する工程。
【０２４８】 （実施例２４） （ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードするさらなる核酸
分子のクローニング） ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼをコードするさらなる核酸分
子は、種々のストラテジーを利用してクローニングされ得る。１つのアプローチ
において、ＤＮＡプローブは、ＰＣＲによって、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡか
ら生成され、次いでこのプローブが、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡラブラリーを
スクリーニングするために使用される。代表的なＰＣＲ反応条件は、以下の表６
に記載される。利用されるプライマーは、ＰＬＲ４正方向（配列番号１０９）お
よびＰＬＲ６逆方向（配列番号１１０）である。
【０２４９】
【表６】 本発明のこの局面で有用である代表的なＰＣＲ熱サイクラープログラムが、表
７に記載される。
【０２５０】
【表７】 先のＰＣＲ反応によって生成されたＤＮＡフラグメントを、全長または実質的
に全長のピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼクローンを単離するた
めに、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプ
ローブとして使用し得る。代表的なハイブリダイゼーション条件は、５７℃での
、６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、および０．５％ ＳＤＳ中での
ハイブリダイゼーションである。代表的な洗浄条件は、室温（代表的に、２０℃
〜３０℃）で５分間の４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中での１回の洗浄、次い
で、５７℃で２０分間の、２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中での１回の洗浄で
ある。任意のさらなる洗浄が、１Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で、５７℃で
３０分間、所望ならば、次いで、さらなる任意の０．５Ｘ ＳＳＣ、０．５％Ｓ
ＤＳ中での５７℃で３０分間の洗浄が実施され得る。
【０２５１】 別のアプローチにおいて、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタ
ンパク質をコードするＤＮＡ分子が、ＲＴ−ＰＣＲ（すなわち、初期基質として
ｍＲＮＡを利用するＰＣＲ反応）によって、ｍＲＮＡからクローニングされ得る
。第一鎖ＤＮＡは、目的の精製ｍＲＮＡから合成される。精製されたｍＲＮＡ（
１５０ｎｇ）は、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）からの１．４μｇのリンカー−プライマー（５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）（配列番号１２２）と混合され、７０℃で１０分間加
熱され、そして急速に氷上で冷却される。次いで、変性ｍＲＮＡテンプレートお
よびリンカー−プライマー（配列番号１２２）の混合物を、Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒ
ａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｍＭ Ｄ
ＴＴ、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、および２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴ Ｍ ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、最終容積２０μｌで混合
した。この反応を、４２℃で５０分間実施し、次いで加熱して（７０℃で、１５
分間）で停止させた。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ Ｈ（１．５単位、１μｌ）を
、この溶液に添加し、そして３７℃で２０分間インキュベートした。
【０２５２】 次に、第一鎖反応物（２μｌ）を、１００μｌのＰＣＲ反応物（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０、５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および５単位の
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（プライマーＣＲ６−ＮＴ（５’ＧＣＡＣＡＴＡ
ＡＧＡＧＴＡＴＧＧＡＴＡＡＧ３’）（配列番号６０）（１０ｐｍｏｌ）および
プライマーＸｈｏＩ−ポリ（ｄＴ）（５’ＧＴＣＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’）（配列番号５９）（１０ｐｍｏｌ）を用いる）におけ
るテンプレートとして使用する。ＰＣＲ増幅を、アニーリング温度が５２℃であ
ることを除いて、Ｄｉｎｋｏｖａ−Ｋｏｓｔｏｖａ，Ａ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４７３−２９４８２（１９９８）（この刊行物は、本
明細書中で参考として援用される）に記載されるように、熱サイクラーにおいて
実施される。簡単には、ＰＣＲ増幅様式は、以下を含む：各々のサイクルが、９
４℃で１分間、５２℃で２分間、および７２℃で３分間を含む、３５サイクル；
次いで、７２℃で５分間および最終サイクル後での４℃での無制限の保持。ＰＣ
Ｒ産物を１．３％アガロースゲルで分離し、約１，２００ｂｐのバンドを示した
。このゲル精製ＰＣＲ産物（約５０ｎｇ）を、次いで、Ｎｏｖｅｇｅｎの説明書
に従って、ｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ベクター（５０ｎｇ）に連結し、そしてコンピ
テントなＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換した。この挿入ｃＤＮＡを、次いで、
オーバーラッピング配列決定プライマーを使用して、配列決定する。
【０２５３】 このように得られたｃＤＮＡを、全長または実質的に全長のピノレジノール／
ラリシレジノールレダクターゼクローンについてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングするために、使用し得る。ｃＤＮＡまたはゲノムＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングするための代表的なハイブリダイゼーション
条件は、５７〜５８℃での６Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５
％ ＳＤＳである。代表的な洗浄条件は、室温（代表的に、２０℃〜３０℃）で
５分間の４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中での１回の洗浄、次いで、５７〜５
８℃で２０分間の、２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中での１回の洗浄である。
任意のさらなる洗浄が、１Ｘ ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で、５７〜５８℃で
３０分間、所望ならば、次いで、さらなる任意の０．５Ｘ ＳＳＣ、０．５％Ｓ
ＤＳ中での５７〜５８℃で３０分間の洗浄が実施され得る。
【０２５４】 なお別のアプローチにおいて、全Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ
ｐｌｒ＿Ｆｉｌ ｃＤＮＡ（配列番号４７）が、全長または実質的に全長のピ
ノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼクローンについてｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用しさ
