CN115197921B

CN115197921B - 五味子松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN115197921B
Application number: CN202210692604.1A
Authority: CN
Inventors: 肖莹; 马雪祺; 陈万生; 段永豪
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN115197921A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体为一种来源于五味子的松脂醇‑落叶松脂醇还原酶PLR及其基因。本发明从五味子中克隆出并筛选了多种ScPLRs，并对其进行生物信息学分析，再通过异源表达以及体外酶活实验，最终明确其结构特征及功能，发现其具有不同的催化活性，具有良好的应用前景，并为五味子中木脂素生物合成相关基因的研究提供基础。

Description

五味子松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶、编码基因及其应用。

背景技术

五味子作为传统中草药，具有2000多年的使用历史。它被收录在中国、日本、韩国、俄罗斯、欧洲、美国药典以及世界卫生组织编辑的国际药典中。五味子中含有木脂素类、萜类、多糖、挥发油类、类黄酮、有机酸类等多种活性成分。

目前已从五味子中分离出100多种木脂素类化合物。其中，木脂素是由苯丙氨酸单体氧化聚合形成的一大类天然产物。五味子中的木脂素主要属于二苯并环辛烷型，包括五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酚等。研究表明其具有抗氧化、抗癌、神经保护、保肝、抗炎等多种药理作用。

松脂醇-落叶松脂醇还原酶(PLR)是木脂素类化合物生物合成的关键酶，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的还原酶。基于预测的五味子中木脂素生物合成途径，PLR能够催化两个步骤：一是在合成罗汉松脂素的过程中先后催化松脂醇生成落叶松脂醇和开环异落叶松脂素，二是在合成五味子素的过程中催化Verrucosin生成二氢愈创木酸(Dihydroguaiaretic acid)。

目前已经从多种植物中分离出PLR基因，例如连翘(Forsythia intermedia)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、亚麻(Linum album或Linum usitatissimum)、茶(Camelliasinensis)、菘蓝(Isatis indigotica)、北美乔柏(Thuja plicata)、宿根亚麻(Linumperenne)等。拟南芥的AtPLRs对松脂醇表现出严格的底物偏好性，但对落叶松脂醇只有微弱的甚至没有催化活性，所以将其命名为AtPRR1和AtPRR2。从亚麻Linum album中发现的LaPLR1只能将(+)-松脂醇(pinoresinol，简称Pin)转化成(-)-开环异落叶松脂素(secoisolariciresinol，简称Sec)，而LuPLR1是只能将(-)松脂醇转化成(+)-开环异落叶松脂素。茶Camellia sinensis中的CsPLRs(CsPLR1和CsPLR2)也有催化松脂醇转化成开环异落叶松脂素的功能，只是CsPLR1可以将(+)-和(-)-松脂醇转化为落叶松脂醇(lariciresinol，简称Lar)和开环异落叶松脂素，而CsPLR2只能选择性地催化(+)-松脂醇转化为(-)-开环异落叶松脂素，通过定点突变CsPLR1的L174I发现其丧失了催化松脂醇但保留了催化(-)-落叶松脂醇的能力。菘蓝IiPLR1能够催化松脂醇转化为落叶松脂醇，再进一步转化落叶松脂醇为开环异落叶松脂素，并且过表达IiPLR1的菘蓝转基因毛状根中落叶松脂醇的积累显著增加。对IiPLR1和AtPLRs的蛋白晶体结构的对比研究明确了决定PLR底物的选择和结合以及催化功能的关键氨基酸残基，并通过定点突变改变IiPLR1的蛋白结构，使其底物选择性改变，从而在大肠杆菌中特异性积累落叶松脂醇。

以上研究结果都证实了PLR在木脂素生物合成过程中的重要作用，但目前还没有对于五味子中相关PLR进行开发利用的报道，因此开发五味子中PLR对木脂素生物合成具有重要意义。

发明内容

本发明旨在提供五味子中松脂醇-落叶松脂醇还原酶(PLR)酶及基因。

本发明还提供了上述基因和酶的应用。

本发明的另一个目的在于提供落叶松脂醇和开环异落叶松脂素的制备方法。

技术方案如下，五味子松脂醇-落叶松脂醇还原酶，含有SEQ ID No.2–5之一所示的氨基酸序列。

优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No.2–5中的任一项所示。

五味子松脂醇-落叶松脂醇还原酶的基因，编码上述SEQ No.2–5之一的氨基酸序列。

优选的，五味子松脂醇-落叶松脂醇还原酶的基因，包含如SEQ ID No.7–10之一的其核苷酸序列。

一种重组载体，含有上述来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因。

一种宿主细胞，含有上述来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因或者上述重组载体。

上述来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶、基因可用于催化松脂醇(Pin)转化为落叶松脂醇(Lar)、催化松脂醇(Pin)转化为开环异落叶松脂素(Sec)或者催化落叶松脂醇(Lar)转化为开环异落叶松脂素(Sec)。

优选的，具有SEQ ID No.2-5序列的松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因，能够催化(+)-松脂醇(+Pin)转化为(+)-落叶松脂醇(+Lar)的反应。

优选的，具有SEQ ID No.3或4序列的松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因，能够催化(+Lar)转化为(-)-开环异落叶松脂素(-Sec)的反应。

优选的，具有SEQ ID No.3-5序列的松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因，能够催化(-)-落叶松脂醇(-Lar)转化为(+)-开环异落叶松脂素(+Sec)的反应。

更为优选的，具有SEQ ID No.3或4序列的松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因，能够催化(-)-松脂醇(-Pin)转化为(-)-落叶松脂醇(-Lar)的反应。

本发明还公开了一种制备落叶松脂醇(Lar)的方法，用SEQ ID No.2-5之一序列的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将(+)-松脂醇(+Pin)转化为(+)-落叶松脂醇(+Lar)；或者用SEQ ID No.3或4序列之一的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将(-)-松脂醇(-Pin)转化为(-)-落叶松脂醇(-Lar)。