れ得る。代表的なハイブリダイゼーション条件は、４７℃で３時間の６Ｘ ＳＳ
Ｃ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、０．５％ ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ）、続いて、
室温（典型的に、２０℃〜３０℃）での３分間の、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ Ｓ
ＤＳ（Ｓｉｇｍａ）、次いで、４７℃で２分間の、４Ｘ ＳＳＣ、０．５％ Ｓ
ＤＳでの１回の洗浄である。任意のさらなる洗浄が、１Ｘ ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳ中で、５５℃で３０分間、所望ならば、次いで、さらなる任意の０．５Ｘ
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での５５℃で３０分間の洗浄が実施され得る。
【０２５５】 従って、１つの局面において、本発明は、ピノレジノール／ラリシレジノール
レダクターゼタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列を提供し、こ
のヌクレオチド配列は、１Ｘ ＳＳＣの５５℃での洗浄条件下で、配列番号４７
、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１０
７および１１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補
体にハイブリタイズしたままであり得る。本発明はまた、ベクター（例えば、複
製可能な発現ベクターなど）および本発明の１つ以上のベクターを含む宿主細胞
を提供し、ここで、このベクターは、本発明の１つ以上の核酸分子を含む。
【０２５６】 本発明はまた、宿主細胞中でのピノレジノール／ラリシレジノールレダクター
ゼタンパク質の発現を増強する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含
する：（ａ）宿主細胞に複製可能な発現ベクターを導入する工程であって、この
発現ベクターは、ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質を
コードする核酸配列を含み、この核酸配列は、ストリンジェントな洗浄条件下で
、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６５、６７、６
９、７１、１０７および１１７からなる群から選択されるヌクレオチド配列のア
ンチセンス相補体にハイブリタイズしたままであり得る、工程、および（ｂ）こ
のコードされたピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質を発
現させる工程。
【０２５７】 本発明はまた、宿主細胞におけるピノレジノール／ラリシレジノールレダクタ
ーゼタンパク質の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包
含する：（ａ）宿主細胞に複製可能なベクターを導入する工程であって、この発
現ベクターは、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号４７、４９、５１、
５３、５５、５７、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１０７および１１７
からなる群から選択される核酸配列にハイブリタイズしたままであり得る核酸配
列を含む、工程、および（ｂ）この核酸配列を転写する工程。
【０２５８】 本発明の好ましい実施形態を例示および記載してきたが、種々の変化が、本発
明の意図とおよび範囲から逸脱することなくそこでなされ得ることが理解される
。
【０２５９】 本発明の上記局面および多くの付随する利点は、添付の図面と組み合わせて考
慮する場合に、上記の詳細な説明を参照することによって、本発明がより良好に
理解されるにつれて、より容易に認識される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａにおけるＥ−コニフェニ
ルアルコールの（＋）−ピノレジノールへの立体特異的転換を示す。この反応の
立体選択性は、ディリジェントタンパク質によって制御される。次いで、（＋）
−ピノレジノールが、引き続いて、（＋）−ピノレジノール／（＋）−ラリシレ
ジノールレダクターゼによって、（＋）−ラリシレジノールおよび（−）−セコ
イソラリシレジノールに転換される。（＋）−ピノレジノール、（＋）−ラリシ
レジノールおよび（−）−セコイソラリシレジノールは、それぞれリグナンのフ
ロフラン、フラノおよびジベンジルブタンファミリーの前駆体である。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/22 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 7/22 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダバン， ローレンス ベー． アメリカ合衆国 ワシントン 99163， プルマン， エヌイー アッパー ドライ ブ 1710 (72)発明者 ディンコバ−コストバ， アルベナ ティ ー． アメリカ合衆国 メリーランド 21218， バルティモア， エヌ． カルバート ストリート 2846 (72)発明者 藤田 政之 香川県木田郡牟礼町牟礼1379−22 (72)発明者 ギャング， デイビッド アール． アメリカ合衆国 ミシガン 48108， ア ン アーバー， ストーン ロード 2336 (72)発明者 フォード， ジョシュア ディー． アメリカ合衆国 ワシントン 99163， プルマン， カーケンダール ロード 102 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA01 GA11 4B050 CC01 CC03 DD09 LL05 4B064 AC16 CA01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AA88Y AB01 BA01 CA05 CA44 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA30 EA20 FA72 FA74

Claims (98)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リグナン生合成経路から単離されたタンパク質であって、該
    タンパク質はディリジェントタンパク質およびピノレジノール／ラリシレジノー
    ルレダクターゼからなる群より選択される、タンパク質。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の、単離されたディリジェントタンパク質。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の、単離されたＦｏｒｓｙｔｈｉａディリジ
    ェントタンパク質。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の、単離されたＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔ
    ｅｒｍｅｄｉａディリジェントタンパク質。
  5. 【請求項５】 請求項３に記載の単離されたＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎｔｅ
    ｒｍｅｄｉａディリジェントタンパク質であって、該タンパク質が配列番号１３
    および配列番号１５からなる群より選択される、タンパク質。
  6. 【請求項６】 請求項２に記載の、単離されたＴｓｕｇａディリジェントタ
    ンパク質。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の、単離されたＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐ
    ｈｙｌｌａディリジェントタンパク質。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の単離されたＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈ
    ｙｌｌａディリジェントタンパク質であって、該タンパク質が配列番号１７およ
    び配列番号１９からなる群より選択される、タンパク質。
  9. 【請求項９】 請求項２に記載の、単離されたＴｈｕｊａディリジェントタ
    ンパク質。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の、単離されたＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔ
    ａディリジェントタンパク質。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の単離されたＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔ
    ａディリジェントタンパク質であって、該タンパク質が配列番号２１、２３、２
    ９、３１、３３、３５、７８、８７、および９４からなる群より選択される、タ
    ンパク質。
  12. 【請求項１２】 請求項２に記載の、単離されたＥｕｃｏｍｍｉａディリジ
    ェントタンパク質。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の、単離されたＥｕｃｏｍｍｉａ ｕｌ
    ｍｏｉｄｅｓディリジェントタンパク質。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の単離されたＥｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍ
    ｏｉｄｅｓディリジェントタンパク質であって、該タンパク質が配列番号９９で
    示されるアミノ酸配列からなる、タンパク質。
  15. 【請求項１５】 請求項２に記載の、単離されたＳｃｈｉｓａｎｄｒａディ
    リジェントタンパク質。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の、単離されたＳｃｈｉｓａｎｄｒａ
    ｃｈｉｎｅｎｓｉｓディリジェントタンパク質。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の単離されたＳｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃ
    ｈｉｎｅｎｓｉｓディリジェントタンパク質であって、該タンパク質が配列番号
    １０６で示されるアミノ酸配列からなる、タンパク質。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載の、単離されたピノレジノール／ラリシレ
    ジノールレダクターゼタンパク質。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載の、単離されたＦｏｒｓｙｔｈｉａピノ
    レジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の、単離されたＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉ
    ｎｔｅｒｍｅｄｉａピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質
    。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の単離されたＦｏｒｓｙｔｈｉａ ｉｎ
    ｔｅｒｍｅｄｉａピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質で
    あって、該タンパク質が配列番号４８、５０、５２、５４、５６、および５８か
    らなる群より選択される、タンパク質。
  22. 【請求項２２】 請求項１８に記載の、単離されたＴｓｕｇａピノレジノー
    ル／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の、単離されたＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒ
    ｏｐｈｙｌｌａピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の単離されたＴｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏ
    ｐｈｙｌｌａピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質であっ
    て、該タンパク質が配列番号７０および配列番号７２からなる群より選択される
    、タンパク質。
  25. 【請求項２５】 請求項１８に記載の、単離されたＴｈｕｊａピノレジノー
    ル／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の、単離されたＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａ
    ｔａピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の単離されたＴｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔ
    ａピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質であって、該タン
    パク質が配列番号６２、６４、６６、および６８からなる群より選択される、タ
    ンパク質。
  28. 【請求項２８】 請求項１８に記載の、単離されたＬｉｎｕｍピノレジノー
    ル／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の、単離されたＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａ
    ｔｉｓｓｉｍｕｍピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の単離されたＬｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔ
    ｉｓｓｉｍｕｍピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質であ
    って、該タンパク質が配列番号１０８で示されるアミノ酸配列からなる、タンパ
    ク質。
  31. 【請求項３１】 請求項１８に記載の、単離されたＳｃｈｉｓａｎｄｒａピ
    ノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質。
  32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の、単離されたＳｃｈｉｓａｎｄｒａ
    ｃｈｉｎｅｎｓｉｓピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質
    。
  33. 【請求項３３】 請求項３２に記載の単離されたＳｃｈｉｓａｎｄｒａ ｃ
    ｈｉｎｅｎｓｉｓピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク質で
    あって、該タンパク質が配列番号１１８で示されるアミノ酸配列からなる、タン
    パク質。
  34. 【請求項３４】 単離されたヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配
    列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１２、１４、１６、１８、２