本发明还公开了一种制备开环异落叶松脂素(Sec)的方法，用SEQ ID No.3或4的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将(+)-落叶松脂醇(+Lar)转化为(-)-开环异落叶松脂素(-Sec)；或者，用SEQ ID No.3-5之一序列的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将(-)-落叶松脂醇(-Lar)转化为(+)-开环异落叶松脂素(+Sec)。

本发明克隆出并筛选了多种ScPLRs，并对其进行生物信息学分析，再通过异源表达以及体外酶活实验，最终明确其结构特征及功能，发现其具有不同的催化活性，具有良好的应用前景，并为五味子中木脂素生物合成相关基因的研究提供基础。

附图说明

为了更好的理解本发明的实质，下面将结合附图来说明本发明。

图1为实施例1中，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为实施例1中，ScPLR-pMD19T-TOP10的单克隆阳性菌PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为实施例2中，原核表达载体PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳结果，1-5分别为121044-pET32a、127563-pET32a、133569-pET32a、129716-pET32a和127024-pET32a。

图4为ScPLR-pET32a-TOP10的单克隆阳性菌PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳结果。

图5为实施例3中蛋白诱导表达后的粗蛋白电泳图。

图6为实施例3中蛋白诱导表达并浓缩纯化后的蛋白电泳图。

图7为实施例3中标准蛋白溶液浓度与吸光度的线性回归方程。

图8为实施例4中，以+Pin为底物时，各实验组结果的LC-MS检测色谱图。

图9为实施例4中，以+Lar为底物时，各实验组结果的LC-MS检测色谱图。

图10为实施例4中，以-Pin为底物时，各实验组结果的LC-MS检测色谱图。

图11为实施例4中，以-Lar为底物时，各实验组结果的LC-MS检测色谱图。

具体实施方式

以下通过实例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1获取基因

1.五味子果实的RNA提取

a.样品采集：取新鲜的五味子果实，用铝箔包裹后放入液氮中。液氮速冻后取出敲碎，将样品移入含有两颗钢珠的1.5ml RNase-free离心管，用球磨机磨碎。

b.提取RNA：样品裂解，萃取分层，挂柱回收，洗涤离心，洗脱RNA(实验步骤参照试剂盒TransZol Up Plus RNA Kit全式金ER501)。

c.RNA浓度及纯度检测结果如表1：

表1总RNA浓度

样品	C(ng/mL)	A260/A280	A260/A230
				五味子	166.3	2.1	1.32

2.五味子cDNA文库的构建

五味子的总RNA逆转录成cDNA：total RNA放置冰上，使用RNase-free的试剂和耗材，实验步骤参照试剂盒(TaKaRa PrimeScript^TM 1st strand cDNA Synthesis Kit)。

3.扩增引物设计

用于基因扩增的引物如表2所示：

表2用于扩增五味子PLR基因的引物

引物名称	序列(5′—3′)
		127024-ge-f	ATGGAGACGACGAGAAGTCG
127024-ge-r	TCATAGTAGTGTGTCTAAAT
		121044-ge-f	ATGGGGAAGAACAGAGTTCT
121044-ge-r	CTATAAATAACGTTTGATGT
		129716-ge-f	ATGGGTGGAAGCAAGATCTT
129716-ge-r	TCAGACAAACTGGTCAAGAT
		127563-ge-f	ATGACGAAGCTGAGTGAGAG
133569-ge-r	TCAGACGTAACGTTTGAGGT

4.基因的扩增

实验步骤参照试剂盒(TOYOBO KOD FX货号：9503002)。

PCR反应液配制参照表3，PCR反应程序如表4：

表3 PCR反应液配方表

组分	加样量
		模板(cDNA)	1μL
F(10μM)	1.5μL
		R(10μM)	1.5μL
2×KOD FX buffer	25μL
		2mM dNTPs	10μL
KOD FX	1μL
		Nuclase-free Water	补齐至50μL

表4 PCR反应程序

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳：150V，15min，结果如图1所示。

5.扩增产物连接PMD19-T载体

扩增产物利用Premix Taq酶(TaKaRa Premix LA)继续扩增在KOD FX酶扩增的产物序列末端加一个A，按如下表5加样。

表5扩增产物Premix Taq酶扩增加样

组分	加样量
		ScPLRs扩增产物	40μL
Premix Taq	1μL

72℃反应20min，扩增产物连接PMD19-T载体按下表6加样，轻轻混合，室温反应1h，反应结束置冰上(实验步骤参照试剂盒TaKaRa PMD^TM19-T Vector Cloning Kit)。

表6连接PMD19-T载体加样

组分	加样体积
		PCR产物	2.5μL
PMD19-T	0.5μL
		SolutionⅠ	2μL

6.载体转化大肠杆菌

实验步骤参照试剂盒(唯地生物TOP10 Chemically Competent Cell)

(1)从-80℃冰箱取出感受态细胞，室温下解冻，后迅速置冰上；

(2)取连接产物5μL，加到50μL感受态细胞中(超净工作台中进行)；

(3)冰上放置30min，并在42℃热激90s，随后立即放置冰上5min；

(4)加入500μL无抗生素的LB培养液，在37℃、200rpm摇床培养约1小时；

(5)室温5000rpm离心1min，留100μL上清，吹打重悬；

(6)将悬液涂布于含100mg/L Amp+的LB固体培养基上，倒放置于37℃恒温培养箱内培养12-16h；

(7)挑8个单克隆菌落接种于300μL含100mg/L Amp+的LB液体培养基中，在37℃、200rpm摇床培养3h以上。

7.单克隆阳性菌检测

实验步骤按照江苏康为世纪生物科技股份有限公司试剂盒2×Flash PCRMasterMix(Dye)说明书进行。参照表7配制反应液，PCR反应程序如表8所示。所得到的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，条件：150V，15min，结果如图2所示。

表7 PCR反应液配方

组分	加样量
		模板(菌液)	1μL
M13-F(10μM)	1μL
		M13-R(10μM)	1μL
2×Flash PCR MasterMix(Dye)	10μL
		ddH₂O	补足体积至20μL

表8 PCR反应程序

8.测序

选择条带匹配的阳性菌，取100μL送测(生工)，利用Vector NTⅠ软件进行序列比对。得到5条序列，分别用121044-ScPLR1、127024-ScPLR2、129716-ScPLR3、127563-ScPLR4、133569-ScPLR5表示。

测序结果如SEQ ID No.6-10所示，其对应的所编码蛋白质氨基酸序列如SEQ IDNo.1-5所示。

实施例2原核表达载体的构建

1.抽提质粒

取10μL测序正确的菌液ScPLRs-pMD19T-TOP10，加到20mL LB(Amp+100mg/L)液体培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床中培养过夜。同时取10μL菌液pET32a+-T1，加到5mL LB(Amp+100mg/L)培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床中培养过夜。裂解菌体，离心取上清后，挂柱回收上清液，洗涤离心，洗脱得到质粒溶液(质粒提取步骤参照试剂盒EasyPurePlasmid MiniPrep Kit全式金EM101进行)。

2.pET32a+质粒双酶切

使用Not I-HF(NEB)和Xho I(NEB)双酶切pET32a+载体用于ScPLRs无缝克隆，反应体系如表9所示。

表9

体系组成	体积
		质粒	25μL
Not I-HF	1μL
		Xho I	1μL
Cutsmart Buffer	3μL

反应液混匀，置于37℃下反应30min，采用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将相应片段切下，胶回收得线性质粒溶液，利用微量紫外分光光度计检测线性质粒溶液得浓度和纯度，用于下一步计算。线性质粒溶液在-20℃条件下可保存一周。

3.无缝克隆引物设计

用于无缝克隆的引物(限制性核酸内切酶位点带有下划线)如表10所示，

127024-F的限制性核酸内切酶位点为gcggccgc；

127024-R的限制性核酸内切酶位点为ctcgag；

121044-F的限制性核酸内切酶位点为gcggccgc；

121044-R的限制性核酸内切酶位点为gctcgag；

129716-F的限制性核酸内切酶位点为gcggccgc；

129716-R的限制性核酸内切酶位点为ctcgag；

127563-F的限制性核酸内切酶位点为gcggccgc；

127563-R的限制性核酸内切酶位点为ctcgag；

133569-F的限制性核酸内切酶位点为gcggccgc；

133569-RF的限制性核酸内切酶位点为ctcgag。

表10无缝克隆引物

引物名称	序列(5′-3′)
		127024-F	tccgtcgacaagcttgcggccgcatggagacgacgaga
127024-R	gtggtggtggtggtgctcgagttagtagtgtgtctaa
		121044-F	tccgtcgacaagcttgcggccgcatggggaagaacaga
121044-R	gtggtggtggtggtgctcgagttaaataacgtttgat
		129716-F	tccgtcgacaagcttgcggccgcatgggtggaagcaag
129716-R	gtggtggtggtggtgctcgagtgacaaactggtcaag
		127563-F	tccgtcgacaagcttgcggccgcatgacgaagctgagt
127563-R	gtggtggtggtggtgctcgagttagatatcgcttcaa
		133569-F	tccgtcgacaagcttgcggccgcatggagggaacgaaa
133569-R	gtggtggtggtggtgctcgagtgacgtaacgtttgag

4.基因片段的扩增

实验步骤参照试剂盒(TOYOBO KOD FX货号：9503002)。PCR反应液的配制和扩增条件如表11和表12所示。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳(条件为150V，15min)，结果如图3所示。1-5分别为121044-pET32a、127563-pET32a、133569-pET32a、129716-pET32a和127024-pET32a。

表11 PCR反应液配方表

表12 PCR反应程序

5.无缝克隆

参照表13配制反应液，轻轻混匀，金属浴50℃、30min，反应后立即置于冰上或者降温至4℃(步骤参照试剂盒plus One step PCR Cloning Kit近岸)。

表13

b.重组产物转化大肠杆菌感受态TOP10

c.涂板，挑斑，加入500μL LB(Amp+100mg/L)，37℃，200rpm，摇菌，过夜，菌检结果如图4所示，送测(生工)，并进行序列比对，。

6.抽提质粒，转化表达型菌株BL21

取测序正确的ScPLRs-pET32a-TOP10，pET32a+-Trans1 T1菌液各10μL，分别加入5mL LB(含Amp+100mg/L)液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。第二天抽提质粒，重新转化BL21(方法同TOP10感受态)。涂板，37℃恒温培养箱培养过夜。挑斑，菌检，留阳性克隆菌株。

实施例3蛋白诱导与纯化

1.蛋白诱导表达

a.各取10μL菌液ScPLRs-pET32a+-BL21，并以pET32a+-BL21作阴性对照，加入5mLLB(含Amp+100mg/L)培养基，过夜培养。

b.培养过夜的菌液取5mL加入到500mLLB(含Amp+100mg/L)的液体培养基中，200rpm、37℃培养大约3h，培养至OD600值约为0.5～0.6。

c.加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1mmol/L，80rpm、16℃培养过夜(12-16h)；

d.7830rpm离心5min富集菌体，分次收集到50mL离心管中，25mL PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬菌体。

e.用超高压细胞破碎仪破碎菌体，破碎后的菌液于4℃、7830rpm离心15min，收集上清，用0.22μm微孔滤膜过滤得到粗蛋白液。

2.SDS-PAGE电泳分析

上一步实验获得的上清、沉淀各取20μL加入4μL蛋白上样缓冲液(6×proteinloading buffer)中，混匀后沸水煮5min加热变性后进行SDS-PAGE电泳分析。

a.配制10％SDS-PAGE胶，分离胶和浓缩胶配方如表14所示，表中为两块胶的量。

先将分离胶加入制胶槽中，约30min凝固后加入浓缩胶，并迅速插入齿梳。凝固后立即使用或者用浸湿的吸水纸包裹后置于4℃保存。

表14分离胶和浓缩凝胶的配方

b.取8μL变性后的样品8，缓慢加入浓缩胶的泳道中，使用Bio-Rad电泳装置进行电泳，电泳程序为：80V、30min；120V、60min。

c.反应结束后，将胶取出，小心切下浓缩胶，将分离胶置于加有考马斯亮蓝染色液的容器中水平摇床60rpm震荡30min，用清水冲洗，再于清水中置于水平摇床上震荡，脱色，反复多次直到蛋白条带明显可见为止。

d.结果分析：127024-ScPLR2蛋白分子量预测为34.6kDa，121044-ScPLR1蛋白分子量预测为34.8kDa，129716-ScPLR3蛋白分子量预测为33.4kDa，127563-ScPLR4蛋白分子量预测为35.2kDa，133569-ScPLR5蛋白分子量预测为35.4kDa。由于ScPLRs是用pET-32a+载体表达，表达出的蛋白有his标签，因此表达的蛋白分子量应比目标蛋白大17kDa。结果如图显示，在55kDa左右，上清液和沉淀都存在目的蛋白，且空载pET-32a+的上清和沉淀在相应的位置上没有条带。