    ０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５か
    らなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１２、１４、１６、
    １８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および
    １０５からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイ
    ブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号１２および配列番号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または
    配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列の
    アンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列
    。
  36. 【請求項３６】 請求項３５に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号１３および配列番号１５からなる群
    より選択されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。
  37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号１２および配列番号１４からなる群より選択
    されるヌクレオチド配列からなる、ヌクレオチド配列。
  38. 【請求項３８】 請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号１６および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または
    配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列の
    アンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列
    。
  39. 【請求項３９】 請求項３８に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号１７および配列番号１９からなる群
    より選択されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。
  40. 【請求項４０】 請求項３８に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号１６および配列番号１８からなる群より選択
    されるヌクレオチド配列からなる、ヌクレオチド配列。
  41. 【請求項４１】 請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、および９３からなる群よ
    り選択されるヌクレオチド配列、または配列番号２０、２２、２８、３０、３２
    、３４、７７、８６、および９３からなる群より選択されるヌクレオチド配列の
    アンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列
    。
  42. 【請求項４２】 請求項４１に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号２１、２３、２９、３１、３３、３
    ５、７８、８７、および９４からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードす
    る、ヌクレオチド配列。
  43. 【請求項４３】 請求項４１に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７
    、８６、および９３からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、ヌク
    レオチド配列。
  44. 【請求項４４】 請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号９８のヌクレオチド配列、または配列番号９８のヌクレオチド配列のアンチセ
    ンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号９９のアミノ酸配列をコードする、
    ヌクレオチド配列。
  46. 【請求項４６】 請求項４４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで該ヌクレオチド配列が、配列番号９８のヌクレオチド配列からなる、ヌ
    クレオチド配列。
  47. 【請求項４７】 請求項３４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号１０５のヌクレオチド配列、または配列番号１０５のヌクレオチド配列のアン
    チセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号１０６のアミノ酸配列をコードする
    、ヌクレオチド配列。
  49. 【請求項４９】 請求項４７に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号１０５のヌクレオチド配列からなる
    、ヌクレオチド配列。
  50. 【請求項５０】 単離されたヌクレオチド配列であって、該単離されたヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号４７、４９、５１
    、５３、５５、５７、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１０７および１１
    ７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号４７、４９、５
    １、５３、５５、５７、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１０７および１
    １７からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブ
    リダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  51. 【請求項５１】 請求項５０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群より選択されるヌクレ
    オチド配列、または配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７からな
    る群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズし
    た状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  52. 【請求項５２】 請求項５１に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号４８、５０、５２、５４、５６、お
    よび５８からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配
    列。
  53. 【請求項５３】 請求項５１に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、ヌクレオチド配列。
  54. 【請求項５４】 請求項５０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号６１、６３、６５、および６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、
    または配列番号６１、６３、６５、および６７からなる群より選択されるヌクレ
    オチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌク
    レオチド配列。
  55. 【請求項５５】 請求項５４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号６２、６４、６６、および６８から
    なる群より選択されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。
  56. 【請求項５６】 請求項５４に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号６１、６３、６５、および６７からなる群よ
    り選択されるヌクレオチド配列からなる、ヌクレオチド配列。
  57. 【請求項５７】 請求項５０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号６９および配列番号７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または
    配列番号６９および配列番号７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列の
    アンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列
    。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号７０および配列番号７２からなる群
    より選択されるアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチド配列。
  59. 【請求項５９】 請求項５７に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号６９および配列番号７１からなる群より選択
    されるヌクレオチド配列からなる、ヌクレオチド配列。
  60. 【請求項６０】 請求項５０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号１０７のヌクレオチド配列、または配列番号１０７のヌクレオチド配列のアン
    チセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  61. 【請求項６１】 請求項６０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号１０８のアミノ酸配列をコードする
    、ヌクレオチド配列。
  62. 【請求項６２】 請求項６０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号１０７のヌクレオチド配列からなる、ヌクレ
    オチド配列。
  63. 【請求項６３】 請求項５０に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該単離されたヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号１１７のヌクレオチド配列、または配列番号１１７のヌクレオチド配列のアン
    チセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
  64. 【請求項６４】 請求項６３に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、ここで、該ヌクレオチド配列が、配列番号１１８のアミノ酸配列をコードする
    、ヌクレオチド配列。
  65. 【請求項６５】 請求項６３に記載の単離されたヌクレオチド配列であって
    、該ヌクレオチド配列が、配列番号１１７のヌクレオチド配列からなる、ヌクレ
    オチド配列。
  66. 【請求項６６】 ディリジェントタンパク質をコードする二本鎖核酸分子で
    あって、該二本鎖核酸分子が、コード鎖および相補的な非コード鎖を含み、ここ
    で、該コード鎖が、６０℃の５０ｍＭ ＫＣＬ中で配列番号１２０のオリゴヌク
    レオチド分子にハイブリダイズし、そして該非コード鎖が、６０℃の５０ｍＭ
    ＫＣＬ中で配列番号１２１のオリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズする、核
    酸分子。
  67. 【請求項６７】 複製可能なベクターであって、該ベクターが、ストリンジ
    ェントな洗浄条件下で、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、
    ３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５からなる群より選択
    されるヌクレオチド配列、または配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２
    、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５からなる群
    より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状
    態を保持し得るヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  68. 【請求項６８】 請求項６７に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１２お
    よび配列番号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号
    １２および配列番号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセ
    ンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  69. 【請求項６９】 請求項６７に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１６お
    よび配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号
    １６および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセ
    ンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  70. 【請求項７０】 請求項６７に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号２０、
    ２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、および９３からなる群より選択さ
    れるヌクレオチド配列、または配列番号２０、２２、２８、３０、３２、３４、
    ７７、８６、および９３からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセ
    ンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  71. 【請求項７１】 請求項６７に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号９８の
    ヌクレオチド配列、または配列番号９８のヌクレオチド配列のアンチセンス相補
    鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  72. 【請求項７２】 請求項６７に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１０５
    のヌクレオチド配列、または配列番号９８のヌクレオチド配列のアンチセンス相
    補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  73. 【請求項７３】 複製可能なベクターであって、該ベクターが、ストリンジ
    ェントな洗浄条件下で、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、