结果如图5所示。

3.重组蛋白纯化

使用Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges纯化柱，按照表15所示配制纯化所需的各溶液，加超纯水至1L，用KOH或H₃PO₄调节pH至7.4，0.22μm微孔滤膜过滤，存放于4℃备用。

表15缓冲溶液配方表

a.使用5倍柱体积(25mL)的wash buffer 1平衡柱子，2mL/min缓慢冲洗，弃去流出液；

b.将粗蛋白液以2mL/min上样；

c.使用5倍柱体积(25mL)的wash buffer 1冲洗柱子，流速为2mL/min，弃去流出液；

d.使用5倍柱体积(25mL)的wash buffer 2冲洗柱子，流速为2mL/min，弃去流出液；

e.使用8倍柱体积(40mL)的elution buffer洗脱样品，收集前20mL洗脱液，弃去后20mL流出液，2mL/min缓慢洗脱；

f.使用6倍柱体积(30mL)的wash buffer 1以2mL/min缓慢冲洗柱子。

注：为避免蛋白降解，上述各步骤均在冰上进行；柱子于4℃保存。

f.洗脱后，使用5倍柱体积的wash buffer 1以2mL/min缓慢冲洗柱子。

注：为避免蛋白降解，上述各步骤均在冰上进行。

4.重组蛋白除盐浓缩

使用Millipore超滤柱(50kDa)浓缩蛋白样品，同时起到除盐的目的。预实验中将上述分别收集到的各蛋白洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，根据电泳结果，合并蛋白浓度较大的样品(如图所示，收集4-12mL组分，纯蛋白收集组分一般不随粗蛋白上样量改变)，

a.纯化后蛋白溶液置于Millipore超滤柱中，在4℃、4500rcf离心，浓缩至0.5-1mL。

b.再加入3mL PBS缓冲液，离心至约500μL。

c.浓缩除盐后的蛋白酶置于冰上，用于后续实验，也可暂存于4℃。

纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示，均可在55kDa左右看到明显目标条带。

5.蛋白浓度检测

使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)检测纯化蛋白浓度，产品编号为P0010 BCA。

a.0.4mg/mL蛋白标准品溶液(BCA)分别取0、1.25、2.5、5、10、15、20μLμL加到96孔板中，PBS缓冲液补至20μL，重复两次。再将纯化后蛋白溶液稀释50倍、100倍、200倍、400倍，重复两次；

b.各孔中加入200μL现配的BCA工作液，在37℃静置30min；

c.630nm波长下检测各孔吸光度；

d.按照蛋白标准品溶液吸光度绘制标准曲线，计算蛋白浓度，结果如表16所示。

表16

重组蛋白名称	浓度(mg/mL)
		127024	1.085588
121044	5.553807
		129716	14.31205
127563	5.638767
		133569	2.617999

标准蛋白溶液浓度与吸光度的线性回归方程如图7所示，为：

y＝0.1817x+0.1113 R²＝0.9993。

实施例4体外酶功能验证

反应体系如表17，体系总量100μL：

表17体外重组酶活反应体系

组分	加样量
		底物(+Pin/-Pin/+Lar/-Lar，100μM)	3.6μL(1mg/mL)
酶(纯化后)	5μg
		NADPH(150μM)	1μL(15mM)
Tris-HCl(pH＝7.0,50mM)	补足体积至100μL

恒温混合器，30℃300rpm 12h

对照组：pET32a+-BL21蛋白诱导表达；实验组：ScPLR-pET32a+-BL21蛋白诱导表达。(酶促反应使用纯化后酶的PBS溶液，对照组用相同pH的PBS缓冲液代替)

底物：+Pin/-Pin/+Lar/-Lar

a.按照表17配制反应体系，反应条件：每个样品3次重复，空白对照不加酶(加等体积1×PBS)，30℃，300rpm，过夜；

b.反应结束后，用200μL甲醇终止反应；

c.14,000rpm、4℃离心15min，取150μL于新的1.5mL离心管中；

d.14,000rpm、4℃离心15min，取100μL于进样小瓶中，利用液相质谱联用仪Agilent 1200-6410LC-MS进行检测；

色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，3.5μm，2.1×100mm；柱温30℃；流速0.3mL/min；进样量5μL；流动相乙腈(A相)和5mM醋酸铵水溶液(B相)；

流动相洗脱梯度表及质谱条件分别如表18和表19所示。

表18流动相洗脱梯度表

表19质谱条件：负离子条件下各成分质谱检测条件

结果分析如下：

从图8中可以看到以+Pin为底物时，121044、129716、127563和133569均可以催化+Pin转化为+Lar；根据图9可以看到，以+Lar为底物时，129716和127563均可以催化+Lar转化为-Sec；五个ScPLRs中只有127024没有催化+Pin或+Lar的能力。

图10显示，以-Pin为底物，129716(SEQ ID No.3)和127563(SEQ ID No.4)的酶活样品中检测到了-Lar，并且127563的样品中还检测到了+Sec；图11显示，以-Lar为底物时，129716、127563和133569均检测到了+Sec；然而127024和121044均没有催化-Lar生成Sec的能力。

总之，127024(SEQ ID No.1)没有催化Pin或Lar的能力；121044(SEQ ID No.2)只具有催化+Pin转化为+Lar的能力；129716(SEQ ID No.3)、127563(SEQ ID No.4)不仅具有催化+Pin转化为+Lar、+Lar转化为-Sec的能力，也具有催化-Pin转化为-Lar、-Lar转化为+Sec的能力；133569(SEQ ID No.5)具有催化+Pin转化为+Lar和催化-Lar转化为+Sec的能力。

序列表

<110> 上海中医药大学

<120> 五味子松脂醇-落叶松脂醇还原酶及其编码基因和应用

<130> 02714

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 1

Met Gly Lys Asn Arg Val Leu Val Val Gly Gly Thr Gly Tyr Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Met Val Lys Ala Ser Leu Asp Gln Gly His Thr Thr Tyr Val

20 25 30

Leu Tyr Arg Pro Glu Val Asn Leu Asp Ile Glu Lys Leu Gln Thr Leu

35 40 45

Leu Ser Phe Lys Gln Gln Gly Ala Arg Leu Val Glu Gly Ser Phe Ser

50 55 60

Asp His Arg Ser Leu Val Asp Ala Val Lys Gln Val Asp Val Val Ile

65 70 75 80

Cys Thr Ile Ser Gly Val His Phe Arg Ser His Asn Ile Leu Leu Gln

85 90 95

Leu Lys Leu Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Gly Asn Val Lys Arg Phe

100 105 110

Leu Pro Ser Glu Phe Gly Thr Asp Pro Ala Arg Met Ala His Ala Ile

115 120 125

Glu Pro Gly Arg Val Thr Phe Asp Asp Lys Met Thr Val Arg Lys Ala

130 135 140

Ile Glu Asp Ala Gly Ile Pro Phe Thr Tyr Val Ser Ala Asn Cys Phe

145 150 155 160

Ala Gly Tyr Phe Val Gly Ala Leu Cys Gln Pro Gly Arg Leu Thr Pro

165 170 175

Ser Ala His Ser Val Gln Leu Phe Gly Asp Gly Asn Thr Lys Ala Ile

180 185 190

Phe Leu Asp Glu Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Thr Ile Lys Ala Ile Asp