    ６３、６５、６７、６９、７１、１０７および１１７からなる群より選択される
    ヌクレオチド配列、または配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１
    、６３、６５、６７、６９、７１、１０７および１１７からなる群より選択され
    るヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得
    るヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  74. 【請求項７４】 請求項７３に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号４７、
    ４９、５１、５３、５５、および５７からなる群より選択されるヌクレオチド配
    列、または配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群より
    選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を
    保持し得る、ベクター。
  75. 【請求項７５】 請求項７３に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号６１、
    ６３、６５、および６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配
    列番号６１、６３、６５、および６７からなる群より選択されるヌクレオチド配
    列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  76. 【請求項７６】 請求項７３に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号６９お
    よび配列番号７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号
    ６９および配列番号７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセ
    ンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  77. 【請求項７７】 請求項７３に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１０７
    のヌクレオチド配列、または配列番号１０７のヌクレオチド配列のアンチセンス
    相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  78. 【請求項７８】 請求項７３に記載の複製可能なベクターであって、ここで
    、前記ヌクレオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１１７
    のヌクレオチド配列、または配列番号１１７のヌクレオチド配列のアンチセンス
    相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、ベクター。
  79. 【請求項７９】 宿主細胞であって、該宿主細胞は、ストリンジェントな洗
    浄条件下で、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２
    、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５からなる群より選択されるヌク
    レオチド配列、または配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３
    ０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５からなる群より選択さ
    れるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し
    得るヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを含む、宿主細胞。
  80. 【請求項８０】 請求項７９に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１２および配列番
    号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１２および
    配列番号１４からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖
    とハイブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  81. 【請求項８１】 請求項７９に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１６および配列番
    号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号１６および
    配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖
    とハイブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  82. 【請求項８２】 請求項７９に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号２０、２２、２８
    、３０、３２、３４、７７、８６、および９３からなる群より選択されるヌクレ
    オチド配列、または配列番号２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６
    、および９３からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖
    とハイブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  83. 【請求項８３】 請求項７９に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号９８のヌクレオチ
    ド配列、または配列番号９８のヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブ
    リダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  84. 【請求項８４】 請求項７９に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１０５のヌクレオ
    チド配列、または配列番号１０５のヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハ
    イブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  85. 【請求項８５】 宿主細胞であって、該宿主細胞が、ストリンジェントな洗
    浄条件下で、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６５
    、６７、６９、７１、１０７および１１７からなる群より選択されるヌクレオチ
    ド配列、または配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６
    ５、６７、６９、７１、１０７および１１７からなる群より選択されるヌクレオ
    チド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得るヌクレオ
    チド配列を含む複製可能なベクターを含む、宿主細胞。
  86. 【請求項８６】 請求項８５に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号４７、４９、５１
    、５３、５５、および５７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または