195 200 205

Asp Pro Arg Thr Leu Asn Lys Thr Leu Tyr Leu Arg Pro Pro Glu Asn

210 215 220

Ile Leu Ser Gln Arg Glu Val Val Gly Ile Trp Glu Lys Leu Ser Gly

225 230 235 240

Lys Thr Leu Glu Lys Ser Ser Ile Ser Glu Glu Asp Phe Leu Thr Ala

245 250 255

Met Lys Gly Met Asp Tyr Ala Gln Gln Val Gly Met Gly His Phe Tyr

260 265 270

His Val Phe Tyr Gln Gly Cys Leu Ser Asn Phe Lys Ile Gly Glu Glu

275 280 285

Gly Glu Glu Ala Ser Val Leu Tyr Pro Glu Val Lys Tyr Thr Ile Val

290 295 300

Glu Asp Tyr Ile Lys Arg Tyr Leu

305 310

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 2

Met Glu Thr Thr Arg Ser Arg Ile Leu Ile Ile Gly Ala Thr Gly Asn

1 5 10 15

Leu Gly Arg His Leu Ile Asn Ala Ser Leu Ala Ala Gly His Pro Thr

20 25 30

Leu Ile Leu Ile Arg Asp Ser Thr Met Leu Ser Arg Pro Glu Lys Ser

35 40 45

Gln Leu Val Glu Asn Phe Ala Ser Ala Gly Ala Lys Val Ile Lys Gly

50 55 60

Ser Leu Glu Asp Tyr Ser Ser Leu Val Glu Ala Ile Lys Gln Val Asp

65 70 75 80

Val Val Ile Cys Ala Val Ser Ala Lys Gln Thr Leu Glu Gln Lys His

85 90 95

Leu Ile Lys Ala Ile Lys Glu Ala Gly Cys Ile Lys Arg Phe Ile Pro

100 105 110

Ser Glu Phe Gly Ser Asp Pro Glu Lys Val His Ile Pro Asp Asn Val

115 120 125

Asn Thr Phe Tyr Pro Tyr Lys Ala Glu Ile Arg Arg Ile Ile Lys Glu

130 135 140

Glu Gly Ile Pro Tyr Thr Phe Ile Ser Cys Asn Phe Phe Thr Gly Val

145 150 155 160

Leu Leu Pro Ser Leu Val Gln Pro Gly Leu Lys Thr Pro Pro Arg Asp

165 170 175

Lys Val Thr Ile Phe Gly Asp Gly Asn Thr Lys Ala Val Phe Met Glu

180 185 190

Glu Arg Asp Val Ala Val Phe Thr Leu Asn Ala Val Asp Asp Pro Arg

195 200 205

Thr Leu Asn Lys Val Leu Tyr Leu Arg Pro Pro Gly Asn Val Tyr Ser

210 215 220

Phe Asn Glu Leu Val Glu Leu Trp Glu Ile Lys Ile Gly Lys Lys Leu

225 230 235 240

Glu Lys Val Tyr Val Ser Glu Asp Gln Val Leu Lys Ser Ile Gln Glu

245 250 255

Thr Pro Tyr Pro Ser Asn Leu Glu Met Thr Tyr Ile Tyr Ser Ala Phe

260 265 270

Ile Lys Gly Asp His Thr Asn Phe Asn Ile Glu Pro Glu Gly Val Asp

275 280 285

Gly Thr Gln Leu Tyr Pro His Leu Gln Tyr Thr Thr Ile Ser Glu Tyr

290 295 300

Leu Asp Thr Leu Leu

305

<210> 3

<211> 307

<212> PRT

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 3

Met Gly Gly Ser Lys Ile Leu Ile Ile Gly Gly Thr Gly Tyr Ile Gly

1 5 10 15

Lys Phe Ile Val Lys Ala Ser Ala Ala Ser Gly His Pro Thr Phe Ala

20 25 30

Leu Ile Arg Glu Ser Thr Ala Ser Asp Pro Ala Lys Ala Ala Leu Ile

35 40 45

Glu Ser Phe Lys Ala Ser Gly Val Thr Leu Leu Tyr Gly Ser Leu Glu

50 55 60

Asp His Ala Ser Leu Val Ala Ala Ile Lys Gln Val Glu Val Val Ile

65 70 75 80

Ser Thr Val Gly His Gly Gln Leu Ala Asp Gln Val Lys Leu Ile Pro

85 90 95

Ala Ile Lys Glu Ala Gly Thr Val Lys Arg Phe Phe Pro Ser Glu Phe

100 105 110

Gly Asn Asp Val Asp Arg Val His Ala Val Glu Pro Ala Lys Thr Ala

115 120 125

Phe Ala Ile Lys Ala Gln Phe Arg Arg Ala Val Glu Ala Ala Gly Ile

130 135 140

Pro His Thr Phe Val Ser Ser Asn Phe Phe Ala Gly Tyr Phe Leu Pro

145 150 155 160

Thr Leu Asn Gln Pro Gly Leu Thr Ser Pro Pro Arg Asp Lys Val Ile

165 170 175

Ile Leu Gly Asp Gly Asn Pro Lys Ala Ile Phe Val Lys Glu Asp Asp

180 185 190

Ile Gly Thr Tyr Thr Ile Lys Ser Val Asp Asp Pro Arg Thr Leu Asn

195 200 205

Lys Ile Leu Tyr Leu Arg Pro Pro Ala Asn Thr Ile Ser Phe Asn Glu

210 215 220

Leu Val Ser Leu Trp Glu Lys Lys Ile Gly Lys Thr Leu Glu Arg Ile

225 230 235 240

Tyr Val Pro Glu Glu Gln Leu Leu Lys Gln Ile Glu Glu Ser Pro Ile

245 250 255

Pro Ile Asn Val Ile Leu Ser Ile Gly His Ser Val Phe Val Lys Gly

260 265 270

Asp His Thr Asn Phe Glu Ile Glu Glu Ser Phe Gly Val Glu Ala Ser

275 280 285

Gln Leu Tyr Pro Asp Val Lys Tyr Thr Thr Val Asp Glu Tyr Leu Asp

290 295 300

Gln Phe Val

305

<210> 4

<211> 314

<212> PRT

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 4

Met Thr Lys Leu Ser Glu Ser Lys Val Leu Ile Val Gly Gly Thr Gly

1 5 10 15

His Ile Gly Arg Arg Leu Val Arg Ala Ser Leu Ala Leu Asn His Pro

20 25 30

Thr Tyr Val Leu Phe Arg Glu Glu Asn Leu Asn Asp Ile Glu Lys Ile

35 40 45

Glu Leu Leu Leu Asp Phe Lys Gln Asn Gly Ala Arg Leu Val Met Gly

50 55 60

Ser Phe Asp Asn Arg Glu Ser Leu Leu Asn Ala Val Lys Gln Val Asp

65 70 75 80

Ile Val Ile Ser Ala Leu Ala Ala Asn His Val Arg His Glu Ile Ile

85 90 95

Thr Gln Leu Lys Leu Leu Asp Val Ile Ile Glu Ala Gly His Ile Lys

100 105 110

Arg Phe Ile Pro Ser Glu Phe Gly Met Asp Pro Asp Ile Met Val Gly

115 120 125

Ala Leu Pro Pro Gly Asn Lys Thr Phe Ile Asp Lys Ser Lys Val Arg

130 135 140

Arg Ala Ile Glu Ala Ala Gly Val Pro His Thr Tyr Val Ser Ala Asn

145 150 155 160

Cys Tyr Ala Ala Tyr Phe Val Gly Gly Leu Gly Gln Ile Gly Pro Gly

165 170 175

Leu Ile Pro Ser Gln Glu Lys Val Ala Leu Phe Gly Asp Gly Glu Ala

180 185 190

Lys Val Ile Trp Asn Asp Glu Met Asp Ile Ala Thr Tyr Val Leu Lys