    配列番号４７、４９、５１、５３、５５、および５７からなる群より選択される
    ヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る
    、宿主細胞。
  87. 【請求項８７】 請求項８５に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号６１、６３、６５
    、および６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号６１
    、６３、６５、および６７からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチ
    センス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  88. 【請求項８８】 請求項８５に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号６９および配列番
    号７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列、または配列番号６９および
    配列番号７１からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖
    とハイブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  89. 【請求項８９】 請求項８５に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１０７のヌクレオ
    チド配列、または配列番号１０７のヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハ
    イブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  90. 【請求項９０】 請求項８５に記載の宿主細胞であって、ここで、前記ヌク
    レオチド配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号１１７のヌクレオ
    チド配列、または配列番号１１７のヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハ
    イブリダイズした状態を保持し得る、宿主細胞。
  91. 【請求項９１】 適切な宿主細胞におけるピノレジノール／ラリシレジノー
    ルレダクターゼの発現を増強する方法であって、該方法が、複製可能な発現ベク
    ターを該宿主細胞に導入する工程であって、該ベクターが、ピノレジノール／ラ
    リシレジノールレダクターゼタンパク質をコードする核酸配列を含み、該核酸配
    列が、ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号４７、４９、５１、５３、５５
    、５７、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１０７、および１１７からなる
    群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした
    状態を保持し得る、工程、ならびに該コードされるピノレジノール／ラリシレジ
    ノールレダクターゼタンパク質を発現させる工程を包含する、方法。
  92. 【請求項９２】 適切な宿主細胞においてピノレジノール／ラリシレジノー
    ルレダクターゼの発現を阻害する方法であって、該方法が、ストリンジェントな
    洗浄条件下で、配列番号４７、４９、５１、５３、５５、５７、６１、６３、６
    ５、６７、６９、７１、１０７、および１１７からなる群より選択される核酸配
    列とハイブリダイズした状態を保持し得る核酸配列を含む複製可能なベクターを
    該宿主細胞に導入する工程、ならびに該核酸配列を転写する工程を包含する、方
    法。
  93. 【請求項９３】 適切な宿主細胞においてディリジェントタンパク質の発現
    を増強する方法であって、該方法が、ディリジェントタンパク質をコードする核
    酸配列を含む複製可能な発現ベクターを該宿主細胞に導入する工程であって、該
    核酸配列が、ストリンジェントな洗浄条件下で配列番号１２、１４、１６、１８
    、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０
    ５からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリ
    ダイズした状態を保持し得る、工程、および該コードされるディリジェントタン
    パク質を発現させる工程を包含する、方法。
  94. 【請求項９４】 適切な宿主細胞においてディリジェントタンパク質の発現
    を阻害する方法であって、該方法が、ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番
    号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６
    、９３、９８、および１０５からなる群より選択される核酸配列とハイブリダイ
    ズした状態を保持し得る核酸配列を含む複製可能なベクターを該宿主細胞に導入
    する工程、および該核酸配列を転写する工程を包含する、方法。
  95. 【請求項９５】 光学的に純粋なリグナンを生成する方法であって、以下： （ａ）光学的に純粋なリグナンを生成する二分子フェノキシカップリング反応
    に関与し得るディリジェントタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクタ
    ーを宿主細胞に導入する工程であって、該核酸配列が、ストリンジェントな洗浄
    条件下で配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３２、３
    ４、７７、８６、９３、９８、および１０５からなる群より選択される核酸配列
    のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、工程； （ｂ）該コードされるディリジェントタンパク質を発現させる工程；ならびに （ｃ）該宿主細胞から光学的に純粋なリグナンを精製する工程； を包含する、方法。
  96. 【請求項９６】 請求項９５に記載の方法であって、ここで、ディリジェン
    トタンパク質をコードする前記核酸配列が、配列番号１２、１４、１６、１８、
    ２０、２２、２８、３０、３２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５
    からなる群より選択される、方法。
  97. 【請求項９７】 ディリジェントタンパク質をコードする単離されたヌクレ
    オチド配列であって、該単離されたヌクレオチド配列が、５８℃、１×ＳＳＣの
    洗浄条件下で、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２８、３０、３
    ２、３４、７７、８６、９３、９８、および１０５からなる群より選択されるヌ
    クレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダイズした状態を保持し得る、
    ヌクレオチド配列。
  98. 【請求項９８】 ピノレジノール／ラリシレジノールレダクターゼタンパク
    質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、該単離されたヌクレオチ
    ド配列が、５５℃の１×ＳＳＣの洗浄条件下で、配列番号４７、４９、５１、５
    ３、５５、５７、６１、６３、６５、６７、６９、７１、１０７、および１１７
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補鎖とハイブリダ
    イズした状態を保持し得る、ヌクレオチド配列。
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