195 200 205

Ala Ala Asp Asp Pro Arg Thr Leu Asn Lys Ala Ile Phe Ile Arg Pro

210 215 220

Pro Asp Asn Ile Leu Ser Gln Arg Glu Leu Val Gln Ile Trp Glu Lys

225 230 235 240

Leu Ile Gly His Glu Leu Lys Lys Thr Asn Ile Ser Ser Gln Glu Trp

245 250 255

Leu Lys Ser Met Glu Gly Met Pro Glu Gly Leu Gln Leu Ala Met Ala

260 265 270

His Asn Phe His Ile Phe Tyr Glu Gly Cys Leu Thr Asn Phe Pro Val

275 280 285

Gly Asp Asp Gln Glu Ala Ser Lys Leu Tyr Pro Glu Val Arg Tyr Thr

290 295 300

Ser Met Glu Glu Tyr Leu Lys Arg Tyr Leu

305 310

<210> 5

<211> 313

<212> PRT

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 5

Met Glu Gly Thr Lys Asp Arg Val Leu Ile Ile Gly Ala Thr Gly Tyr

1 5 10 15

Leu Gly Arg Arg Phe Val Lys Ala Ser Leu Ala Leu Gly Tyr Pro Thr

20 25 30

Tyr Leu Leu Tyr Arg Pro Glu Val Ala Ser Asp Ala Glu Lys Val Gln

35 40 45

Met Leu Ile Gly Phe Lys Met Gln Gly Ala His Leu Leu Glu Gly Ser

50 55 60

Leu Gly Asp His Glu Ser Met Val Ser Ala Leu Lys Gln Val Asp Val

65 70 75 80

Val Val Ser Ala Val Ala Gly Asn His Leu Arg His Ala Ile Leu Glu

85 90 95

Gln Ile Lys Leu Val Asn Ala Ile Lys Glu Val Gly Thr Ile Lys Arg

100 105 110

Phe Ile Pro Ser Glu Phe Gly Met Asp Pro Gly Arg Met Lys His Ala

115 120 125

Ile Asp Pro Gly Ala Tyr Val Phe Lys Asp Lys Arg Ile Val Arg Glu

130 135 140

Ala Ile Glu Lys Ala Gly Ile Pro Tyr Thr Tyr Ile Ser Ala Asn Cys

145 150 155 160

Cys Ala Gly Tyr Phe Leu Ser Ala Leu Ala Gln Ile Leu Asn Phe Met

165 170 175

Pro Pro Arg Asp His Val Leu Ile Tyr Gly Asp Gly Ser Lys Lys Cys

180 185 190

Ile Trp Val Asp Glu Asp Asp Ile Gly Met Tyr Thr Met Met Ala Ile

195 200 205

Asn Asp Pro Arg Thr Leu Asn Lys Ser Leu Tyr Leu Arg Pro Arg Ser

210 215 220

Asn Ile Leu Thr Gln Ile Glu Val Val Gln Leu Trp Glu Lys Leu Ile

225 230 235 240

Gly Lys Glu Leu Lys Lys Thr Phe Val Ser Glu Glu Glu Trp Leu Gly

245 250 255

Asn Met Gly Lys Met Ala Ala Pro Met Gln Ile Gly Val Ala His Phe

260 265 270

Tyr Gln Ile Phe Tyr Arg Gly Asp Leu Asp Phe Glu Val Glu Ser Pro

275 280 285

Asp Gly Val Asp Ser Gln Asp Leu Trp Pro Asp Tyr Lys Tyr Val Thr

290 295 300

Ala Glu Glu Tyr Leu Lys Arg Tyr Val

305 310

<210> 6

<211> 939

<212> DNA

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 6

atggggaaga acagagttct cgtggttggg ggaactggtt acttggggaa gagaatggtg 60

aaggctagtt tagaccaagg tcacactacc tatgtacttt accggccgga ggttaatctg 120

gacatcgaga aactccaaac cctcttgtct ttcaagcagc aaggtgcccg gctggtcgag 180

gggtcatttt ccgatcaccg aagcctcgtc gatgccgtaa aacaggtcga cgttgtgata 240

tgtacgatct cgggcgttca ttttcgcagc cacaacattc ttctccagct caaactggta 300

gatgccatca aagaagctgg taatgtcaag cgattcttac cgtcggaatt tggaaccgat 360

ccggcgagaa tggcgcacgc tatagagcct ggaagagtga ccttcgacga caagatgacg 420

gtgagaaaag ccattgaaga tgctggaatt cccttcactt acgtctccgc taactgcttc 480

gccggatact tcgtcggcgc cctgtgccaa ccaggcagac tcactccttc agcgcactcc 540

gttcaactct tcggagatgg caacacaaag gcaatttttt tggatgagga tgacattgct 600

acctacacaa tcaaggccat agatgatccc cgtaccctca acaaaaccct gtatctccgg 660

ccaccggaaa acatcctctc acagagggaa gtagtcggaa tctgggagaa actgtcgggg 720

aagacattag agaagtcaag tatctccgag gaagactttc tcactgccat gaaaggcatg 780

gattatgcac agcaagtggg gatgggacat ttctatcatg tgttctacca aggctgcctt 840

tcaaatttta aaatagggga ggagggcgag gaggcttcgg tgctctaccc ggaggtcaag 900

tatacaatag tggaagacta catcaaacgt tatttatag 939

<210> 7

<211> 930

<212> DNA

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 7

atggagacga cgagaagtcg gattctgata atcggagcaa caggtaatct ggggcgtcat 60

ctcataaatg caagccttgc cgctggccat ccaacattga ttctaattcg agattcaaca 120

atgctttctc gacccgaaaa atctcaactt gtggagaact tcgcatctgc tggagctaaa 180

gtcatcaagg gttctctgga agattactcc agtctagttg aagccattaa gcaagtggat 240

gtcgtgattt gtgctgtatc tgcaaaacaa accctcgagc agaagcatct cattaaagct 300

atcaaagaag ctggatgcat caagaggttc attccatctg agtttggatc agacccagag 360

aaagttcaca tccccgataa tgtgaatacc ttttatccgt acaaagctga gatccgacgg 420

attataaagg aggaaggcat accatacacc ttcatttcct gcaacttctt cacaggagtt 480

ttacttccat cacttgtcca accgggcctc aagactcctc caagggacaa agtcacaatc 540

ttcggagatg gaaatactaa agctgtcttc atggaggaaa gggatgttgc tgtatttacc 600

cttaatgctg tggatgatcc tcgaactttg aacaaggtat tatatttgag gccaccgggc 660

aatgtttatt cgttcaacga attagttgag ctttgggaaa taaagattgg gaagaagctt 720

gagaaggttt atgtatcaga ggatcaggtt cttaagagca tccaagagac tccatatcca 780

agcaacctgg agatgacata tatatactca gctttcatca agggagacca caccaacttc 840

aacatcgagc cggaaggtgt ggatggaacc caactttatc ctcatttaca atacaccact 900

atcagtgaat atttagacac actactatga 930

<210> 8

<211> 924

<212> DNA

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 8

atgggtggaa gcaagatctt gatcatcgga ggaaccggct acatcggaaa gttcattgtc 60

aaagctagcg cggcgtcagg ccacccgacc ttcgctctca tcagagagag caccgcttcc 120

gatcctgcaa aggccgcact aatcgaatcg ttcaaagctt ccggcgtcac cttgctctac 180

ggatctcttg aagatcatgc gagtttagtt gcggcgatca agcaagttga ggtcgtcata 240

tctactgttg gtcatggcca gttggctgat caggtcaagc tcatccctgc tatcaaagaa 300

gctggaacgg tgaagagatt cttcccttcg gaattcggaa atgatgtgga ccgggttcat 360

gctgttgagc cagcaaagac tgcattcgca atcaaagcgc aattccgacg agctgttgaa 420

gctgccggca ttccgcacac ttttgtgtcc tccaacttct tcgctggcta cttcctccct 480

acattgaacc agcctggact cacctctccc ccaagggaca aagttatcat tttgggtgat 540

ggaaatccaa aagctatatt tgtaaaggaa gatgatattg gtacttacac catcaaatct 600

gtggatgatc caaggacctt gaacaagatc ctctatctga gaccccctgc taacaccatc 660

tcattcaacg agctcgtctc tctatgggag aagaagattg gcaaaacctt ggaaaggatc 720

tatgttccag aggaacaact cctcaaacaa attgaagaat ctccgattcc aattaacgtt 780

attctttcga tcggtcactc ggttttcgtg aagggagacc ataccaattt tgagatcgag 840

gaatcattcg gcgtggaggc ttctcagctc tatcctgatg ttaagtacac aactgtggat 900

gaatatcttg accagtttgt ctga 924

<210> 9

<211> 945

<212> DNA

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 9

atgacgaagc tgagtgagag caaggttctg attgtgggtg gcacaggcca catagggagg 60

aggctggtta gagccagtct tgcccttaat cacccaactt acgtcctgtt tcgagaggag 120

aatttgaatg atatcgagaa gatcgagctt cttctggatt tcaagcaaaa cggtgctcgt 180

cttgtgatgg gatcgttcga caaccgggag agcctgctga atgcagttaa gcaggtggac 240

atcgtcatat ccgccttggc tgcaaaccat gtccgccatg agatcatcac gcaattgaag 300

ctcctggatg tcatcataga agccggtcat atcaagaggt tcataccttc agagtttgga 360

atggacccag atataatggt tggtgctcta cctccaggca ataagacatt tatagataaa 420

agcaaggtca ggcgtgcaat agaagctgca ggagttcccc atacctatgt ctctgcaaat 480

tgctacgctg catatttcgt cggtggcctg ggccaaatcg gccctggttt aatcccatca 540

caggaaaaag ttgccctctt tggagatgga gaggccaaag tgatatggaa tgatgagatg 600

gacatagcaa catatgttct taaagcagca gacgatccac ggacattaaa caaggcaata 660

tttatcagac ctccagacaa tatactttct cagagagagc ttgtgcaaat atgggagaaa 720

ctaattggcc atgaattaaa gaaaacaaat atttcatctc aagagtggtt gaaatctatg 780

gaagggatgc ccgaggggct gcaattagca atggcacaca actttcatat attctatgaa 840

gggtgtttaa caaatttccc agttggtgat gatcaagaag cttcgaagct ttacccagaa 900

gtcagataca catctatgga agaatatttg aagcgatatc tatga 945

<210> 10

<211> 942

<212> DNA

<213> 五味子(Schisandra chinensis)

<400> 10

atggagggaa cgaaagatag ggttttgatt ataggagcaa caggttattt gggaagaagg 60

tttgtgaagg caagcttggc tcttggctat cccacgtatc ttctataccg tccggaagtc 120

gcatcagatg ccgagaaagt tcagatgctt atcggattca aaatgcaagg agcccatctt 180

ctcgaaggtt cacttggaga tcatgagagc atggtttcag cactaaagca ggtggacgtg 240

gttgtctcag ctgttgcagg aaaccaccta agacatgcca ttctcgaaca gatcaaactc 300

gtcaacgcca ttaaagaagt tggcacaatt aagaggttca ttccttcaga gtttgggatg 360

gatccaggcc ggatgaagca tgctatagat cctggagcgt atgtttttaa ggataaacgt 420

attgttcgag aagcaataga gaaggcaggt atcccttaca cctatatctc tgctaactgc 480

tgtgctggat acttcctctc tgctctggca cagatactga acttcatgcc acccagagac 540

catgttctta tctacggcga tggcagtaag aaatgcatat gggttgatga ggatgatata 600

ggaatgtata ctatgatggc cattaatgat cctcgaacct tgaacaagag tctttatttg 660

cgtcctcgca gcaacatttt gacacagatt gaagttgttc aattatggga gaagctcata 720

gggaaggaat tgaagaaaac atttgtttct gaagaagaat ggcttggaaa tatgggcaag 780

atggctgcgc ctatgcaaat cggtgtagcc cacttttacc aaattttcta tcgcggtgat 840

ctagatttcg aggttgagag tccagatggc gtggatagcc aagatttgtg gccagattat 900

aaatacgtca cagctgaaga gtacctcaaa cgttacgtct ga 942

Claims

1.一种来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.2或3所示。

2.一种来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的松脂醇-落叶松脂醇还原酶。

3.根据权利要求2所述来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 7或8所示。

4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因。

5.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求2或3所述的来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因或者权利要求4所述的重组载体，所述的重组细胞不是植物细胞。

6.权利要求1所述来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶、或者权利要求2或3所述来源于五味子的松脂醇-落叶松脂醇还原酶基因在催化松脂醇转化为落叶松脂醇、催化松脂醇转化为开环异落叶松脂素或者催化落叶松脂醇转化为开环异落叶松脂素方面的应用，其特征在于，如SEQ ID No.2序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶将（+）-松脂醇转化为（+）-落叶松脂醇；如SEQ ID No. 3序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶将（+）-松脂醇转化为（+）-落叶松脂醇，或者将（-）-松脂醇转化为（-）-落叶松脂醇，或者将（-）-松脂醇转化为（+）-开环异落叶松脂素，或者将（+）-松脂醇转化为（-）-开环异落叶松脂素。

7.一种制备落叶松脂醇的方法，其特征在于，用如SEQ ID No.2序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将（+）-松脂醇转化为（+）-落叶松脂醇；或者用如SEQ ID No.3序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将（+）-松脂醇转化为（+）-落叶松脂醇；或者用如SEQ ID No. 3序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将（-）-松脂醇转化为（-）-落叶松脂醇。

8.一种制备开环异落叶松脂素的方法，其特征在于，用如SEQ ID No.3序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将（+）-落叶松脂醇转化为（-）-开环异落叶松脂素；或者用如SEQ IDNo.3序列所示的松脂醇-落叶松脂醇还原酶，将（-）-落叶松脂醇转化为（+）-开环异落叶松脂素。